Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro Analyse af plasmodiuminficerede røde blodlegemer ved cytotoksiske lymfocytter

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/63987
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, 2Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en ny metode til at hjælpe med at belyse mekanismerne for cellulær immunitet over for Plasmodium i blodstadiet af infektion. Dette er et in vitro-assay , der måler inficeret drab af røde blodlegemer ved cytotoksiske lymfocytter.

Abstract

Malaria er et stort folkesundhedsproblem og præsenterer mere end 200 millioner tilfælde om året på verdensplan. På trods af mange års videnskabelig indsats er beskyttende immunitet mod malaria stadig dårligt forstået, hovedsageligt på grund af metodologiske begrænsninger af langvarig Plasmodium-kultur, især for Plasmodium vivax. De fleste undersøgelser har fokuseret på adaptiv immunitetsbeskyttelse mod malaria af antistoffer, som spiller en central rolle i kontrollen med malaria. Imidlertid er den sterile beskyttelse induceret af svækkede Plasmodium sporozoitter-vacciner relateret til cellulært respons, hovedsageligt til cytotoksiske T-lymfocytter, såsom CD8 + og gamma delta T-celler (γδ T). Derfor skal der udvikles nye metoder for bedre at forstå funktionerne i det cellulære immunrespons og dermed understøtte fremtidig terapi og vaccineudvikling. For at finde en ny strategi til at analysere denne cellemedierede immunitet mod Plasmodium blodstadieinfektion etablerede vores gruppe et in vitro-assay, der måler inficerede røde blodlegemer (iRBC), der dræbes af cytotoksiske lymfocytter. Dette assay kan bruges til at studere cellulære immunresponsmekanismer mod forskellige Plasmodium spp. i blodstadiet. Medfødte og adaptive cytotoksiske immunceller kan direkte eliminere iRBC'er og den intracellulære parasit i en effektor: målmekanisme. Mål-iRBC'er er mærket for at evaluere cellelevedygtighed og cokultureres med effektorceller (CD8 + T, γδ T, NK-celler osv.). Lysisprocenten beregnes ud fra testede betingelser sammenlignet med en spontan lysiskontrol i et flowcytometribaseret assay. I sidste ende er denne drabsanalysemetode et stort fremskridt i forståelsen af cellemedieret immunitet over for malaria i blodstadiet, hvilket hjælper med at afdække nye potentielle terapeutiske mål og fremskynde udviklingen af malariavacciner.

Introduction

Malaria er fortsat en global sundhedskrise med mere end 240 millioner tilfælde og 627,000 malariarelaterede dødsfald rapporteret i 20201. Der er i øjeblikket fem parasitære arter, der kan forårsage malaria hos mennesker, hvoraf Plasmodium falciparum og Plasmodium vivax er de to mest udbredte arter. Under Plasmodium-infektion er leveren eller præerythrocytisk stadium asymptomatisk, og symptomer forekommer kun under parasitens aseksuelle cyklus i det erythrocytiske stadium. På dette infektionsstadium frigives tusindvis af merozoitter afledt af leverstadiet i blodbanen og inficerer røde blodlegemer (RBC'er). I RBC differentierer parasitterne sig til trofozoitter og schizonter ved skizogoni, indtil schizonter bryder erytrocytten, frigiver nydannede merozoitter og gentager denne blodcyklus. Gentagne cyklusser af invasion, replikation og merozoitfrigivelse resulterer i en eksponentiel vækst i parasitpopulationen og udløser i sidste ende sygdomssymptomer2.

En vigtig udfordring ved at studere immunresponset på malaria er, at Plasmodium spp. der inficerer mennesker, inficerer ikke laboratoriedyremodeller. Således skal Plasmodium-inficerede patientprøver indsamles friske og straks behandles og analyseres. I malaria-endemiske områder er ressourcerne til at få adgang til immunologiske og molekylære mekanismer imidlertid begrænsede. På grund af disse begrænsninger anvendes gnavere i vid udstrækning som eksperimentelle modeller til at undersøge immunresponset mod Plasmodium-infektion. Mens P. berghei og P. chabaudi ofte bruges som surrogater for P. falciparum-infektion, har den ikke-dødelige stamme af P. yoelii 17XNL også mange træk til fælles med P. vivax, såsom reticulocytbegrænset infektion 3,4. Udviklingen af Plasmodium in vitro-assays, der kan anvendes til humane eller animalske modelafledte prøver, er værdifuld for at få en bedre forståelse af patogenesen af malaria og sammenligne det immunologiske respons, der fremkaldes af forskellige arter af parasitten.

Beskyttende antimalarial immunitet forstås ikke fuldstændigt hverken på det præerythrocytiske stadium eller blodstadiet. Det er kendt, at eksponering for gentagne infektioner resulterer i delvis erhvervet immunitet, men steril immunitet udvikles sjældent5. I årtier var anti-Plasmodium beskyttende immunitet hovedsageligt forbundet med induktion af neutraliserende eller opsoniserende antistoffer, der forhindrer parasitinvasion af værtsceller eller fører til fagocytose af antigenpræsenterende celler, henholdsvis6. Som følge heraf har de fleste bestræbelser på at producere malariavacciner hidtil været afhængige af at inducere beskyttende og langvarige antistoffer 7,8. Den sterile beskyttelse induceret ved vaccination med en svækket sporozoit korrelerer imidlertid direkte med aktivering og ekspansion af cytotoksiske T-lymfocytter 8,9.

For nylig har nogle undersøgelser af nyligt isolerede patientprøver og in vitro-kulturer vist, at medfødte eller adaptive cytotoksiske immunceller som CD8 + T10, γδ T 11 og NK-celler12 direkte kan eliminere Plasmodium-inficerede RBC'er og dets intracellulære parasit på en effektor: målforholdsmåde. Disse skelsættende fund definerede en helt ny immuneffektormekanisme i forbindelse med malaria. For at dissekere denne nye malariaimmunitet er det vigtigt at undersøge cytotoksiske virkningsmekanismer i dræberceller mod inficerede RBC'er (iRBC'er) i naturlig infektion eller vaccination.

Her præsenterer vi et in vitro-assay , der måler lymfocytternes cytotoksiske aktivitet mod malaria i blodstadiet. Dette assay kan derefter hjælpe med at belyse mekanismerne i det cellulære immunrespons mod Plasmodium erytrocytstadiet. Målcellerne, iRBC'er, er mærket med carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) for at evaluere cellelevedygtighed og dyrkes derefter sammen med effektorceller som cytotoksiske lymfocytter (CTL). Denne cokultur evalueres derefter ved flowcytometri ved hjælp af fluorescerende markører for specifikke celletyper. Endelig beregnes procentdelen af iRBC-lyse ved CTL ved at dividere den eksperimentelle tilstand med den spontane ruptur af RBC'er og spontan lysiskontrol, som forekommer under inkubation uden effektorcellen. Samlet set kan denne drabsanalysemetode bidrage til en bedre forståelse af cellemedieret malariaimmunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev gennemført efter politikkerne fra Oswaldo Cruz Foundation og National Ethical Council (CAAE: 59902816.7.0000.5091). De humane protokoller blev udviklet i samarbejde med den kliniske forskningsgruppe fra Research Center for Tropical Medicine of Rondônia (CEPEM), som var ansvarlig for at tilmelde patienter i undersøgelsen. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle patienterne.

Til dyreforsøget blev der udført procedurer efter principperne for adfærd i den brasilianske praksisvejledning til pleje og brug af dyr til videnskabelige og didaktiske formål fra National Council for the Control of Animal Experimentation (CONCEA). Protokollerne blev godkendt af Fiocruz Animal Experimentation Council (CEUA-protokol LW15/20-2).

1. Indsamling af humane blodprøver og PBMC-isolering

  1. Opsaml blod fra Plasmodium-inficerede patienter i et 10 ml evakueret blodopsamlingsrør med natriumheparin. Da malariapatienter viser lymfopeni, er der en række 5-9 x 106 mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) i en 10 ml blodprøve. Da CD8 + T-celler eller γδ T-celler udgør ~ 10% af PBMC'er, skal du helst indsamle 50-100 ml blod / patient.
    BEMÆRK: Mindst 1 x 105 effektorceller / tilstand bør overvejes.
  2. Beregn procentdelen af iRBC'er ved blodudstrygning som beskrevet nedenfor.
    1. Tilsæt 5 μL totalt blod til et klart dias og forbered en blodudstrygning. Udfør Romanowsky-type panoptisk hurtig plet eller May-Günwald-Giemsa-plet. Her anvendes det panoptiske hurtige pletsæt, som består af tre reagenser: reagens A (fiksering), reagens B (cytoplasmatisk plet) og reagens C (nuklear og cytoplasmatisk differentiel plet).
    2. Dyp langsomt objektglasset i opløsning A 10x, derefter 4x i opløsning B og til sidst 10x i opløsning C. Eventuelt overskydende reagens fjernes fra objektglassene mellem opløsningerne. Efter dypning i opløsning C skylles objektglasset i rindende vand fra hanen og lader det tørre.
    3. Under et opretstående lysmikroskop med et 100x olienedsænkningsmål tælles 1000 RBC'er i sekventielle firkanter og beregner procentdelen af parasitæmi ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 1
  3. Fortynd 15 ml blod i forholdet 1:1 i sterilt fosfatbufret saltvand (PBS).
  4. Tilsæt 15 ml lymfocytseparationsmedium (densitet på 1,077 g / ml) til et 50 ml rør. Lag forsigtigt 30 ml fortyndet blodprøve på centrifugeringsmedieopløsningen. Når prøven lægges i lag, må blodprøven og lymfocytseparationsmediet ikke blandes.
  5. Centrifuger glassene ved 400 x g i 40 minutter ved 22 °C med lav acceleration og ingen pauseindstilling.
  6. Træk det øverste lag indeholdende plasma af ved hjælp af en steril pipette, og lad det mononukleære cellelag være uforstyrret. Overfør laget af mononukleære celler (PBMC'er) til et sterilt rør ved hjælp af en steril pipette.
  7. Kassér ikke røret, der indeholder blodpillen, da det senere vil blive brugt til inficeret RBC-isolering. Fra dette trin skal du sørge for at holde RBC'erne ved stuetemperatur (RT). Lad dem aldrig køle af.
  8. Cellerne vaskes to gange ved tilsætning af PBS og centrifugeres ved 350 x g i 10 minutter med pauseindstilling. Resuspender cellepillen i 5 ml RPMI-medium suppleret med penicillin/streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS; komplet medium).
  9. Tæl PBMC'erne i nærvær af trypanblå opløsning for at kontrollere cellelevedygtighed ved hjælp af et hæmacytometer (Neubauer-kammer) eller automatiseret celletæller. Tæl ikke de blåfarvede celler, da disse repræsenterer døende celler, som absorberer trypanblå.
  10. Cellekoncentrationen justeres til 107 celler/ml ved hjælp af hele mediet. Rens de ønskede cytotoksiske lymfocytpopulationer (CD8 + T-celler, NK-celler, γδ T-celler) ved hjælp af magnetisk perleisolering i henhold til reagensproducentprotokollen.

2. Isolering af menneskelig RBC

BEMÆRK: Til human-inficeret RBC-isolering anbefales det at starte med blodprøver, der har mindst 2% parasitæmi, fortrinsvis med mere i trofozoit / tidlig skizont parasit fase.

  1. PERCOLL (i det følgende benævnt densitetsgradientseparationsmedium) fremstilles ved den anbefalede koncentration som beskrevet nedenfor.
    1. Der tilsættes 90 ml separationsmedium med 100 % densitetsgradient og 10 ml 10x PBS for at opnå 90 % isotonisk densitetsgradientseparationsmedium.
    2. Til P. vivax-inficeret reticulocytseparation fremstilles45% densitetsgradientseparationsmedier. Der tilsættes 50 ml 90 % isotonisk separationsmedium for gradientgradient og 50 ml 1x PBS for at opnå 45 % separationsmedium for densitetsgradient.
    3. Til P. falciparum-inficeret erytrocytseparation fremstilles 65% densitetsgradientseparationsmedier. Tilsæt 72 ml 90% isotonisk densitetsgradientseparationsmedium og 28 ml 1x PBS for at opnå 65% densitetsgradientseparationsmedium.
    4. Til uinficeret reticulocytseparation fremstilles 70% densitetsgradientseparationsmedier. Tilsæt 78 ml 90% isotonisk densitetsgradientseparationsmedium og 22 ml 1x PBS for at opnå 70% densitetsgradientseparationsmedium.
  2. Separationsmediet for massefyldegradient opvarmes til 37 °C i vandbad.
  3. Efter fjernelse af PBMC-laget fjernes forsigtigt så meget af det øverste lag centrifugeringsmedium som muligt uden at røre cellerne. Med en glaspasteurpipette fjernes det øvre neutrofillag forsigtigt uden at forstyrre RBC-pelleten og estimerer pelletvolumen. Tilsæt 4x RBC-pelletvolumenet af RT komplet medium og resuspender.
  4. I et andet 50 ml konisk rør tilsættes 5x pelletvolumenet på 45%, 65% eller 70% densitetsgradientseparationsmedium afhængigt af celletypen, der skal isoleres. Lag RBC-suspensionen forsigtigt oven på densitetsgradientseparationsmediumlaget.
  5. Spin i 15 minutter ved 850 x g, med lav acceleration og ingen pauseindstilling. Det uklare røde/brune lag, der ligger mellem supernatanten og separationsmediet for densitetsgradienten, opsamles med en 5 ml pipette. Overfør til et sterilt 15 ml rør.
  6. Vask cellerne ved at tilsætte RT komplet medium op til 15 ml og drej ned i 10 minutter ved 860 x g. Gentag vasken ved at tilsætte 10 ml RT komplet medium og drej ned. Supernatanten kasseres, og der fremstilles et blodudstrygning fra pelletten for at kontrollere, om der er iRBC-berigelse, efter trin 1.2.
  7. Resuspender pellet i 1 ml RT komplet medium og lad det sidde ved stuetemperatur, mens cellerne tælles. Tilsæt 10 μL cellesuspension i et hæmocytometer (Neubauer-kammer) og tæl RBC'erne i det centrale område opdelt i 25 mellemstore firkanter. Juster cellekoncentrationen til 1 x 107 iRBC'er/ml i RT komplette medier.

3. Eksperimentel malariainfektion hos mus

  1. Optø en prøve kryopræserveret P. yoelii 17XNL:PyGFP (MRA-817), en GFP-ekspressionsstamme opnået fra MR4/ATCC, og injicer 100 μL intraperitonealt (i.p.) i en 8 uger gammel C57BL/6-hunmus.
  2. Følg parasitæmibyrden hver 3. dag ved halevene lancing blodindsamling.
    1. Punktere karret med nålen skrå op og komme ind i venen i en lav vinkel, der begynder ved den distale ende af halen.
    2. Opsaml blodprøven med en pipette eller et kapillarrør op til 5 eller 10 ml, og tryk derefter manuelt for at stoppe blødningen.
    3. Forbered et blodudstrygning (som beskrevet i trin 1.2), indtil parasitæmi når 10% -15% af inficerede RBC'er.
  3. Der opsamles 10 μL blod ved hjælp af en halevene og fortyndes til 100 μL PBS for at injicere i den anden donormus.
    BEMÆRK: Kryopræserverede parasitter skal optøs og overføres til mus to gange, før de anvendes til eksperimentelle infektioner.
  4. Når den anden passage når 15% af parasitæmi, samles fem dråber blod ved haleklipningsmetoden og fortyndes i 1 ml PBS. Forbered en infektionsopløsning ved at justere koncentrationen til 1 x 106 iRBC'er/ml i steril PBS, og injicer i.p. 100 μL (1 x 105 iRBC'er) af opløsningen i hver mus, der kræves til forsøget.
  5. Overvåg parasitæmi hver 2-3 dage, indtil den når ~ 30% iRBC'er, hvilket forekommer cirka 12 dage efter infektion. Når musene når den ønskede parasitæmi, skal du indsamle blod ved hjertepunktur som beskrevet nedenfor.
    1. Opsug 100 μL heparinopløsning (30 E/ml) til en 1 ml sprøjte med en 26 G kanyle.
    2. Bedøv musen ved indånding med 5% isofluran og bekræft fraværet af reflekser. Placer musen på siden og stik vinkelret nålen lige under albuen, gennem ribbenene og ind i hjertet. Træk langsomt sprøjtestemplet ud og drej kanylen, indtil der opnås 0,5-1 ml blod.
    3. Udfør human eutanasi ved cervikal dislokation under anæstesi. Rengør musens venstre side aseptisk med 70% ethanol. Med kirurgisk saks skal du lave et snit på venstre side af musen, der passerer gennem huden og bughinden. Find milten og fjern den.
    4. Anbring musemilten i en petriskål med 5 ml komplet medium for at rense den ønskede effektorcellepopulation (f.eks. CD8+ T-celler).

4. Opnåelse af friske hele musesplenocytter

  1. I petriskålen skæres milten forsigtigt i små stykker ved hjælp af en saks eller en barbermaskine.
  2. Anbring en 100 μM cellesi over et 50 ml konisk rør og overfør den udskårne milt til cellesien med en pipette. Mos milten gennem silen med et sprøjtestempel.
  3. Vask cellerne gennem silen med 10 ml komplet medie. Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten kasseres.
  4. Resuspender cellepelleten i 2 ml kold 1x RBC-lysebuffer. Inkuber suspensionen i 5 minutter på is.
  5. Cellesuspensionen vaskes med 10 ml 4 °C fuldmedier. Gentag vasketrinnet tre gange, og fjern eventuelle cellepropper mellem miltvaskene fra Plasmodium-inficerede mus.
  6. Cellerne centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, hvorefter supernatanten kasseres.
    BEMÆRK: Plasmodiuminficerede milt forstørres og fyldes med fagocytiske celler indeholdende nedbrudt hæmoglobin og hæmozoin.
  7. For at undgå problemer under magnetisk perleisolering af effektorceller skal du bruge følgende trin til at fjerne hæmozoinberigede fagocytiske celler og hæmozoin. Miltcellerne resuspenderes med MACS-bufferen, og koncentrationen justeres til 1 x 108 celler/ml. Placer en LS- eller LD-søjle i magnetfeltet. Klargør kolonnen ved at skylle med 3 ml MACS-buffer.
  8. Påfør cellesuspension på kolonnen. Vask kolonnen tre gange med 3 ml MACS-buffer. Opsaml gennemstrømning indeholdende miltcellerne.
  9. Tæl splenocytterne i en trypanblå opløsning og kontroller cellelevedygtigheden i et hæmacytometer (Neubauer-kammer) eller automatiseret celletæller. Juster cellekoncentrationen til 1 x 107 celler/ml i RT komplette medier.

5. Cytotoksisk effektorcellerensning (CD8a + T-celle negativ selektion)

BEMÆRK: Der er mange positive og negative selektionsreagenser, der kan rense cytotoksiske effektorceller (CD8 + T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-celler). I denne protokol bruger vi et negativt udvalg af milt-CD8a + T-celler og følger producentens instruktioner.

  1. Alle splenocytter centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres. Resuspender cellepellet i 40 μL MACS-buffer.
  2. Tilsæt 10 μL af en biotin-antistofcocktail. Bland godt og inkuber i 5 min på is.
  3. Tilføj 30 μL MACS-buffer. Tilsæt 20 μL anti-biotin mikroperler. Bland godt og inkuber i 10 min på is.
  4. Tilsæt 400 μL MACS-buffer og fortsæt til magnetisk celleseparation. Placer MACS LS-søjlen i magnetfeltstøtten. Klargør kolonnen ved at skylle med 3 ml MACS-buffer.
  5. Påfør cellesuspension på kolonnen. Vask kolonnen tre gange med 3 ml MACS-buffer. Saml gennemstrømningen, der indeholder alle umærkede celler, som er de forbedrede CD8a + T-celler.
  6. Tæl CD8a + T-cellerne i en trypanblå opløsning og kontroller cellelevedygtigheden i et hæmacytometer (Neubauer-kammer) eller automatiseret celletæller. Juster cellekoncentrationen til 1 x 107 celler/ml i RT komplette medier.

6. P. yoelii inficeret RBC-isolering

  1. Centrifuger det opsamlede blod i et 1,5 ml rør ved 850 x g i 3 min. Kassér serumet og resuspender blodet i 1 ml 1x RPMI uden FBS.
  2. Placer LS-søjlen i magnetfeltstøtten og skyl med 3 ml 1x RPMI. Før RBC-suspensionen gennem kolonnen. For at isolere flere iRBC'er skal du genanvende gennemstrømningen (3 ml RPMI og 1 ml fortyndet blod) i kolonnen.
  3. Vask to gange med 5 ml 1x RPMI. Udfør vasketrin ved at tilføje bufferalikvoter, så snart søjlebeholderen er tom. Lad ikke nogen kolonner tørre op.
  4. Tilføj 5 ml RPMI, fjern kolonnen, og rens iRBC'erne i et nyt 15 ml rør. Tæl iRBC'erne og juster koncentrationen til 1 x 107 RBC'er/ml.

7. CFSE-mærkning af RBC'er og forberedelse til flowcytometri

BEMÆRK: Start RBC-mærkningsprotokollen med dobbelt så mange celler, der skal bruges til eksperimentet, da ~ 50% af cellerne typisk går tabt i vasketrinnene efter CFSE-mærkningstrinnet. For at fastslå autofluorescensen af RBC'erne / iRBC'erne skal du inkludere en kontrolprøve af umærkede celler.

  1. Fortynd CFSE til en slutkoncentration på 10 mM i 1x RPMI uden FBS. Vask cellerne en gang med 1x RPMI uden FBS i et 15 ml rør.
  2. Resuspender RBC'erne i 500 μL 1x RPMI uden FBS, og tilsæt 500 μL af den fortyndede CFSE. Inkuber i 8 minutter ved RT, beskyttet mod lys.
  3. Der vaskes tre gange ved at tilsætte 14 ml komplet substrat (10 % FBS RPMI) efterfulgt af centrifugering ved 850 x g i 10 minutter. Resuspender cellerne i komplet medium til en koncentration på 1-5 x 106 / ml. Inkuber i 1 time ved RT.

8. Cytotoksisk lymfocyt / RBC-samkultur og forberedelse til flowcytometri

BEMÆRK: Hvis involveringen af specifikke receptorer eller molekyler måles, inkuberes de specifikke blokerende og isotypekontrolantistoffer (10 mg / ml) med effektorcellerne i 30 minutter før cokultur.

  1. Plade cellerne i en 96-brønds rundbundet plade. Tilsæt de oprensede lymfocytter og CFSE-mærkede iRBC'er i det ønskede effektor-målcelleforhold til et slutvolumen på 200 μL og homogeniser. Forbered hver betingelse i tre eksemplarer.
    BEMÆRK: Vi foreslår at justere iRBC-koncentrationen til 1-5 x 104 celler / ml og vælge forholdet baseret på det rensede cellenummer (f.eks. 0,5: 1, 2,5: 1 og 5: 1).
  2. Inkluder spontan lysekontrol, som er mål-iRBC'erne uden effektoren, for at evaluere enhver spontan lyse, da dette vil blive brugt til at repræsentere en 100% cellelevedygtighedstilstand.
  3. Drej pladen ned i 1 min ved 360 x g for at maksimere cellekontakten. Der inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 timer.
    BEMÆRK: Hypoxibetingelser (lavO2), systematisk anvendt til P. falciparum-kultur , bør ikke anvendes, da effektorcellerne ikke overlever i dette miljø. I modsætning hertil er Plasmodium-parasitter levedygtige i den omgivende luft i 5% CO2 i op til 12 timer.
  4. Drej i 5 minutter ved 850 x g , og vend pladen for at fjerne supernatanten.
    BEMÆRK: Supernatanten kan om ønsket anvendes til måling af eventuelle opløselige faktorer, der frigives i samkulturen.
  5. Mærk RBC'erne med anti-mus Ter119 1:200 (eller anti-human CD235 1:100 for humane prøver) og CD8+ T-celler med anti-CD8 1:200 eller anti-CD3 1:200 antistoffer (anti-mus eller menneske) i 30 minutter ved 4 °C i 1x PBS indeholdende 3% FBS (FACS-buffer).
    BEMÆRK: Antistoffluoroforen skal vælges ud fra cellesporer/celleproliferationsreagenset (f.eks. CFSE-mærket iRBC, APC-Cy7 anti-Ter119 og PerCP-Cy5.5 anti-CD8a).
  6. Cellerne vaskes med FACS-buffer og centrifugeres ned i 5 minutter ved 850 x g. Prøverne overføres til FACS-rør, og der tilsættes 30 μL tælleperler til de enkelte rør . Homogeniser tælleperlerne ved hvirvelstrøm i 30 s.

9. Flowcytometri

  1. Analysér prøver ved hjælp af et 405/488/561/640 laserinstrument.
  2. For humane celler mærket med CFSE (FITC), PE anti-human γδ TCR og PE-Cy7 anti-human CD235a antistof, brug 530/30 (FITC), 575/25 (PE) og 780/60 (PE-Cy7) filtre i et tre-laser (blå, rød, gulgrøn) konfigurationscytometer.
  3. Til museceller mærket med CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 anti-mus CD8a og APC-Cy7 anti-mus Ter119 skal du bruge 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5) og 780/60 (APC-Cy7) filtre i tre-lasercytometeropsætningen.
  4. Vælg tælleperlepopulationen som stopport for at erhverve mindst 20.000 begivenheder i stopporten, som skal være ens for alle forhold. Udfør analyse og kompensation ved hjælp af passende flowcytometri erhvervelse / analyse software.
  5. Indstil gating-strategien som beskrevet nedenfor.
    1. Vælg enkeltceller (singlets), undtagen snavs ved hjælp af FSC-tophøjde (H) til areal (A) forhold. Vælg RBC'er, og ekskluder lymfocytterne fra analyse baseret på fluorescens af RBC-markøren (Ter119 eller CD235a) og det lymfocytspecifikke antistof (CD8a).
    2. I den forrige RBC-gating skal du vælge levedygtige RBC'er baseret på CFSE-positiv farvning. Analyser dataene med flowcytometerdataanalysesoftware.

10. Beregning og statistik

  1. For at beregne procentdelen af iRBC-lysis skal du følge gating-strategien beskrevet i trin 9. Procentdelen af levedygtige RBC'er er frekvensen af CFSE-positive celler inde i RBC-porten baseret på Ter119 (mus) eller CD235a (human) positiv fluorescens.
  2. Brug den spontane lysekontrol, RBC'er uden effektorceller, tilstand som kontrol til at estimere RBC spontan ruptur. Denne tilstand vil blive betragtet som RBC-lysis (100% levedygtighed). Brug følgende formel til at beregne procentdelen af RBC-lysis i hver testet tilstand:
    Equation 2
    BEMÆRK: Under kulturinkubationen kan nogle inficerede RBC'er spontant lyse eller briste af parasitten. Brug den CFSE-positive RBC-frekvens af den spontane lysetilstand, som ikke indeholder effektorceller, som baseline for lymfocytcytotoksicitet.
  3. Beregn gennemsnittet af triplikater for hver tilstand, og bestem statistisk signifikans ved hjælp af tovejs ANOVA ved flere sammenligninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her beskrives den anvendte metode til isolering af CFSE-mærkede Plasmodium-inficerede RBC'er i et cokulturassay med cytotoksiske lymfocytter. For det første giver vi en skematisk repræsentation af, hvordan man udfører protokollen, idet der anvendes humane prøver inficeret med P. vivax (figur 1). Derefter et illustreret flowchart om, hvordan man fortsætter med protokollen i en malariaeksperimentel model ved hjælp af en C57BL/6-mus inficeret med P. yoelii (figur 2). I figur 3 vises de forventede resultater (før og efter) for trin 6 i protokollen (berigelse af P. yoelii-inficerede RBC'er ved hjælp af magnetiske søjler). Endelig viser figur 4 en repræsentativ flowcytometrianalyse, der beskriver den gating-strategi, der er nødvendig for at vurdere procentdelen af RBC-lyse, som beskrevet i trin 9. Derfor fremhæver dette afsnit de forskellige teknikker, der anvendes her, og beskriver hele processen med erhvervelse, samling og dataanalyse for at vurdere iRBC-drab ved cytotoksiske lymfocytter.

Human Plasmodium-inficerede RBC'er lysis ved cytotoksiske celler
Figur 1 viser en skematisk fremstilling af protokollen til evaluering af cytotoksiske cellers drab på humane plasmodiuminficerede RBC'er. For at måle cellelyse blev PBMC fra Plasmodium-inficerede patienter oprenset ved hjælp af separationsmediet efterfulgt af magnetisk oprensning af den cytotoksiske lymfocytpopulation (CTL) af interesse (f.eks. CD8+ T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-celler osv.). RBC'ernes pellet, der var tilbage fra PBMC-isolationen, blev brugt til at berige Plasmodium-inficerede RBC'er ved hjælp af densitetsgradientseparationsmedium (65% P. falciparum; 45% P. vivax). iRBC'er blev mærket med CFSE og inkuberet med eller uden lymfocytter i 4 timer ved 37 °C, 5% CO2. Efter samkulturperioden blev alle RBC'er (inficerede eller ej) mærket med anti-humant CD235a-antistof (for RBC'erne) og CTL-specifikke antistoffer (f.eks. Anti-CD8, anti- γδTCR osv.) før flowcytometrianalyse. Udvælgelsen og analysen af humane prøver svarede til dem, der blev påvist for museprøver i figur 4.

P. yoelii-inficeret RBC-lysis ved cytotoksiske CD8 + T-celler
Et rutediagram over den eksperimentelle procedure til evaluering af den cytotoksiske effektormekanisme i den eksperimentelle malariamodel er vist i figur 2 sammen med repræsentative eksperimentelle data vist i figur 3 og figur 4. C57BL/6 mus blev inficeret med 1 x 105P. yoelii (Py) iRBC'er, og parasitæmi blev overvåget, indtil den nåede omkring 30%. Py-iRBC'er blev isoleret fra blod ved hjælp af magnetisk adskillelse, da parasithæm-underproduktet, hæmozoin, er jernberiget og fungerer som paramagnetiske partikler i et magnetfelt13. Renheden af den berigede prøve blev analyseret ved blodudstrygning i sammenligning med prækolonneprøven (figur 3). iRBC'er blev derefter mærket med cellesporreagenset CFSE. Parallelt blev cytotoksiske CD8 + T-celler renset fra splenocytter ved hjælp af et magnetisk negativt selektionssæt. Som kontrol blev den samme protokol brugt til CD8 + T-cellerensning fra uinficerede mus. Effektorceller (CD8+ T) og målceller (CFSE-mærkede Py-iRBC) blev inkuberet ved forskellige effektor:målforhold (E:T: 0,5:1, 2,5:1 og 5:1) i 4 timer ved 37 °C 5% CO2. I slutningen af samkulturen blev hver tilstand mærket med antistoffer anti-mus Ter119 for RBC'er og anti-CD8a for cytotoksiske celler. Gating strategien og prøveresultaterne er vist i figur 4. 

Figure 1
Figur 1. Skematisk oversigt over in vitro-dræbende assay. Eksempel på dræbende assay-eksperiment. Plasmodiuminficeret blod opsamles og behandles under anvendelse af et separationsgradientmedium. Efter centrifugering opsamles PBMC-laget, og cytotoksiske celler (CTL'er) blev renset under anvendelse af magnetiske perler. RBC-laget behandles igen ved hjælp af densitetsgradientseparationsmedier. Efter centrifugering opsamles Plasmodium-iRBC-laget og mærkes med CFSE. Derefter blev de oprensede CTL og iRBC'er cokultureret i 4 timer ved 37 °C, 5% CO2, efterfulgt af cellespecifik mærkning og analyse i et flowcytometer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Eksperimentel malariamodel til dræbende analyse. Først blev C57BL/6-mus inficeret med 105 PyX17NL-inficerede røde blodlegemer. Derefter overvåges parasitæmi ved blodudstrygning, indtil toppen af infektionen (30% -40% iRBC'er), ca. 12 dage efter infektion (dpi). Den næste dag blev mus blødt og aflivet til miltindsamling. Blodet blev behandlet, og inficerede RBC'er blev beriget ved magnetisk adskillelse efterfulgt af mærkning med CFSE (øverst til højre). Milten blev behandlet til cytotoksisk lymfocytisolering ved negativ selektion ved anvendelse af magnetiske perler. Derefter blev de oprensede cytotoksiske lymfocytter og iRBC'er dyrket sammen i 4 timer ved 37 ° C, 5% CO2, efterfulgt af cellespecifik mærkning og analyse i et flowcytometer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. iRBC-berigelse ved hjælp af magnetiske søjler. IRBC'erne blev renset fra P. yoelii-inficerede mus ved hjælp af LS-søjler. Oprensningen fremhæves ved blodudstrygninger fra blod indsamlet før ( A ) og efter (B) kolonneberigelse. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Vurdering af cellelyseprocent af P. yoelii-iRBC'er af CD8+ lymfocytter. Gating strategien for cellelyse procent. (A) Sæt stopporten ind i tælleperlepopulationen (~ 20.000 begivenheder). (B) Kontroller spontan lyse, iRBC'er uden lymfocytter. Start gating-strategien ved at vælge de enkelte celler, eksklusive affald, baseret på forholdet mellem FSC-tophøjde og areal, efterfulgt af udvælgelsen af RBC-populationen i APC-Cy7 Ter119-positiv og PerCP-Cy5.5 CD8-negativ. Vælg derefter live iRBC'er som CFSE (FITC) høj positiv. (C) Eksempel på eksperimentanalyse med forskellige effektorer: målforhold, der viser procentdelen af levende RBC efter cokulturen. D) Grafisk gengivelse af RBC-lyseprocenten beregnet på grundlag af formlen beskrevet i punkt 10. Signifikanssammenligningen mellem grupperne (cytotoksisk CD8 eller naiv CD8) blev vurderet ved tovejs ANOVA med flere sammenligninger. P < 0,0001 (****). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi et in vitro-assay til måling af Plasmodium-inficerede røde blodlegemer, der dræbes af cytotoksiske lymfocytter. Dette assay kan hjælpe med at belyse mekanismerne for cellulær beskyttende immunitet over for malariaparasitens erythrocytiske stadium. Den største fordel ved denne metode er, at den giver et kvantitativt assay af cellemedieret drab af iRBC'er, der kan bruges til at løse mange spørgsmål om, hvordan immunceller interagerer med forskellige Plasmodium spp.

Det er vigtigt, at denne metode kan bruges til at studere P. vivax og andre Plasmodium-parasitter, der ikke opretholdes in vitro-kultur 14,15. Derudover kan denne protokol tilpasses enhver Plasmodium-art og forskellige værter, såsom mennesker, mus og ikke-menneskelige primater. Flowcytometribaserede metoder anvendes i vid udstrækning til at evaluere cytotoksisk celleaktivering, cytokinproduktion og degranulering10,11,16, men den nuværende metode er den eneste, der udforsker RBC-lysis ved direkte cellekontakt med dræberceller.

Der er også mange metoder, såsom mikroskopi, polymerasekædereaktion (PCR) og flowcytometri, der bruges til at studere malaria ved at måle parasitæmi, invasion og malariaaktivitet. For at analysere den cellemedierede cytotoksicitet af RBC'er er nuværende metoder, der bruger Cr51 eller hæmoglobinfrigivelse, imidlertid ikke følsomme nok til at evaluere RBC-lyse. LDH-frigivelse kan også bruges til at evaluere RBC-drab af nogle CTL'er som CD8 + T-celler, men måling af LDH er ikke en nøjagtig metode, da aktiverede medfødte eller medfødte lignende celler kan dræbe hinanden som en reguleringsmekanisme.

CFSE bruges i vid udstrækning til at spore celler eller udforske celleproliferation i flowcytometri eller fluorescerende mikroskopi17. Da RBC'er ikke spredes18, bør CFSE-fluorescensintensiteten falde med cellelyse. Flowcytometri er en meget præcis teknik, da den kan detektere meget lave niveauer af specifikke markører, og det har derfor været meget brugt til at spore parasitæmi og invasion i malariainfektion 19,20,21,22,23. Vigtigst er det, at flowcytometri kan måle mange parametre i en enkelt celle og sortere celler i forskellige populationer. Ved at tilføje kvantitative standardreagenser (tælleperler) til hver prøve kan man normalisere antallet af erhvervede begivenheder og opnå absolutte celletal24. Denne metode giver mulighed for en pålidelig kvantitativ sammenligning mellem forsøgsbetingelser, hvilket er afgørende for den aktuelt foreslåede protokol.

Nogle kritiske trin for denne protokol omfatter sikring af prøvekvaliteten, sikring af korrekt cellefarvning og inkludering af kontroller til normalisering af beregninger. Der kræves en stor mængde friske blodprøver for at rense inficerede RBC'er. Oprensningen af densitetsgradientseparationsmediet bør behandles omhyggeligt, da dets koncentration er afgørende for at opnå de ønskede Plasmodium iRBC'er. Blodoverlejringen på densitetsgradientseparationsmediet skal også udføres så langsomt som muligt, og ringens rødlagshøstning skal udføres omhyggeligt for at undgå at miste iRBC'er. For at gøre rensningsprocessen lettere bør der anvendes en blodprøve med høj parasitæmi, da mængden af iRBC'er vil være højere. Det skal bemærkes, at i RBC-isolationsprotokollen ved anvendelse af magnetfelter vil kun parasitmodne stadier (midt-sene stadiet trofozoitter eller skizonter), der producerer betydelige mængder hæmozoin, blive renset. Som følge heraf vil ethvert ringtrin ikke blive indsamlet, og dette kan påvirke det endelige resultat.

Cellefarvning skal udføres omhyggeligt for at undgå tab eller lysering af celler. Langvarig opbevaring eller fiksering bør undgås før farvning. Det er vigtigt at bemærke, at de eksperimentelle betingelser skal udføres i tre eksemplarer ved hjælp af serielle effektor: målforhold og passende kontroller, såsom en umærket, spontan lysetilstand og en hypotesekontrol. Tilføjelsen af celletællingsperler er afgørende, da det giver en nem måde at bestemme koncentrationen af celler eller absolutte celletal for hver prøve. Under flowcytometeroptagelse skal du sørge for at indstille antallet af hændelser, der skal indsamles i tælleperleporten for at normalisere antallet af celler i hver prøve efter coculture.

Da mindst 1 x 105 effektorceller er nødvendige for konsistente resultater i et cokulturassay, er en mulig begrænsning af den beskrevne metode det begrænsede antal celler efter oprensning, hvilket kan være et problem, især når man arbejder med sjældne cellepopulationer. Dette gælder faktisk for iRBC-oprensning, da det kræver at have en meget høj parasitæmi, der ikke opnås så let, især når man arbejder med humane prøver i endemiske områder.

En protokolforbedring kan være cokulturinkubationstiden. Selvom vi tidligere brugte en 12 timers inkubationstid10,11, observerede vi for nylig, at 4 timer er nok til at differentiere de eksperimentelle betingelser, hvilket reducerer tiden for potentiel spontan lyse og forbedrer reproducerbarheden af resultaterne.

De mekanismer, der er involveret i direkte drab på Plasmodium-inficerede RBC'er, afdækkes gradvist. Vores gruppe var den første til at vise, at CD8 + T-celler kan genkende og dræbe P.vivax-inficerede reticulocytter via HLA-I-præsentation af den inficerede celle11. For nylig viste en anden undersøgelse, at γδ T-celler genkender P. falciparum-inficerede RBC'er gennem phosphoantigengenkendelse af butyrophylin, et molekyle til stede på overfladen af iRBC'er10. I begge undersøgelser er RBC-lysis granulysin og granzym B-afhængig og fører til intracellulær parasitdrab.

Selvom mange metoder er blevet udviklet gennem årene til måling af parasitæmi, invasion, malariaaktivitet og billedcelleinteraktion, har ingen været i stand til at analysere den direkte drab af iRBC'er af cytotoksiske celler i et kvantitativt flowcytometribaseret assay 19,20,21. Vi brugte en innovativ tilgang til at evaluere cellelysekapacitet i malaria ved CFSE-mærkning af Plasmodium-inficerede RBC'er og evaluering af iRBC-lysis i en bestemt periode med samkultur med lymfocytter. Derfor præsenterer denne in vitro-dræbende analyse en ny strategi til afklaring af mekanismerne for cellemedieret immunitet over for malaria i blodstadiet, hvilket vil bidrage til at fremme undersøgelsen af nye terapeutiske mål og udviklingen af malariavacciner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Dhelio Pereira og medlemmerne af Research Center for Tropical Medicine of Rondônia (CEPEM) for malariapatienttilmelding og blodindsamling og Felicia Ho for at hjælpe med manuskriptrevision. Følgende reagens blev opnået gennem BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL: PyGFP, MRA- 817, bidraget af Ana Rodriguez. Denne forskning blev støttet af Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4, stipendier (CJ, GC, CG) og Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - stipendium (LL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 μM cell strainer Corning 431752
96 Well Round (U) Bottom Plate  Thermo Scientific 12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody Biolegend 349114 Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody Biolegend 317314 Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody Biolegend 344714 Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody Biolegend 331408 Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody  Biolegend 100733 Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody Biolegend 116223 Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554
Fetal Bovine Serum, qualified Gibco 26140079
Ficoll-Paque Plus  Cytiva 17144003 Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP meithel pharma 71228-400-003 Used - 2000 USP units/2mL
Isoflurane  Piramal critical care  66794-0013-25
LS MACS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer BD Bioscience 
Percoll Cytiva 17089101 Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent Sigma-Aldrich   S5761
Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge;  BD 14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml  BD 366480

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
  2. Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
  3. Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
  4. Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
  5. Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
  6. Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
  7. Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
  8. Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
  9. Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
  10. Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
  11. Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
  12. Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
  13. Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
  14. Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
  15. Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
  16. Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
  17. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
  18. Migliaccio, A. R. Erythroblast enucleation. Haematologica. 95 (12), 1985 (2010).
  19. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
  20. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
  21. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
  22. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
  23. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
  24. Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).

Tags

Immunologi og infektion udgave 186 malaria Plasmodium blodstadium cytotoksiske celler røde blodlegemer dræbende analyse flowcytometri
<em>In vitro</em> Analyse af <em>plasmodiuminficerede</em> røde blodlegemer ved cytotoksiske lymfocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Lacerda, L., Castro, G., Gomes,… More

de Lacerda, L., Castro, G., Gomes, C., Junqueira, C. In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes. J. Vis. Exp. (186), e63987, doi:10.3791/63987 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter