Summary
Het huidige protocol beschrijft de fabricage van op poly (melkzuur-co-glycolzuur) gebaseerde zeer open poreuze microsferen (HOPM's) via de op single-emulsieformulering gebaseerde facile microfluïdische technologie. Deze microsferen hebben potentiële toepassingen in tissue engineering en drugsscreening.
Abstract
Vergeleken met bulksteigers en directe injectie van cellen alleen, hebben de injecteerbare modulaire eenheden enorme interesse gewekt in het repareren van slecht functionerende weefsels vanwege het gemak in de verpakking van cellen, verbeterde celretentie en minimale invasiviteit. Bovendien zou de poreuze conformatie van deze microschaaldragers de mediumuitwisseling kunnen verbeteren en het niveau van voedingsstoffen en zuurstofvoorraden kunnen verbeteren. De huidige studie illustreert de handige fabricage van poly (melkzuur-co-glycolzuur) -gebaseerde zeer open poreuze microsferen (PLGA-HOPMs) door de gemakkelijke microfluïdische technologie voor celafgiftetoepassingen. De resulterende monodispersed PLGA-HOPMs bezaten deeltjesgroottes van ~ 400 μm en open poriën van ~ 50 μm met onderling verbonden vensters. In het kort werden de geëmulgeerde oliedruppels (PLGA-oplossing in dichloormethaan, DCM), omwikkeld met de 7,5% (w /v) gelatine waterige fase, geïntroduceerd in de 1% (w / v) continu stromende poly (vinylalcohol) (PVA) waterige oplossing door het coaxiale mondstuk in de aangepaste microfluïdische opstelling. Vervolgens werden de microsferen onderworpen aan oplosmiddelextractie en lyofilisatieprocedures, wat resulteerde in de productie van HOPM's. Met name verschillende formuleringen (concentraties van PLGA en porogeen) en verwerkingsparameters (emulgerende kracht, naaldmeter en stroomsnelheid van gedispergeerde fase) spelen een cruciale rol in de kwaliteiten en kenmerken van de resulterende PLGA HOPMs. Bovendien kunnen deze architecturen mogelijk verschillende andere biochemische signalen inkapselen, zoals groeifactoren, voor uitgebreide medicijnontdekking en weefselregeneratietoepassingen.
Introduction
Celbeladen microsferen bieden gunstige voordelen, zoals verbeterde celretentiecapaciteit in situ, efficiënte levering van cellen en het daaropvolgende vermogen van celproliferatie in vivo1. Tot op heden zijn tal van onderzoeken naar voren gebracht voor het ontwikkelen van een succesvolle steigerstructuur ter ondersteuning van een gunstige omgeving voor cellen voor weefselregeneratie of medicijnscreeningtoepassingen2. De hypoxieomgeving is echter vaak onvermijdelijk in het interieur vanwege onvoldoende toevoer van voedingsstoffen / zuurstof en metabole afvalophoping3. Om deze problemen te overwinnen, zijn zeer poreuze microsferen (PM's) ontwikkeld met behulp van verschillende biomaterialen 4,5,6. Bovendien lijden de steigers in dynamische cultuur aan overmatige schuifspanning7 en kan de onstabiele toestand van het kweekmedium de betrouwbaarheid van PM's verbreken. Als alternatief kan poly (melk-co-glycolzuur) (PLGA) worden gebruikt om PM's met een goede mechanische sterkte voor dynamische cultuur te verwerken1. We toonden bijvoorbeeld co-injectie van muismyoblast (C2C12)-beladen PLGA zeer open PM's (HOPM's) en menselijke navelstrengatheliale cel (HUVEC)-beladen poly (ethyleenglycol) holle microstaafjes om volumetrisch spierverlies te genezen, waardoor een opmerkelijke verbetering van in situ skeletspierregeneratiewordt bereikt 8.
Met name PM's worden gekenmerkt door grote oppervlakten en hoge porositeiten, wat van specifiek belang is voor celadhesie en groei naar minimaal invasieve celafgifte9. Met het oog op deze aspecten zijn verschillende biocompatibele materialen gebruikt om de PM's10,11 te fabriceren. Deze ontwerpbare PM's gecocultureerd met cellen bieden een uitstekende hechting, aanzienlijke mechanische sterkte en sterk onderling verbonden vensters, die de celproliferatie voor het repareren van beschadigde weefsels kunnen verbeteren12. In dit verband zijn ook verschillende technologieën ontwikkeld om poreuze bollen te fabriceren13,14. Aan de ene kant werden PM's geproduceerd met behulp van gasvormende middelen, zoals NH4HCO3, die werden beperkt vanwege onvoldoende interconnectiviteit 15,16,17. Aan de andere kant werden PM's direct geschoren na emulgering, wat leidde tot polydisperse PM's18. Uiteindelijk is de druppelmicrofluïdische technologie op basis van de emulsie-templatingbenadering misschien een efficiënte methode voor het construeren van PM's, omdat het vaak resulteert in deeltjes van uniforme grootte19. Met name de morfologische eigenschappen van de microsferen zijn vaak afhankelijk van de kwaliteit van de gegenereerde emulsiedruppels (d.w.z. water-in-olie, W / O of olie-in-water, O / W), die de kenmerken van de biomaterialen aanzienlijk kunnen beïnvloeden20. Het is vermeldenswaard dat het vooraf ontworpen microfluïdische platform kan worden toegepast om de microvezels of microsferen te genereren. In een geval toonden Yu et al. de productie aan van met cellen beladen microfibrousstructuren op basis van capillaire microfluïdische platforms, die kunnen worden gebruikt om cellulaire netwerken samen te stellen voor het nabootsen van natuurlijke weefsels21. In een ander geval fabriceerden Ye et al. fotonische kristalmicrocapsules door de sjabloonreplicatie van silica colloïdale kristalparels door middel van microfluïdische technologieën, die veel beperkingen van de huidige technieken die complexe etikettering en specifieke apparatuur vereisen, zouden kunnen overwinnen22.
Inderdaad, de redenering achter het gebruik van deze techniek is te wijten aan verschillende voordelen, zoals gemakkelijk van aard zijn, geen geavanceerde apparatuur vereisen, en het gemak ervan bij het synthetiseren van PM's van uniforme grootte voor celafgifte en regeneratieve geneeskundetoepassingen. In deze context kunnen PM's met hoge porositeiten en interconnectiviteit met vooraf opnieuw ontworpen componenten van emulsie-templating gemakkelijk worden verkregen uit een microfluïdisch apparaat dat is samengesteld uit poly (vinylchloride) (PVC) buizen, een glazen capillair en een naald. Een W/O-emulsie-precursor wordt bereid door een waterige oplossing van gelatine en een organische oplossing van PLGA te homogeniseren. Door selectief het toepasselijke deel van de emulsie in het microfluïdische platform te injecteren, worden de PM's met uniforme deeltjesgroottes en onderling verbonden poriën over het hele oppervlak naar het binnenste vervaardigd. Het huidige protocol heeft tot doel de PLGA-HOPM's te fabriceren door emulsie-templating in het microfluïdische platform. Er wordt aangenomen dat dit protocol reproduceerbare productie van PLGA-HOPM's mogelijk maakt en mogelijk toepasbaar zal zijn op hun gerelateerde gebieden van tissue engineering en geneesmiddelenscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van oplossingen
- Bereid de PVA-stamoplossing van tevoren door de PVA-oplossing in een waterbad van 80 °C te verwarmen en vervolgens bij 4 °C in de koelkast te plaatsen. Koel af tot kamertemperatuur (RT) voor experimenteel gebruik.
- Bereid de emulsie-precursor door de waterige gelatine-oplossing (1 ml, 7,5%, w/v) toe te voegen aan de organische fase van PLGA (2 ml, 2%, w/v in dichloormethaan, DCM) (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Over het algemeen omvat microfluïdische technologie verschillende fasen om de microsferen te vormen. De continue of verzamelfase bestaat uit een waterige poly (vinylalcohol) (PVA, 600 ml, 1%, w / v).
2. Druppel microfluïdische apparaatassemblage en fabricage van PLGA-HOPM's
OPMERKING: De verbruiksartikelen die nodig zijn voor deze assemblage worden vermeld in de materiaaltabel.
- Pas de druppelgeneratorassemblage aan.
- Bouw een co-flow microfluïdische generator met behulp van een glazen capillair (OD, 1 mm), PVC-buizen (ID, 1 mm) en een doseernaald van 26 G.
- Verbind het glazen capillair met het uiteinde van de PVC-buis en prik vervolgens met een naald aan de verbinding van de bovenstaande structuur.
- Plaats het andere uiteinde van de PVC-buis in de continue fase tijdens het genereren van druppels. Gebruik UV-lijm om de openingen bij de verbinding na uitharding af te dichten.
OPMERKING: De naald moet ongeveer 45° gebogen zijn voor een gemakkelijke piercing op de PVC-buis en de naaldpunt moet in de capillaire buis worden gespannen om de coaxiale structuur te vormen.
- Bereid het druppelmicrofluïdische platform voor.
- Gebruik twee spuitpompen, zoals weergegeven in figuur 1. Gebruik een spuit van 50 ml om de continue fase te laden en een spuit van 5 ml voor emulsievorming.
- Stel de stroomsnelheden van de continue en dispersiefase in op respectievelijk 2 ml/min en 0,08 ml/min.
- Plaats een bekerglas van 500 ml in een ijsbad en vul het met een voorgekoelde PVA waterige oplossing (stap 1.1).
OPMERKING: Het uiteinde van het glazen capillair moet worden ondergedompeld in de verzamelfase. Er wordt voorgesteld om het supernatant van de verzamelfase met de glazen staaf te roeren (1 uur, 60 tpm) na de vorming van emulsiedruppels in het platform. Emulsiedruppels worden geproduceerd aan de punt van de naaldpunt. Over het algemeen beïnvloedt de meter van de naald de grootte van PM's, waarbij de kleinere meter overeenkomt met de kleinere maat van PM's. Bovendien is de poriediameter voornamelijk gecorreleerd aan de porogeenconcentratie, die kan toenemen met de juiste gelatineconcentratie1.
- Voer de emulgering en druppelgeneratie uit.
- Bereid de emulsie voor volgens de onderstaande stappen.
- Bereid de emulsie voor door de waterige gelatine-oplossing onmiddellijk in de DCM-oplossing van PLGA te decanteren (stap 1.2) en te emulgeren met behulp van het ultrasone apparaat (zie Materiaaltabel).
- Pas het ultrasone vermogen aan op 400 W en stel de totale verwerkingstijd in op 90 s (interval 2 s, ultrasone behandeling 1 s), vergezeld van het voortdurend handmatig veranderen van de positie van de sonde.
- Stabiliseer de resulterende emulsie voor spuitafzuiging en druppelgeneratie in ongeveer 20 minuten.
OPMERKING: Plaats de sonde van de ultrasone celbreker in de olie-waterinterface. Er wordt voorgesteld om de ultrasone sonde geen contact te laten maken met de container.
- Voer de druppelgeneratie uit.
- Laad de voorbereide emulsie (stap 2.3.1) snel in de spuit van 5 ml van het microfluïdische platform na ultrasone behandeling.
- Introduceer de onstabiele W/O-emulsie (die zich in de loop van de fasescheiding bevindt) in het microfluïdische apparaat als de discontinue fase. Gebruik tegelijkertijd de waterige oplossing van PVA als de continue fase.
- Verzamel de microsferen met de emulsie aan de onderkant van het verzamelbekerglas (PVA, 1%, w/v) na het injecteren van de juiste delen van de emulsie in het microfluïdische apparaat.
- Plaats het monster een nacht op 4 °C voor verdere stabilisatie.
- Spoel en lyofiliseer de voorbereide microsferen (PLGA-HOPMs) volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: De gegenereerde PLGA-HOPM's bevatten willekeurige poriën aan de binnenkant en het oppervlak.- Bewaar de microsferen bij 4 °C voordat u normaliseert naar RT en roer met een glazen staaf (1 uur, 60 tpm) om de resterende DCM te elimineren.
- Filtreer de verzamelfase in het bekerglas van 500 ml zorgvuldig en was de verzamelde microsferen driemaal met gedeïoniseerd water om de resterende PVA op het oppervlak van PM's af te spoelen.
- Plaats de PLGA-microsferen gedurende 30 minuten in het waterbad van 37 °C om de gelatine in de PLGA-ruggengraat op te lossen.
- Spoel de resulterende PLGA-HOPM's tweemaal met het gedeïoniseerde water om de resterende gelatine te verwijderen en koel voor voor oplyofilisatie bij -80 °C gedurende 24 uur.
- Bewaar de droge PLGA-HOPMs bij -20 °C voor verdere experimenten.
- Bereid de emulsie voor volgens de onderstaande stappen.
3. Scanning elektronenmicroscoop (SEM) beeldvorming
- Deponeer PLGA-HOPM's op het monsterstadium van SEM (zie Materiaaltabel) bij RT en plaats de monsterfase in de sputtercel van de magnetronsputter. Schakel de transformator en magnetron één voor één in. Introduceer het monster aan de SEM nadat het gedurende 1 minuut met goud is gesputterd.
- Verkrijg de SEM-beelden door de versnellingsspanning in te stellen op 5 kV.
- Kwantificeer bovendien de deeltjesgrootte van PLGA-HOPM's met behulp van 100 PM's in het variabele veld van SEM-beeldvorming. Meet het representatieve resultaat om de poriegrootteverdeling te kwantificeren.
- Open de afbeeldingen met Afbeelding J en gebruik de "rechte lijn" om overeen te komen met de schaalbalk van de SEM-afbeelding, waardoor de software pixel tot lengte identificeert.
- Klik op analyseren > schaal instellen, stel de "bekende afstand" in op de schaalbalk van de SEM-afbeelding en klik op globaal > OK.
- Klik op analyseren > Tools > ROI manager... om de porie- of deeltjesgrootte van PLGA PM's te meten en klik op toevoegen. Meet het aantal monsters op basis van de vereiste.
- Klik op Meten om de kwantitatieve gegevens van de afbeeldingen te verkrijgen voor verdere berekening.
4. Celkweek en fluorescentie beeldvorming
OPMERKING: Rat beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSC's) werden gebruikt voor het huidige werk. De cellen werden verkregen uit een commerciële bron (zie Materiaaltabel).
- Kweek de cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium aangevuld met L-glutamine (DMEM / F-12), 10% (v / v) foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
- Passeer de BMSC's van de rat in een verhouding van 1: 2 na het bereiken van 90% van de samenvloeiing.
- Voer celadhesie uit volgens de onderstaande stappen.
- Incubeer de PLGA-HOPMs met ethylalcohol (5 ml, 70%, v/v) en centrifugeer op 500 x g gedurende 10 minuten bij RT om te steriliseren.
- Was de gesteriliseerde PLGA-HOPMs tweemaal met fosfaatbufferoplossing.
- Incubeer de HOPM's (vijf in aantal) met de celsuspensie (5 ml, 1 x 105 cellen/ml) in een steriele centrifugebuis (50 ml) onder dynamische cultuur voor BMSCs-hechting op PLGA-HOPM's.
- Voer de dynamische cultuur uit in een thermostatische aseptische shaker (37 °C, 90 tpm) door een afgesloten centrifugebuis van 50 ml in de schudder te plaatsen (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De dynamische cultuur is bedoeld om de hechtingssnelheid van BMSC's op de steigers te verbeteren, in plaats van de PM's en cellen rechtstreeks op de plastic plaat te incuberen. De cellen en PLGA PM's worden toegevoegd aan een steriele centrifugebuis van 50 ml, waarbij de buis wordt geïncubeerd met een thermostatische aseptische shaker (37 °C, 90 rpm) en de media om de 2 dagen worden vervangen.
- Voer de live en dode dual-stain assay uit.
- Spoel de met cellen beladen PM's driemaal voor het eluteren van BMSC's zonder bevestiging aan PLGA-HOPM's.
- Plaats de met cellen beladen PM's op de 35 mm glazen bodemplaat. Voeg 1 ml kleuringsbuffer (zie materiaaltabel), waaronder respectievelijk 1 μL calceïne-AM en propidiumjodide (PI), toe aan het pbs-voorgewassen monster.
- Beoordeel de monsters door middel van confocale laserscanmicroscopie (zie Materiaaltabel). Schakel het excitatielicht van 488 nm en 552 nm in bij de overeenkomstige detector. Voor z-overlay-analyse stelt u de z-breed in om de verschillende lagen van het monster vast te leggen door z-asbeweging van de microscoop.
OPMERKING: Het is vermeldenswaard dat de andere vlekken op de juiste manier kunnen worden gebruikt voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op basis van eerder werk dat de belangrijkste parametersoptimaliseerde 1, werd PLGA opgelost in het verdampingsbare DCM-oplosmiddel. De primaire W /O-emulsie werd bereid door homogeniseren met gelatine onder ultrasone sondebehandeling. De aangepaste co-flow fluidic structuur werd simplistisch geassembleerd, waarbij een spuit werd gebruikt om de stromen constant te introduceren. Bovendien werden voldoende spoelprocedures uitgevoerd om PVA en gelatine van PLGA-microsferen te elimineren (figuur 1A, aanvullende figuur 1A, B). Vervolgens werden de morfologische kenmerken van PLGA-HOPM's waargenomen door SEM-beeldvorming. Er werd waargenomen dat de PLGA-HOPM's grote afmetingen vertoonden (350-500 μm) met willekeurige poriën (10-100 μm) en onderling verbonden vensters, wat een hoge efficiëntie in zuurstof / metabolisch afvaltransport zou kunnen vergemakkelijken (figuur 1B). Deze morfologische resultaten waren in overeenstemming met de gerapporteerde resultaten1.
Als proof-of-concept werden de BMSC's ingezet om voorzichtig te kweken binnen de PLGA-HOPM's. Er werd aangenomen dat de interne structuur van PM's de cellen in staat kon stellen zich te hechten aan en de proliferatie te garanderen tijdens dynamische cultuur8. Bovendien is de reden voor het selecteren van BMSCs dat deze cellen worden gekenmerkt door multipolaire differentiatie en beschadigde weefsels repareren, en ook vaak worden gebruikt om het biologische gedrag van verschillende bioactieve materialen te bestuderen23. De BMSC's werden gebruikt om in vitro microtissues te construeren met de microsferen en gevisualiseerde celverdeling en overlevingstoestand door z-analyse van CLSM (figuur 1C). Er werd waargenomen dat een groot aantal cellen zich in 1 d aan steigers hechtte en de groene fluorescentie werd gehandhaafd, wat uitgebreide hechtings- en migratiemogelijkheden van cellen in PLGA-HOPM's vertegenwoordigt. Het cytoplasma werd indirect in beeld gebracht met calceïne-AM-kleuring, omdat de acetoxymethylester (AM) -groep zorgt voor verbeterde hydrofobiciteit en de penetratie door het levende celmembraan vergemakkelijkt. Hoewel calceïne-AM geen fluorescentie heeft, kan het worden gehydrolyseerd door het endogene esterase intracellulair om het polaire molecuul calceïne met een sterke negatieve lading te genereren en sterke groene fluorescentie uit te zenden24. Daarom wordt het cytoplasma indirect gevisualiseerd met calceïne-AM-kleuring (figuur 1C, aanvullende figuur 1C).
Figuur 1: Fabricage en cytocompatibiliteit van PLGA-HOPM's. (A) Schematische illustratie van de fabricage van de PLGA-HOPM's. (B) De poriediameter van PM's op basis van SEM-beeldvorming (10-100 μm). Schaalbalk = 100 μm. (C) Live (calceïne-AM, groen) en dode (propidiumjodide, PI, rood) kleuring van BMSCs gecocultureerd met PLGA-HOPMs gedurende 24 uur. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Illustraties van het echte microfluïdische platform, emulsie en interlaagbeeldvorming van met cellen beladen PLGA-HOPM's. (A) Schema van het echte druppelmicrofluïdicaplatform. (B) W/O-precursor geëmulgeerd door ultrasone behandeling. (C) De tussenlaag van levende en dode kleuring van BMSCs gecocultureerd met PLGA-HOPM's gedurende 24 uur. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een efficiënte strategie om PLGA-gebaseerde architecturen te fabriceren, namelijk de PLGA-HOPMs. Opgemerkt moet worden dat verschillende kritieke stappen zorgvuldig moeten worden genomen, waaronder het vermijden van oplosmiddelvervluchtiging van PLGA en een zachte aanpassing van het ultrasone vermogen aan de doelpositie tijdens de voorbereiding van de emulsie. Bovendien kan de vloeistofuitlaat van de spuit van 20 ml tot op zekere hoogte worden aangepast om de fasescheiding van geëmulgeerde precursoren op te lossen. Een beperking is echter dat, aangezien de toestand van porogeen wordt beïnvloed door de omgevingstemperatuur, de stabiliteit van de emulsie ongewenst kan zijn. Samen kan de handige assemblage van het druppelmicrofluïdische platform de fabricage van celbeladen microgels voor weefseltechnologie en medicijnscreeningtoepassingen aanzienlijk vergemakkelijken. PLGA wordt vaak toegepast als een leveringsvoertuig bij het fabriceren van microsferen, omdat het een door de Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurde grondstof voor medicijnafgifte is25. Bovendien biedt het alifatische polyester onschadelijke afbraakattributen via hydrolyse in vitro of in vivo, die afhankelijk is van het aandeel lactidezuur en glycolzuur tijdens syntheseprocedures26.
Om PLGA-HOPMs te fabriceren, werden de waterige en organische fasen gehomogeniseerd om een W / O-emulsie te vormen met behulp van de ultrasone sonde. Vervolgens werd de W/O-emulsie ingebracht in het microfluïdische druppelapparaat en evolueerde naar water-in-olie-in-water (W/O/W) druppeltjes aan de naaldpunt (figuur 1A, aanvullende figuur 1A, B). De verkregen W/O/W druppeltjes konden worden gestold door DCM in de verzamelfase te extraheren en te verdampen. De voorgekoelde opvangfase in een ijsbad zou ervoor kunnen zorgen dat de gelatine in de zachte geltoestand blijft, waarbij de goed verdeelde emulsie direct behouden blijft tijdens oplosmiddelverdamping, wat resulteert in de PLGA-HOPM's na verdere lyofilisatie (figuur 1B).
Bovendien bevat de emulsie-templatingsmethode vluchtige organische oplosmiddelen, die door vervluchtiging kunnen worden verwijderd. Ook kon het residu van DCM in de PLGA-HOPM's bijna volledig worden verwijderd, berekend op basis van gaschromatografiemeting2. Bovendien zou de microfluïdische technologie de cyto/biocompatibiliteit van PLGA niet beïnvloeden. In feite toonden de PLGA-HOPM's gekweekt met BMSC's van ratten aan dat het aantal levende cellen uitgebreid was, met slechts een paar dode cellen en de uitrekkende morfologie. Bovendien kon cytoplasma worden afgebeeld door de levende fluorescerende kleurstof, wat duidt op uitrekken op de HOPM's.
Samen kunnen PLGA-HOPM's met uitstekende morfologische eigenschappen voldoen aan de vereisten met betrekking tot cellulaire adhesie en verspreidingscapaciteiten in de HOPM's voor weefselregeneratie en verschillende biomedische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK en AZC erkennen financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 en U1605225) en het Programma voor innovatief onderzoeksteam in wetenschap en technologie aan de Fujian Province University. YSZ werd niet ondersteund door een van deze programma's en ontving geen betaling van welke aard dan ook; in plaats daarvan wordt de steun van het Brigham Research Institute erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
