RNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) for å visualisere mikrobiell kolonisering og infeksjon i Caenorhabditis elegans tarmer

RNA FISH-farging er nyttig for visualisering, identifisering og kvantifisering av mikrober som naturlig koloniserer eller infiserer C.elegans, inkludert mikrobiombakterier og intracellulære patogener. Denne teknikken er enkel, rask og robust, slik at man effektivt kan flekke og visualisere mikrober i sammenheng med et helt intakt dyr. Vi kan bruke RNA FISH til å oppdage og visualisere tarmmikrobiombakterier i ville C.elegans.

Dette kan hjelpe oss med å forstå sammenlignbare interaksjoner i pattedyrsystemer. Etter overføring av nematoder med ønsket mikrobe av interesse, fra NGM-plater til mikrosentrifugerør, vask nematoder ved å legge til en milliliter 1X PBST til mikrofugerør. Spinn ned prøvene i en mikrocentrifuge eller Nanofuge med riktig hastighet.

Bruk en pipette, fjern alle unntatt 100 mikroliter av supernatanten. Gjenta vask med PBST to til tre ganger. For å fikse nematoder med paraformaldehyd, start med å tilsette 33 mikroliter 16% paraformaldehyd til mikrofugerøret som inneholder 100 mikroliter supernatant over nematodepelleten for en endelig konsentrasjon på 4% paraformaldehyd.

Inkuber prøvene som inneholder nematoder kolonisert eller infisert med mikroben av interesse i 30 til 45 minutter ved romtemperatur. Fjern paraformaldehydoppløsningen og tilsett 0, 5 ml PBST til prøvene. Spinn ned prøvene i en mikrosentrifuge med riktig hastighet som nevnt i tekstmanuskriptet.

Fjern så mye av supernatanten som mulig med en pipette uten å forstyrre pelleten. Tilsett 0,5 milliliter PBST til prøvene i mikrofugerørene. Gjenta vask med PBST to til tre ganger.

Etter den siste vasken, spinn ned prøvene og fjern supernatanten, og la pelleten være uforstyrret. Deretter forbereder du en milliliter hybridiseringsbuffer per prøve. Tilsett 800 mikroliter hybridiseringsbuffer til mikrofugerørene som inneholder nematodepelleten.

Pellet prøvene i mikrosentrifugen. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten. Forbered 100 mikroliter per prøve av hybridiseringsbuffer med ønsket FISH-sonde til en endelig konsentrasjon på 5 til 10 nanogram per mikroliter sonde og virvel for å blande.

Tilsett 100 mikroliter hybridiseringsbuffer som inneholder FISH-sonde til hver prøve. Bland ved å forsiktig flikke eller invertere rørene. Inkuber prøvene over natten i et tørt bad ved 46 til 54 grader Celsius eller en termisk mikser ved 46 til 54 grader Celsius ved 1.200 rotasjoner per minutt.

Forbered tre milliliter vaskebuffer per prøve. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet. Fjern hybridiseringsbufferen ved hjelp av en pipette mens du er forsiktig med å la nematodepelleten være uforstyrret.

Tilsett en milliliter forberedt vaskebuffer til hver prøve. Sentrifuge prøvene med riktig hastighet. Fjern vaskebufferen med en pipette, mens du er forsiktig med å la pelleten stå uforstyrret.

Tilsett en milliliter forberedt vaskebuffer til hver prøve. Inkuber prøvene i en time ved 48 til 56 grader Celsius i et tørt bad eller termisk mikser ved 48 til 56 grader Celsius ved 1.200 rotasjoner per minutt. Hvis du inkuberer i et tørt bad, må du forsiktig invertere rørene hvert 15. til 20. minutt.

Sentrifuge prøvene med riktig hastighet. Bruk en pipette, fjern vaskebufferen, mens du er forsiktig med å la pelleten være uforstyrret. Tilsett 100 til 500 mikroliter PBST til hver av prøvene.

På dette tidspunktet kan prøvene lagres i PBST ved fire grader Celsius i opptil en uke til protokollen er klar til å fortsette. Pellet prøvene med riktig hastighet. Fjern så mye PBST som mulig uten å forstyrre nematodepelleten.

Tilsett 20 mikroliter anti-fade monteringsmedium med DAPI til prøvene. Legg i en pipetter på 20 mikroliter med en pipettespiss på 200 mikroliter og bruk saks til å kutte pipettespissen av slik at større nematoder kan pipetteres. Med den kuttede pipettespissen, overfør 5 til 10 mikroliter av pelleten til et mikroskopglass.

Dekk med en 22 x 22 coverslip. For å lagre lysbildene, forsegle kantene på dekselet med neglelakk og hold dem i en mørk boks ved fire grader Celsius til de er klare til videre bruk. Under differensialinterferenskontrastmikroskopet ble en vill Caenorhabditis tropicalis-stamme funnet å være kolonisert med en bakterie som ser ut til å holde seg retningsbestemt til tarmepitelet.

Fluorescerende signal fra den grønne universelle 16S rRNA-sonden og den røde Alphaproteobacteria-artssonden overlapper helt, noe som tyder på at de fleste bakterier som koloniserer tarmene, er den vedheftende Alphaproteobacteria-bakterien. Det todelte RNA-genomet til Orsay-viruset består av RNA1- og RNA2-segmenter, og FISH-sonder rettet mot begge segmentene er utviklet. ZIP1-protein merket med grønt fluorescerende protein ses lokalisert i tarmkjernene til celler som viser positiv Orsay-virus FISH-farging i cytoplasma.

Flere dyr farget med Orsay-spesifikk eller N.parisii-spesifikk FISH er vist å indikere styrken på dette signalet for enkel kvantifisering. Samtidig infeksjon av C.elegans med to microsporidia parasitter ved hjelp av artsspesifikke prober som konkurrerer om binding til 18S, bruk av DAPI for å flekke kjerner muliggjør bedre lokalisering av infeksjonen i sammenheng med hele dyret, spesielt for tarmen som har store, lett identifiserbare kjerner. Infeksjoner med N.parisii resulterer i utvikling av meronter til sporer.

Den resulterende FISH-fargingen demonstrerer små og store stangformede strukturer som sannsynligvis samsvarer med N.parisii-sporer, som er farget med N.parisii-spesifikke sonder i rødt. Når du velger fikseringsmiddel, husk at PFA-fiksering muliggjør bedre bevaring av morfologi og transgen GFP, men acetonfiksering er nødvendig for visualisering av sporoplasmer. RNA FISH kan brukes til å identifisere og visualisere bakterier som koloniserer C.elegans tarmer.

Forskere kan da utføre flere genetiske skjermer for å identifisere faktorer som er involvert i disse vertsmikrobeinteraksjonene.