Summary
Hier beschrijven we een nieuwe methode om de mechanismen van cellulaire immuniteit tegen Plasmodium tijdens het bloedstadium van infectie op te helderen. Dit is een in vitro test die geïnfecteerde rode bloedcellen dodental door cytotoxische lymfocyten meet.
Abstract
Malaria is een groot probleem voor de volksgezondheid en presenteert wereldwijd meer dan 200 miljoen gevallen per jaar. Ondanks jarenlange wetenschappelijke inspanningen is beschermende immuniteit tegen malaria nog steeds slecht begrepen, voornamelijk als gevolg van methodologische beperkingen van langdurige Plasmodium-cultuur, vooral voor Plasmodium vivax. De meeste studies hebben zich gericht op adaptieve immuniteitsbescherming tegen malaria door antilichamen, die een sleutelrol spelen bij het beheersen van malaria. De steriele bescherming geïnduceerd door verzwakte Plasmodium sporozoïetenvaccins is echter gerelateerd aan cellulaire respons, voornamelijk op cytotoxische T-lymfocyten, zoals CD8 + en gamma delta T-cellen (γδ T). Daarom moeten nieuwe methodologieën worden ontwikkeld om de functies van de cellulaire immuunrespons beter te begrijpen en zo toekomstige therapie en vaccinontwikkeling te ondersteunen. Om een nieuwe strategie te vinden om deze celgemedieerde immuniteit tegen Plasmodium bloedstadium-infectie te analyseren, heeft onze groep een in vitro test opgezet die geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBC) doding door cytotoxische lymfocyten meet. Deze test kan worden gebruikt om cellulaire immuunresponsmechanismen tegen verschillende Plasmodium spp. in het bloedstadium te bestuderen. Aangeboren en adaptieve cytotoxische immuuncellen kunnen iRBC's en de intracellulaire parasiet direct elimineren in een effector:target-mechanisme. Doel-iRBC's worden gelabeld om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren en gecocultiveerd met effectorcellen (CD8 + T, γδ T, NK-cellen, enz.). Het lysispercentage wordt berekend op basis van geteste omstandigheden, vergeleken met een spontane lysiscontrole in een op flowcytometrie gebaseerde assay. Uiteindelijk is deze moordtestmethode een belangrijke vooruitgang in het begrijpen van celgemedieerde immuniteit tegen malaria in het bloedstadium, waardoor nieuwe potentiële therapeutische doelen worden ontdekt en de ontwikkeling van malariavaccins wordt versneld.
Introduction
Malaria blijft een wereldwijde gezondheidscrisis, met meer dan 240 miljoen gevallen en 627.000 malariagerelateerde sterfgevallen gemeld in 20201. Er zijn momenteel vijf parasitaire soorten die malaria bij de mens kunnen veroorzaken, waarvan Plasmodium falciparum en Plasmodium vivax de twee meest voorkomende soorten zijn. Tijdens Plasmodium-infectie is de lever of het pre-erytrocytische stadium asymptomatisch en treden de symptomen alleen op tijdens de aseksuele cyclus van de parasiet in het erytrocytische stadium. In dit infectiestadium worden duizenden merozoïeten afgeleid van het leverstadium vrijgegeven in de bloedbaan en infecteren rode bloedcellen (RBC's). In de RBC differentiëren de parasieten in trofozoïeten en schizonten door schizogonie, totdat schizonten de erytrocyt scheuren, nieuw gevormde merozoieten vrijgeven en deze bloedcyclus herhalen. Herhaalde cycli van invasie, replicatie en merozoïetafgifte resulteren in een exponentiële groei van de parasietpopulatie en veroorzaken uiteindelijk ziektesymptomen2.
Een belangrijke uitdaging bij het bestuderen van de immuunrespons op malaria is dat de Plasmodium spp. die mensen infecteert, infecteert geen proefdiermodellen. Plasmodium-geïnfecteerde patiëntmonsters moeten dus vers worden verzameld en onmiddellijk worden verwerkt en geanalyseerd. In malaria-endemische gebieden zijn de middelen om toegang te krijgen tot immunologische en moleculaire mechanismen echter beperkt. Vanwege deze beperkingen worden knaagdieren veel gebruikt als experimentele modellen om de immuunrespons tegen Plasmodium-infectie te onderzoeken. Hoewel P. berghei en P. chabaudi vaak worden gebruikt als surrogaten voor P. falciparum-infectie, heeft de niet-dodelijke stam van P. yoelii 17XNL ook veel kenmerken gemeen met P. vivax, zoals reticulocytenbeperkte infectie 3,4. De ontwikkeling van Plasmodium in vitro assays, die kunnen worden gebruikt voor van menselijke of dierlijke modellen afgeleide monsters, is waardevol voor het verkrijgen van een beter begrip van de pathogenese van malaria en het vergelijken van de immunologische respons die wordt opgewekt door verschillende soorten van de parasiet.
Beschermende antimalaria-immuniteit wordt niet volledig begrepen, noch in het pre-erytrocytische stadium, noch in het bloedstadium. Het is bekend dat blootstelling aan herhaalde infecties resulteert in gedeeltelijk verworven immuniteit, maar steriele immuniteit wordt zelden ontwikkeld5. Decennialang werd anti-Plasmodium beschermende immuniteit voornamelijk geassocieerd met de inductie van neutraliserende of opsoniserende antilichamen die parasitaire invasie van gastheercellen voorkomen of leiden tot fagocytose door antigeen-presenterende cellen, respectievelijk6. Als gevolg hiervan zijn de meeste inspanningen om antimalariavaccins te produceren tot nu toe gebaseerd op het induceren van beschermende en langdurige antilichamen 7,8. De steriele bescherming geïnduceerd door vaccinatie met een verzwakt sporozoiet correleert echter direct met de activering en expansie van cytotoxische T-lymfocyten 8,9.
Onlangs hebben sommige studies van vers geïsoleerde patiëntmonsters en in vitro culturen aangetoond dat aangeboren of adaptieve cytotoxische immuuncellen zoals CD8 + T 10, γδ T11 en NK-cellen12 plasmodium-geïnfecteerde RBC's en zijn intracellulaire parasiet direct kunnen elimineren op een effector: target ratio manier. Deze baanbrekende bevindingen definieerden een geheel nieuw immuuneffectormechanisme in de context van malaria. Om deze nieuwe antimalaria-immuniteit te ontleden, is het essentieel om cytotoxische effectormechanismen van killercellen tegen geïnfecteerde RBC's (iRBC's) bij natuurlijke infectie of vaccinatie te onderzoeken.
Hier presenteren we een in vitro test die de cytotoxische activiteit van lymfocyten tegen malaria in het bloedstadium meet. Deze test kan vervolgens helpen bij het ophelderen van de mechanismen van de cellulaire immuunrespons tegen het Plasmodium erytrocytenstadium. De doelcellen, iRBC's, worden gelabeld met carboxyfluoresceïnesuccinimidylester (CFSE) om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren en worden vervolgens gecocultiveerd met effectorcellen zoals cytotoxische lymfocyten (CTL). Deze cocultuur wordt vervolgens geëvalueerd door flowcytometrie, met behulp van fluorescerende markers voor specifieke celtypen. Ten slotte wordt het percentage iRBC-lysis door CTL berekend door de experimentele toestand te delen door de spontane breuk van RBC's en spontane lysiscontrole, die optreedt tijdens incubatie zonder de effectorcel. Over het algemeen kan deze dodingstestmethode bijdragen aan een beter begrip van celgemedieerde malaria-immuniteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens het beleid van de Oswaldo Cruz Foundation en de National Ethical Council (CAAE: 59902816.7.0000.5091). De menselijke protocollen werden ontwikkeld in samenwerking met de klinische onderzoeksgroep van het Onderzoekscentrum voor Tropische Geneeskunde van Rondônia (CEPEM), dat verantwoordelijk was voor het inschrijven van patiënten in de studie. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten.
Voor de dierstudie werden procedures uitgevoerd volgens de gedragsprincipes van de Braziliaanse praktijkgids voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke en didactische doeleinden van de Nationale Raad voor de controle van dierproeven (CONCEA). De protocollen zijn goedgekeurd door de Fiocruz Animal Experimentation Council (CEUA protocol LW15/20-2).
1. Verzameling van menselijke bloedmonsters en PBMC-isolatie
- Verzamel bloed van met Plasmodium geïnfecteerde patiënten in een 10 ml geëvacueerde bloedafnamebuis met natriumheparine. Omdat malariapatiënten lymfopenie vertonen, is er een bereik van 5-9 x 106 perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) in een bloedmonster van 10 ml. Aangezien CD8 + T-cellen of γδ T-cellen ~ 10% van de PBMC's uitmaken, verzamelen ze bij voorkeur 50-100 ml bloed / patiënt.
OPMERKING: Er moet rekening worden gehouden met minimaal 1 x 105 effectorcellen / conditie. - Bereken het percentage iRBC's door middel van bloeduitstrijkjes zoals hieronder beschreven.
- Voeg 5 μL totaal bloed toe aan een heldere dia en bereid een bloeduitstrijkje voor. Voer Romanowsky-type panoptische snelle vlek of May-Günwald-Giemsa-beits uit. Hier wordt de panoptische snelle kleurkit gebruikt, die bestaat uit drie reagentia: reagens A (fixatie), reagens B (cytoplasmatische kleur) en reagens C (nucleaire en cytoplasmatische differentiële kleuring).
- Dompel de dia langzaam 10x in oplossing A, dan 4x in oplossing B en ten slotte 10x in oplossing C. Giet het overtollige reagens uit de glaasjes tussen de oplossingen. Na het onderdompelen in oplossing C spoelt u de glijbaan af in stromend leidingwater en laat u deze drogen.
- Tel onder een rechtopstaande lichtmicroscoop met een 100x olie-onderdompelingsobjectief 1000 RBC's in opeenvolgende vierkanten en bereken het percentage parasitemie met behulp van de volgende vergelijking:
- Verdun 15 ml bloed in een verhouding van 1:1 in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 15 ml lymfocytenscheidingsmedium (dichtheid van 1,077 g / ml) toe aan een buis van 50 ml. Leg het 30 ml verdund bloedmonster voorzichtig op de centrifugatiemediumoplossing. Laat bij het gelaagd maken van het monster het bloedmonster en het lymfocytenscheidingsmedium niet mengen.
- Centrifugeer de buizen op 400 x g gedurende 40 minuten bij 22 °C, met lage versnelling en geen pauze-instelling.
- Trek de bovenste laag met plasma af met behulp van een steriele pipet en laat de mononucleaire cellaag ongemoeid. Breng de laag mononucleaire cellen (PBMC's) over in een steriele buis met behulp van een steriele pipet.
- Gooi de buis met de bloedkorrel niet weg, omdat deze later zal worden gebruikt voor geïnfecteerde RBC-isolatie. Zorg er vanaf deze stap voor dat u de RBC's op kamertemperatuur (RT) houdt. Laat ze nooit afkoelen.
- Was de cellen tweemaal door PBS toe te voegen en centrifugeer op 350 x g gedurende 10 minuten, met pauze-instelling. Resuspendeer de celkorrel in 5 ml RPMI-medium aangevuld met penicilline/streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS; compleet medium).
- Tel de PBMC's in aanwezigheid van trypanblauwe oplossing om de levensvatbaarheid van de cel te controleren, met behulp van een hemacytometer (Neubauer-kamer) of geautomatiseerde celteller. Tel de blauw gekleurde cellen niet mee, omdat deze stervende cellen vertegenwoordigen, die trypanblauw absorberen.
- Pas de celconcentratie aan op 107 cellen / ml met behulp van volledig medium. Zuiver de gewenste cytotoxische lymfocytenpopulaties (CD8+ T-cellen, NK-cellen, γδ T-cellen) met behulp van magnetische kralenisolatie volgens het protocol van de reagensfabrikant.
2. Menselijke RBC-isolatie
OPMERKING: Voor met de mens geïnfecteerde RBC-isolatie wordt aanbevolen om te beginnen met bloedmonsters met minimaal 2% parasitemie, bij voorkeur met meer in het trofozoïte / vroege schizontparasietstadium.
- Bereid de PERCOLL (hierna dichtheidsgradiëntscheidingsmedium genoemd) in de aanbevolen concentratie zoals hieronder beschreven.
- Voeg 90 ml 100% dichtheidsgradiëntscheidingsmedium en 10 ml 10x PBS toe om 90% isotone dichtheidsgradiëntscheidingsmedium te verkrijgen.
- Voor P. vivax-geïnfecteerde reticulocytenscheiding, bereid45% dichtheid gradiënt scheidingsmedia voor. Voeg 50 ml 90% isotone dichtheid gradiënt scheidingsmedium en 50 ml 1x PBS toe om 45% dichtheid gradiënt scheidingsmedium te verkrijgen.
- Voor P. falciparum-geïnfecteerde erytrocytenscheiding, bereid 65% dichtheid gradiënt scheidingsmedia voor. Voeg 72 ml 90% isotone dichtheidsgradiëntscheidingsmedium en 28 ml 1x PBS toe om 65% dichtheidsgradiëntscheidingsmedium te verkrijgen.
- Voor niet-geïnfecteerde reticulocytenscheiding bereidt u scheidingsmedia met een gradiënt van 70% dichtheid voor. Voeg 78 ml 90% isotone dichtheidsgradiëntscheidingsmedium en 22 ml 1x PBS toe om een gradiëntscheidingsmedium met een dichtheid van 70% te verkrijgen.
- Verwarm het dichtheidsgradiëntscheidingsmedium tot 37 °C in een waterbad.
- Verwijder na verwijdering van de PBMC-laag voorzichtig zoveel mogelijk van de bovenste laag centrifugatiemedium zonder de cellen aan te raken. Verwijder met een glazen Pasteurpipet voorzichtig de bovenste neutrofielenlaag zonder de RBC-pellet te verstoren en schat het pelletvolume in. Voeg 4x het RBC pelletvolume van RT compleet medium toe en resuspend.
- Voeg in een tweede conische buis van 50 ml 5x het pelletvolume van 45%, 65% of 70% dichtheidsgradiëntscheidingsmedium toe, afhankelijk van het celtype dat u wilt isoleren. Leg de RBC-suspensie voorzichtig op de mediumlaag voor dichtheidsgradiëntscheiding.
- Draai gedurende 15 minuten op 850 x g, met lage acceleratie en geen pauze-instelling. Verzamel de troebele rood/bruine laag die tussen het supernatant en het scheidingsmedium van de dichtheidsgradiënt ligt met een pipet van 5 ml. Breng over in een steriele buis van 15 ml.
- Was de cellen door RT compleet medium tot 15 ml toe te voegen en draai gedurende 10 minuten op 860 x g. Herhaal het wassen door 10 ml RT compleet medium toe te voegen en spin naar beneden. Gooi het supernatant weg en maak een bloeduitstrijkje van de pellet om te controleren op iRBC-verrijking, volgens stap 1.2.
- Resuspendie van de pellet in 1 ml RT compleet medium en laat op kamertemperatuur zitten terwijl de cellen worden geteld. Voeg 10 μL celsuspensie toe in een hemocytometer (Neubauer-kamer) en tel de RBC's in het centrale gebied onderverdeeld in 25 middelgrote vierkanten. Stel de celconcentratie in op 1 x 107 iRBC's/ml in RT complete media.
3. Experimentele malaria-infectie bij muizen
- Ontdooi een aliquot van gecryopreserveerde P. yoelii 17XNL:PyGFP (MRA-817), een GFP-tot expressie brengende stam verkregen uit MR4/ATCC, en injecteer 100 μL intraperitoneaal (i.p.) in een 8 weken oude vrouwelijke C57BL/6-muis.
- Volg de parasietenlast om de 3 dagen door middel van bloedafname van de staartader.
- Doorboor het vat met de naald schuine kant omhoog en ga de ader in een ondiepe hoek binnen, beginnend bij het distale uiteinde van de staart.
- Verzamel het bloedmonster met een pipet of capillaire buis tot 5 of 10 ml en oefen vervolgens handmatige druk uit om het bloeden te stoppen.
- Bereid een bloeduitstrijkje voor (zoals beschreven in stap 1.2) totdat parasitemie 10% -15% van de geïnfecteerde RBC's bereikt.
- Verzamel 10 μL bloed door middel van staartaderprikken en verdun tot 100 μL PBS om i.p. te injecteren in de tweede donormuis.
OPMERKING: Gecryopreserveerde parasieten moeten worden ontdooid en tweemaal bij muizen worden doorgegeven voordat ze worden gebruikt voor experimentele infecties. - Wanneer de tweede passage 15% van de parasietemie bereikt, verzamelt u vijf druppels bloed volgens de staartknipmethode en verdunt u in 1 ml PBS. Bereid een infectieoplossing door de concentratie aan te passen op 1 x 106 iRBC's/ml in steriele PBS en injecteer i.p. 100 μL (1 x 105 iRBCs) van de oplossing in elke muis die nodig is voor het experiment.
- Controleer parasitemie elke 2-3 dagen totdat het ~ 30% iRBC's bereikt, wat ongeveer 12 dagen na infectie optreedt. Wanneer de muizen de gewenste parasiet bereiken, verzamelt u bloed door hartpunctie zoals hieronder beschreven.
- Zuig 100 μL heparine-oplossing (30 E/ml) aan in een spuit van 1 ml met een naald van 26 G.
- Verdoof de muis door inademing met 5% isofluraan en bevestig de afwezigheid van reflexen. Plaats de muis op zijn kant en steek de naald loodrecht in net onder de elleboog, door de ribben en in het hart. Trek de zuiger van de spuit langzaam uit en draai de naald totdat 0,5-1 ml bloed is verkregen.
- Voer humane euthanasie uit door cervicale dislocatie onder anesthesie. Reinig aseptisch de linkerkant van de muis met 70% ethanol. Maak met een chirurgische schaar een snede aan de linkerkant van de muis die door de huid en het buikvlies gaat. Zoek de milt en verwijder deze.
- Plaats de milt van de muis in een petrischaaltje met 5 ml volledig medium om de gewenste effectorcelpopulatie (bijv. CD8+ T-cellen) te zuiveren.
4. Het verkrijgen van verse hele muizensplenocyten
- Snijd in de petrischaal de milt voorzichtig in kleine stukjes met een schaar of een scheermes.
- Plaats een 100 μM celzeef over een conische buis van 50 ml en breng de uitgesneden milt met een pipet over in de celzeef. Pureer de milt door de zeef met een zuiger van de spuit.
- Was de cellen door de zeef met 10 ml complete media. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C op 300 x g en gooi het supernatant weg.
- Resuspendie van de celkorrel in 2 ml koude 1x RBC lysisbuffer. Incubeer de suspensie gedurende 5 minuten op ijs.
- Was de celsuspensie met 10 ml complete media van 4 °C. Herhaal de wasstap drie keer en verwijder eventuele celstolsels tussen de wasbeurten voor milt van met Plasmodium geïnfecteerde muizen.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
OPMERKING: Plasmodium-geïnfecteerde milten zijn vergroot en gevuld met fagocytische cellen die afgebroken hemoglobine en hemozoïne bevatten. - Om problemen tijdens de magnetische kraalisolatie van effectorcellen te voorkomen, gebruikt u de volgende stappen om hemozoïne-verrijkte fagocytische cellen en hemozoïne te verwijderen. Resuspendeer de miltcellen met MACS-buffer en stel de concentratie in op 1 x 108 cellen/ml. Plaats een LS- of LD-kolom in het magnetisch veld. Bereid de kolom voor door af te spoelen met 3 ml MACS-buffer.
- Pas celophanging toe op de kolom. Was de kolom drie keer met 3 ml MACS-buffer. Verzamel doorstroom met de miltcellen.
- Tel de splenocyten in een trypanblauwe oplossing en controleer de levensvatbaarheid van de cel in een hemacytometer (Neubauer-kamer) of geautomatiseerde celteller. Stel de celconcentratie in op 1 x 107 cellen/ml in RT complete media.
5. Cytotoxische effector celzuivering (CD8a + T cel negatieve selectie)
OPMERKING: Er zijn veel positieve en negatieve selectiereagentia die cytotoxische effectorcellen kunnen zuiveren (CD8+ T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-cellen). In dit protocol gebruiken we een negatieve selectie van milt CD8a + T-cellen en volgen we de instructies van de fabrikant.
- Centrifugeer alle splenocyten gedurende 10 minuten bij 400 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de celkorrel in 40 μL MACS-buffer.
- Voeg 10 μL van een biotine-antilichaamcocktail toe. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Voeg 30 μL MACS-buffer toe. Voeg 20 μL anti-biotine micro-kralen toe. Meng goed en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
- Voeg 400 μL MACS-buffer toe en ga verder met magnetische celscheiding. Plaats de MACS LS-kolom in de magnetische veldsteun. Bereid de kolom voor door af te spoelen met 3 ml MACS-buffer.
- Pas celophanging toe op de kolom. Was de kolom drie keer met 3 ml MACS-buffer. Verzamel de doorstroom die alle niet-gelabelde cellen bevat, de verrijkte CD8a + T-cellen.
- Tel de CD8a+ T-cellen in een trypanblauwe oplossing en controleer de levensvatbaarheid van de cel in een hemacytometer (Neubauer-kamer) of geautomatiseerde celteller. Stel de celconcentratie in op 1 x 107 cellen/ml in RT complete media.
6. P. yoelii geïnfecteerde RBC-isolatie
- Centrifugeer het verzamelde bloed in een buis van 1,5 ml op 850 x g gedurende 3 minuten. Gooi het serum weg en resuspensie het bloed in 1 ml 1x RPMI zonder FBS.
- Plaats de LS-kolom in de magnetische veldsteun en spoel af met 3 ml 1x RPMI. Haal de RBC-suspensie door de kolom. Om meer iRBC's te isoleren, brengt u de doorstroming (3 ml RPMI en 1 ml verdund bloed) opnieuw aan in de kolom.
- Was twee keer met 5 ml 1x RPMI. Voer wasstappen uit door bufferaliquots toe te voegen zodra het kolomreservoir leeg is. Laat geen kolommen opdrogen.
- Voeg 5 ml RPMI toe, verwijder de kolom en spoel de iRBC's in een nieuwe buis van 15 ml. Tel de iRBC's en pas de concentratie aan tot 1 x 107 RBC's/ml.
7. CFSE-etikettering van RBC's en voorbereiding voor flowcytometrie
OPMERKING: Start het RBC-etiketteringsprotocol met tweemaal het aantal cellen dat voor het experiment zal worden gebruikt, aangezien ~ 50% van de cellen meestal verloren gaat in de wasstappen na de CFSE-etiketteringsstap. Om de autofluorescentie van de RBC's/iRBC's vast te stellen, neemt u een controlemonster van niet-gelabelde cellen op.
- Verdun CFSE tot een eindconcentratie van 10 mM in 1x RPMI zonder FBS. Was de cellen eenmaal met 1x RPMI zonder FBS in een tube van 15 ml.
- Resuspendeer de RBC's in 500 μL van 1x RPMI zonder FBS en voeg 500 μL van de verdunde CFSE toe. Incubeer gedurende 8 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
- Was drie keer door toevoeging van 14 ml volledig medium (10% FBS RPMI), gevolgd door centrifugeren op 850 x g gedurende 10 minuten. Resuspendie van de cellen in volledig medium tot een concentratie van 1-5 x 106 / ml. Incubeer gedurende 1 uur bij RT.
8. Cytotoxische lymfocyt/RBC-cocultuur en voorbereiding voor flowcytometrie
OPMERKING: Als de betrokkenheid van specifieke receptoren of moleculen wordt gemeten, incubeer dan de specifieke blokkerende en isotypecontrole-antilichamen (10 mg / ml) met de effectorcellen gedurende 30 minuten vóór cocultuur.
- Plaats de cellen in een 96-well round-bottom plaat. Voeg de gezuiverde lymfocyten en CFSE-gelabelde iRBC's in de gewenste effector-doelcelverhouding toe aan een eindvolume van 200 μL en homogeniseer. Bereid elke voorwaarde in drievoud voor.
OPMERKING: We raden aan om de iRBC-concentratie aan te passen naar 1-5 x 104 cellen / ml en de verhouding te kiezen op basis van het gezuiverde celnummer (bijv. 0,5: 1, 2,5: 1 en 5: 1). - Neem de spontane lysiscontrole op, wat de doel-iRBC's zijn zonder de effector, om spontane lysis te evalueren, omdat dit zal worden gebruikt om een 100% cel levensvatbaarheidsconditie weer te geven.
- Draai de plaat gedurende 1 minuut op 360 x g om het celcontact te maximaliseren. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 uur.
OPMERKING: Hypoxie (laag O2), systematisch gebruikt voor P. falciparum cultuur, mag niet worden gebruikt omdat de effectorcellen niet overleven in deze omgeving. Plasmodiumparasieten daarentegen zijn levensvatbaar in de omgevingslucht in 5% CO2 gedurende maximaal 12 uur. - Draai gedurende 5 minuten op 850 x g en draai de plaat om om het supernatant te verwijderen.
OPMERKING: Indien gewenst kan het supernatant worden gebruikt om eventuele oplosbare factoren te meten die in de cocultuur vrijkomen. - Label de RBC's met anti-muis Ter119 1:200 (of anti-humane CD235 1:100 voor menselijke monsters) en CD8+ T-cellen met anti-CD8 1:200 of anti-CD3 1:200 antilichamen (anti-muis of mens) gedurende 30 minuten bij 4 °C in 1x PBS met 3% FBS (FACS-buffer).
OPMERKING: Het antilichaamfluorofoor moet worden geselecteerd op basis van het celtracer/celproliferatiereagens (bijv. CFSE-gelabeld iRBC, APC-Cy7 anti-Ter119 en PerCP-Cy5.5 anti-CD8a). - Was de cellen met FACS-buffer en draai gedurende 5 minuten af op 850 x g. Breng de monsters over naar FACS-buizen en voeg 30 μL telparels toe aan afzonderlijke buizen . Homogeniseer de telkralen door gedurende 30 s te vortexen.
9. Flowcytometrie
- Analyseer monsters met een 405/488/561/640 laserinstrument.
- Gebruik voor menselijke cellen gelabeld met CFSE (FITC), PE anti-humane γδ TCR en PE-Cy7 anti-humane CD235a-antilichamen 530/30 (FITC), 575/25 (PE) en 780/60 (PE-Cy7) filters in een configuratiecytometer met drie lasers (blauw, rood, geelgroen).
- Voor muiscellen gelabeld met CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 anti-muis CD8a en APC-Cy7 anti-muis Ter119, gebruik 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5) en 780/60 (APC-Cy7) filters in de drie-laser cytometer opstelling.
- Kies de populatie met telkralen als stoppoort om minimaal 20.000 gebeurtenissen in de stoppoort te verkrijgen, die voor alle omstandigheden identiek moeten zijn. Voer analyse en compensatie uit met behulp van geschikte flowcytometrie-acquisitie- / analysesoftware.
- Stel de gating-strategie in zoals hieronder beschreven.
- Selecteer enkele cellen (singlets), met uitzondering van vuil met behulp van FSC-piekhoogte (H) tot gebied (A) -verhouding. Selecteer RBC's en sluit de lymfocyten uit van analyse op basis van fluorescentie van de RBC-marker (Ter119 of CD235a) en het lymfocytspecifieke antilichaam (CD8a).
- Selecteer in de vorige RBC-gating levensvatbare RBC's op basis van CFSE-positieve kleuring. Analyseer de gegevens met flowcytometer-data-analysesoftware.
10. Berekening en statistieken
- Om het percentage iRBC-lysis te berekenen, volgt u de gating-strategie beschreven in stap 9. Het percentage levensvatbare RBC's is de frequentie van CFSE-positieve cellen binnen de RBC-poort op basis van Ter119 (muis) of CD235a (menselijke) positieve fluorescentie.
- Gebruik de spontane lysiscontrole, RBC's zonder effectorcellen, conditie als controle om RBC spontane ruptuur te schatten. Deze voorwaarde wordt beschouwd als RBC-lysis (100% levensvatbaarheid). Gebruik de volgende formule om het percentage RBC-lysis in elke geteste toestand te berekenen:
OPMERKING: Tijdens de kweekincubatie kunnen sommige geïnfecteerde RBC's spontaan lyseren of worden gescheurd door de parasiet. Gebruik de CFSE-positieve RBC-frequentie van de spontane lysisconditie, die geen effectorcellen bevat, als basislijn voor cytotoxiciteit van lymfocyten. - Bereken het gemiddelde van drievouden voor elke aandoening en bepaal de statistische significantie met behulp van tweerichtings-ANOVA bij meerdere vergelijkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wordt de toegepaste methodologie beschreven voor isolatie van CFSE-gelabelde Plasmodium-geïnfecteerde RBC's in een cocultuurtest met cytotoxische lymfocyten. Ten eerste geven we een schematische weergave van hoe het protocol moet worden uitgevoerd, met behulp van menselijke monsters die zijn geïnfecteerd met P. vivax (figuur 1). Vervolgens een geïllustreerd stroomdiagram over hoe verder te gaan met het protocol in een malaria-experimenteel model met behulp van een C57BL / 6-muis geïnfecteerd met P. yoelii (figuur 2). In figuur 3 worden de verwachte resultaten (voor en na) voor stap 6 van het protocol (verrijking van met P. yoelii geïnfecteerde RBC's met behulp van magnetische kolommen) weergegeven. Ten slotte toont figuur 4 een representatieve flowcytometrie-analyse, waarin de gatingstrategie wordt beschreven die nodig is om het percentage RBC-lysis te beoordelen, zoals beschreven in stap 9. Daarom belicht deze sectie de verschillende technieken die hier worden gebruikt en beschrijft het hele proces van acquisitie, assemblage en gegevensanalyse om iRBC-doding door cytotoxische lymfocyten te beoordelen.
Humane plasmodium-geïnfecteerde RBC's lysis door cytotoxische cellen
Een schematische weergave van het protocol voor de evaluatie van het doden van met Plasmodium geïnfecteerde RBC's door cytotoxische cellen is weergegeven in figuur 1. Om de cellyse te meten, werd PBMC van plasmodium-geïnfecteerde patiënten gezuiverd met behulp van het scheidingsmedium, gevolgd door magnetische zuivering van de cytotoxische lymfocytenpopulatie (CTL) van belang (bijv. CD8 + T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-cellen, enz.). De pellet van de RBC's die overbleef van de PBMC-isolatie werd gebruikt om Plasmodium-geïnfecteerde RBC's te verrijken met behulp van dichtheidsgradiëntscheidingsmedium (65% P. falciparum; 45% P. vivax). iRBC's werden gelabeld met CFSE en geïncubeerd met of zonder lymfocyten gedurende 4 uur bij 37 °C, 5% CO2. Na de cocultuurperiode werden alle RBC's (al dan niet geïnfecteerd) gelabeld met anti-humaan CD235a-antilichaam (voor de RBC's) en CTL-specifieke antilichamen (bijv. Anti-CD8, anti-γδTCR, enz.) vóór flowcytometrie-analyse. De verwerving en analyse van menselijke monsters waren vergelijkbaar met die voor muizenmonsters in figuur 4.
P. yoelii-geïnfecteerde RBC-lysis door cytotoxische CD8+ T-cellen
Een stroomschema van de experimentele procedure om het cytotoxische effectormechanisme in het experimentele malariamodel te evalueren is weergegeven in figuur 2, samen met representatieve experimentele gegevens in figuur 3 en figuur 4. C57BL/6 muizen werden geïnfecteerd met 1 x 105P. yoelii (Py) iRBCs, en parasitemie werd gecontroleerd totdat het ongeveer 30% bereikte. Py-iRBC's werden geïsoleerd uit bloed met behulp van magnetische scheiding, omdat het parasiet heemsubproduct, hemozoïne, ijzerverrijkt is en functioneert als paramagnetische deeltjes in een magnetisch veld13. De zuiverheid van het verrijkte monster werd geanalyseerd door middel van bloeduitstrijkjes in vergelijking met het pre-kolommonster (figuur 3). iRBC's werden vervolgens gelabeld met het cell tracer reagens CFSE. Tegelijkertijd werden cytotoxische CD8+ T-cellen gezuiverd uit splenocyten met behulp van een magnetische negatieve selectiekit. Als controle werd hetzelfde protocol gebruikt voor CD8+ T-celzuivering van niet-geïnfecteerde muizen. Effector (CD8+ T) en target (CFSE-gelabelde Py-iRBC) cellen werden geïncubeerd bij verschillende effector:target ratio's (E:T: 0,5:1, 2,5:1 en 5:1) gedurende 4 uur bij 37 °C 5% CO2. Aan het einde van de cocultuur werd elke aandoening gelabeld met antilichamen anti-muis Ter119 voor RBC's en anti-CD8a voor cytotoxische cellen. De gatingstrategie en de steekproefresultaten zijn weergegeven in figuur 4.
Figuur 1. Schematische weergave van de in vitro dodingstest. Voorbeeld van een moordtestexperiment. Met plasmodium geïnfecteerd bloed wordt verzameld en verwerkt met behulp van een scheidingsgradiëntmedium. Na centrifugatie wordt de PBMC-laag verzameld en cytotoxische cellen (CTL's) worden gezuiverd met behulp van magnetische kralen. De RBC-laag wordt opnieuw verwerkt met behulp van scheidingsmedia voor dichtheidsgradiënt. Na centrifugatie wordt de Plasmodium-iRBC-laag verzameld en gelabeld met CFSE. Daarna werden de gezuiverde CTL en iRBC's gedurende 4 uur gecocultureerd bij 37 °C, 5% CO2, gevolgd door celspecifieke etikettering en analyse in een flowcytometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Experimenteel malariamodel voor het doden van assay. Eerst werden C57BL/6-muizen geïnfecteerd met 105 PyX17NL-geïnfecteerde rode bloedcellen. Vervolgens wordt parasitemie gecontroleerd door een bloeduitstrijkje, tot de piek van de infectie (30% -40% iRBC's), ongeveer 12 dagen na infectie (dpi). De volgende dag werden muizen gebloed en geëuthanaseerd voor miltverzameling. Het bloed werd verwerkt en geïnfecteerde RBC's werden verrijkt door magnetische scheiding, gevolgd door etikettering met CFSE (rechtsboven). De milt werd verwerkt voor cytotoxische lymfocytenisolatie, door negatieve selectie met behulp van magnetische kralen. Daarna werden de gezuiverde cytotoxische lymfocyten en iRBC's gedurende 4 uur gecocultureerd bij 37 °C, 5% CO2, gevolgd door celspecifieke etikettering en analyse in een flowcytometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. iRBC-verrijking met behulp van magnetische kolommen. De iRBC's werden gezuiverd van met P. yoelii geïnfecteerde muizen met behulp van LS-kolommen. De zuivering wordt benadrukt door bloeduitstrijkjes van bloed verzameld vóór (A ) en na (B) kolomverrijking. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Beoordeling van het cellysepercentage van P. yoelii-iRBCs door CD8+ lymfocyten. De gatingstrategie voor cellysepercentage. (A) Zet het stophek in de populatie van de telkralen (~ 20.000 gebeurtenissen). (B) Controle spontane lysis, iRBC's zonder lymfocyten. Start de gating-strategie door de afzonderlijke cellen te selecteren, exclusief puin, op basis van de FSC-piekhoogte-oppervlakteverhouding, gevolgd door de selectie van de RBC-populatie in APC-Cy7 Ter119-positief en PerCP-Cy5,5 CD8-negatief. Selecteer vervolgens live iRBC's als CFSE (FITC) hoog positief. (C) Voorbeeld experimentanalyse met behulp van verschillende effector: doelverhoudingen, die het percentage levende RBC na de cocultuur weergeven. D) Grafische weergave van het RBC-lysispercentage, berekend op basis van de in punt 10 beschreven formule. De significantievergelijking tussen de groepen (cytotoxisch CD8 of naïef CD8) werd beoordeeld door tweerichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. P < 0,0001 (****). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een in vitro test om plasmodium-geïnfecteerde rode bloedcellen te doden door cytotoxische lymfocyten. Deze test kan helpen bij het ophelderen van de mechanismen van cellulaire beschermende immuniteit tegen het erytrocytische stadium van de malariaparasiet. Het grote voordeel van deze methodologie is dat het een kwantitatieve test biedt van het celgemedieerde doden van iRBC's die kan worden gebruikt om veel vragen te beantwoorden over hoe immuuncellen interageren met verschillende Plasmodium spp.
Belangrijk is dat deze methode kan worden gebruikt om P. vivax en andere Plasmodium-parasieten te bestuderen die niet in vitro cultuur worden onderhouden14,15. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan elke Plasmodium-soort en verschillende gastheren, zoals mensen, muizen en niet-menselijke primaten. Op flowcytometrie gebaseerde methoden worden veel gebruikt om cytotoxische celactivering, cytokineproductie en degranulatiete evalueren 10,11,16, maar de huidige methode is de enige die RBC-lysis onderzoekt door direct celcontact met killercellen.
Er zijn ook veel methoden, zoals microscopie, polymerasekettingreactie (PCR) en flowcytometrie, die worden gebruikt om malaria te bestuderen door parasitemie, invasie en antimalariaactiviteit te meten. Om de celgemedieerde cytotoxiciteit van RBC's te analyseren, zijn de huidige methoden die Cr51 of hemoglobineafgifte gebruiken echter niet gevoelig genoeg om RBC-lysis te evalueren. LDH-afgifte kan ook worden gebruikt om RBC-doding te evalueren door sommige CTL's zoals CD8 + T-cellen, maar het meten van LDH is geen nauwkeurige methode omdat geactiveerde aangeboren of aangeboren cellen elkaar kunnen doden als een regulerend mechanisme.
CFSE wordt veel gebruikt om cellen te volgen of celproliferatie te onderzoeken in flowcytometrie of fluorescerende microscopie17. Aangezien RBC's niet prolifereren18, zou de CFSE-fluorescentie-intensiteit moeten afnemen met cellysis. Flowcytometrie is een zeer nauwkeurige techniek omdat het zeer lage niveaus van specifieke markers kan detecteren, en daarom is het op grote schaal gebruikt om parasitemie en invasie bij malaria-infectie te volgen 19,20,21,22,23. Het belangrijkste is dat flowcytometrie veel parameters in een enkele cel kan meten en cellen in verschillende populaties kan sorteren. Door kwantitatieve standaardreagentia (het tellen van kralen) aan elk monster toe te voegen, kan men het aantal verworven gebeurtenissen normaliseren en absolute celtellingen24 verkrijgen. Deze methode maakt een betrouwbare kwantitatieve vergelijking tussen experimentele omstandigheden mogelijk, wat van cruciaal belang is voor het momenteel voorgestelde protocol.
Enkele kritieke stappen voor dit protocol zijn het waarborgen van de monsterkwaliteit, het zorgen voor de juiste celkleuring en het opnemen van besturingselementen om berekeningen te normaliseren. Een grote hoeveelheid vers bloedmonsters is nodig om geïnfecteerde RBC's te zuiveren. De zuivering van het dichtheidsgradiëntscheidingsmedium moet zorgvuldig worden benaderd, omdat de concentratie ervan van cruciaal belang is voor het verkrijgen van de gewenste Plasmodium iRBC's. De bloedoverlay op het scheidingsmedium van de dichtheidsgradiënt moet ook zo langzaam mogelijk worden gedaan en de ring met rode laag moet zorgvuldig worden geoogst om te voorkomen dat iRBC's verloren gaan. Om het zuiveringsproces gemakkelijker te maken, moet een bloedmonster met een hoge parasitemie worden gebruikt, omdat de hoeveelheid iRBC's hoger zal zijn. Opgemerkt moet worden dat in het RBC-isolatieprotocol met behulp van magnetische velden alleen parasiet volwassen stadia (midden-laat stadium trofozoïeten of schizonten) die aanzienlijke hoeveelheden hemozoïne produceren, zullen worden gezuiverd. Als gevolg hiervan wordt geen enkele ringfase verzameld en dit kan van invloed zijn op het eindresultaat.
Celkleuring moet zorgvuldig worden uitgevoerd om verlies of lysis van cellen te voorkomen. Langdurige opslag of fixatie moet worden vermeden voordat u kleurt. Het is belangrijk op te merken dat de experimentele omstandigheden in drievoud moeten worden uitgevoerd met behulp van seriële effector:doelverhoudingen en geschikte controles, zoals een niet-gelabelde, spontane lysisconditie en een hypothesecontrole. De toevoeging van celtelparels is cruciaal omdat het een eenvoudige manier biedt om de concentratie van cellen of het absolute celgetal voor elk monster te bepalen. Zorg ervoor dat u tijdens de acquisitie van de flowcytometer het aantal gebeurtenissen instelt dat moet worden verzameld in de poort van de telparels om het aantal cellen in elk monster na cocultuur te normaliseren.
Aangezien ten minste 1 x 105 effectorcellen nodig zijn voor consistente resultaten in een cocultuurtest, is een mogelijke beperking van de beschreven methodologie het beperkte aantal cellen na zuivering, wat vooral een probleem kan zijn bij het werken met zeldzame celpopulaties. Dit geldt inderdaad voor iRBC-zuivering, omdat het een zeer hoge parasitemie vereist die niet zo gemakkelijk te verkrijgen is, vooral bij het werken met menselijke monsters in endemische gebieden.
Een protocolverbetering kan de cocultuurincubatietijd zijn. Hoewel we eerder een incubatietijd van 12 uur10,11 gebruikten, hebben we onlangs waargenomen dat 4 uur voldoende is om de experimentele omstandigheden te differentiëren, waardoor de tijd voor potentiële spontane lysis wordt verkort en de reproduceerbaarheid van de resultaten wordt verbeterd.
De mechanismen die betrokken zijn bij het direct doden van met Plasmodium geïnfecteerde RBC's worden geleidelijk blootgelegd. Onze groep was de eerste die aantoonde dat CD8+ T-cellen P.vivax-geïnfecteerde reticulocyten kunnen herkennen en doden via HLA-I-presentatie door de geïnfecteerde cel11. Onlangs toonde een andere studie aan dat γδ T-cellen P. falciparum-geïnfecteerde RBC's herkennen door fosfoantigeenherkenning door butyrophyline, een molecuul dat aanwezig is op het oppervlak van iRBCs10. In beide studies is RBC-lysis granulysine en granzyme B-afhankelijk en leidt het tot intracellulaire parasietdoding.
Hoewel er in de loop der jaren veel methoden zijn ontwikkeld om parasitemie, invasie, antimalariaactiviteit en beeldcelinteractie te meten, is geen enkele in staat geweest om de directe doding van iRBC's door cytotoxische cellen te analyseren in een kwantitatieve flowcytometrie-gebaseerde test 19,20,21. We gebruikten een innovatieve aanpak om de cellysecapaciteit bij malaria te evalueren door CFSE-etikettering van Plasmodium-geïnfecteerde RBC's en evaluatie van iRBC-lysis in een specifieke periode van cocultuur met lymfocyten. Daarom presenteert deze in vitro dodende test een nieuwe strategie om de mechanismen van celgemedieerde immuniteit tegen malaria in het bloedstadium te verduidelijken, wat de studie van nieuwe therapeutische doelen en de ontwikkeling van malariavaccins zal helpen bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Dhelio Pereira en de leden van het Onderzoekscentrum voor Tropische Geneeskunde van Rondônia (CEPEM) voor de inschrijving van malariapatiënten en bloedafname en Felicia Ho voor het helpen met de herziening van het manuscript. Het volgende reagens werd verkregen via BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL:PyGFP, MRA- 817, bijgedragen door Ana Rodriguez. Dit onderzoek werd ondersteund door Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4, fellowships (CJ, GC, CG), en Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - fellowship (LL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R.
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
