Summary
Bu protokol, tek emülsiyon formülasyonuna dayalı kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (HOPM'ler) üretimini açıklamaktadır. Bu mikrosferlerin doku mühendisliği ve ilaç taramasında potansiyel uygulamaları vardır.
Abstract
Toplu iskeleler ve tek başına hücrelerin doğrudan enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, enjekte edilebilir modüler üniteler, hücrelerin paketlenmesindeki kolaylık, gelişmiş hücre tutma ve minimum invazivlik nedeniyle arızalı dokuların onarımında büyük ilgi görmüştür. Dahası, bu mikro ölçekli taşıyıcıların gözenekli konformasyonu, orta değişimi artırabilir ve besin ve oksijen kaynaklarının seviyesini artırabilir. Bu çalışma, hücre dağıtım uygulamaları için kolay mikroakışkan teknolojisi ile poli(laktik-ko-glikolik asit) bazlı yüksek açık gözenekli mikrosferlerin (PLGA-HOPM'ler) uygun şekilde üretilmesini göstermektedir. Ortaya çıkan monodispers PLGA-HOPM'lar, ~400 μm'lik parçacık boyutlarına ve birbirine bağlı pencerelerle ~50 μm'lik açık gözeneklere sahipti. Kısaca,% 7.5 (w / v) jelatin sulu faz ile sarılmış emülsifiye yağ damlacıkları (diklorometan, DCM'deki PLGA çözeltisi), özelleştirilmiş mikroakışkan kurulumdaki koaksiyel nozul aracılığıyla% 1 (w / v) sürekli akan poli (vinil alkol) (PVA) sulu çözeltiye sokulmuştur. Daha sonra, mikrosferler çözücü ekstraksiyonu ve liyofilizasyon prosedürlerine tabi tutuldu ve bu da HOPM'lerin üretilmesiyle sonuçlandı. Özellikle, çeşitli formülasyonlar (PLGA ve porojen konsantrasyonları) ve işleme parametreleri (emülsifiye edici güç, iğne göstergesi ve dağınık fazın akış hızı), ortaya çıkan PLGA HOPM'ların niteliklerinde ve özelliklerinde çok önemli roller oynamaktadır. Dahası, bu mimariler, genişletilmiş ilaç keşfi ve doku rejenerasyonu uygulamaları için büyüme faktörleri gibi çeşitli diğer biyokimyasal ipuçlarını potansiyel olarak kapsülleyebilir.
Introduction
Hücre yüklü mikrosferler, in situ hücre tutma kapasitesinin artması, hücrelerin verimli bir şekilde verilmesi ve ardından in vivo1 hücre çoğalmasının kabiliyeti gibi olumlu avantajlar sunar. Bugüne kadar, doku rejenerasyonu veya ilaç tarama uygulamaları için hücreler için elverişli bir ortamı desteklemek üzere başarılı bir iskele yapısı geliştirmek için çok sayıda araştırma yapılmıştır2. Bununla birlikte, hipoksi ortamı, yetersiz besin / oksijen kaynağı ve metabolik atık birikimi nedeniyle iç mekanlarda çoğu zaman kaçınılmazdır3. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çeşitli biyomalzemeler kullanılarak yüksek gözenekli mikrosferler (PM'ler) geliştirilmiştir 4,5,6. Ek olarak, dinamik kültürde, iskeleler aşırı kesme gerilmesi7'den muzdariptir ve kültür ortamının dengesiz durumu PM'lerin doğruluğunu bozabilir. Alternatif olarak, dinamik kültür1 için iyi mekanik mukavemete sahip PM'leri işlemek için poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) kullanılabilir. Örneğin, hacimsel kas kaybını iyileştirmek için fare miyoblastı (C2C12) yüklü PLGA yüksek derecede açık PM'ler (HOPM'ler) ve insan göbek damarı endotel hücresi (HUVEC) yüklü poli (etilen glikol) içi boş mikroçubukların birlikte enjeksiyonunu gösterdik ve in situ iskelet kası rejenerasyonunda kayda değer bir iyileşme sağladık8.
Özellikle, PM'ler geniş yüzey alanları ve yüksek gözeneklilikler ile karakterizedir, bu da minimal invaziv hücre dağıtımına yönelik hücre yapışması ve büyümesi için özel bir ilgi alanıdır9. Bu hususlar ışığında, PMs10,11'in imalatında çeşitli biyouyumlu malzemeler kullanılmıştır. Hücrelerle birlikte kültürlenmiş bu tasarlanabilir PM'ler, hasarlı dokuların onarımı için hücre proliferasyonunu artırabilecek mükemmel yapışma, önemli mekanik mukavemet ve yüksek oranda birbirine bağlı pencereler sunar12. Bu bağlamda, gözenekli küreleri imal etmek için çeşitli teknolojiler de geliştirilmiştir13,14. Bir yandan, PM'ler, yetersiz ara bağlantı15,16,17 nedeniyle kısıtlanan NH4HCO3 gibi gaz oluşturucu ajanlar kullanılarak üretildi. Öte yandan, PM'ler emülsifikasyondan sonra doğrudan kesildi ve bu da PM'lerin18'ini polidisperse etmesine yol açtı. Sonunda, emülsiyon-şablonlama yaklaşımına dayanan damlacık mikroakışkan teknolojisi, PM'leri oluşturmak için belki de etkili bir yöntemdir, çünkü genellikle tek tip boyutlu parçacıklar19 ile sonuçlanır. Özellikle, mikrosferlerin morfolojik özellikleri genellikle üretilen emülsiyon damlacıklarının kalitesine bağlıdır (yani, yağda su, W / O veya su içinde yağ, O / W), bu da biyomalzemelerin özelliklerini önemli ölçüde etkileyebilir20. Önceden tasarlanmış mikroakışkan platformun mikrofiberleri veya mikrosferleri üretmek için uygulanabileceğini belirtmek gerekir. Bir örnekte, Yu ve ark., doğal dokuları taklit etmek için hücresel ağları bir araya getirmek için kullanılabilecek kılcal bazlı mikroakışkan platformlara dayanan hücre yüklü mikrofibröz yapıların üretimini göstermiştir21. Başka bir örnekte, Ye ve ark. silika kolloidal kristal boncukların mikroakışkan teknolojiler aracılığıyla şablon replikasyonu ile fotonik kristal mikrokapsüller ürettiler, bu da karmaşık etiketleme ve spesifik aparat gerektiren mevcut tekniklerin birçok sınırlamasının üstesinden gelebilir22.
Gerçekten de, bu tekniğin kullanılmasının ardındaki mantık, doğada kolay olması, sofistike ekipman gerektirmemesi ve hücre dağıtımı ve rejeneratif tıp uygulamaları için tek tip boyutlu PM'lerin sentezlenmesindeki kolaylık gibi çeşitli avantajlardan kaynaklanmaktadır. Bu bağlamda, emülsiyon-şablonlamanın önceden tasarlanmış bileşenleri ile, yüksek gözenekliliğe ve birbirine bağlanabilirliğe sahip PM'ler, poli(vinil klorür) (PVC) borudan, bir cam kılcal damardan ve bir iğneden monte edilmiş mikroakışkan bir cihazdan kolayca elde edilebilir. Bir W/O emülsiyon öncüsü, sulu bir jelatin çözeltisi ve organik bir PLGA çözeltisi homojenize edilerek hazırlanır. Emülsiyonun uygulanabilir kısmını seçici olarak mikroakışkan platforma enjekte ederek, homojen partikül boyutlarına ve yüzey boyunca iç mekana birbirine bağlı gözeneklere sahip PM'ler üretilir. Mevcut protokol, PLGA-HOPM'ları mikroakışkan platformda emülsiyon-şablonlama ile üretmeyi amaçlamaktadır. Bu protokolün PLGA-HOPM'ların tekrarlanabilir üretimine izin verdiğine ve potansiyel olarak ilgili doku mühendisliği ve ilaç tarama alanlarında uygulanabilir olacağına inanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Çözeltilerin hazırlanması
- PVA stok çözeltisini, PVA çözeltisini 80 °C'lik bir su banyosunda ısıtarak ve daha sonra 4 °C'de buzdolabına yerleştirerek önceden hazırlayın. Deneysel kullanım için oda sıcaklığına (RT) soğutun.
- Sulu jelatin çözeltisini (1 mL,% 7.5, w / v) PLGA'nın organik fazına (2 mL,% 2, diklorometan, DCM'de w / v) ekleyerek emülsiyon öncüsünü hazırlayın (bkz.
NOT: Genel olarak, mikroakışkan teknolojisi, mikrosferleri oluşturmak için farklı aşamalar içerir. Sürekli veya toplama fazı sulu bir poli (vinil alkol) içerir (PVA, 600 mL,% 1, w / v).
2. Damlacık mikroakışkan cihaz montajı ve PLGA-HOPM'ların imalatı
NOT: Bu montaj için gerekli sarf malzemeleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
- Damlacık jeneratörü tertibatını özelleştirin.
- Bir cam kılcal damar (OD, 1 mm), PVC tüpler (ID, 1 mm) ve 26 G dağıtım iğnesi kullanarak bir ko-akışlı mikroakışkan jeneratör oluşturun.
- Cam kılcal damarı PVC borunun ucuna bağlayın ve ardından yukarıdaki yapının bağlantısında bir iğne ile delin.
- PVC borunun diğer ucunu damlacık üretimi sırasında sürekli faza yerleştirin. UV yapıştırıcı kullanarak, kürlemeden sonra eklemdeki boşlukları kapatın.
NOT: PVC boruda uygun delme için iğnenin yaklaşık 45 ° kavisli bükülmesi ve iğne noktasının koaksiyel yapıyı oluşturmak için kılcal boruya gerilmesi gerekir.
- Damlacık mikroakışkan platformunu hazırlayın.
- Şekil 1'de gösterildiği gibi iki şırınga pompası kullanın. Sürekli fazı yüklemek için 50 mL'lik bir şırınga ve emülsiyon oluşumu için 5 mL'lik bir şırınga kullanın.
- Sürekli ve dağılım fazlarının akış hızlarını sırasıyla 2 mL / dak ve 0.08 mL / dak olarak ayarlayın.
- Bir buz banyosuna 500 mL'lik bir beher yerleştirin ve önceden soğutulmuş bir PVA sulu çözelti ile doldurun (adım 1.1).
NOT: Cam kılcal damarın ucu toplama aşamasına daldırılmalıdır. Platformda emülsiyon-damlacık oluşumundan sonra toplama fazının süpernatanının cam çubukla karıştırılması (1 saat, 60 rpm) önerilir. Emülsiyon damlacıkları iğne ucunda üretilir. Genel olarak, iğnenin göstergesi, daha küçük göstergenin PM'lerin daha küçük boyutuna karşılık geldiği PM'lerin boyutunu etkiler. Ayrıca, gözenek çapı esas olarak porojen konsantrasyonu ile ilişkilidir ve uygun jelatin konsantrasyonu1 ile artabilir.
- Emülsifikasyon ve damlacık oluşumunu gerçekleştirin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek emülsiyonu hazırlayın.
- Sulu jelatin çözeltisini PLGA'nın DCM çözeltisine (adım 1.2) derhal boşaltarak ve ultrasonik cihazı kullanarak emülsifiye ederek emülsiyonu hazırlayın (bkz.
- Ultrasonik gücü 400 W'a ayarlayın ve probun konumunu manuel olarak sürekli değiştirmenin eşlik ettiği toplam işlem süresini 90 s (aralık 2 s, ultrasonik tedavi 1 s) olarak ayarlayın.
- Şırınga emme ve damlacık üretimi için elde edilen emülsiyonu yaklaşık 20 dakika içinde stabilize edin.
NOT: Ultrasonik hücre kırıcının probunu yağ-su arayüzüne yerleştirin. Ultrasonik probun konteynere temas etmesine izin verilmemesi önerilir.
- Damlacık oluşumunu gerçekleştirin.
- Ultrasonik tedaviden sonra mikroakışkan platformun 5 mL şırıngasında hazırlanan emülsiyonu (adım 2.3.1) hızla yükleyin.
- Kararsız W/O emülsiyonunu (faz ayırma sırasında) süreksiz faz olarak mikroakışkan cihaza sokun. Aynı zamanda, PVA'nın sulu çözeltisini sürekli faz olarak kullanın.
- Emülsiyonun uygun kısımlarını mikroakışkan cihaza enjekte ettikten sonra toplama kabının altındaki emülsiyonu içeren mikrosferleri (PVA,% 1, w / v) toplayın.
- Daha fazla stabilizasyon için numuneyi gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek hazırlanan mikrosferleri (PLGA-HOPM'ler) durulayın ve liyofilize edin.
NOT: Üretilen PLGA-HOPM'lar iç ve yüzeyde keyfi gözenekler içerir.- RT'ye normalleştirmeden önce mikrosferleri 4 ° C'de saklayın ve artık DCM'yi ortadan kaldırmak için bir cam çubukla (1 saat, 60 rpm) karıştırın.
- 500 mL beherdeki toplama fazını dikkatlice filtreleyin ve PM'lerin yüzeyindeki artık PVA'yı yıkamak için toplanan mikrosferleri üç kez deiyonize suyla yıkayın.
- PLGA omurgasına sarılmış jelatini eritmek için PLGA mikrosferlerini 37 °C su banyosuna 30 dakika boyunca yerleştirin.
- Elde edilen PLGA-HOPM'ları, artık jelatini çıkarmak için deiyonize su ile iki kez durulayın ve 24 saat boyunca -80 ° C'de liyofilizasyon için ön soğutun.
- Daha fazla deney için kuru PLGA-HOPM'leri -20 °C'de saklayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek emülsiyonu hazırlayın.
3. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme
- PLGA-HOPM'ları RT'de SEM'in numune aşamasına yatırın (bkz. Malzeme Tablosu) ve numune aşamasını magnetron püskürtücünün püskürtme hücresine koyun. Transformatörü ve magnetronu tek tek açın. Numuneyi 1 dakika boyunca altınla püskürtüldükten sonra SEM'e verin.
- Hızlanma voltajını 5 kV'a ayarlayarak SEM görüntülerini elde edin.
- Ek olarak, PLGA-HOPM'ların partikül boyutunu, SEM görüntülemenin değişken alanında 100 PM kullanarak ölçün. Gözenek boyutu dağılımını ölçmek için temsili sonucu ölçün.
- Grafikleri Resim J ile açın ve SEM görüntüsünün ölçek çubuğunu eşleştirmek için "düz çizgiyi" kullanın, bu da yazılımın pikseli uzunluğa kadar tanımlamasını sağlar.
- Analiz et > ölçek ayarla'ya tıklayın, SEM görüntüsünün ölçek çubuğuna "bilinen mesafeyi" ayarlayın ve genel > Tamam'a tıklayın.
- PLGA PM'lerin gözenek veya partikül boyutunu ölçmek için analiz > Araçları > YG yöneticisi... üzerine tıklayın ve ekle'ye tıklayın. Gereksinime göre numune sayısını ölçün.
- Daha fazla hesaplama için grafiklerin nicel verilerini elde etmek için Ölçü'ye tıklayın.
4. Hücre kültürü ve floresan görüntüleme
NOT: Bu çalışmada sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC) kullanılmıştır. Hücreler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamındaki hücreleri L-glutamin (DMEM / F-12),% 10 (v / v) fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye etti. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Sıçan BMSC'lerini, birleşmenin% 90'ına ulaştıktan sonra 1: 2 oranında geçirin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek hücre yapışması gerçekleştirin.
- PLGA-HOPM'ları etil alkol (5 mL, %70, v/v) ile inkübe edin ve sterilize etmek için RT'de 10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
- Sterilize edilmiş PLGA-HOPM'ları fosfat tampon çözeltisi ile iki kez yıkayın.
- PLGA-HOPM'lara BMSC'lerin yapışması için dinamik kültür altında steril bir santrifüj tüpünde (50 mL) hücre süspansiyonu (5 mL, 1 x 10 5 hücre/mL) ile HOPM'ları (beş sayıda) inkübe edin.
- Dinamik kültürü, çalkalayıcıya kapalı bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirerek termostatik bir aseptik çalkalayıcıda (37 °C, 90 rpm) gerçekleştirin (bkz.
NOT: Dinamik kültür, PM'leri ve hücreleri doğrudan plastik plaka üzerine inkübe etmek yerine, BMSC'lerin iskelelerdeki yapışma oranını arttırmayı amaçlamaktadır. Hücreler ve PLGA PM'ler 50 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne eklenir, tüpü termostatik bir aseptik çalkalayıcıda (37 ° C, 90 rpm) inkübe eder ve ortamı her 2 günde bir değiştirir.
- Canlı ve ölü çift leke testini gerçekleştirin.
- PLGA-HOPM'lara bağlanmadan BMSC'leri salınım yapmak için hücre yüklü PM'leri üç kez durulayın.
- Hücre yüklü PM'leri 35 mm'lik cam alt plakaya yerleştirin. PBS tarafından önceden yıkanmış numuneye sırasıyla 1 μL kalsein-ve propidiyum iyodür (PI) dahil olmak üzere 1 mL boyama tamponu ekleyin (bkz.
- Örnekleri konfokal lazer tarama mikroskobu ile değerlendirin (bkz. İlgili dedektörde 488 nm ve 552 nm uyarma ışığını açın. Z-bindirme analizi için, mikroskopun z ekseni hareketi ile numunenin farklı katmanlarını yakalamak için z-genişliğini ayarlayın.
NOT: Diğer lekelerin analiz için uygun şekilde kullanılabileceğini belirtmek gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ana parametreler1'i optimize eden önceki çalışmalara dayanarak, PLGA buharlaştırılabilir DCM çözücü içinde çözüldü. Birincil W / O emülsiyonu, ultrasonik prob tedavisi altında jelatin ile homojenize edilerek hazırlanmıştır. Özelleştirilmiş ko-akışlı akışkan yapı, akışları sürekli olarak tanıtmak için bir şırınganın kullanıldığı basit bir şekilde monte edildi. Ayrıca, PLGA mikrosferlerinin PVA ve jelatinini ortadan kaldırmak için yeterli durulama prosedürleri gerçekleştirilmiştir (Şekil 1A, Ek Şekil 1A, B). Daha sonra, PLGA-HOPM'ların morfolojik özellikleri SEM görüntüleme ile gözlendi. PLGA-HOPM'ların oksijen/metabolik atık taşımacılığında yüksek verimliliği kolaylaştırabilecek keyfi büyüklükte gözenekler (10-100 μm) ve birbirine bağlı pencerelerle büyük boyutlarda (350-500 μm) sergilediği gözlenmiştir (Şekil 1B). Bu morfolojik sonuçlar rapor edilen sonuçlarla uyumluydu1.
Bir kavram kanıtı olarak, BMSC'ler PLGA-HOPM'lar içinde geçici olarak kültür için kullanıldı. PM'lerin iç yapısının, hücrelerin dinamik kültür8 sırasında proliferasyona yapışmasına ve proliferasyona izin verebileceğine inanılıyordu. Ek olarak, BMSC'lerin seçilmesinin mantığı, bu hücrelerin çok kutuplu farklılaşma ve hasarlı dokuları onarma ile karakterize edilmesi ve ayrıca çeşitli biyoaktif malzemelerin biyolojik davranışlarını incelemek için yaygın olarak kullanılmasıdır23. BMSC'ler, mikrosferler ve görselleştirilmiş hücre dağılımı ve sağkalım durumu ile in vitro mikrodokuların CLSM'nin z-analizi ile oluşturulmasında kullanıldı (Şekil 1C). 1 d'de iskelelere çok sayıda hücrenin yapıştığı ve PLGA-HOPM'lardaki hücrelerin kapsamlı yapışma ve göç yeteneklerini temsil eden yeşil floresanın korunduğu gözlendi. Sitoplazma dolaylı olarak kalsein-boyaması ile görüntülendi, çünkü asetoksimetil ester () grubu gelişmiş hidrofobiklik sağlar ve canlı hücre zarından penetrasyonu kolaylaştırır. Kalsein-'nin floresansı olmamasına rağmen, güçlü bir negatif yüklü polar molekül kalsein üretmek ve güçlü yeşil floresan24 yaymak için endojen esteraz tarafından hücre içi hidrolize edilebilir. Bu nedenle, sitoplazma kalsein-boyaması ile dolaylı olarak görselleştirilir (Şekil 1C, Ek Şekil 1C).
Şekil 1: PLGA-HOPM'ların imalatı ve sitouyumluluğu. (A) PLGA-HOPM'ların imalatını gösteren şematik. (B) SEM görüntülemeye dayalı PM'lerin gözenek çapı (10-100 μm). Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) PLGA-HOPM'larla birlikte kültürlenmiş BMSC'lerin 24 saat boyunca canlı (kalsein-, yeşil) ve ölü (propidyum iyodür, PI, kırmızı) boyanması. Ölçek çubuğu = 250 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Hücre yüklü PLGA-HOPM'ların gerçek mikroakışkan platformunun, emülsiyonunun ve katmanlar arası görüntülemesinin çizimleri. (A) Gerçek damlacık mikroakışkanlar platformunun şeması. (B) Ultrason tedavisi ile emülsifiye edilmiş W / O öncüsü. (C) PLGA-HOPM'larla 24 saat boyunca birlikte kültürlenen BMSC'lerin canlı ve ölü boyanmasının ara katmanı. Ölçek çubuğu = 250 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, PLGA-HOPM'ler gibi PLGA tabanlı mimariler üretmek için etkili bir strateji açıklanmaktadır. PLGA'nın çözücü uçuculuğundan kaçınmak ve emülsiyonun hazırlanması sırasında ultrasonik gücün hedef konuma nazikçe ayarlanması da dahil olmak üzere birkaç kritik adımın dikkatlice atılması gerektiğine dikkat edilmelidir. Ek olarak, 20 mL şırınganın sıvı çıkışı, emülsifiye öncüllerin faz ayrımını çözmek için belirli bir dereceye kadar ayarlanabilir. Bununla birlikte, bir sınırlama, porojen durumu çevresel sıcaklıktan etkilendiğinden, emülsiyonun stabilitesinin istenmeyen olabileceğidir. Birlikte, damlacık mikroakışkan platformunun uygun montajı, doku mühendisliği ve ilaç tarama uygulamaları için hücre yüklü mikrojellerin üretimini önemli ölçüde kolaylaştırabilir. PLGA, Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı bir ilaç dağıtım emtiası25 olduğu için mikrosferlerin üretiminde sıklıkla bir dağıtım aracı olarak uygulanır. Ek olarak, alifatik polyester, sentez prosedürleri sırasında laktid asit ve glikolik asit oranına bağlı olarak in vitro veya in vivo hidroliz yoluyla zararsız bozunma özellikleri sunar26.
PLGA-HOPM'ları imal etmek için, sulu ve organik fazlar ultrasonik prob kullanılarak bir W / O emülsiyonu oluşturmak için homojenize edildi. Daha sonra, W / O emülsiyonu damlacık mikroakışkan cihazına sokuldu ve iğne ucundaki su içinde yağda su (W / O / W) damlacıklarına dönüştü (Şekil 1A, Ek Şekil 1A, B). Elde edilen W / O / W damlacıkları, toplama aşamasında DCM'nin ekstraksiyonu ve buharlaştırılmasıyla katılaşabilir. Bir buz banyosundaki önceden soğutulmuş toplama aşaması, jelatinin yumuşak jel durumunda kalmasına izin verebilir, çözücü-buharlaşma sırasında iyi dağıtılmış emülsiyonu doğrudan koruyabilir ve daha fazla liyofilizasyondan sonra PLGA-HOPM'lara neden olabilir (Şekil 1B).
Ek olarak, emülsiyon-şablonlama yöntemi, uçuculaştırma ile giderilebilen uçucu organik çözücüler içerir. Ayrıca, PLGA-HOPM'lardaki DCM kalıntısı, gaz kromatografisi ölçümü2'den hesaplanarak neredeyse tamamen çıkarılabilir. Dahası, mikroakışkan teknolojisi PLGA'nın sito/biyouyumluluğunu etkilemeyecektir. Aslında, sıçan BMSC'leri ile kültürlenen PLGA-HOPM'ler, canlı hücrelerin sayısının sadece birkaç ölü hücre ve germe morfolojisi ile geniş olduğunu göstermiştir. Dahası, sitoplazma, canlı floresan boya ile görüntülenebilir ve bu da HOPM'lerde gerilmeyi gösterir.
Birlikte, mükemmel morfolojik özelliklere sahip PLGA-HOPM'lar, doku rejenerasyonu ve çeşitli biyomedikal uygulamalar için HOPM'lar boyunca hücresel yapışma ve yayılma yetenekleri ile ilgili gereksinimleri karşılayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK ve AZC, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC, 32071323, 81971734 ve U1605225) ve Fujian Eyalet Üniversitesi'ndeki Bilim ve Teknoloji Yenilikçi Araştırma Ekibi Programı'ndan finansal desteği kabul eder. YSZ ne bu programlardan herhangi biri tarafından desteklendi ne de herhangi bir türde ödeme aldı; bunun yerine, Brigham Araştırma Enstitüsü'nün desteği kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
