Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור של מיקרוספרות נקבוביות פתוחות מאוד (HOPMs) המבוססות על פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) באמצעות טכנולוגיית מיקרופלואידית מבוססת תחליב יחיד. למיקרוספרות אלה יש יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות ובבדיקת תרופות.
Abstract
בהשוואה לפיגומים בתפזורת והזרקה ישירה של תאים בלבד, היחידות המודולריות הניתנות להזרקה זכו לעניין עצום בתיקון רקמות לא תקינות בשל הנוחות באריזות התאים, שימור תאים משופר ופולשניות מינימלית. יתר על כן, הקונפורמציה הנקבובית של נשאים זעירים אלה יכולה לשפר את חילופי הבינוניים ולשפר את רמת חומרי המזון ואספקת החמצן. המחקר הנוכחי ממחיש את הייצור הנוח של מיקרוספרות נקבוביות פתוחות מאוד (PLGA-HOPMs) המבוססות על פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית) על ידי הטכנולוגיה המיקרופלואידית של facile עבור יישומי העברת תאים. ה- PLGA-HOPMs החד-ממדיים שהתקבלו היו בעלי גודל חלקיקים של ~ 400 מיקרומטר ונקבוביות פתוחות של ~ 50 מיקרומטר עם חלונות מחוברים. בקצרה, טיפות השמן המתחלבות (תמיסת PLGA בדיכלורומתאן, DCM), עטופות בפאזה המימית של ג'לטין 7.5% (w/v), הוכנסו לתמיסה המימית של 1% (w/v) פולי(ויניל אלכוהול) (PVA) הזורם באופן רציף דרך הזרבובית הקואקסיאלית במערך המיקרופלואידי המותאם אישית. לאחר מכן, המיקרוספרות היו נתונות להליכי מיצוי ממסים וליופיליזציה, וכתוצאה מכך לייצור HOPMs. יש לציין כי פורמולציות שונות (ריכוזים של PLGA ופורוגן) ופרמטרים לעיבוד (כוח תחליב, מד מחט וקצב זרימה של פאזה מפוזרת) ממלאים תפקידים מכריעים באיכויות ובמאפיינים של ה- PLGA HOPMs המתקבלים. יתר על כן, ארכיטקטורות אלה עשויות לתמצת רמזים ביוכימיים שונים אחרים, כגון גורמי גדילה, לגילוי תרופות מורחב וליישומים של התחדשות רקמות.
Introduction
מיקרוספרות עמוסות תאים מציעות יתרונות חיוביים, כגון יכולת שימור תאים משופרת באתרה, אספקה יעילה של תאים, ויכולת נוספת של התפשטות תאים in vivo1. עד כה, נערכו מחקרים רבים לפיתוח מבנה פיגומים מוצלח לתמיכה בסביבה תורמת לתאים להתחדשות רקמות או ליישומי סינון תרופות2. עם זאת, סביבת היפוקסיה היא לעתים קרובות בלתי נמנעת בפנים עקב אספקה מספקת של חומרים מזינים / חמצן והצטברות פסולת מטבולית3. כדי להתגבר על בעיות אלה, מיקרוספרות נקבוביות מאוד (PMs) פותחו באמצעות ביו-חומריםשונים 4,5,6. בנוסף, בתרבות דינמית, הפיגומים סובלים מלחץ גזירה מוגזם7, והמצב הלא יציב של מדיום התרבית עלול לשבור את הנאמנות של PMs. לחלופין, ניתן להשתמש בפולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) לעיבוד PMs עם חוזק מכני טוב לתרבית דינמית1. לדוגמה, הדגמנו הזרקה משותפת של מיובלסט עכבר (C2C12) עמוס PLGA פתוח מאוד PMs (HOPMs) ותאי אנדותל של ורידים אנושיים (HUVEC) עמוסי פולי(אתילן גליקול) מיקרורודים חלולים כדי לרפא אובדן שריר נפחי, ולהשיג שיפור מדהים של התחדשות שרירי השלד באתרו 8.
יש לציין כי PMs מאופיינים בשטחי פנים גדולים ונקבוביות גבוהות, וזה עניין ספציפי להידבקות תאים וצמיחה לקראת אספקת תאים זעיר פולשנית9. לאור היבטים אלה, נעשה שימוש בחומרים שונים בעלי תאימות ביולוגית כדי לייצר אתה-PMs 10,11. ה-PMs הניתנים לתכנון יחד עם תאים מציעים הידבקות מצוינת, חוזק מכני ניכר וחלונות מחוברים מאוד, שיכולים לשפר את התפשטות התאים לתיקון רקמות פגומות12. בהקשר זה, טכנולוגיות שונות פותחו גם כדי לייצר כדורים נקבוביים13,14. מצד אחד, PMs הופקו באמצעות חומרים יוצרי גז, כגון NH4HCO3, אשר רוסנו עקב קישוריותמספקת 15,16,17. מאידך גיסא, PMs נגזו ישירות לאחר אמולסיפיקציה, מה שהוביל לפולידיספרס PMs18. בסופו של דבר, הטכנולוגיה המיקרופלואידית של הטיפות המבוססת על גישת האמולסיה-טמפלציה היא אולי שיטה יעילה לבניית PMs, מכיוון שלעתים קרובות היא גורמת לחלקיקים בגודל אחיד19. יש לציין כי התכונות המורפולוגיות של המיקרוספרות תלויות לעתים קרובות באיכות טיפות האמולסיה הנוצרות (כלומר, מים בשמן, W/O, או שמן במים, O/W), אשר עשויות להשפיע באופן משמעותי על תכונות הביו-חומרים20. ראוי לציין כי ניתן ליישם את הפלטפורמה המיקרופלואידית שתוכננה מראש כדי ליצור את המיקרופייברים או המיקרוספרות. לדוגמה, Yu et al. הדגימו ייצור של מבנים מיקרו-פיסיביים עמוסי תאים המבוססים על פלטפורמות מיקרופלואידיות מבוססות נימים, אשר יכולות לשמש להרכבת רשתות תאיות לחיקוי רקמות טבעיות21. במקרה אחר, Ye et al. ייצרו מיקרו-קפסולות גבישים פוטוניים על ידי שכפול תבנית של חרוזי גביש קולואידיים סיליקה באמצעות טכנולוגיות מיקרופלואידיות, שיכלו להתגבר על מגבלות רבות של טכניקות עכשוויות הדורשות תיוג מורכב ומנגנון ספציפי22.
ואכן, הרציונל מאחורי השימוש בטכניקה זו נובע מיתרונות שונים, כגון היותה נוחה באופיה, שאינה דורשת ציוד מתוחכם, והנוחות שלה בסינתזה של PMs בגודל אחיד ליישומי אספקת תאים ורפואה רגנרטיבית. בהקשר זה, עם רכיבים שתוכננו מראש של תחליב-טמפלאט, ניתן לקבל בנוחות PMs עם נקבוביות גבוהות וקישוריות מהתקן מיקרופלואידי המורכב מצינורות פולי(ויניל כלוריד) (PVC), נימי זכוכית ומחט. תחליב-מבשר W/O מוכן על ידי הומוגניזציה של תמיסה מימית של ג'לטין ותמיסה אורגנית של PLGA. על ידי הזרקה סלקטיבית של החלק הישים של האמולסיה לתוך הפלטפורמה המיקרופלואידית, ה- PMs עם גדלי חלקיקים אחידים ונקבוביות מחוברות זו לזו לאורך פני השטח לפנים מפוברקים. הפרוטוקול הנוכחי נועד לייצר את ה-PLGA-HOPMs על ידי תחליב-טמפלינג בפלטפורמה המיקרופלואידית. ההערכה היא כי פרוטוקול זה מאפשר ייצור ניתן לשחזור של PLGA-HOPMs ועשוי להיות ישים בתחומים הקשורים שלהם של הנדסת רקמות ובדיקת תרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרונות
- הכינו את תמיסת מלאי ה-PVA מראש על ידי חימום תמיסת ה-PVA באמבט מים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הכנסתה למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לקרר לטמפרטורת החדר (RT) לשימוש ניסיוני.
- הכן את תחליב-מבשר על ידי הוספת תמיסת הג'לטין המימית (1 מ"ל, 7.5%, w/v) לשלב האורגני של PLGA (2 מ"ל, 2%, w/v בדיכלורומתאן, DCM) (ראה טבלת חומרים).
הערה: באופן כללי, טכנולוגיה מיקרופלואידית כוללת שלבים שונים ליצירת המיקרוספרות. השלב הרציף או האיסוף מורכב מפולי מימי (אלכוהול ויניל) (PVA, 600 מ"ל, 1%, w/v).
2. הרכבה וייצור של מכשירים מיקרופלואידיים טיפתיים של PLGA-HOPMs
הערה: הפריטים המתכלים הדרושים להרכבה זו מפורטים בטבלת החומרים.
- התאם אישית את מכלול מחולל הטיפות.
- בנה גנרטור מיקרופלואידי בזרימה משותפת באמצעות נימי זכוכית (OD, 1 מ"מ), צינורות PVC (ID, 1 מ"מ) ומחט חלוקה של 26 גרם.
- חבר את נימי הזכוכית לקצה צינור ה- PVC ולאחר מכן נקב עם מחט בחיבור של המבנה הנ"ל.
- מניחים את הקצה השני של צינור ה-PVC בפאזה הרציפה במהלך יצירת הטיפות. באמצעות דבק UV, יש לאטום את המרווחים במפרק לאחר הריפוי.
הערה: יש לכופף את המחט בצורה מעוקלת כ-45° לצורך פירסינג נוח בצינור ה-PVC, ונקודת המחט נמתחה לתוך הצינור הנימי כדי ליצור את המבנה הקואקסיאלי.
- הכינו את הפלטפורמה המיקרופלואידית הטיפה.
- השתמשו בשתי משאבות מזרק, כפי שמוצג באיור 1. השתמש במזרק של 50 מ"ל כדי לטעון את הפאזה הרציפה ובמזרק של 5 מ"ל ליצירת תחליב.
- הגדר את קצבי הזרימה של שלבי הרציף והפיזור ב-2 מ"ל/דקה ו-0.08 מ"ל/דקה, בהתאמה.
- הניחו בגודל 500 מ"ל באמבט קרח ומלאו אותה בתמיסה מימית PVA מקוררת מראש (שלב 1.1).
הערה: קצה נימי הזכוכית חייב להיות שקוע בשלב האיסוף. מומלץ לערבב (שעה, 60 סל"ד) את הסופר-נטנט של שלב האיסוף עם מוט הזכוכית לאחר היווצרות טיפות האמולסיה בפלטפורמה. טיפות תחליב מיוצרות בקצה נקודת המחט. באופן כללי, מד המחט משפיע על גודל ה- PMs, שבו המד הקטן יותר מתאים לגודל הקטן יותר של PMs. יתר על כן, קוטר הנקבוביות מתואם בעיקר לריכוז הפורוגן, המסוגל לעלות עם ריכוז הג'לטיןהמתאים 1.
- בצע את התחליב ואת יצירת טיפות.
- הכן את האמולסיה לפי השלבים הבאים.
- הכן את התחליב על ידי פירוק מיידי של תמיסת הג'לטין המימית לתמיסת DCM של PLGA (שלב 1.2) ותחליב באמצעות ההתקן העל-קולי (ראה טבלת חומרים).
- התאם את ההספק העל-קולי ל-400 W, והגדר את זמן העיבוד הכולל כ-90 שניות (מרווח 2 שניות, טיפול על-קולי 1 שניות), בליווי שינוי מתמיד של מיקום הבדיקה באופן ידני.
- ייצוב התחליב המתקבל עבור יניקה מזרק ויצירת טיפות תוך כ-20 דקות.
הערה: מקם את הבדיקה של מפסק התאים העל-קוליים בממשק שמן-מים. מומלץ לא לתת לבדיקה הקולית ליצור קשר עם המיכל.
- בצע את יצירת הטיפות.
- טען את האמולסיה המוכנה (שלב 2.3.1) במהירות במזרק 5 מ"ל של הפלטפורמה המיקרופלואידית לאחר טיפול קולי.
- הכנס את תחליב ה-W/O הלא יציב (שנמצא במהלך הפרדת פאזה) לתוך ההתקן המיקרופלואידי כפאזה הלא רציפה. יחד עם זאת, השתמש בתמיסה המימית של PVA כפאזה הרציפה.
- לאסוף את המיקרוספרות המכילות את האמולסיה בתחתית האיסוף (PVA, 1%, w/v) לאחר הזרקת חלקים מתאימים של האמולסיה לתוך המכשיר המיקרופלואידי.
- מניחים את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לייצוב נוסף.
- שטפו וליאופיליזציה את המיקרוספרות המוכנות (PLGA-HOPMs) בהתאם לשלבים הבאים.
הערה: ה- PLGA-HOPMs שנוצרו מכילים נקבוביות שרירותיות על הפנים ועל פני השטח.- אחסנו את המיקרוספרות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני הנרמול ל-RT וערבבו במוט זכוכית (שעה, 60 סל"ד) כדי לחסל את שאריות ה-DCM.
- סננו בזהירות את שלב האיסוף בכוס של 500 מ"ל, ושטפו את המיקרוספרות שנאספו שלוש פעמים במים שעברו דה-יוניזציה כדי לשטוף את שאריות ה-PVA על פני השטח של PMs.
- הניחו את המיקרוספרות של PLGA באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להמיס את הג'לטין העטוף בעמוד השדרה של PLGA.
- יש לשטוף את ה-PLGA-HOPMs המתקבלים פעמיים במים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר את שאריות הג'לטין ולקרר מראש לליופיליזציה בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות.
- אחסנו את ה-PLGA-HOPMs היבשים בטמפרטורה של -20°C לניסויים נוספים.
- הכן את האמולסיה לפי השלבים הבאים.
3. הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
- הפקידו PLGA-HOPMs על שלב הדגימה של SEM (ראו טבלת חומרים) ב-RT והכניסו את שלב הדגימה לתא הפיזור של מפזר המגנטרון. הפעל את השנאי והמגנטרון בזה אחר זה. הציגו את הדגימה ל-SEM לאחר שהייתה מצופה בזהב למשך דקה אחת.
- השג את תמונות ה- SEM על ידי הגדרת מתח התאוצה ב- 5 kV.
- בנוסף, כמת את גודל החלקיקים של PLGA-HOPMs באמצעות 100 PMs בשדה המשתנה של הדמיית SEM. מדוד את התוצאה המייצגת כדי לכמת את התפלגות גודל הנקבוביות.
- פתח את הגרפיקה עם תמונה J והשתמש ב"קו ישר "כדי להתאים לסרגל קנה המידה של תמונת ה- SEM, מה שגורם לתוכנה לזהות פיקסל לאורך.
- לחץ על נתח > להגדיר קנה מידה, להגדיר את "מרחק ידוע" לסרגל קנה המידה של התמונה SEM, ולחץ על > הכללית אישור.
- לחץ על נתח > כלים > מנהל ROI ... כדי למדוד את גודל הנקבובית או החלקיקים של PLGA PMs ולחץ על הוסף אותו. מדוד את מספר הדגימות בהתבסס על הדרישה.
- לחץ על מדידה כדי לקבל את הנתונים הכמותיים של הגרפיקה לחישוב נוסף.
4. תרבית תאים והדמיית פלואורסצנציה
הערה: תאי גזע מזנכימליים של מח עצם חולדה (BMSCs) שימשו לעבודה הנוכחית. התאים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
- תרבית את התאים במדיום הנשר המהונדס של דולבקו בתוספת L-גלוטמין (DMEM/F-12), סרום בקר עוברי 10% (v/v) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה של התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
- מעבירים את ה-BMSCs של החולדות ביחס של 1:2 לאחר שהגיעו ל-90% מהמפגש.
- בצע הידבקות תאים בהתאם לשלבים הבאים.
- דגרו את ה-PLGA-HOPMs עם אלכוהול אתילי (5 מ"ל, 70%, v/v) וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 10 דקות ב-RT כדי לעקר.
- שטפו את ה-PLGA-HOPMs המעוקרים פעמיים בתמיסת חיץ פוספט.
- דגירה של ה-HOPMs (חמישה במספר) עם מתלה התא (5 מ"ל, 1 x 105 תאים /מ"ל) בצינור צנטריפוגה סטרילי (50 מ"ל) תחת תרבית דינמית להידבקות BMSCs ל-PLGA-HOPMs.
- בצע את התרבית הדינמית בשייקר אספטי תרמוסטטי (37 °C, 90 סל"ד) על ידי הצבת צינור צנטריפוגה אטום של 50 מ"ל בשייקר (ראה טבלת חומרים).
הערה: התרבית הדינמית מתכוונת לשפר את קצב ההיצמדות של BMSCs על הפיגומים, במקום לדגור ישירות את ה- PMs והתאים על צלחת הפלסטיק. התאים ו- PLGA PMs מתווספים לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל, דגירה של הצינור בשייקר אספטי תרמוסטטי (37 מעלות צלזיוס, 90 סל"ד) והחלפת המדיה כל יומיים.
- בצע את בדיקת הכתם הכפול החי והמת.
- שטפו את ה-PMs עמוסי התאים שלוש פעמים כדי להפוך את ה-BMSCs ללא חיבור ל-PLGA-HOPMs.
- הנח את ה-PMs עמוסי התאים על צלחת תחתית הזכוכית בקוטר 35 מ"מ. הוסף 1 מ"ל של חיץ צביעה (ראה טבלת חומרים), כולל 1 μL של calcein-AM ופרופידיום יודיד (PI), בהתאמה, לדגימה שטופה מראש על-ידי PBS.
- הערך את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (ראו טבלת חומרים). הפעל את אור העירור של 488 ננומטר ו-552 ננומטר בגלאי המתאים. לניתוח שכבת-על z, הגדר את ה-z-wide כדי ללכוד את השכבות השונות של הדגימה על ידי תנועת ציר z של המיקרוסקופ.
הערה: ראוי לציין כי ניתן להשתמש בכתמים האחרים כראוי לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתבסס על עבודה קודמת שביצעה אופטימיזציה של הפרמטרים העיקריים1, PLGA הומסה בממס DCM הניתן לאידוי. תחליב ה- W/O הראשוני הוכן על ידי הומוגניזציה עם ג'לטין תחת טיפול בדיקה קולי. המבנה הזורם המשותף המותאם אישית הורכב בצורה פשטנית, שבה נעשה שימוש במזרק כדי להציג את הזרימות ללא הרף. יתר על כן, בוצעו הליכי שטיפה מספיקים כדי לסלק PVA וג'לטין של מיקרוספרות PLGA (איור 1A, איור משלים 1A,B). לאחר מכן, התכונות המורפולוגיות של PLGA-HOPMs נצפו על ידי הדמיית SEM. נצפה כי ה-PLGA-HOPMs הציגו גדלים גדולים (350-500 מיקרומטר) עם נקבוביות בגודל שרירותי (10-100 מיקרומטר) וחלונות מחוברים זה לזה, מה שיכול להקל על יעילות גבוהה בהובלת חמצן/פסולת מטבולית (איור 1B). תוצאות מורפולוגיות אלה היו בהסכמה עם התוצאות המדווחות1.
כהוכחת היתכנות, ה-BMSCs שימשו לתרבות מהוססת בתוך ה-PLGA-HOPMs. הוא האמין כי המבנה הפנימי של PMs יכול לאפשר לתאים להיצמד ולהבטיח את ההתרבות במהלך תרבית דינמית8. בנוסף, הרציונל לבחירת BMSCs הוא שתאים אלה מאופיינים בהתמיינות רב קוטבית ותיקון רקמות פגומות, והם גם משמשים בדרך כלל לחקר ההתנהגות הביולוגית של חומרים ביו-אקטיביים שונים23. ה-BMSCs שימשו לבניית מיקרו-רקמות במבחנה עם המיקרוספרות ודמיינו את התפלגות התאים ואת מצב ההישרדות שלהם על-ידי ניתוח z של CLSM (איור 1C). נצפה כי מספר גדול של תאים דבקו בפיגומים ב-1 d, והפלואורסצנציה הירוקה נשמרה, המייצגת יכולות הידבקות ונדידה נרחבות של תאים ב-PLGA-HOPMs. הציטופלסמה צולמה בעקיפין עם כתם קלצין-AM מכיוון שקבוצת אסטר אצטוקסימתיל (AM) מספקת הידרופוביות משופרת ומקלה על החדירה דרך קרום התא החי. למרות שלקלצין-AM אין פלואורסצנציה, הוא יכול לעבור הידרוליזה על ידי האסטראז האנדוגני באופן תוך-תאי כדי ליצור את המולקולה הקוטבית קלצ'ין עם מטען שלילי חזק ולפלוט פלואורסצנציה ירוקה חזקה24. לכן, הציטופלסמה מודגמת בעקיפין באמצעות צביעת קלצין-AM (איור 1C, איור משלים 1C).
איור 1: ייצור ותאימות ציטו-תאימות של PLGA-HOPMs. (A) המחשה סכמטית של ייצור ה-PLGA-HOPMs. (B) קוטר הנקבוביות של PMs מבוסס על הדמיית SEM (10-100 מיקרומטר). סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) צביעה חיה (calcein-AM, ירוקה) ומתה (פרופידיום יודיד, PI, אדום) של BMSCs מתורבתים עם PLGA-HOPMs במשך 24 שעות. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: איורים של הפלטפורמה המיקרופלואידית האמיתית, תחליב והדמיה בין-שכבתית של PLGA-HOPMs עמוסי תאים. (A) סכימה של פלטפורמת מיקרופלואידיקה טיפתית אמיתית. (B) תחליב מבשר על ידי טיפול אולטרסאונד. (C) השכבה המשולבת של כתמים חיים ומתים של BMSCs יחד עם PLGA-HOPMs במשך 24 שעות. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר אסטרטגיה יעילה לייצור ארכיטקטורות מבוססות PLGA, כלומר PLGA-HOPMs. יש לציין כי יש לנקוט בזהירות במספר צעדים קריטיים, כולל הימנעות מהתנשאות ממס של PLGA והתאמה עדינה של הכוח הקולי למצב המטרה במהלך הכנת התחליב. בנוסף, מוצא נוזלי של מזרק 20 מ"ל יכול להיות מותאם במידה מסוימת כדי לפתור את הפרדת הפאזה של מבשרי מתחלב. עם זאת, מגבלה היא שמכיוון שמצב הפורוגן מושפע מטמפרטורת הסביבה, יציבות התחליב עשויה להיות בלתי רצויה. יחד, ההרכבה הנוחה של הפלטפורמה המיקרופלואידית הטפטפת יכולה להקל באופן משמעותי על ייצור מיקרוג'לים עמוסי תאים ליישומי הנדסת רקמות וסינון תרופות. PLGA מיושמת לעתים קרובות ככלי משלוח בייצור מיקרוספרות מכיוון שהיא סחורה למשלוח תרופות25 שאושרה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA). בנוסף, פוליאסטר אליפטי מציע תכונות השפלה לא מזיקות באמצעות הידרוליזה או במבחנה או in vivo, אשר תלוי בשיעור של חומצת לקטיד וחומצה גליקולית במהלך הליכי סינתזה26.
כדי לייצר PLGA-HOPMs, הפאזות המימיות והאורגניות היו הומוגניות ליצירת תחליב W/O באמצעות הגשושית העל-קולית. לאחר מכן, תחליב ה-W/O הוכנס למכשיר המיקרופלואידי של הטיפות והתפתח לטיפות מים בשמן במים (W/O/W) בקצה המחט (איור 1A, איור משלים 1A, B). ניתן היה למצק את טיפות ה-W/O/W המתקבלות על ידי חילוץ ואידוי DCM בשלב האיסוף. שלב האיסוף המקורר מראש באמבט קרח יכול לאפשר לג'לטין להישאר במצב של ג'ל רך, תוך שמירה ישירה על התחליב המפוזר היטב במהלך אידוי הממס, וכתוצאה מכך PLGA-HOPMs לאחר ליופיליזציה נוספת (איור 1B).
בנוסף, שיטת התחליב-טמפלציה מכילה ממיסים אורגניים נדיפים, אשר ניתן להסיר על ידי נדידה. כמו כן, ניתן להסיר כמעט לחלוטין את שאריות ה- DCM ב- PLGA-HOPMs, בחישוב ממדידת כרומטוגרפיית גז2. יתר על כן, הטכנולוגיה המיקרופלואידית לא תשפיע על תאימות הציטו/תאימות הביולוגית של PLGA. למעשה, ה-PLGA-HOPMs שגודלו בתרבית עם BMSCs של חולדות הראו שמספר התאים החיים היה נרחב, עם מעט תאים מתים והמורפולוגיה המתוחה. יתר על כן, ציטופלסמה יכולה להיות מדומיינת על ידי צבע פלואורסצנטי חי, המציין מתיחה על HOPMs.
יחד, PLGA-HOPMs בעלי תכונות מורפולוגיות מצוינות יכולים לעמוד בדרישות הנוגעות להידבקות תאית ויכולות התפשטות ברחבי ה- HOPMs להתחדשות רקמות ויישומים ביו-רפואיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK ו- AZC מכירים בתמיכה כספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, 32071323, 81971734 ו- U1605225) ותוכנית לצוות מחקר חדשני במדע וטכנולוגיה באוניברסיטת מחוז פוג'יאן. YSZ לא נתמך על ידי אף אחת מתוכניות אלה ולא קיבל תשלום מכל סוג שהוא; במקום זאת, תמיכה ממכון המחקר בריגהם זוכה להכרה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
