Summary
Här beskriver vi en ny metod för att belysa mekanismerna för cellulär immunitet mot Plasmodium under infektionsstadiet i blodet. Detta är en in vitro-analys som mäter infekterade röda blodkroppar som dödar av cytotoxiska lymfocyter.
Abstract
Malaria är ett stort folkhälsoproblem och uppvisar mer än 200 miljoner fall per år över hela världen. Trots år av vetenskapliga ansträngningar är skyddande immunitet mot malaria fortfarande dåligt förstådd, främst på grund av metodologiska begränsningar av långsiktig Plasmodium-kultur, särskilt för Plasmodium vivax. De flesta studier har fokuserat på adaptivt immunitetsskydd mot malaria av antikroppar, som spelar en nyckelroll för att kontrollera malaria. Det sterila skydd som induceras av försvagade Plasmodium sporozoites-vacciner är emellertid relaterat till cellulärt svar, främst till cytotoxiska T-lymfocyter, såsom CD8+ och gamma delta T-celler (γδ T). Därför måste nya metoder utvecklas för att bättre förstå funktionerna i det cellulära immunsvaret och därmed stödja framtida terapi och vaccinutveckling. För att hitta en ny strategi för att analysera denna cellmedierade immunitet mot Plasmodium-blodstegsinfektion, etablerade vår grupp en in vitro-analys som mäter infekterade röda blodkroppar (iRBC) dödande av cytotoxiska lymfocyter. Denna analys kan användas för att studera cellulära immunsvarsmekanismer mot olika Plasmodium spp. i blodstadiet. Medfödda och adaptiva cytotoxiska immunceller kan direkt eliminera iRBC och den intracellulära parasiten i en effektor:målmekanism. Mål-iRBC är märkta för att utvärdera cellviabilitet och samodlade med effektorceller (CD8 + T, γδ T, NK-celler, etc.). Lysprocenten beräknas baserat på testade förhållanden, jämfört med en spontanlyskontroll i en flödescytometribaserad analys. I slutändan är denna dödsanalysmetod ett stort framsteg för att förstå cellmedierad immunitet mot malaria i blodstadiet, vilket hjälper till att avslöja nya potentiella terapeutiska mål och påskynda utvecklingen av malariavacciner.
Introduction
Malaria är fortfarande en global hälsokris, med mer än 240 miljoner fall och 627 000 malariarelaterade dödsfall rapporterade 20201. Det finns för närvarande fem parasitarter som kan orsaka malaria hos människor, varav Plasmodium falciparum och Plasmodium vivax är de två vanligaste arterna. Under Plasmodium-infektion är levern eller det pre-erytrocytiska stadiet asymptomatiskt, och symtom uppträder endast under parasitens asexuella cykel i det erytrocytiska stadiet. Vid detta infektionsstadium släpps tusentals merozoiter som härrör från leverstadiet ut i blodomloppet och infekterar röda blodkroppar (RBC). I RBC differentieras parasiterna till trofozoiter och schizonter av schizogoni, tills schizonter brister erytrocyten och släpper ut nybildade merozoiter och upprepar denna blodcykel. Upprepade cykler av invasion, replikation och merozoitfrisättning resulterar i en exponentiell tillväxt av parasitpopulationen och utlöser slutligen sjukdomssymtom2.
En viktig utmaning för att studera immunsvaret mot malaria är att Plasmodium spp. som infekterar människor inte infekterar laboratoriedjurmodeller. Således måste Plasmodium-infekterade patientprover samlas in färskt och omedelbart bearbetas och analyseras. Men i malaria-endemiska områden är resurserna för att få tillgång till immunologiska och molekylära mekanismer begränsade. På grund av dessa begränsningar används gnagare ofta som experimentella modeller för att undersöka immunsvaret mot Plasmodium-infektion. Medan P. berghei och P. chabaudi ofta används som surrogat för P. falciparum-infektion, har den icke-dödliga stammen av P. yoelii 17XNL också många gemensamma drag med P. vivax, såsom retikulocytbegränsad infektion 3,4. Utvecklingen av Plasmodium in vitro-analyser, som kan användas för prover från humana eller djurmodeller, är värdefull för att få en bättre förståelse för patogenesen av malaria och jämföra det immunologiska svaret som framkallas av olika arter av parasiten.
Skyddande antimalarial immunitet är inte fullständigt förstådd varken vid pre-erytrocytiskt stadium eller blodstadiet. Det är känt att exponering för upprepade infektioner resulterar i partiell förvärvad immunitet, men steril immunitet utvecklas sällan5. I årtionden var anti-Plasmodium skyddande immunitet huvudsakligen associerad med induktion av neutraliserande eller opsoniserande antikroppar som förhindrar parasitinvasion av värdceller eller leder till fagocytos av antigenpresenterande celler, respektive6. Som ett resultat har de flesta ansträngningar för att producera antimalariala vacciner hittills förlitat sig på att inducera skyddande och långvariga antikroppar 7,8. Det sterila skydd som induceras genom vaccination med en försvagad sporozoit korrelerar emellertid direkt med aktiveringen och expansionen av cytotoxiska T-lymfocyter 8,9.
Nyligen har vissa studier av nyligen isolerade patientprover och in vitro-kulturer visat att medfödda eller adaptiva cytotoxiska immunceller som CD8 + T 10, γδ T11 och NK-celler12 direkt kan eliminera Plasmodium-infekterade RBC och dess intracellulära parasit på ett effektor: målförhållande sätt. Dessa banbrytande fynd definierade en helt ny immuneffektormekanism i samband med malaria. För att dissekera denna nya antimalariala immunitet är det viktigt att utforska cytotoxiska effektormekanismer hos mördarceller mot infekterade RBC (iRBC) vid naturlig infektion eller vaccination.
Här presenterar vi en in vitro-analys som mäter lymfocyternas cytotoxiska aktivitet mot malaria i blodstadiet. Denna analys kan sedan hjälpa till att belysa mekanismerna för det cellulära immunsvaret mot Plasmodium erytrocytstadiet. Målcellerna, iRBCs, märks med karboxifluoresceinsuccinimidylester (CFSE) för att utvärdera cellviabiliteten och samodlas sedan med effektorceller som cytotoxiska lymfocyter (CTL). Denna samodling utvärderas sedan med flödescytometri med hjälp av fluorescerande markörer för specifika celltyper. Slutligen beräknas procentandelen iRBC-lys med CTL genom att dividera det experimentella tillståndet med spontan bristning av RBC och spontanlyskontroll, som inträffar under inkubation utan effektorcellen. Sammantaget kan denna dödande analysmetod bidra till en bättre förståelse av cellmedierad malariaimmunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer genomfördes enligt policyerna från Oswaldo Cruz Foundation och National Ethical Council (CAAE: 59902816.7.0000.5091). De mänskliga protokollen utvecklades i samarbete med den kliniska forskargruppen från Research Center for Tropical Medicine of Rondônia (CEPEM), som ansvarade för att inkludera patienter i studien. Informerat samtycke erhölls från alla patienter.
För djurstudien utfördes procedurer enligt principerna för uppförande av den brasilianska praxisguiden för vård och användning av djur för vetenskapliga och didaktiska ändamål från National Council for the Control of Animal Experimentation (CONCEA). Protokollen godkändes av Fiocruz Animal Experimentation Council (CEUA-protokoll LW15/20-2).
1. Insamling av blodprover från människa och isolering av PBMC
- Samla blod från Plasmodium-infekterade patienter i ett 10 ml evakuerat bloduppsamlingsrör med natriumheparin. Eftersom malariapatienter uppvisar lymfopeni finns det ett intervall på 5-9 x 106 mononukleära celler i perifert blod (PBMC) i ett 10 ml blodprov. Eftersom CD8 + T-celler eller γδ T-celler utgör ~ 10% av PBMC, samla helst 50-100 ml blod / patient.
OBS: Minst 1 x 105 effektorceller / tillstånd bör övervägas. - Beräkna procentandelen iRBC med blodutstryk enligt beskrivningen nedan.
- Tillsätt 5 μL totalt blod till en klar bild och förbered ett blodutstryk. Utför panoptisk snabb fläck av Romanowsky-typ eller May-Günwald-Giemsa-fläck. Här används det panoptiska snabbfläcksatsen, som består av tre reagens: reagens A (fixering), reagens B (cytoplasmatisk fläck) och reagens C (kärn- och cytoplasmatisk differentiell fläck).
- Doppa långsamt glaset i lösning A 10x, sedan 4x i lösning B och slutligen 10x i lösning C. Töm ut eventuellt överskott av reagens från objektglasen mellan lösningarna. Efter doppning i lösning C, skölj bilden i rinnande kranvatten och låt den torka.
- Under ett upprätt ljusmikroskop med ett 100x oljenedsänkningsmål, räkna 1000 RBC i sekventiella rutor och beräkna procentandelen parasitemi med följande ekvation:
- Späd 15 ml blod i en 1: 1-andel i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 15 ml lymfocytseparationsmedium (densitet 1,077 g / ml) till ett 50 ml rör. Lägg försiktigt 30 ml utspätt blodprov på centrifugeringsmedielösningen. Vid skiktning av provet, låt inte blodprovet och lymfocytseparationsmediet blandas.
- Centrifugera rören vid 400 x g i 40 minuter vid 22 °C, med låg acceleration och ingen brytinställning.
- Dra av det övre lagret som innehåller plasma med en steril pipett och lämna det mononukleära cellskiktet ostört. Överför skiktet av mononukleära celler (PBMC) till ett sterilt rör med en steril pipett.
- Kassera inte röret som innehåller blodpelleten eftersom det kommer att användas senare för infekterad RBC-isolering. Från det här steget, se till att hålla RBC: erna vid rumstemperatur (RT). Låt dem aldrig svalna.
- Tvätta cellerna två gånger genom att tillsätta PBS och centrifugera vid 350 x g i 10 minuter, med pausinställning. Resuspendera cellpelleten i 5 ml RPMI-medium kompletterat med penicillin/streptomycin och 10% fetalt bovint serum (FBS; komplett medium).
- Räkna PBMC: erna i närvaro av trypanblå lösning för att kontrollera cellens livskraft med hjälp av en hemacytometer (Neubauer-kammare) eller automatiserad cellräknare. Räkna inte de blåfärgade cellerna eftersom dessa representerar döende celler, som absorberar trypanblått.
- Justera cellkoncentrationen till 107 celler/ml med komplett medium. Rena de önskade cytotoxiska lymfocytpopulationerna (CD8 + T-celler, NK-celler, γδ T-celler) med magnetisk pärlisolering enligt tillverkarens protokoll för reagenstillverkare.
2. Mänsklig RBC-isolering
OBS: För humaninfekterad RBC-isolering rekommenderas att börja med blodprover som har minst 2% parasitemi, företrädesvis med mer i trofozoit / tidigt schizont parasitstadium.
- Bered PERCOLL (hädanefter kallat separationsmedium för densitetsgradient) vid den rekommenderade koncentration som beskrivs nedan.
- Tillsätt 90 ml separationsmedium med 100 % densitetsgradient och 10 ml 10x PBS för att erhålla separationsmedium med 90 % isotonisk densitet.
- För P. vivax-infekterad retikulocytseparation, förberedseparationsmedium med 45% densitetsgradient. Tillsätt 50 ml 90% separationsmedium för isotonisk densitet och 50 ml 1x PBS för att erhålla separationsmedium med 45% densitetsgradient.
- För P. falciparum-infekterad erytrocytseparation, förbered separationsmedia med 65% densitetsgradient. Tillsätt 72 ml 90% separationsmedium för isotonisk densitet och 28 ml 1x PBS för att erhålla separationsmedium med 65% densitetsgradient.
- För oinfekterad retikulocytseparation, förbered 70% densitetsgradientseparationsmedium. Tillsätt 78 ml 90% separationsmedium för isotonisk densitet och 22 ml 1x PBS för att erhålla 70% densitetsgradientseparationsmedium.
- Värm separationsmediet med densitetsgradient till 37 °C i ett vattenbad.
- Efter avlägsnande av PBMC-skiktet, avlägsna försiktigt så mycket av det övre lagret av centrifugeringsmediet som möjligt utan att vidröra cellerna. Med en glaspasteurpipett, ta försiktigt bort det övre neutrofilskiktet utan att störa RBC-pelleten och uppskatta pelletsvolymen. Tillsätt 4x RBC-pelletsvolymen av RT komplett medium och suspendera igen.
- I ett andra 50 ml koniskt rör, tillsätt 5x pelletsvolymen på 45%, 65% eller 70% densitetsgradientseparationsmedium beroende på celltypen som ska isoleras. Lägg RBC-upphängningen försiktigt ovanpå mellanskiktet för densitetsgradientseparation.
- Snurra i 15 minuter vid 850 x g, med låg acceleration och ingen pausinställning. Samla upp det grumliga röda/bruna lagret som ligger mellan supernatanten och separationsmediet med densitetsgradient med en 5 ml pipett. Överför till ett sterilt 15 ml rör.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta RT complete medium upp till 15 ml och snurra ner i 10 minuter vid 860 x g. Upprepa tvätten genom att tillsätta 10 ml RT komplett medium och snurra ner. Kassera supernatanten och förbered ett blodutstryk från pelleten för att kontrollera iRBC-anrikning enligt steg 1.2.
- Återsuspendera pelleten i 1 ml RT komplett medium och låt sitta vid rumstemperatur medan cellerna räknas. Tillsätt 10 μL cellsuspension i en hemocytometer (Neubauer-kammare) och räkna RBC: erna i det centrala området indelat i 25 medelstora rutor. Justera cellkoncentrationen till 1 x 107 iRBC/ml i RT-kompletta medier.
3. Experimentell malariainfektion hos mus
- Tina en alikvot kryokonserverad P. yoelii 17XNL:PyGFP (MRA-817), en GFP-uttryckande stam erhållen från MR4/ATCC, och injicera 100 μL intraperitonealt (i.p.) i en 8 veckor gammal kvinnlig C57BL/6-mus.
- Följ parasitemibördan var 3: e dag genom blodinsamling i svansvenen.
- Punktera kärlet med nålavfasningen och gå in i venen i en grund vinkel som börjar vid svansens distala ände.
- Samla blodprovet med en pipett eller kapillärrör upp till 5 eller 10 ml, applicera sedan manuellt tryck för att stoppa blödningen.
- Förbered ett blodutstryk (som beskrivs i steg 1.2) tills parasitemi når 10% -15% av infekterade röda blodkroppar.
- Samla upp 10 μl blod genom svansvensöppning och späd till 100 μl PBS för att intragrafiskt injicera i den andra donatormusen.
OBS: Kryokonserverade parasiter bör tinas och överföras till möss två gånger innan de används för experimentella infektioner. - När den andra passagen når 15% parasitemi, samla fem droppar blod med svansklippningsmetoden och späd i 1 ml PBS. Bered en infektionslösning genom att justera koncentrationen till 1 x 106 iRBCs/ml i steril PBS och injicera i.p. 100 μL (1 x 105 iRBCs) av lösningen i varje mus som krävs för experimentet.
- Övervaka parasitemi var 2-3: e dag tills den når ~ 30% iRBCs, vilket inträffar ungefär 12 dagar efter infektion. När mössen når önskad parasitemi, samla blod genom hjärtpunktion som beskrivs nedan.
- Aspirera 100 μL heparinlösning (30 E/ml) i en 1 ml spruta med en 26 G nål.
- Bedöva musen genom inandning med 5% isofluran och bekräfta frånvaron av reflexer. Placera musen på sidan och sätt vinkelrätt in nålen strax under armbågen, genom revbenen och in i hjärtat. Dra långsamt ut sprutkolven och rotera nålen tills 0,5-1 ml blod erhålls.
- Utför human eutanasi genom cervikal dislokation under anestesi. Rengör vänster sida av musen aseptiskt med 70% etanol. Med kirurgisk sax, gör ett snitt på vänster sida av musen som passerar genom huden och bukhinnan. Leta reda på mjälten och ta bort den.
- Placera musmjälten i en petriskål med 5 ml komplett medium för att rena den önskade effektorcellpopulationen (t.ex. CD8 + T-celler).
4. Få färska hela mussplenocyter
- Skär försiktigt mjälten i små bitar i petriskålen med sax eller rakhyvel.
- Placera en 100 μM cellsil över ett 50 ml koniskt rör och överför den utskurna mjälten till cellsilen med en pipett. Mosa mjälten genom silen med en sprutkolv.
- Tvätta cellerna genom silen med 10 ml komplett media. Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 2 ml kall 1x RBC-lysbuffert. Inkubera suspensionen i 5 minuter på is.
- Tvätta cellsuspensionen med 10 ml 4 °C komplett media. Upprepa tvättsteget tre gånger och ta bort eventuella cellproppar mellan tvättarna för mjälte från Plasmodium-infekterade möss.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C och kassera sedan supernatanten.
OBS: Plasmodiuminfekterade mjälte förstoras och fylls med fagocytiska celler innehållande nedbrutet hemoglobin och hemozoin. - För att undvika problem under magnetisk pärlisolering av effektorceller, använd följande steg för att avlägsna hemozoinberikade fagocytiska celler och hemozoin. Återsuspendera mjältcellerna med MACS-buffert och justera koncentrationen till 1 x 108 celler/ml. Placera en LS- eller LD-kolumn i magnetfältet. Förbered kolonnen genom att skölja med 3 ml MACS-buffert.
- Applicera cellsuspension på kolonnen. Tvätta kolonnen tre gånger med 3 ml MACS-buffert. Samla genomströmning som innehåller mjältcellerna.
- Räkna splenocyterna i en trypanblå lösning och kontrollera cellviabiliteten i en hemacytometer (Neubauer-kammare) eller automatiserad cellräknare. Justera cellkoncentrationen till 1 x 107 celler/ml i RT-komplett media.
5. Rening av cytotoxiska effektorceller (CD8a + T-cellnegativ selektion)
OBS: Det finns många positiva och negativa selektionsreagens som kan rena cytotoxiska effektorceller (CD8 + T, γδ T, NK, iNKT, MAIT celler). I detta protokoll använder vi ett negativt urval av mjält-CD8a + T-celler och följer tillverkarens instruktioner.
- Centrifugera alla splenocyter vid 400 x g i 10 min vid 4 °C och kassera supernatanten. Återsuspendera cellpelleten i 40 μL MACS-buffert.
- Tillsätt 10 μL av en biotin-antikroppscocktail. Blanda väl och inkubera i 5 min på is.
- Tillsätt 30 μL MACS-buffert. Tillsätt 20 μL mikropärlor mot biotin. Blanda väl och inkubera i 10 min på is.
- Tillsätt 400 μL MACS-buffert och fortsätt till magnetisk cellseparation. Placera MACS LS-kolumnen i magnetfältsstödet. Förbered kolonnen genom att skölja med 3 ml MACS-buffert.
- Applicera cellsuspension på kolonnen. Tvätta kolonnen tre gånger med 3 ml MACS-buffert. Samla genomströmningen som innehåller alla omärkta celler, som är de anrikade CD8a + T-cellerna.
- Räkna CD8a + T-cellerna i en trypanblå lösning och kontrollera cellviabiliteten i en hemacytometer (Neubauer-kammare) eller automatiserad cellräknare. Justera cellkoncentrationen till 1 x 107 celler/ml i RT complete media.
6. P. yoelii infekterad RBC-isolering
- Centrifugera det uppsamlade blodet i ett 1,5 ml rör vid 850 x g i 3 minuter. Kassera serumet och resuspendera blodet i 1 ml 1x RPMI utan FBS.
- Placera LS-kolonnen i magnetfältstödet och skölj med 3 ml 1x RPMI. För RBC-upphängningen genom kolonnen. För att isolera fler iRBC, applicera genomströmningen (3 ml RPMI och 1 ml utspätt blod) i kolonnen.
- Tvätta två gånger med 5 ml 1x RPMI. Utför tvättsteg genom att tillsätta buffertalikvoter så snart kolonnbehållaren är tom. Låt inga kolumner torka upp.
- Tillsätt 5 ml RPMI, ta bort kolonnen och rensa iRBC: erna till ett nytt 15 ml rör. Räkna iRBC:erna och justera koncentrationen till 1 x 107 RBC/ml.
7. CFSE-märkning av RBC och förberedelse för flödescytometri
Starta RBC-märkningsprotokollet med dubbelt så många celler som kommer att användas för experimentet, eftersom ~ 50% av cellerna vanligtvis går förlorade i tvättstegen efter CFSE-märkningssteget. För att fastställa autofluorescensen hos RBC/iRBC:erna, inkludera ett kontrollprov av omärkta celler.
- Späd CFSE till en slutlig koncentration på 10 mM i 1x RPMI utan FBS. Tvätta cellerna en gång med 1x RPMI utan FBS i ett 15 ml rör.
- Återsuspendera röda blodkroppar i 500 μL 1x RPMI utan FBS och tillsätt 500 μL av den utspädda CFSE. Inkubera i 8 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus.
- Tvätta tre gånger genom att tillsätta 14 ml komplett medium (10% FBS RPMI), följt av centrifugering vid 850 x g i 10 min. Resuspendera cellerna i komplett medium till en koncentration av 1-5 x 106 / ml. Inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
8. Cytotoxisk lymfocyt/RBC-samodling och förberedelse för flödescytometri
OBS: Om involveringen av specifika receptorer eller molekyler kommer att mätas, inkubera de specifika blockerande och isotypkontrollantikropparna (10 mg / ml) med effektorcellerna i 30 minuter före samodling.
- Platta cellerna i en 96-brunns rundbottenplatta. Tillsätt de renade lymfocyterna och CFSE-märkta iRBC i önskat effektor-målcellförhållande till en slutlig volym på 200 μL och homogenisera. Förbered varje villkor i tre exemplar.
OBS: Vi föreslår att du justerar iRBC-koncentrationen till 1-5 x 104 celler / ml och väljer förhållandet baserat på det renade cellantalet (t.ex. 0,5: 1, 2,5: 1 och 5: 1). - Inkludera spontanlyskontrollen, som är mål-iRBC utan effektorn, för att utvärdera eventuell spontan lys, eftersom denna kommer att användas för att representera ett 100% cellviabilitetstillstånd.
- Snurra ner plattan i 1 min vid 360 x g för att maximera cellkontakten. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i 4 timmar.
OBS: Hypoxitillstånd (lågO2), som systematiskt används för P. falciparum-odling , bör inte användas eftersom effektorcellerna inte överlever i denna miljö. Däremot är Plasmodium-parasiter livskraftiga i omgivande luft i 5% CO2 i upp till12 timmar. - Snurra i 5 minuter vid 850 x g och vänd plattan för att ta bort supernatanten.
Om så önskas kan supernatanten användas för att mäta eventuella lösliga faktorer som frigörs i samkulturen. - Märk RBC: erna med anti-mus Ter119 1:200 (eller anti-human CD235 1:100 för humana prover) och CD8 + T-celler med anti-CD8 1:200 eller anti-CD3 1:200-antikroppar (anti-mus eller människa) i 30 minuter vid 4 ° C i 1x PBS innehållande 3% FBS (FACS-buffert).
OBS: Antikroppsfluoroforen bör väljas baserat på cellspårare/cellproliferationsreagens (t.ex. CFSE-märkt iRBC, APC-Cy7 anti-Ter119 och PerCP-Cy5.5 anti-CD8a). - Tvätta cellerna med FACS-buffert och snurra ner i 5 minuter vid 850 x g. Överför proverna till FACS-rör och tillsätt 30 μL räknepärlor till enskilda rör . Homogenisera räknepärlorna genom virvelfräsning i 30 sekunder.
9. Flödescytometri
- Analysera prover med ett 405/488/561/640 laserinstrument.
- För mänskliga celler märkta med CFSE (FITC), PE anti-human γδ TCR och PE-Cy7 anti-human CD235a-antikropp, använd 530/30 (FITC), 575/25 (PE) och 780/60 (PE-Cy7) filter i en trelaser (blå, röd, gulgrön) konfigurationscytometer.
- För musceller märkta med CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 anti-mus CD8a och APC-Cy7 anti-mus Ter119, använd 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5) och 780/60 (APC-Cy7) filter i trelasercytometerinställningen.
- Välj populationen med räknande pärlor som stoppgrind för att få minst 20 000 händelser i stoppgrinden, som ska vara identiska för alla förhållanden. Utför analys och kompensation med hjälp av lämplig programvara för flödescytometri eller analys.
- Ställ in grindstrategin enligt beskrivningen nedan.
- Markera enskilda celler (singlets), exklusive skräp med FSC-topphöjd (H) till area (A). Välj röda blodkroppar och exkludera lymfocyterna från analys baserad på fluorescens av RBC-markören (Ter119 eller CD235a) och den lymfocytspecifika antikroppen (CD8a).
- I föregående RBC-grind väljer du livskraftiga RBC:er baserat på CFSE-positiv färgning. Analysera data med programvara för analys av flödescytometerdata.
10. Beräkning och statistik
- För att beräkna procentandelen iRBC-lys, följ grindstrategin som beskrivs i steg 9. Procentandelen livskraftiga RBC är frekvensen av CFSE-positiva celler inuti RBC-grinden baserat på Ter119 (mus) eller CD235a (human) positiv fluorescens.
- Använd spontanlyskontrollen, RBC utan effektorceller, tillstånd som en kontroll för att uppskatta RBC spontan bristning. Detta tillstånd kommer att betraktas som RBC-lys (100% livskraft). Använd följande formel för att beräkna procentandelen RBC-lys i varje testat tillstånd:
OBS: Under odlingsinkubationen kan vissa infekterade röda blodkroppar spontant lysera eller brista av parasiten. Använd CFSE-positiv RBC-frekvens för spontanlystillståndet, som inte innehåller några effektorceller, som baslinje för lymfocytcytotoxicitet. - Beräkna genomsnittet av tre exemplar för varje tillstånd och bestäm statistisk signifikans med hjälp av tvåvägs ANOVA vid flera jämförelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskrivs den tillämpade metoden för isolering av CFSE-märkta Plasmodium-infekterade RBC i en samodlingsanalys med cytotoxiska lymfocyter. Först tillhandahåller vi en schematisk representation av hur man utför protokollet, med hjälp av humana prover infekterade med P. vivax (figur 1). Därefter ett illustrerat flödesschema om hur man går vidare med protokollet i en malariaexperimentell modell med hjälp av en C57BL / 6-mus infekterad med P. yoelii (figur 2). I figur 3 visas de förväntade resultaten (före och efter) för steg 6 i protokollet (anrikning av P. yoelii-infekterade röda blodkroppar med magnetiska kolonner). Slutligen visar figur 4 en representativ flödescytometrianalys, som beskriver den grindstrategi som behövs för att bedöma procentandelen RBC-lys, som beskrivs i steg 9. Därför belyser detta avsnitt de olika tekniker som används här och beskriver hela processen för förvärv, montering och dataanalys för att bedöma iRBC-dödande av cytotoxiska lymfocyter.
Humana plasmodiuminfekterade röda blodkroppar lys av cytotoxiska celler
En schematisk representation av protokollet för att utvärdera dödandet av humana Plasmodium-infekterade röda blodkroppar av cytotoxiska celler visas i figur 1. För att mäta celllys renades PBMC från Plasmodium-infekterade patienter med hjälp av separationsmediet, följt av magnetisk rening av den cytotoxiska lymfocytpopulationen (CTL) av intresse (t.ex. CD8 + T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-celler, etc.). RBC: s pellet kvar från PBMC-isoleringen användes för att anrika Plasmodium-infekterade RBC med hjälp av separationsmedium för densitetsgradient (65% P. falciparum; 45% P. vivax). iRBC märktes med CFSE och inkuberades med eller utan lymfocyter i 4 timmar vid 37 °C, 5% CO2. Efter samodlingsperioden märktes alla röda blodkroppar (infekterade eller inte) med anti-human CD235a-antikropp (för RBC) och CTL-specifika antikroppar (t.ex. anti-CD8, anti-γδTCR, etc.) före flödescytometrianalys. Insamlingen och analysen av humana prover liknade dem som visades för musprover i figur 4.
P. yoelii-infekterad RBC-lys av cytotoxiska CD8+ T-celler
Ett flödesschema över det experimentella förfarandet för att utvärdera cytotoxiska effektormekanismen i den experimentella malariamodellen visas i figur 2, tillsammans med representativa experimentella data som visas i figur 3 och figur 4. C57BL/6-möss infekterades med 1 x 105P. yoelii (Py) iRBCs, och parasitemi övervakades tills den nådde cirka 30%. Py-iRBC isolerades från blod med hjälp av magnetisk separation, eftersom parasithemsubprodukten, hemozoin, är järnanrikad och fungerar som paramagnetiska partiklar i ett magnetfält13. Renheten hos det anrikade provet analyserades med blodutstryk i jämförelse med förkolonnprovet (figur 3). iRBC märktes sedan med cellspårreagenset CFSE. Parallellt renades cytotoxiska CD8 + T-celler från splenocyter med hjälp av ett magnetiskt negativt selektionssats. Som en kontroll användes samma protokoll för CD8 + T-cellrening från oinfekterade möss. Effektorceller (CD8+ T) och målceller (CFSE-märkta Py-iRBC) inkuberades vid olika effektor-målförhållanden (E:T: 0,5:1, 2,5:1 och 5:1) under 4 timmar vid 37 °C 5 %CO2. I slutet av samkulturen märktes varje tillstånd med antikroppar anti-mus Ter119 för RBC och anti-CD8a för cytotoxiska celler. Grindstrategin och provresultaten visas i figur 4.
Figur 1. Schematisk bild av dödande test in vitro. Exempel på dödande analysexperiment. Plasmodiuminfekterat blod samlas in och bearbetas med användning av ett separationsgradientmedium. Efter centrifugering samlas PBMC-skiktet och cytotoxiska celler (CTL) renades med magnetiska pärlor. RBC-skiktet bearbetas återigen med hjälp av separationsmedier för densitetsgradient. Efter centrifugering uppsamlas Plasmodium-iRBC-skiktet och märks med CFSE. Därefter samodlades de renade CTL- och iRBC-ämnena i 4 timmar vid 37 °C, 5% CO2, följt av cellspecifik märkning och analys i en flödescytometer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Experimentell malariamodell för dödande analys. Först infekterades C57BL / 6-möss med 105 PyX17NL-infekterade röda blodkroppar. Därefter övervakas parasitemi med blodutstryk tills infektionens topp (30% -40% iRBC), cirka 12 dagar efter infektion (dpi). Nästa dag blöddes möss och avlivades för mjältinsamling. Blodet bearbetades och infekterade röda blodkroppar anrikades genom magnetisk separation, följt av märkning med CFSE (uppe till höger). Mjälten bearbetades för isolering av cytotoxiska lymfocyter genom negativt urval med magnetiska pärlor. Därefter samodlades de renade cytotoxiska lymfocyterna och iRBC i 4 timmar vid 37 °C, 5%CO2, följt av cellspecifik märkning och analys i en flödescytometer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. iRBC-anrikning med magnetiska kolonner. iRBC: erna renades från P. yoelii-infekterade möss med LS-kolonner. Reningen framhävs av blodutstryk från blod som samlats in före ( A ) och efter (B) kolonnanrikning. Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Bedömning av celllysprocent av P. yoelii-iRBCs med CD8+ lymfocyter. Gating-strategin för celllysprocent. (A) Ställ in stoppgrinden i populationen med räknande pärlor (~20 000 händelser). (B) Kontrollera spontanlys, iRBC utan lymfocyter. Starta grindstrategin genom att välja enskilda celler, exklusive skräp, baserat på FSC-topphöjden i förhållande till området, följt av valet av RBC-populationen i APC-Cy7 Ter119-positiv och PerCP-Cy5.5 CD8-negativ. Välj sedan live iRBC som CFSE (FITC) hög positiv. (C) Exempel på experimentanalys med olika effektor: målförhållanden, som visar procentandelen levande RBC efter samkulturen. D) Grafisk representation av RBC-lysprocenten beräknad på grundval av den formel som beskrivs i avsnitt 10. Signifikansjämförelsen mellan grupperna (cytotoxisk CD8 eller naiv CD8) bedömdes med tvåvägs ANOVA med flera jämförelser. P < 0,0001 (****). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi en in vitro-analys för att mäta Plasmodium-infekterade röda blodkroppar dödande av cytotoxiska lymfocyter. Denna analys kan hjälpa till att belysa mekanismerna för cellulär skyddande immunitet mot malariaparasitens erytrocytiska stadium. Den stora fördelen med denna metod är att den ger en kvantitativ analys av cellmedierad avdödning av iRBC som kan användas för att ta itu med många frågor om hur immunceller interagerar med olika Plasmodium spp.
Viktigt är att denna metod kan användas för att studera P. vivax och andra Plasmodium-parasiter som inte upprätthålls in vitro-kultur 14,15. Dessutom kan detta protokoll anpassas till alla Plasmodium-arter och olika värdar, såsom människor, möss och icke-mänskliga primater. Flödescytometribaserade metoder används ofta för att utvärdera cytotoxisk cellaktivering, cytokinproduktion och degranulering10,11,16, men den nuvarande metoden är den enda som utforskar RBC-lys genom direkt cellkontakt med mördarceller.
Det finns också många metoder, såsom mikroskopi, polymeraskedjereaktion (PCR) och flödescytometri, som används för att studera malaria genom att mäta parasitemi, invasion och antimalarial aktivitet. För att analysera den cellmedierade cytotoxiciteten hos RBC är nuvarande metoder som använder Cr51 eller hemoglobinfrisättning inte tillräckligt känsliga för att utvärdera RBC-lys. LDH-frisättning kan också användas för att utvärdera RBC-dödande av vissa CTL som CD8 + T-celler, men mätning av LDH är inte en exakt metod eftersom aktiverade medfödda eller medfödda celler kan döda varandra som en regleringsmekanism.
CFSE används ofta för att spåra celler eller utforska cellproliferation i flödescytometri eller fluorescerande mikroskopi17. Eftersom röda blodkroppar inte prolifererar18 bör CFSE-fluorescensintensiteten minska med celllys. Flödescytometri är en mycket exakt teknik eftersom den kan upptäcka mycket låga nivåer av specifika markörer, och så har den använts i stor utsträckning för att spåra parasitemi och invasion i malariainfektion 19,20,21,22,23. Viktigast är att flödescytometri kan mäta många parametrar i en enda cell och sortera ut celler i olika populationer. Genom att lägga till kvantitativa standardreagens (räkna pärlor) till varje prov kan man normalisera antalet förvärvade händelser och få absoluta celltal24. Denna metod möjliggör en tillförlitlig kvantitativ jämförelse mellan experimentella förhållanden, vilket är avgörande för det nuvarande föreslagna protokollet.
Några kritiska steg för detta protokoll inkluderar att säkerställa provkvaliteten, säkerställa korrekt cellfärgning och inkludera kontroller för att normalisera beräkningar. En stor mängd färska blodprover krävs för att rena infekterade röda blodkroppar. Reningen av separationsmediet med densitetsgradient bör behandlas noggrant eftersom dess koncentration är avgörande för att erhålla de önskade Plasmodium iRBC:erna. Blodöverlagringen på separationsmediet med densitetsgradient måste också göras så långsamt som möjligt, och skörden av det röda ringlagret måste göras noggrant för att undvika att förlora iRBC. För att underlätta reningsprocessen bör ett blodprov med hög parasitemi användas eftersom mängden iRBC blir högre. Det bör noteras att i RBC-isoleringsprotokollet med magnetfält kommer endast parasitmogna stadier (trofozoiter i mitten av sent stadium eller schizonter) som producerar betydande mängder hemozoin att renas. Som ett resultat kommer inget ringsteg att samlas in, vilket kan påverka slutresultatet.
Cellfärgning bör utföras noggrant för att undvika förlust eller lys av celler. Långvarig lagring eller fixering bör undvikas före färgning. Det är viktigt att notera att de experimentella betingelserna bör utföras i tre exemplar med hjälp av seriella effektor:målförhållanden och lämpliga kontroller, såsom ett omärkt, spontant lystillstånd och en hypoteskontroll. Tillsatsen av cellräkningspärlor är avgörande eftersom det ger ett enkelt sätt att bestämma koncentrationen av celler eller absoluta celltal för varje prov. Under flödescytometerförvärv, var noga med att ställa in antalet händelser som ska samlas in i räkningspärlorna för att normalisera antalet celler i varje prov efter samodling.
Eftersom minst 1 x 105 effektorceller behövs för konsekventa resultat i en samodlingsanalys, är en möjlig begränsning av den beskrivna metoden det begränsade antalet celler efter rening, vilket kan vara ett problem särskilt när man arbetar med sällsynta cellpopulationer. Detta gäller faktiskt iRBC-rening, eftersom det kräver att man har en mycket hög parasitemi som inte är så lätt att erhålla, särskilt när man arbetar med humana prover i endemiska områden.
En protokollförbättring kan vara kokulturens inkubationstid. Även om vi tidigare använde en 12 h inkubationstid10,11, observerade vi nyligen att 4 h är tillräckligt för att differentiera experimentbetingelserna, vilket minskar tiden för potentiell spontan lys och förbättrar reproducerbarheten av resultaten.
De mekanismer som är involverade i direkt dödande av Plasmodium-infekterade röda blodkroppar avslöjas gradvis. Vår grupp var den första som visade att CD8 + T-celler kan känna igen och döda P.vivax-infekterade retikulocyter via HLA-I-presentation av den infekterade cellen11. Nyligen visade en annan studie att γδ T-celler känner igen P. falciparum-infekterade RBC genom fosfoantigenigenkänning av butyrophylin, en molekyl som finns på ytan av iRBC10. I båda studierna är RBC-lysis beroende av granulysin och granzym B och leder till intracellulär parasitdödande.
Även om många metoder har utvecklats genom åren för att mäta parasitemi, invasion, antimalarial aktivitet och bildcellsinteraktion, har ingen kunnat analysera den direkta dödandet av iRBC av cytotoxiska celler i en kvantitativ flödescytometribaserad analys 19,20,21. Vi använde ett innovativt tillvägagångssätt för att utvärdera celllyskapacitet i malaria genom CFSE-märkning av Plasmodium-infekterade RBC och utvärdering av iRBC-lys under en specifik period av samodling med lymfocyter. Därför presenterar denna in vitro-dödande analys en ny strategi för att klargöra mekanismerna för cellmedierad immunitet mot malaria i blodstadiet, vilket kommer att bidra till att främja studien av nya terapeutiska mål och utvecklingen av malariavacciner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Dhelio Pereira och medlemmarna i Research Center for Tropical Medicine of Rondônia (CEPEM) för malariapatientregistrering och blodinsamling och Felicia Ho för att hjälpa till med manuskriptrevision. Följande reagens erhölls genom BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL: PyGFP, MRA- 817, bidragit av Ana Rodriguez. Denna forskning stöddes av Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4, stipendier (CJ, GC, CG) och Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - stipendium (LL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R.
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
