Summary

Fabricación de microesferas porosas altamente abiertas (HOPM) mediante tecnología microfluídica

Published: May 16, 2022
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Summary

El presente protocolo describe la fabricación de microesferas porosas altamente abiertas (HOPM) basadas en ácido poli(láctico-co-glicólico) a través de la tecnología microfluídica fácil basada en formulación de emulsión única. Estas microesferas tienen aplicaciones potenciales en ingeniería de tejidos y detección de fármacos.

Abstract

En comparación con los andamios a granel y la inyección directa de células solas, las unidades modulares inyectables han despertado un enorme interés en la reparación de tejidos mal funcionantes debido a la conveniencia en el empaquetado de las células, la mejora de la retención celular y la mínima invasividad. Además, la conformación porosa de estos portadores de microescala podría mejorar el intercambio medio y mejorar el nivel de nutrientes y suministros de oxígeno. El presente estudio ilustra la fabricación conveniente de microesferas porosas altamente abiertas basadas en ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA-HOPM) mediante la tecnología microfluídica fácil para aplicaciones de administración celular. Los PLGA-HOPM monodispersos resultantes poseían tamaños de partícula de ~ 400 μm y poros abiertos de ~ 50 μm con ventanas de interconexión. Brevemente, las gotas de aceite emulsionado (solución de PLGA en diclorometano, DCM), envueltas con la fase acuosa de gelatina al 7,5% (p/v), se introdujeron en la solución acuosa de poli (alcohol vinílico) (PVA) de flujo continuo al 1% (p/v) a través de la boquilla coaxial en la configuración microfluídica personalizada. Posteriormente, las microesferas se sometieron a procedimientos de extracción con disolventes y liofilización, lo que resultó en la producción de HOPM. En particular, varias formulaciones (concentraciones de PLGA y porógeno) y parámetros de procesamiento (poder emulsionante, medidor de aguja y caudal de fase dispersa) juegan un papel crucial en las cualidades y características de los PLGA HOPM resultantes. Además, estas arquitecturas podrían encapsular potencialmente otras señales bioquímicas, como factores de crecimiento, para aplicaciones extendidas de descubrimiento de fármacos y regeneración de tejidos.

Introduction

Las microesferas cargadas de células ofrecen ventajas favorables, como una mayor capacidad de retención celular in situ, una entrega eficiente de células y la posterior capacidad de proliferación celular in vivo1. Hasta la fecha, se han presentado numerosas investigaciones para desarrollar una estructura de andamiaje exitosa para apoyar un entorno propicio para las células para la regeneración de tejidos o aplicaciones de detección de drogas2. Sin embargo, el ambiente de hipoxia es a menudo inevitable en el interior debido a los suministros insuficientes de nutrientes / oxígeno y la acumulación de desechos metabólicos3. Para superar estos problemas, se han desarrollado microesferas altamente porosas (PMs) utilizando diversos biomateriales 4,5,6. Además, en el cultivo dinámico, los andamios sufren de un esfuerzo cortante excesivo7, y el estado inestable del medio de cultivo podría romper la fidelidad de los PM. Alternativamente, el ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) podría usarse para procesar PM con buena resistencia mecánica para el cultivo dinámico1. Por ejemplo, demostramos la coinyección de PMs altamente abiertos (HOPM) de PLGA cargados de mioblastos de ratón (C2C12) y microvarillas huecas de poli(etilenglicol) cargadas de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) para curar la pérdida muscular volumétrica, logrando una mejora notable de la regeneración del músculo esquelético in situ 8.

En particular, las PM se caracterizan por grandes áreas de superficie y altas porosidades, lo que es de interés específico para la adhesión celular y el crecimiento hacia la entrega celular mínimamente invasiva9. En vista de estos aspectos, se han empleado diversos materiales biocompatibles para fabricar las PM10,11. Estos PM diseñables cocultivados con células ofrecen una excelente adherencia, una resistencia mecánica considerable y ventanas altamente interconectadas, lo que podría mejorar la proliferación celular para reparar tejidos dañados12. En este sentido, también se han desarrollado diversas tecnologías para fabricar esferas porosas13,14. Por un lado, las PM fueron producidas utilizando agentes formadores de gas, como NH4HCO3, que fueron restringidos debido a la insuficiente interconectividad15,16,17. Por otro lado, las PM fueron cortadas directamente después de la emulsificación, lo que condujo a PMs polidispersas18. Al final, la tecnología microfluídica de gotas basada en el enfoque de plantillas de emulsión es quizás un método eficiente para construir PMs, ya que a menudo resulta en partículas de tamaño uniforme19. En particular, los atributos morfológicos de las microesferas a menudo dependen de la calidad de las gotas de emulsión generadas (es decir, agua en aceite, W / O, o aceite en agua, O / W), lo que puede afectar significativamente los atributos de los biomateriales20. Vale la pena señalar que la plataforma microfluídica prediseñada se puede aplicar para generar las microfibras o microesferas. En un caso, Yu et al. demostraron la producción de estructuras microfibrosas cargadas de células basadas en plataformas microfluídicas capilares, que podrían usarse para ensamblar redes celulares para imitar tejidos naturales21. En otro caso, Ye et al. fabricaron microcápsulas de cristal fotónico mediante la replicación de plantillas de perlas de cristal coloidal de sílice a través de tecnologías microfluídicas, lo que podría superar muchas limitaciones de las técnicas actuales que requieren un etiquetado complejo y aparatos específicos22.

De hecho, la razón detrás de la utilización de esta técnica se debe a varias ventajas, como ser de naturaleza fácil, no requerir equipos sofisticados y su conveniencia para sintetizar PM de tamaño uniforme para aplicaciones de administración celular y medicina regenerativa. En este contexto, con componentes prediseñados de plantillas de emulsión, las PM con altas porosidades e interconectividad se pueden obtener convenientemente de un dispositivo microfluídico ensamblado a partir de tubos de poli(cloruro de vinilo) (PVC), un capilar de vidrio y una aguja. Se prepara un precursor de emulsión W/O homogeneizando una solución acuosa de gelatina y una solución orgánica de PLGA. Al inyectar selectivamente la porción aplicable de la emulsión en la plataforma microfluídica, se fabrican los PM con tamaños de partícula uniformes y poros interconectados en toda la superficie hasta el interior. El presente protocolo tiene como objetivo fabricar los PLGA-HOPM mediante plantillas de emulsión en la plataforma microfluídica. Se cree que este protocolo permite la producción reproducible de PLGA-HOPM y será potencialmente aplicable en sus campos relacionados de ingeniería de tejidos y detección de fármacos.

Protocol

1. Preparación de soluciones Preparar previamente la solución madre de PVA calentando la solución de PVA en un baño maría a 80 °C y, posteriormente, colocándola en la nevera a 4 °C. Enfriar a temperatura ambiente (RT) para uso experimental. Preparar la emulsión-precursor añadiendo la solución acuosa de gelatina (1 mL, 7,5%, p/v) a la fase orgánica de PLGA (2 mL, 2%, p/v en diclorometano, DCM) (ver Tabla de materiales).NOTA: Generalmente, la tecnologí…

Representative Results

Basándose en trabajos previos que optimizaron los parámetros principales1, PLGA se disolvió en el disolvente DCM evaporable. La emulsión primaria de W/O se preparó homogeneizando con gelatina bajo tratamiento de sonda ultrasónica. La estructura fluídica de coflujo personalizada se ensambló de manera simplista, en la que se empleó una jeringa para introducir los flujos constantemente. Además, se llevaron a cabo suficientes procedimientos de enjuague para eliminar el PVA y la gelatina de l…

Discussion

Este artículo describe una estrategia eficiente para fabricar arquitecturas basadas en PLGA, a saber, los PLGA-HOPM. Cabe señalar que se deben tomar varios pasos críticos con cuidado, incluida la evitación de la volatilización del disolvente de PLGA y el ajuste suave de la potencia ultrasónica a la posición objetivo durante la preparación de la emulsión. Además, la salida de líquido de la jeringa de 20 ml se puede ajustar hasta cierto punto para resolver la separación de fases de los precursores emulsionados….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SCL, YW, RKK y AZC reconocen el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, 32071323, 81971734 y U1605225) y el Programa para el Equipo de Investigación Innovadora en Ciencia y Tecnología en la Universidad de la Provincia de Fujian. YSZ no fue apoyado por ninguno de estos programas ni recibió pago de ningún tipo; en cambio, se reconoce el apoyo del Instituto de Investigación Brigham.

Materials

Centrifuge tube Solarbio, Beijing, China 5 mL & 50 mL (sterility)
Confocal laser scanning microscopy Leica, Wetzlar, Germany TCS SP8
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China 20161110 Research Grade
Dispensing needle Kindly, Shanghai, China 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm
DMEM/F-12 Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA 15400054 DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's
Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12
50/50 Mix) with L-glutamine
Ethyl alcohol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China 20210918 Research Grade
Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%)
Fetal bovine serum (FBS) Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra Research Grade
Freeze drier Bilon, Shanghai, China FD-1B-50
Gelatin Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA lot# SZBF2870V From porcine skin, Type A
Glass bottom plate Biosharp, Hefei, China BS-15-GJM, 35 mm
Glass capillary Huaou, Jiangsu, China 0.9-1.1 × 120 mm
Incubator shaker Zhicheng, Shanghai, China ZWYR-200D
Live dead kit cell imaging kit Solarbio, Beijing, China 60421211112 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Low-speed centrifuge Xiangyi, Hunan, China TD5A
Magnetron sputter Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China MSP-2S
Microflow injection pump Harvard Apparatus, Holliston, USA Harvard Pump 11 Plus
Penicillin-streptomycin Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra 2135250 Research Grade
Phosphate buffered saline (PBS) Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China GP21090181556 PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium
Poly(lactic-co-glycolic acid) Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA lot# MKCF9651 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA lot# MKCK4266 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed
PVC tube Shenchen, Shanghai, China Inner diameter, ID: 1 mm
Rat bone marrow mesenchyml stem cells Procell, Wuhan, China
Scanning electron microscope Phenom pure, Eindhoven, Netherlands Set acceleration voltage at 5 kV
Syrine for medical purpose Kindly, Shanghai, China 5 mL & 50 mL (with the needle)
Temperature water bath Mingxiang, Shenzhen, China 36 W
Transformer Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China SZ-2KVA
Ultrasonic cell breaker JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China JY 92-IID
UV curing glue Zhuolide, Foshan, China D-3100

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Luo, S., Wang, Y., Kankala, R. K., Zhang, Y. S., Chen, A. Fabricating Highly Open Porous Microspheres (HOPMs) via Microfluidic Technology. J. Vis. Exp. (183), e63971, doi:10.3791/63971 (2022).

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