Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

RNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) for å visualisere mikrobiell kolonisering og infeksjon i Caenorhabditis elegans tarmer

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63980
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2School of Biological Sciences, University of California, San Diego

Summary

Tarmmikrober, inkludert ekstracellulære bakterier og intracellulære patogener som Orsay-viruset og mikrosporidia (sopp), er ofte forbundet med ville Caenorhabditis nematoder . Denne artikkelen presenterer en protokoll for å oppdage og kvantifisere mikrober som koloniserer og/eller infiserer C. elegans nematoder, og for måling av patogenbelastning etter kontrollerte infeksjoner i laboratoriet.

Abstract

Tarmene av ville Caenorhabditis nematoder er bebodd av en rekke mikroorganismer, inkludert tarmmikrobiombakterier og patogener, som mikrosporidia og virus. På grunn av likhetene mellom Caenorhabditis elegans og pattedyrs tarmceller, samt kraften til C. elegans-systemet , har denne verten dukket opp som et modellsystem for å studere vertstarm-mikrobe-interaksjoner in vivo. Selv om det er mulig å observere noen aspekter av disse interaksjonene med lysfeltmikroskopi, er det vanskelig å klassifisere mikrober nøyaktig og karakterisere omfanget av kolonisering eller infeksjon uten mer presise verktøy. RNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) kan brukes som et verktøy for å identifisere og visualisere mikrober i nematoder fra naturen eller for å eksperimentelt karakterisere og kvantifisere infeksjon i nematoder infisert med mikrober i laboratoriet. FISH-sonder, som merker den svært tallrike lille underenheten ribosomalt RNA, produserer et lyst signal for bakterier og mikrosporidiske celler. Sonder designet for å målrette konserverte regioner av ribosomalt RNA som er felles for mange arter, kan oppdage et bredt spekter av mikrober, mens målretting av divergerende regioner av ribosomal RNA er nyttig for smalere deteksjon. På samme måte kan prober utformes for å merke viralt RNA. En protokoll for RNA FISH-farging med enten paraformaldehyd (PFA) eller acetonfiksering presenteres. PFA-fiksering er ideell for nematoder assosiert med bakterier, mikrosporidier og virus, mens acetonfiksering er nødvendig for visualisering av mikrosporidasporer. Dyr ble først vasket og festet i paraformaldehyd eller aceton. Etter fiksering ble FISH-sonder inkubert med prøver for å muliggjøre hybridisering av sonder til ønsket mål. Dyrene ble igjen vasket og deretter undersøkt på mikroskopglass eller ved hjelp av automatiserte tilnærminger. Samlet sett muliggjør denne FISH-protokollen deteksjon, identifisering og kvantifisering av mikroberene som bor i C. elegans tarm, inkludert mikrober som det ikke finnes genetiske verktøy for.

Introduction

Caenorhabditis elegans har dukket opp som et kraftig modellsystem for å studere medfødt immunitet og vert-mikrobe-interaksjoner i tarmepitelcellene 1,2. På grunn av å ha en gjennomsiktig kropp og bare 20 tarmceller, representerer C. elegans et praktisk system for overvåking av prosessene for mikrobiell intestinal kolonisering og infeksjon i sammenheng med en intakt organisme. Nematode tarmceller deler flere morfologiske og funksjonelle likheter med pattedyrs tarmepitelceller, noe som gjør dem til en trekkbar in vivo-modell for disseksjon av prosesser som styrer mikrobiomkolonisering og patogeninfeksjon 3,4,5,6.

Wild C. elegans spiser på en rekke mikrober som koloniserer og infiserer tarmen, og prøvetaking av disse nematoder har resultert i oppdagelse av virus, eukaryoter (sopp, oomycetes) og bakterier som naturlig forbinder med denne verten 7,8,9,10. Orsay-viruset ble funnet å infisere tarmen og er for tiden det eneste kjente naturlige viruset av C. elegans9. Microsporidia er sopprelaterte obligatoriske intracellulære patogener som er den vanligste infeksjonen i villfanget Caenorhabditis, med flere arter som har blitt oppdaget infisere C. elegans og relaterte nematoder 8,11. Mange bakterier er ofte funnet i tarmlumen av villfangede C. elegans, og flere arter er etablert som en naturlig modell for C. elegans mikrobiom (CeMbio) 6,12,13,14. Å oppdage og karakterisere mikrober som naturlig koloniserer og / eller infiserer C. elegans er avgjørende for å forstå de genetiske mekanismene som styrer disse vertsmikrobeinteraksjonene, samt visualisere nye mikrobielle prosesser som bare forekommer i sammenheng med et intakt vertsdyr.

Etter prøvetaking screenes ville nematoder via differensialinterferenskontrastmikroskopi (DIC) for å se etter fenotyper som indikerer infeksjon eller kolonisering. For eksempel kan endringer i det stereotype granulerte utseendet til tarmcellene være forbundet med tilstedeværelsen av en intracellulærparasittinfeksjon. Spesielt er tap av tarmgranulat og redusert cytosolisk viskositet tegn på virusinfeksjon, mens omorganisering av tarmgranulat til "spor" kan indikere infeksjon med mikrosporidia i slekten Nematocida 8,9. Fordi det finnes et bredt utvalg av mikrober i ville C. elegans-prøver, kan det være vanskelig å skille mellom mikrober gjennom DIC-mikroskopi. Informasjon om den romlige fordelingen av mikrober i verten kan også være vanskelig å oppdage på grunn av den lille størrelsen på mange mikrober15. I tillegg er det ikke alltid mulig å dyrke bestemte mikrober av interesse in vitro, noe som fører til vanskeligheter med deteksjon og / eller kvantifisering.

RNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) gir en metode for fluorescerende merking av mikrober ved å benytte fluorescerende prober som binder seg til RNA av den lille ribosomale underenheten (SSU) i faste celler. Hvis analyse av morfologiske egenskaper antyder en bestemt klasse mikrobe, kan FISH-sonder som retter seg mot spesifikke eller brede klasser av slike mikrober brukes. For eksempel regnes EUB338 som en universell sonde for bakteriell SSU og brukes ofte til å oppdage et bredt spekter av bakterier16. Protokollen beskrevet her bruker enkeltstrengede DNA-sonder som er sluttmerket med en fluorofor og spesielt designet for å være komplementære til mål-SSU av mikroben av interesse, selv om det tidligere er designet prober tilgjengelig16. Den største fordelen med å målrette SSU av mikrober er den relativt store overfloden av dette RNA, som vanligvis består av 80% -90% av alt RNA i cellen, noe som fører til farging med et meget høyt signal-til-støy-forhold17. Prober kan også utformes for å målrette RNA for å oppdage virus, som Orsay-viruset 9,18, som ofte er tilstede i svært høye kopier i infiserte celler hvis viruset replikerer aktivt.

Avhengig av resultatene med kjente sonder, kan det være nødvendig å innhente ytterligere sekvensinformasjon for å designe mer spesifikke sonder for artsbekreftelse in situ. En vanlig tilnærming er å bruke universelle primere mot konserverte regioner i SSU (16S for bakterier og 18S for eukaryoter) for å forsterke (via PCR) regioner som er mer divergerende8. Ved hjelp av denne sekvensinformasjonen kan prober med mer artsspesifisitet utformes. Disse FISH-sondene kan da muliggjøre identifisering av mikrober på en kulturuavhengig måte8. I tillegg kan RNA FISH gi innsikt i unike morfologiske koloniserings- og infeksjonsegenskaper, inkludert filamentering eller vevslokaliseringsmønstre19,20. Ulike fargede FISH-sonder kan brukes samtidig, noe som muliggjør visuelt skille mellom mikrober i ville nematodeprøver, samt observasjon av mikrobe-mikrobedynamikk inne i en vert15,20. Videre kan RNA FISH-farging brukes på vertspatogeninteraksjonsstudier der infeksjon og kolonisering av en kjent art enkelt kan kvantifiseres manuelt eller gjennom automatiserte tilnærminger for å gi innsikt i patogenbelastning, for eksempel ved å sammenligne C. elegans-mutanter som enten har økt eller redusert motstand mot infeksjon21.

Protocol

MERK: Nematoder kan festes med enten paraformaldehydoppløsning (PFA) eller aceton. PFA muliggjør bedre visualisering av morfologi enn aceton og kan bevare signaler fra transgent grønt fluorescerende protein (GFP), som er ødelagt av aceton. Imidlertid er acetonfiksering nødvendig for å permeabilisere mikrosporidiske sporer for å muliggjøre merking av dette livsstadiet. Videre kan aceton være mer praktisk enn PFA fordi det er mindre giftig, og prøver kan lagres i flere dager i aceton i en -20 ° C fryser uten behov for å fjerne fikseringsmiddelet. Nedenfor er to separate protokoller, ved bruk av enten PFA-løsning eller aceton som fikseringsmiddel. For en visualisering av protokolltrinnene, se figur 1.

1. FISKEFARGING med PFA-fiksering

  1. Forbered nematoder med tilhørende mikrober
    1. Dyrk nematoder med ønsket mikrobe av interesse på standard Nematode Growth Media (NGM) plater sådd med riktig matkilde. Inkuber nematodene ved 20 °C til ønsket livsstadium er nådd.
    2. Tilsett 2 ml M9 minimale saltmedier (42 mM Na 2 HPO 4, 22mM KH2PO 4, 8,6 mM NaCl, 19 mM NH 4 Cl) + 0,1 % mellom 20 til NGM-plater som inneholder Caenorhabditis-stammen infisert eller kolonisert med ønsket mikrobe som skal visualiseres.
      MERK: Tilsetningen av vaskemiddel er å forhindre at nematoder fester seg til pipetter og mikrofugerør, og for å hjelpe pellet L1-L2 stadium nematoder. 0,1% Triton-X kan brukes i stedet for Tween 20.
    3. Pipetter opp nematodene fra platene ved hjelp av en Pasteur-pipette og pære i glass, og overfør dem til merkede 1,5 ml mikrofugerør.
      MERK: Glasspipetter foretrekkes fordi nematoder kan feste seg til plastpipetter, men tilsetning av vaskemiddel (Tween 20 eller Triton-X) kan minimere dette problemet.
    4. Ved hjelp av en mikrocentrifuge, spinn ned prøvene som inneholder koloniserte eller infiserte nematoder ved 2000 x g for 60 s for L1 dyr, eller 500 x g for 60 s for L4 eller voksne dyr. Alle påfølgende sentrifugeringstrinn vil bli utført med den valgte hastigheten.
    5. Fjern supernatanten fra mikrofugerørene ved hjelp av en pipette. Unngå å forstyrre nematodepelleten ved forsiktig å fjerne supernatanten ned til 100 μL over pelleten. Dette kan estimeres ved hjelp av merkede 1,5 ml mikrofugerør.
  2. Vask nematoder for å eliminere ekstern forurensning
    1. Tilsett 1 ml 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mMKH2PO4) + 0,1 % mellom 20 (PBS-T) i mikrofugerør.
    2. Spinn ned prøvene i en mikrosentrifuge med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Bruk en pipette til å fjerne alle unntatt 100 μL av supernatanten. Dette kan estimeres ved hjelp av merkede 1,5 ml mikrofugerør.
    3. Gjenta de to trinnene ovenfor 2-3x.
      MERK: Tre totale vasker er vanligvis tilstrekkelig; Imidlertid kan ytterligere vasker utføres for å fjerne overflødig ekstern forurensning.
  3. Fest nematoder med PFA
    1. I avtrekkshetten tilsettes 33 μL 16% PFA til mikrofugerøret som inneholder 100 μL supernatant over nematodepelleten oppnådd fra trinn 1.2.3 for en endelig konsentrasjon på 4% PFA.
      FORSIKTIG: PFA er kreftfremkallende. Kontakt med PFA kan føre til hudsensibilisering og irritasjon og øyeskader. PFA frigjør giftige røyk som kan føre til luftveisirritasjon eller sensibilisering. Når du bruker PFA, arbeid i en avtrekkshette med riktig personlig verneutstyr og se passende sikkerhetsdatablad før bruk.
    2. Inkuber prøvene som inneholder nematoder kolonisert eller infisert med mikroben av interesse i 30-45 minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjon, lagre prøvene i 70% etanol ved 4 ° C til protokollen er klar til å fortsette.
      MERK: En kortere inkubasjonsperiode er bedre for å opprettholde GFP-signalet i transgene stammer på grunn av nedbrytning av GFP av PFA over tid. Lengre inkubasjonstider tillater fikseringsmiddelet å bedre permeabilisere inn i prøvene. Det er best å bestemme inkubasjonstiden empirisk avhengig av prøven.
  4. Fjern PFA-oppløsningen
    1. Spinn ned prøvene i en mikrosentrifuge med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Fjern så mye av supernatanten som mulig med en pipette uten å forstyrre pelleten.
      FORSIKTIG: Supernatanten inneholder PFA, som er giftig. Kast supernatanten og minst de to første vasker som giftig avfall i en avtrekkshette.
    2. Tilsett 0,5 ml PBS-T til prøvene i mikrofugerørene.
    3. Følg og gjenta trinn 1.4.1 og 1.4.2 2-3x med PBS-T.
      MERK: Å utføre flere vasker vil bidra til å redusere bakgrunnssignalet. Minst fire vasker totalt anbefales.
    4. Etter den siste vasken, spinn ned prøvene og fjern supernatanten, og la pelleten være uforstyrret.
  5. Forbered hybridiseringsbuffer (HB) og vask nematoder
    1. Forbered 1 ml HB (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,01% SDS) per prøve.
      MERK: HB bør tilberedes fersk før hver bruk for å unngå nedbør. Imidlertid kan en generell buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) gjøres på forhånd og oppbevares ved romtemperatur til HB er nødvendig. Før bruk, lag 1 ml per prøve av den generelle bufferen og legg SDS til en endelig konsentrasjon på 0,01%.
    2. Tilsett 800 μL HB til mikrofugerørene som inneholder nematodepelleten. Pellet prøvene i mikrosentrifugen (se trinn 1.1.4). Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten.
  6. Hybridiser FISH-sonden til ønsket målsekvens
    1. Bland 100 μL per prøve av tilberedt HB med ønsket FISH-sonde til en endelig konsentrasjon på 5-10 ng / μL sonde.
      MERK: FISH-sonder er 15-23 -mer oligoer, antisense til SSU av mikroben av interesse, og merket med en farget fluorophore festet til 5 'eller 3' enden (se tabell 1 for sonder som brukes her). Vanligvis lagres FISH-sonder på 1 mg/ml.
    2. Tilsett 100 μL HB som inneholder FISH-sonde til hver prøve. Bland ved å forsiktig flikke eller invertere rørene.
      MERK: FISH-sonder i forskjellige farger kan legges til samtidig for å visualisere flere fluorescerende signaler i samme prøve (se figur 1B).
    3. Inkuber prøvene over natten (6-24 timer) i et tørt bad ved 46-54 °C eller en termisk mikser ved 46-54 °C ved 1 200 o/min.
      MERK: Inkubasjon ved 46-48 °C brukes vanligvis til hybridisering. Det kan imidlertid være nødvendig å justere denne temperaturen avhengig av smeltetemperaturen til FISH-sonden. Generelt er hybridiseringstemperaturen 4 °C under smeltetemperaturen.
  7. Fjern FISH-sonden og vask nematoder
    1. Forbered 3 ml vaskebuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01 % SDS) per prøve.
      MERK: WB bør tilberedes fersk før hver bruk for å unngå nedbør. Imidlertid kan en generell buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) lages på forhånd og oppbevares ved romtemperatur til vaskebufferen er nødvendig. Før bruk, lag 3 ml per prøve av den generelle bufferen og tilsett EDTA til en endelig konsentrasjon på 5 mM og SDS til en endelig konsentrasjon på 0,01%.
    2. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Fjern HB med en pipette, mens du er forsiktig med å la nematodepelleten være uforstyrret.
    3. Tilsett 1 ml forberedt WB til hver prøve.
    4. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Fjern WB ved hjelp av en pipette, mens du er forsiktig med å la pelleten være uforstyrret.
    5. Tilsett 1 ml forberedt WB til hver prøve.
    6. Inkuber prøvene i 1 time ved 48-56 °C i et tørt bad (eller termisk mikser ved 48-56 °C ved 1200 o/min). Hvis du inkuberer i et tørt bad, må du forsiktig invertere rørene hvert 15.-20. minutt.
      MERK: Generelt brukes 48 °C som standard vasketemperatur; Det kan imidlertid hende at denne temperaturen må justeres hvis det er høyt bakgrunnssignal. Vasketemperaturen er ofte 2 °C høyere enn hybridiseringstemperaturen. Inkubasjonstiden i WB kan forkortes til 30 minutter for å redusere bakgrunnen ytterligere, hvoretter trinn 1.7.4 og 1.7.5 skal gjentas. Dette etterfølges av en (for bakterier) eller to (for mikrosporidia sporoplasmer) 30 minutters inkubasjonsperioder ved 48 °C.
    7. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Bruk en pipette, fjern vaskebufferen, mens du er forsiktig med å la pelleten være uforstyrret.
    8. Tilsett 100-500 μL PBS-T til hver av prøvene. På dette tidspunktet kan prøvene lagres i PBS-T ved 4 °C i opptil en uke til protokollen er klar til å fortsette.
  8. Monter nematodene
    1. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Fjern så mye PBS-T som mulig uten å forstyrre nematodepelleten.
    2. (Valgfritt) Tilsett 20 μL antifade monteringsmedium med DAPI (Table of Materials) til prøvene.
    3. Legg i en 20 μL pipettor med en 200 μL pipettespiss og bruk saks til å kutte av pipettespissen slik at større nematoder kan pipettes.
    4. Med den kuttede pipettespissen, overfør 5-10 μL av pelleten til et mikroskopglass. Dekk med en 22 x 22 coverslip. For å lagre lysbildene forsegler du kantene på dekselet med neglelakk og oppbevarer dem i en mørk eske ved 4 °C til de er klare til videre bruk.

2. FISK farging med acetonfiksering

  1. Klargjør nematoder med tilhørende mikrober som beskrevet i trinn 1.1.
  2. Vask nematoder for å eliminere ekstern forurensning som beskrevet i trinn 1.2.
  3. Fest nematoder med aceton
    1. Fjern supernatant uten å forstyrre pelleten og tilsett 1 ml aceton av laboratoriekvalitet til prøven.
      FORSIKTIG: Aceton er en svært brannfarlig væske og damp. Selv om det kan kjøpes over disk som neglelakkfjerner, er det viktig å huske at aceton forårsaker alvorlig øyeirritasjon, og kan forårsake døsighet eller svimmelhet.
    2. Inkuber prøvene som inneholder nematoder kolonisert eller infisert med mikroben av interesse i 15 minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjon kan prøvene lagres i aceton ved -20 °C i opptil 2 uker til protokollen er klar til å fortsette.
      MERK: Ikke bruk denne protokollen med transgene C. elegans-stammer som uttrykker GFP (eller dets alleliske muterte former) hvis det er ønskelig å opprettholde fluorescensen, da aceton ødelegger dette signalet.
  4. Fjern aceton
    1. Spinn ned prøvene i en mikrosentrifuge med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Fjern supernatanten med en pipette uten å forstyrre pelleten.
      FORSIKTIG: Supernatanten inneholder aceton. Kast supernatanten og minst de to første vasker som giftig avfall i en avtrekkshette.
    2. Tilsett 0,5 ml PBS-T til prøvene i mikrofugerørene.
    3. Følg og gjenta trinn 2.4.1 og 2.4.2 2-4x med PBS-T.
      MERK: Å utføre flere vasker vil bidra til å redusere bakgrunnssignalet. Det anbefales å utføre fire vasker totalt.
    4. Etter siste vask, spinn ned prøvene og fjern supernatanten, slik at pelleten er uforstyrret.
  5. Forbered hybridiseringsbuffer (HB) og vask nematodene som beskrevet i trinn 1.5.
  6. Hybridiser FISH-sonden til ønsket målsekvens som beskrevet i trinn 1.6.
  7. Fjern FISH-sonden og vask nematoder
    1. Forbered 1,1 ml vaskebuffer (WB) (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,01 % SDS) per prøve.
      MERK: WB bør tilberedes fersk før hver bruk for å unngå nedbør. Imidlertid kan en generell buffer (900 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7,5) gjøres på forhånd og oppbevares ved romtemperatur til en vaskebuffer er nødvendig. Før bruk, lag 1,1 ml per prøve av den generelle bufferen og tilsett EDTA til en endelig konsentrasjon på 5 mM og SDS til en endelig konsentrasjon på 0,01%.
    2. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet (se 1.1.4). Fjern HB med en pipette, mens du er forsiktig med å la nematodepelleten være uforstyrret.
    3. Tilsett 100 μL forberedt WB til hver prøve.
    4. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet (se 1.1.4). Fjern WB ved hjelp av en pipette, mens du er forsiktig med å la pelleten være uforstyrret.
    5. Tilsett 1 ml forberedt WB til hver prøve.
    6. Inkuber prøvene i 1 time ved 48-56 °C i et tørt bad (eller termisk mikser ved 48-56 °C ved 1,200 o / min). Hvis du inkuberer i et tørt bad, må du forsiktig invertere rørene hvert 15.-20. minutt.
      MERK: Generelt brukes 48 °C som standard vasketemperatur; Det kan imidlertid hende at denne temperaturen må justeres hvis det er høyt bakgrunnssignal. Vasketemperaturen er ofte 2 °C høyere enn hybridiseringstemperaturen.
    7. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet (se trinn 1.1.4). Bruk en pipette, fjern vaskebufferen, mens du er forsiktig med å la pelleten være uforstyrret.
    8. Tilsett 100-500 μL PBS-T til hver av prøvene. På dette tidspunktet kan prøvene lagres i PBS-T ved 4 °C i opptil en uke til protokollen er klar til å fortsette.
  8. Monter nematodene som beskrevet i trinn 1.8.

Representative Results

For å analysere mikrobiombakterier ble spesifikke og universelle FISH-sonder til bakterielle 16S brukt på vilt isolerte dyr. Wild Caenorhabditis tropicalis stamme (JU1848) ble samplet fra Nouragues-skogen nær en liten elv i Fransk Guyana fra råtnende palmefrukter22. Under mikroskopet differensiell interferenskontrast (DIC) ble denne nematodestammen funnet å være kolonisert med en bakterie som ser ut til å holde seg retningsbestemt til tarmepitelet (figur 2A). JU1848 ble deretter selektivt rengjort for å eliminere andre mikrobielle forurensninger og berike for ønsket adhering bakterie23. Ved hjelp av den universelle PCR-metoden ble bakterien identifisert som en ny art i Alphaproteobacteria-klassen. En FISH-sonde merket med Cal Fluor Red 610 ble deretter designet spesielt til 16S rRNA-sekvensen av denne bakterien for å tillate fluorescerende visualisering av kolonisering i C. tropicalis (figur 2B). En universell 16S rRNA FISH-sonde som var i stand til å binde mange bakteriearter (EUB338) ble merket med 6-karboksyfluorescin (FAM) og ble også tilsatt denne prøven. De grønne og røde fluorescerende signalene overlapper helt, noe som tyder på at de fleste bakterier som koloniserer tarmene, er den vedheftende Alphaproteobacteria-bakterien. Disse dyrene ble fikset i PFA før farging.

For å analysere eksperimentell infeksjon i laboratoriet med intracellulære patogener av kjent identitet, ble Orsay-virus og mikrosporidian-spesifikke FISH-sonder brukt på C. elegans med villtypebakgrunn. Orsay-viruset er et positivt tråd-RNA-virus fra Nodaviridae-familien, og det eneste naturlige virale patogenet som finnes i C. elegans. Det todelte RNA-genomet til Orsay-viruset består av RNA1- og RNA2-segmenter, og FISH-sonder rettet mot begge disse segmentene er utviklet (figur 3A,B)9,18. I tarmen registreres viralt RNA av RIG-I homolog DRH-124, som kreves for aktivering av transkripsjonsforsvarsprogrammet kalt Intracellular Pathogen Response (IPR) 25,26,27. Transkripsjonen av antivirale IPR-gener er i det minste delvis kontrollert av ZIP-1 transkripsjonsfaktor21. Her ses uttrykket av ZIP-1::GFP lokalisert i tarmkjernene til celler som viser positiv Orsay-virus FISH-farging i cytoplasma (figur 3A)21. Flere dyr farget med Orsay-spesifikk FISH er vist å indikere styrken på dette signalet for enkel kvantifisering (figur 3B). Dyr vist i figur 3A,B ble fastsatt i PFA.

Den mikrosporidiske parasitten kalt Nematocida parisii, som betyr nematode-killer fra Paris, er et obligatorisk intracellulært patogen i tarmen. Flere FISH-sonder som merker 18S rRNA av N. parisii har blitt brukt, inkludert fluorescerende merkede MicroA- og MicroB-sonder. Flere dyr farget med MicroB FISH er vist å indikere styrken på dette signalet for enkel kvantifisering (figur 3C). I tillegg er C. elegans infisert av andre nært beslektede microsporidia. Koinfeksjon av N2 med N. parisii og den relaterte N. ausubeli kan skilles ved hjelp av denne FISH-protokollen ved å designe artsspesifikke FISH-sonder som konkurrerer mot hverandre om binding til en divergerende region på 18S rRNA (figur 3D)28. I dette eksemplet har N. parisii FISH-sonden perfekt baseparing til N. parisii 18S rRNA, men en 7 bp mismatch til N. ausubeli 18S rRNA. Det motsatte gjelder for N. ausubeli-sonden. Som sådan vil hver artsspesifikk FISH-sonde utkonkurrere om binding til de beslektede artene 18S over de ikke-kognate artene. I tillegg tillater bruk av DAPI for å flekke kjerner bedre lokalisering av infeksjonen i sammenheng med hele dyret, spesielt for tarmen som har store, lett identifiserbare kjerner. Figur 3C,D inneholder dyr som ble fikset i PFA. Senere infeksjoner med N. parisii resulterer i utvikling av meronter i sporer. For å visualisere N. parisii-sporer må dyrene festes i aceton da det trenger bedre inn i sporeveggen enn PFA (figur 3E,F)8. Den resulterende FISH-fargingen demonstrerer de små og store stavformede strukturene, som sannsynligvis korresponderer med N. parisii-sporer, som er farget med N. parisii-spesifikke sonder i rødt.

Figure 1
Figur 1: Visuell fremstilling av FISH-protokollen. Laget med Biorender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: FISKEFARGING av vill C. tropicalis JU1848-stamme kolonisert med festende bakterier i tarmen. (A) Nomarski-bilde som viser tusenvis av tynne baciller bakterier (bac) retningsbestemt binding til tarmen (i) av JU1848, og skaper en hårlignende fenotype i lumen (lu). Dette figurpanelet er tilpasset fra Morgan, E. et al (2021)23. (B) FISH-farging av JU1848, festet i PFA, ved hjelp av en rødmerket sonde (b002_16S_A-CF610) designet for å målrette 16S rRNA-sekvensen til den vedheftende bakterien (øverst) og en grønnmerket universell FISH-sonde (EUB338-FAM) designet for å målrette mot 16S av bakterier (bunn). DAPI-farging av vertskjerner er vist i blått. Se tabell 1 for sondesekvenser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: FISKEFARGING av C. elegans infisert med intracellulære patogener. (A,B) FISKEFARGING av C. elegans som uttrykker ZIP-1::GFP og infisert med Orsay-viruset, som ble fikset med PFA før farging for å bevare GFP-signalet. Orsay 1 Red og Orsay 2 Red prober ble brukt til patogenfarging. (A) Det sammensatte bildet består av sammenslåtte røde og grønne fluorescerende kanaler. Nukleær ZIP-1: GFP-uttrykk er indusert ved Orsay-virusinfeksjon og vises i grønt. Autofluorescens fra tarmgranulatene er vist i gult og indikert med gule piler. Stiplede linjer skisserer nematodekroppen. Skalalinje = 25 μm. (B) Det sammensatte bildet består av sammenslåtte røde fluorescerende og DIC-kanaler. Skala bar = 200 μm. (C,D) FISK farging av villtype C. elegans infisert med mikrosporidia som ble fiksert i PFA. (C) FISK farging av villtype C. elegans infisert med N. parisii og fast i PFA. MicroB-CF610 sonde ble brukt til farging av patogener. Det sammensatte bildet består av sammenslåtte røde fluorescerende og DIC-kanaler. Skala bar = 100 μm. (D) FISH farging av villtype C. elegans co-infisert med N. parisii og N. ausubeli i tarmen. De to patogenene ble farget ved hjelp av et par spesifikke FISH-sonder som konkurrerer om binding til samme region av 18S rRNA. N. parisii ble farget med MicroF-CF610 (rød) og N. ausubeli ble farget med MicroSp1A-FAM (grønn). DAPI-farging av vertskjerner ses i blått. Skala bar = 25 μm. (E) FISH farging med aceton-fast vill-type C. elegans infisert med N. parisii sporer. MicroA-CF610 (rød) ble brukt til farging (rød). Skalalinje = 15 μm. (F) Nomarski-bilde som viser N. parisii-sporer sett i (E). Skala bar = 15 μm. I (E) og (F) er de små og store stavformede strukturer merket med henholdsvis små og store piler som tilsvarer N. parisii-sporer. Se tabell 1 for sondesekvenser. Bildet vist i (A) er tilpasset fra Lažetić, V. et al (2022)21. Bilder vist i (B) og (C) er tilpasset fra Reddy, K. C. et al (2019)26. Bilder vist i (E) og (F) er tilpasset fra Troemel, E. R. et al (2008)8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sondens navn Probe spesifisitet Sonde fluorofor Sonde sekvens
EUB338-FAM Bakteriell 16S (universell) 5' 6-fluorescein (FAM) GCTGCCTCCCGTAGGAGT
b002_16S_A-CF610 Alfaproteobakterier 16S Cal Fluor Rød 610 (CF610) TGTACCGACCCTTAACGTTC
Orsay1 Rød Orsay virus RNA1 Cal Fluor Rød 610 (CF610) GACATATGTGATGCCGAGAC
Orsay2 Rød Orsay virus RNA2 Cal Fluor Rød 610 (CF610) GTAGTGTCATTGTAGGCAGC
MicroA-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Rød 610 (CF610) CTCTGTCCATCCTCGGCAA
MicroB-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Rød 610 (CF610) CTCTCGGCACTCCTTCCTG
MicroF-CF610 Nematocida parisii 18S Cal Fluor Rød 610 (CF610) AGACAAATCAGTCCACGAATT
MicroSp1A-FAM Nematocida ausubeli 18S 5' 6-fluorescein (FAM) CAGGTCACCCCACGTGCT

Tabell 1: Liste over FISH-sondesekvenser. Alle FISH-sonder ble kommersielt kjøpt med fluoroforen festet til 5'-enden (via tilpasset oligonukleotidsyntese; se materialtabell) og oligonukleotidene ble renset ved omvendt fase HPLC.

Discussion

Wild C. elegans er naturlig forbundet med en rekke mikrober. Forskere kan bruke RNA FISH til å oppdage og identifisere disse mikrober, samt få innsikt i lokaliseringen i sammenheng med et helt dyr. Mikrober med ønskelige eller interessante fenotyper kan identifiseres gjennom denne metoden og deretter isoleres for videre karakterisering og sekvensering. Mengden av mange bakterieisolater fra ville C. elegans kan også kvantifiseres via RNA FISH29. Ved å bruke protokollen som er beskrevet her, er det også mulig å observere kjente mikroorganismer i vertene og lære mer om samspillet deres. Det er viktig at Orsay-virus og mikrosporidia er obligatoriske parasitter og ikke kan dyrkes uavhengig av verten, så FISH er standard visualiseringsverktøy. Kolonisering eller infeksjon kan også kvantifiseres gjennom RNA FISH ved hjelp av nematoder dyrket på plater sådd med en ønsket dyrkbar bakterie av interesse. I tillegg til å farge mikroorganismer i C. elegans tarm, kan denne protokollen brukes til andre nematodestammer som C. tropicalis eller Oscheius tipulae19,23.

Den største fordelen med FISH-protokollen er at den tilbyr en enkel, rask og robust metode for å farge mikrober assosiert med C. elegans. Bilder produsert fra FISH-farging har et høyt signal-til-støy-forhold, som oppnås ved å bruke FISH-sonder som retter seg mot det rikelige RNA-et til SSU i prøven. Fordi det vanligvis er 30x eller høyere nivåer av rRNA enn rDNA, skyldes det meste av signalet fra FISH-farging med sonder som retter seg mot rRNA rRNA i stedet for rDNA30. Videre gjør RNA FISH det mulig å se infeksjon eller kolonisering i sammenheng med hele dyret. Denne visualiseringen forenkles gjennom co-farging av vertskjerner med DAPI og / eller bruk av fluorescerende merkede stammer av C. elegans for bedre å markere lokaliseringen av infeksjon eller kolonisering i prøven. For eksempel ble mikrosporidisk-spesifikk FISH brukt til å bestemme vevstropismen til Nematocida displodere ved å bruke et panel av C. elegans-stammer med GFP-uttrykk i forskjellige vev20. I tillegg er denne protokollen egnet til endringer som gjør det mulig for forskere å bestemme de ideelle forholdene som passer for deres spesifikke behov (for eksempel justering av fikseringsperioden, økning av hybridiseringstemperaturen).

Et kritisk skritt i FISH-protokollen er å fikse prøvene. Inkubasjonsperioden etter tilsetning av fikseringsmiddelet er nødvendig for å gi tid for agenten til å permeabilisere prøven. Lengre inkubasjonstider er ikke ideelle for prøver som inneholder transgene fluorescerende proteiner på grunn av proteinnedbrytning av PFA over tid. For prøver som inneholder GFP, er det viktig å bestemme den optimale fikseringstiden for å tillate permeabilisering, samtidig som GFP-signalet opprettholdes.

FISH kan brukes til å farge for bakterier, virus eller mikrosporidia i C. elegans. Den beste typen fikseringsmiddel som brukes til FISH, avhenger imidlertid av prøven og nedstrømskravene. Denne protokollen presenterer en PFA-løsning som det primære fikseringsmiddelet for å farge bakterier og virus. PFA er imidlertid ikke tilstrekkelig for visualisering av mikrosporidiske sporer, da det ikke kan trenge inn i sporeveggen. For visualisering av sporer, bør aceton brukes i stedet. Selv om PFA-fiksering er effektiv for FISH-merking av andre livsstadier av mikrosporidia, inkludert sporoplasmer, meronter og sporonter. Andre store forskjeller ses mellom acetonfiksering og PFA-fiksering; Aceton er mer praktisk fordi prøver raskt kan lagres i fryseren etter tilsetning, uten behov for vask. Imidlertid dreper aceton raskt eksisterende GFP i en transgen vert. PFA er det foretrukne fikseringsmiddelet hvis det er viktig å bevare noen fysiologiske strukturer i verten, da acetonfikserte dyr ser ut til å være mer nedbrutt, noe som gjør identifisering av noen vev vanskeligere. Fordi prøvene er faste, tillater ikke denne FISH-protokollen levende avbildning av vert-mikrobe-interaksjoner in vivo. Imidlertid kan et pulsjaktende infeksjonsforløp etterfulgt av FISH-farging av prøver på forskjellige tidspunkter tillate en å se en viss dynamikk av mikrobiell infeksjon 19,20,31.

Et annet kritisk skritt gjennom hele protokollen er grundig vasking av prøvene før og etter hybridisering. Før hybridisering, når du samler ormene i mikrofugerørene, kan overskytende bakterier eller andre mikrober fra NGM-platene bæres med ormprøven. Tre vasker med PBS-T er standard; Imidlertid kan det være nødvendig med flere vasker for å eliminere eksterne mikroorganismer tilstrekkelig, spesielt ved bruk av tungt forurensede, vilt isolerte C. elegans. Ved visning av de monterte prøvene etter FISH kan det være noe gjenværende FISH-sonde som gir store mengder signal i bakgrunnen av prøven. Vasketemperaturen og antall vasker er viktig for å fjerne overflødig og ikke-spesifikt bundet sonde. For å redusere bakgrunnsfluorescensen er det mulig å utføre to eller tre vasker med 1 ml WB hvert 30. minutt, i stedet for en vask med 1 ml WB i en time. Ulike FISH-sonder kan kreve forskjellige vasketemperaturer. Vanligvis er vasketemperaturen 2 °C over hybridiseringstemperaturen, men dette kan økes hvis det er for mye bakgrunnsfluorescens (høy støy).

FISH-protokollen bruker fluorescerende prober designet for å målrette mot artsspesifikt mikrobielt RNA, men FISH-sonder kan utformes for andre høykopi-transkripsjoner. Andre FISH-sonder kan ha andre smeltetemperaturer, så inkubasjonstrinn må kanskje utføres ved en høyere eller lavere temperatur enn beskrevet. FISH-farging kan identifisere den romlige fordelingen av mikrobiell kolonisering eller infeksjon i verten, noe som muliggjør karakterisering av vertsmikrobe og mikrobe-mikrobe-interaksjoner. En begrensning er at bare noen få konvensjonelle fluoroforer kan brukes samtidig, noe som reduserer antall forskjellige mikroorganismer som kan påvises via FISH samtidig. Dette begrenser bruken for komplekse mikrobiomstudier i C. elegans. Imidlertid bruker flerfarget rRNA-målrettet FISH prober merket med ikke-kanoniske fluoroforer som kan øke antall forskjellige mikrobielle gruppeetiketter15. En annen begrensning er at det er vanskelig å skille mellom nært beslektede arter, spesielt bakterier, som har SSU-sekvenser som er svært like. Den ekstreme sekvensforskjellen mellom mikrosporidia-arter bidrar imidlertid til å lette deres differensiering med denne protokollen (figur 3) 32,33.

Samlet sett beskriver denne FISH-protokollen en teknikk for å oppdage mikroorganismer i C. elegans. Det tillater forskere å bruke et gjennomsiktig og genetisk trekkbart modellsystem for å oppdage og kvantifisere kolonisering og infeksjon innenfor rammen av et intakt dyr, samt identifisere unik mikrobiell oppførsel eller morfologi i verten. En preprintversjon av dette manuskriptet ble lagt ut under gjennomgang34.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Takk til Dr. Marie-Anne Félix for å gi oss ville nematode stammer. Dette arbeidet ble støttet av NSF under CAREER Grant 2143718 og California State University under en CSUPERB New Investigator Award til RJL, NIH under R01 AG052622 og R01 GM114139 til ERT, og av et American Heart Association Fellowship til VL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS Invitrogen AM9822
Acetone Fisher Scientific A-11-1
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) Vectalab NC9524612
EDTA Fisher Scientific S311-500
FISH probes (see Table 1) LGC Biosearch Technologies FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis
KCl Fisher Scientific P217
KH2PO4 Fisher Scientific P-286
Na2HPO4 Fisher Scientific S375-500
NaCl Fisher Scientific S-671
NH4Cl Fisher Scientific A-661
Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 50-980-487 CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately
Thermal mixer Eppendorf 5384000020
Tris base Fisher Scientific BP152
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  2. Balla, K. M., Troemel, E. R. Caenorhabditis elegans as a model for intracellular pathogen infection. Cellular Microbiology. 15 (8), 1313-1322 (2013).
  3. Dimov, I., Maduro, M. F. The C. elegans intestine: organogenesis, digestion, and physiology. Cell and Tissue Research. 377 (3), 383-396 (2019).
  4. Bossinger, O., Fukushige, T., Claeys, M., Borgonie, G., McGhee, J. D. The apical disposition of the Caenorhabditis elegans intestinal terminal web is maintained by LET-413. Developmental Biology. 268 (2), 448-456 (2004).
  5. Szumowski, S. C., Botts, M. R., Popovich, J. J., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. The small GTPase RAB-11 directs polarized exocytosis of the intracellular pathogen N. parisii for fecal-oral transmission from C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 8215-8220 (2014).
  6. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  7. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  8. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6 (12), 2736-2752 (2008).
  9. Felix, M. A., et al. Natural and experimental infection of Caenorhabditis nematodes by novel viruses related to nodaviruses. PLoS Biology. 9 (1), 1000586 (2011).
  10. Osman, G. A., et al. Natural infection of C. elegans by an oomycete reveals a new pathogen-specific immune response. Current Biology. 28 (4), 640-648 (2018).
  11. Zhang, G. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLOS Pathogens. 12 (12), 1006093 (2016).
  12. Clark, L. C., Hodgkin, J. Commensals, probiotics and pathogens in the Caenorhabditis elegans model. Cell Microbiology. 16 (1), 27-38 (2014).
  13. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Michael, L., Markus, S., Petra, P., Holger, D. A multicolor fluorescence in situ hybridization approach using an extended set of fluorophores to visualize microorganisms. Frontiers in Microbiology. 10, 1383 (2019).
  16. Fuchs, B. M., et al. Flow cytometric analysis of the in situ accessibility of Escherichia coli 16S rRNA for fluorescently labeled oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology. 64 (12), 4973-4982 (1998).
  17. O'Neil, D., Glowatz, H., Schlumpberger, M. Ribosomal RNA depletion for efficient use of RNA-seq capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 4-19 (2013).
  18. Franz, C. J., et al. Santeuil and Le Blanc viruses primarily infect intestinal cells in Caenorhabditis nematodes. Virology. 448, 255-264 (2014).
  19. Tran, T. D., Ali, M. A., Lee, D., Luallen, R. J. Bacterial filamentation as a mechanism for cell-to-cell spread within an animal host. Nature Communications. 13 (1), 1-11 (2022).
  20. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLOS Pathogens. 12 (6), 1005724 (2016).
  21. Lažetić, V., et al. et al The transcription factor ZIP-1 promotes resistance to intracellular infection in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 13 (1), 1-16 (2022).
  22. Félix, M. -A., et al. Species richness, distribution and genetic diversity of Caenorhabditis nematodes in a remote tropical rainforest. BMC Evolutionary Biology. 13 (1), 10 (2013).
  23. Morgan, E., Longares, J. F., Félix, M. A., Luallen, R. J. Selective cleaning of wild Caenorhabditis nematodes to enrich for intestinal microbiome bacteria. Journal of Visualized Experiments. (174), e62937 (2021).
  24. Sowa, J. N., et al. The Caenorhabditis elegans RIGI homolog DRH-1 mediates the intracellular pathogen response upon viral infection. Journal of Virology. 94 (2), 01173 (2020).
  25. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLOS Pathogens. 10 (6), 1004200 (2014).
  26. Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLoS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
  27. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  28. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PloS One. 14 (4), 0216011 (2019).
  29. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  30. Fu, R., Gong, J. Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 64 (6), 885-896 (2017).
  31. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  32. Cuomo, C. A., et al. Microsporidian genome analysis reveals evolutionary strategies for obligate intracellular growth. Genome Research. 22 (12), 2478-2488 (2012).
  33. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8 (1), 14023 (2017).
  34. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 185
RNA-fluorescens <em>in situ</em> hybridisering (FISH) for å visualisere mikrobiell kolonisering og infeksjon i <em>Caenorhabditis elegans</em> tarmer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rivera, D. E., Lažetić,… More

Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (185), e63980, doi:10.3791/63980 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter