Summary
用肌内脂肪代替健康的肌肉组织是人类疾病和病症的突出特征。该协议概述了如何可视化，成像和量化肌内脂肪，从而可以严格研究肌内脂肪形成的机制。
Abstract
纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）是间充质基质细胞，在骨骼肌稳态和再生过程中起关键作用。FAPs构建和维护充当分子肌纤维支架的细胞外基质。此外，FAPs对于肌纤维再生是必不可少的，因为它们分泌肌肉干细胞（MuSC）感知的多种有益因子。然而，在患病状态下，FAPs是肌内脂肪和纤维化瘢痕组织的细胞起源。这种脂肪纤维化是肌肉减少症和神经肌肉疾病（如杜氏肌营养不良症）的标志。确定FAPs分化为肌内脂肪的原因和方式的一个重要障碍是脂肪细胞的有效保存和随后的可视化，特别是在冷冻组织切片中。传统的骨骼肌组织处理方法，如速冻，不能正确保存单个脂肪细胞的形态，从而阻止准确的可视化和定量。为了克服这一障碍，开发了一种严格的方案，保留了骨骼肌切片中的脂肪细胞形态，允许肌肉内脂肪的可视化，成像和定量。该协议还概述了如何处理RT-qPCR的肌肉组织的一部分，使用户能够通过观察脂肪生成基因表达的差异来确认观察到的脂肪形成变化。此外，它可以通过肌肉样品的全载免疫荧光来可视化脂肪细胞。最后，该协议概述了如何对表达 Pdgfrα的FAPs进行遗传谱系示踪，以研究FAPs的脂肪转化。该协议始终如一地产生脂肪细胞的高分辨率和形态学上准确的免疫荧光图像，以及RT-qPCR的确认，允许对肌内脂肪进行稳健，严格和可重复的可视化和定量。总之，这里描述的分析管道是提高我们对FAPs如何分化成肌内脂肪的理解的第一步，并为验证防止脂肪形成的新干预措施提供了一个框架。
Introduction
脂肪纤维化对健康肌肉组织的浸润是杜氏肌营养不良症（DMD）和其他神经肌肉疾病，以及肌肉减少症，肥胖症和糖尿病的显着特征1，2，3，4，5，6，7，8，9，10.虽然在这些情况下脂肪浸润增加与肌肉功能下降密切相关，但我们对肌内脂肪形成的原因和方式的了解仍然有限。FAPs是一种多能的间充质基质细胞群，存在于大多数成人器官中，包括骨骼肌11，12。然而，随着年龄的增长和慢性疾病，FAPs产生纤维化瘢痕组织并分化成脂肪细胞，其位于单个肌纤维之间并形成肌内脂肪13，14，15，16，17，18，19，20。
为了开始对抗肌内脂肪的形成，需要定义FAPs如何变成脂肪细胞的机制。PDGFRα是该领域识别肌肉内FAPs的“金标准”标记13，16，17，18，20，21，22，23，24，25，26，27。结果，在Pdgfrα前驱体的控制下，已经产生了几种小鼠他莫昔芬诱导的Cre系，允许使用Cre-LoxP系统27，28，29在体内遗传操纵FAPs。例如，通过将这种可诱导的Cre谱系与遗传报告基因相结合，可以执行FAPs的谱系追踪，我们已经成功地将这种策略应用于肌肉和白色脂肪组织中的命运映射FAPs20，30。除了谱系追踪之外，这些Cre品系还为研究FAP到脂肪的转化提供了有价值的工具。
定义FAPs脂肪转化为肌内脂肪的机制的一个主要障碍是能够严格和可重复地量化在不同条件下形成的肌内脂肪量。关键是平衡肌肉和脂肪组织的保存，并将其与可用的染色方法相匹配，以可视化脂肪细胞。例如，骨骼肌通常在没有事先固定的情况下被速冻，保留肌纤维但破坏脂肪细胞形态（图1）。相反，固定后进行石蜡包埋，同时显示最佳的组织组织学，包括脂肪细胞，去除所有脂质，从而使大多数亲脂性染料（例如常用的染料油红O）无法使用。
图1：速冻肌肉组织中肌内脂肪与固定肌肉组织中的代表性图像。免疫荧光图像显示甘油损伤后21天（B）速冻和（C）固定TA内的脂肪细胞（黄色），肌纤维（灰色）和细胞核（青色）。比例尺：50 μm.请点击此处查看此图的大图。
这里描述的方案保留了肌纤维和脂肪细胞的形态，并允许可视化和分析多种细胞类型。该方法基于多聚甲醛（PFA）固定肌肉组织中脂肪细胞的免疫荧光染色，允许与多种抗体共染色。它还可以很容易地适应于使用全安装成像在完整组织中的空间显示肌内脂肪，从而提供有关肌肉内脂肪的细胞微环境的信息。此外，该协议可以与我们最近发表的方法相结合，以确定固定肌肉组织31中肌纤维的横截面积，这是评估肌肉健康的重要测量。本文还概述了将这种方法与遗传谱系追踪相结合，以绘制FAPs分化为脂肪细胞的命运图谱。因此，这里描述的多功能方案能够对FAPs及其在组织切片和完整组织中分化为肌内脂肪进行严格且可重复的评估。
图 2：协议概述示意图。 组织处理的示意图概述，其中三分之一的TA被去除，快速冷冻和匀浆，以便 随后通过 RT-qPCR进行RNA分离和转录分析。另外三分之二的TA是PFA固定的，并经过加工，用于对冷冻切片或全纤维进行免疫染色。 请点击此处查看此图的大图。
Protocol
所有动物协议均由佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. FAPs的遗传谱系追踪
注意：如果不需要 FAP 的遗传谱系追踪，则可以跳过步骤 1。
- 要对FAPs进行谱系追踪，请获得必要的小鼠等位基因。
注意：在 Pdgfrα 前驱体的控制下，已经产生了几种他莫昔芬诱导的Cre品系，以成功靶向FAP，包括来自霍根29，兰多27和Bergles32 实验室。作为Cre活性的遗传报告基因，有许多Rosa26报告基因等位基因可用，例如 Rosa26EYFP33。虽然建议每个实验室确定哪种克雷报告基因组合最有效，但通过将 PdgfrαCreERT2 小鼠（29 和Jax#032770）与 Rosa26EYFP （33 和Jax#006148）报告者杂交，得到 PdgfrαCreERT2;罗莎26EYFP小鼠可用于有效和特异性地标记FAP20。为了追踪成熟FAPs的命运，建议等到小鼠达到至少约10周龄后再施用他莫昔芬。谱系追踪实验可以在男性和女性身上进行。 - 通过口服强饲法给予他莫昔芬
- 在玉米油中准备40mg / mL他莫昔芬，并在刮饲前1天充分涡旋混合。在旋转杂交炉中在37°C下孵育O / N。
注意：他莫昔芬是一种致癌物质，应小心处理。处理时一定要戴手套，称量成粉末时戴口罩，因为有吸入的危险。 - 根据方案清洁该区域，并将强饲针头连接到1 mL注射器上。将200μL他莫昔芬吸入注射器中。
- 斯克鲁夫 · Rosa26EYFP小鼠（10周龄，两性使用），将它们放在平坦的表面上并牢牢抓住尾巴的基部。用空闲的手用拇指和食指抓住鼠标中间，然后轻轻地用轻微的压力滑动手柄，直到刚好越过肩膀。
- 用拇指和食指向后捏皮肤，拿起鼠标并翻转手，使鼠标面向用户，并将尾巴塞在握鼠标的手的小指和无名指之间。
- 此时，请确保鼠标已完全固定，无法移动其头部或手臂。将强饲针插入口腔，并用它来稍微倾斜小鼠的头部;这使得食道更容易接近。
- 小心而缓慢地将针头插入食道。如果遇到任何阻力，不要用力打针;针应该很容易滑落。慢慢注射他莫昔芬。监测小鼠15-20分钟，以确保在强饲时没有问题。
注意：连续 2 天给药他莫昔芬通常可使 FAP 的重组效率达到约 75%-85%，而不会引起任何不良反应。建议用户在诱导损伤之前等待1-2周，这将使剩余的他莫昔芬从系统中除去，并将任何剩余的蛋白质翻转过来。
- 在玉米油中准备40mg / mL他莫昔芬，并在刮饲前1天充分涡旋混合。在旋转杂交炉中在37°C下孵育O / N。
2. 胫骨前肌（TA）损伤
注意：为了研究肌内脂肪，建议使用基于甘油的损伤模型（无菌盐水中的甘油为50%），这导致大量的肌内脂肪形成34，35，36，37。
- 通过添加异氟醚并确保小鼠室和鼻锥的管子打开来准备麻醉机。用70%乙醇或过氧化物溶液清洁腔室和工作区域（取决于实验方案）。
- 将氧气流速设置为2.5 L / min，异氟醚浓度设置为2.5%。将鼠标放入麻醉室，等待约5分钟，使其被麻醉。
- 将鼠标仰卧放在干净的加热垫上，然后将鼻子插入鼻锥。用棉头涂抹器将兽医眼药膏轻轻涂抹在眼睛上，以防止麻醉时干燥。持续监测麻醉情况，并在受伤前对鼠标进行脚趾捏合，以确保完全麻醉鼠标。
- 用新鲜的酒精擦拭巾清洁腿部以进行消毒。
- 将30-50μL 50%甘油（取决于小鼠的大小）吸入胰岛素注射器中。轻轻梳理胫骨上的头发，露出TA的位置。
注意：当头发仍然被酒精擦拭弄湿时，更容易移动头发并实现更好的可视化。 - 定位TA后（刚好在胫骨的侧面，它稍微突出穿过皮肤，轻轻触诊即可感觉到），将针头插入TA远端，靠近脚踝。将针头完全插入肌肉中，慢慢注射甘油，同时逐渐拔出针头，这有助于损伤大部分肌肉。
注意：最好将针头平行于腿部插入，角度略微升高。良好的损伤通常会导致背屈，因为 TA 在拔出针头后会收缩。如果小鼠的脚趾向外伸展，则很可能是注射了长指伸肌（EDL）。 - 将鼠标放回笼子中，监测约15-20分钟，以确保麻醉恢复。
- 将针头丢弃在尖锐容器中。永远不要重装针头。
注意：甘油注射后的镇痛应按照机构动物护理和使用委员会的批准提供。足脂肪细胞可以在损伤后5天（dpi）观察到。到7 dpi时，所有脂肪细胞都已形成，到21 dpi时，它们已完全成熟。
3. 组织采集
- 在1x PBS中准备4%的PFA，并在开始收获前放在冰上。
- 将任何用于肌肉固定的板（12孔或24孔）放在冰上，并向每个孔中加入4%的PFA，确保每个孔的PFA体积是被固定组织的10-20倍。
- 在甘油损伤后7至21天之间，根据机构指南（即异氟醚过量后颈椎脱位）对小鼠实施安乐死。
- 开始收获任何用于组织学或RNA分离的组织。
注意：组织应在牺牲后10-15分钟内速冻或置于PFA中（图2）。 - 用70%乙醇充分喷洒要切入的小鼠的任何区域，以帮助防止头发远离解剖区域和器械。
- 用剪刀切开腿部顶部周围的皮肤，靠近骨盆（图3A）。
- 轻轻地将腿部皮肤从上到脚踝拉到脚踝（图3B）。
注意：TA是一种泪滴形的肌有清晰定义的远端肌腱，连接到内侧楔形骨和第一跖骨。它位于胫骨的侧面，并延伸到下膝盖。 - 首先，在收获TA之前，使用尖头镊子除去外结缔组织层（表皮）（图3C）。使用解剖显微镜更好地观察表皮。
- 从肌肉底部开始，从肌腱远端开始，将TA下方的镊子滑出，然后轻轻向上拉向膝盖（图3D）。停在肌肉的末端;不要推过膝盖下部感觉到的阻力。
- 如果在到达下膝盖之前有明显的阻力，请停止并继续去除结缔组织剩余的层。
注意：还有另一条远端肌腱刚好在TA肌腱的外侧，附着在EDL上，EDL是TA外侧的细长肌肉。小心地将镊子仅滑到TA肌腱下方可以防止EDL的意外收获，但也可以在固定后轻松将其移除。 - 一旦TA用镊子从腿上部分抬起，用手术刀使用相同的动作切断TA与下膝盖的连接（图3E）。用剪刀剪断脚踝处的肌腱，以完全去除TA。只处理肌腱处的肌肉，以避免损伤纤维。
- 在肌腱对面的末端切开1/3的TA（图3F），将其放入微量离心管中，然后将其放入液氮中快速冷冻（图3H）。
- 将其他2/3的组织浸没在标记的孔中，其中4%PFA用于组织学（图3I）。一定要跟踪第一个和最后一个组织何时被放置在固定剂中。在4°C下置于振荡器上2-2.5小时。
- 固定的持续时间取决于组织及其大小。确定固定组织所需的持续时间。在4°C下固定TA2-2.5小时通常可以很好地保持脂肪细胞形态，而不会引起组织的过度固定。
注意：如果计划使用TA进行全载免疫荧光染色，请跳过本方案的其余部分，直到达到第7节：“全载免疫荧光染色”。 - 固定后，从孔中除去PFA，用冷1x PBS冲洗组织2-3次，然后用冷的1x PBS洗涤2-3次，每次洗涤5分钟。
- 从孔中取出PBS，并在1x PBS中加入足够的30%蔗糖以使组织漂浮。置于振荡器上，在4°C下过夜。
图3：组织收获摘要 （A）皮肤在腿部底部被切开，（B）后肢肌肉暴露在外。（C）一旦从TA中去除表皮，（D）镊子用于部分分离肌肉并确保表膜已被完全去除。（E）TA用手术刀从腿上切下，并在切除肌腱后取出。（G）将TA切割成三分之一和三分之二的碎片后，（H）三分之一在液氮中速冻以进行RT-qPCR分析，（I）另外三分之二固定在4%PFA中以进行组织学检查。 请点击此处查看此图的大图。
4. 嵌入
- 通过标记和填充足够的包埋介质以完全浸没组织来准备用于包埋的标本模具。
- 从孔中取出纸巾，在纸巾上干燥多余的蔗糖，然后移动到冷冻介质填充的标本模具中。
注意：了解模具在低温恒温器上的切口方向是有帮助的。通过这种方式，用户可以以一种易于接近感兴趣区域的方式定位模具中的组织。对于TA，这将通过将最厚的一端（与肌腱侧相反）朝向将要切割的表面来实现。这使得TA可以很容易地在其最厚的部分（腹部）处切片，并允许肌肉纤维的横截面切割。 - 通过将装有异戊烷的容器部分浸入液氮中来制备异戊烷浆料。确保容器中有足够的液体异戊烷浸没约一半的标本模具以用于包埋组织。
- 开始冷冻模具，小心地将它们放入异戊烷浆料中，并确保大约一半的模具被浸没。另外，确保模具从四个侧面均匀冻结。
- 在整个模具从顶部明显冻结之前，将模具从异戊烷中取出。这需要多长时间取决于所使用的模具。
- 将冷冻模具保存在装有干冰的容器中，同时冷冻其余块，然后将其储存在-80°C。
注意：用于冷冻的异戊烷可以重复使用。放入玻璃瓶中，但在异戊烷达到室温（RT）之前不要拧紧盖子。否则，压力的变化可能会使瓶子破碎。
5. 切片
- 将低温恒温器设置为-22至-24°C，将含有TA的模具加入低温恒温器中，并等待至少30分钟以进行温度适应。同时，标记一系列带正电荷的显微镜载玻片。
- 插入防侧翻板并与低温恒温器对齐，使其与试样块接触的板中具有最小的缺口。牢固到位。
- 将新的低温恒温器刀片插入刀片支架并将其固定到位。
注意：刀片锋利。在操作低温恒温器或冷冻模具的其他部件时，请盖上刀片。 - 从模具中取出冻结的块。向低温恒温器卡盘添加一层均匀的包埋介质，并将块放置在培养基中。静置1-3分钟，直到包埋介质完全冻结（不透明白色）。
注：对于助产士，卡盘上应可以看到最厚的区域（腹部）。 - 将带有组织块的低温恒温器卡盘放入低温恒温器中。揭开刀片并向前推进低温恒温器，直到刚与刀片接触。以25μm切片穿过块，直到组织不再被包埋介质遮挡。
注意：切片时，调整低温恒温器的角度和/或载物台的位置，使截面厚度均匀。收集几个截面以确保截面厚度的均匀性可能会有所帮助。建议用户在切入TA（腹部）内感兴趣的区域之前找到适当的防侧倾板位置，因为这允许用户尝试防侧辊板的多个位置，直到切片笔直而不会浪费组织。 - 将切片厚度更改为10-12μm，并在标记的显微镜载玻片上收集切片。建议通过在6-10张载玻片（标记为1-x）上收集相邻切片来进行连续切片，这允许对多个标记物进行染色。如果需要，使用细刷子展开切片，然后再将其收集到幻灯片上。
注：如果截面卷曲，请检查温度是否在 -22 至 -24 °C 范围内保持稳定。如果部分有垂直条纹，这可能是由于防滚板或刀片上的缺口;这可以通过调整防侧倾板的位置和/或切换到新的刀片来修复。 - 将同一切片平面的相邻部分收集到每个滑块上后，将厚度调整回25μm以通过块前进150-200μm，然后将厚度调整回10-12μm并再次开始切片。
注意：这种串行切片允许用户通过TA在不同深度进行可视化，成像和量化;每张幻灯片三到四个串行部分就足够了。 - 将载玻片和组织块储存在-80°C。
6. 组织切片的免疫荧光（IF）染色
注意：由于抗体浓度可能因批次和制造商而异，因此建议在染色目标载玻片之前，在测试载玻片上评估几种不同浓度的抗体，从而进行优化。
- 在室温下或在37°C的温板上解冻/干燥载玻片10-20分钟。
- 使用疏水笔在幻灯片纸张表面的边缘画一条线，使其与玻璃相遇。
- 将载玻片放入Coplin罐中，每次洗涤用1x PBS + 0.1%吐温20（PBST）3-5x在摇床上洗涤至少5分钟，以使组织切片再水化。
注意：在这一点上，重要的是不要让载玻片在没有浸没在PBST（直到疏水线）的情况下静置，否则组织切片会变干。 - 将载玻片放在加湿室的架子上，并在室温下用310-350μL封闭溶液（5%驴血清和0.3%Triton X-100在1x PBS中）覆盖载玻片1-2小时。
注意：不需要额外的透化步骤，因为封闭溶液含有0.3%的Triton X-100，允许组织切片的充分透化。当使用衍生自小鼠的一抗（即下面列出的PAX7和MYOD1）时，建议在阻断步骤的封闭溶液中使用Fab片段（1：50）的小鼠对小鼠封闭步骤。这将有助于减少由于小鼠二抗与一抗以外的抗体的非特异性结合而导致的背景。 - 在进行下一步之前，请先稀释封闭溶液中使用的一抗，如下所示：
- 用于脂肪细胞染色和全切片成像的一抗：以1：1000的稀释比例稀释兔抗佩里利平。
- 用于脂肪细胞谱系示踪的一抗：以1：1000的比例稀释鸡抗GFP，以1：1000的比例稀释兔抗蠕动蛋白。
- 用于FAPs谱系示踪的一抗：以1：1000的比例稀释鸡抗GFP，以1：250的比例稀释山羊抗PDGFRα。
- 针对肌源性标志物的一抗：以 1：25 的比例稀释小鼠抗 PAX7 或以 1：250 的比例稀释小鼠抗 MYOD1，以 1：1000 稀释兔抗层粘连蛋白。
注意：虽然上面列出的抗体已经成功地用该方案进行了评估，但其他标记FAP，脂肪细胞和/或其他细胞类型的标记物和抗体也可能与该方案兼容。强烈建议首次使用一抗时，用户应包括阴性对照载玻片，其中省略一抗。这将控制抗体的特异性。遵循方案中的所有其他步骤，包括添加二抗，但封闭溶液在下一步中单独使用，而不是封闭溶液中的一抗。
- 将封闭溶液从载玻片上倾倒，并用310-350μL具有一抗的封闭溶液覆盖，并在加湿室中于4°C孵育过夜。
- 第二天，将封闭溶液/一抗从载玻片上倒下，并将它们放入Coplin罐中。用PBST冲洗载玻片2-3次，每次洗涤用PBST在摇床上洗涤3-5次至少5分钟。
- 在最后一次洗涤期间，制备二抗或任何直接偶联物以用于封闭溶液中。尽量减少这些抗体在光线下花费的时间，以避免光漂白。
- 稀释的二抗/直接偶联物：488nm驴抗鸡（1：1000）或抗兔（1：1000）或抗小鼠（1：1000），568nm驴抗山羊（1：1000）或抗兔（1：1000）或鬼臼蛋白（肌纤维;1：100），DAPI染色（细胞核;1：500）。
- 在加湿室中用310-350μL具有二抗和/或直接偶联物的封闭溶液覆盖载玻片。在室温下孵育1-2小时。从现在开始保护样品免受光线照射。
- 倾倒封闭溶液/二抗并将其放入Coplin罐中。用PBST冲洗一次，每次洗涤用PBST在摇摇杯上洗涤3-5次至少5分钟。盖上科普林罐，以防止光线照射。
- 通过轻敲边缘并用纸巾擦拭背面来尽可能地干燥载玻片，但不要让纸巾部分变干。
- 将三滴或四滴水性安装介质添加到载玻片的顶部水平边缘，然后轻轻添加盖玻片。如果盖玻片下形成气泡，请勿按下或移动;任何压力或运动都会扭曲脂肪细胞脆弱的细胞结构。
- 在成像之前，让安装介质在黑暗中凝固过夜。
7. 全贴片免疫荧光染色
- 固定约1小时后（参见步骤3.14），使用尖头镊子从固定的TA上剥离肌纤维。
- 将分离的纤维放入24孔板中，并用PBST洗涤3x，每次3分钟。对于所有后续孵育，请确保盖上盖子以防止蒸发。
- 在振荡器上以RT（200-300μL）在1x PBS中在1%曲拉基X-100中孵育1小时，以允许更好的抗体渗透。
- 用PBST冲洗几次后，用封闭溶液（200-300μL）覆盖并在螺母或振荡器上在4°C下封闭过夜。
- 在封闭溶液中以所需浓度稀释一抗（浓度加倍往往是一个很好的起点）。将样品（200-300μL）在4°C的螺母或摇床上孵育过夜。
- 全天用PBST严格洗涤样品，并在摇床上的室温下频繁更换，每次洗涤约4-6x，持续30-60分钟。
- 将封闭溶液中的二抗稀释到所需浓度（1：500往往效果良好）加核染色，并将样品（200-300μL）在4°C的螺母或振荡器上孵育过夜。
- 全天用PBST严格洗涤样品，在摇床上的室温下频繁更换，每次洗涤约4-6次，每次洗涤30-60分钟或在4°C下洗涤过夜。
- 要安装，请轻轻干燥多余的PBST，然后将光纤放入载玻片上的一滴或两滴安装介质中（图4A）。要抬起盖玻片（18毫米x 18毫米），请添加小粘土脚;这将防止纤维被压扁，并将盖玻片固定在载玻片上。为此，对化合物进行建模效果很好。盖玻片固定后，向边缘添加更多介质，直到盖玻片下方的区域充满。
注意：除了使用含有抗褪色剂的安装介质外，组织还可以通过一系列升序甘油（PBS中甘油为30%至80%）移动。 - 在成像前等待1-2天，以允许安装介质固化。
8. 肌内脂肪的成像
- 打开显微镜并启动成像软件。将幻灯片固定在舞台上。
注意：对于肌肉切片中的脂肪细胞成像，5x或10x物镜结合宽视场显微镜通常就足够了。为了可视化WM-IF，需要共聚焦显微镜。 - 使用任何通道来标识要成像的区域。
- 在成像软件中，调整每个通道的增益和曝光时间。
- 在每个通道中拍摄整个组织的图像（根据显微镜和所使用的软件自动或手动），并合并各个瓷砖以形成整个TA横截面的复合物。
注意：建议在不同深度拍摄同一 TA 的两个或三个不同部分的图像。通过量化每个部分中的脂肪细胞，然后报告由于注射错误而导致的肌内脂肪量的平均局部差异。
9. 量化脂肪细胞
- 如果以前未安装，请将 细胞计数器 插件添加到 ImageJ （https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html）。
- 将图像作为TIF文件或原始显微镜文件导入图像J。在图像J中将每个通道作为单独的 TIF 文件进行查看。
注：如果使用LIF或类似的显微镜文件类型，请在“生物格式导入选项”下，为“查看堆栈依据”选择“超堆叠”，然后选中“拆分通道”框。单击“确定”打开该文件。此外，请确保未选中“自动缩放”框。 - 确保每个通道的图像均为 8 位格式（灰色）： 图像>类型 > 8 位。
- 合并 DAPI（蓝色）、GFP（绿色）、佩里利平（红色）和鬼臼（灰色）图像： 图像>颜色>合并通道。
- 检查比例（分析>集比例）是否以微米为单位。使用手绘选择工具，勾勒出每个横截面的受伤和未受伤部分，然后测量（分析>测量）并在电子表格中记录受伤与未受伤的区域。
注意：受伤的肌肉可以被识别为没有肌纤维的区域或由包含中央定位的肌纤维细胞填充的区域。 - 启动细胞计数器： >初始化>细胞计数器插件。
- 选择计数器类型，然后计数每个脂肪细胞。在电子表格中记录脂肪细胞的总数，然后计算每1 mm2 受伤区域的脂肪细胞数量。
10. 使用逆转录-qPCR进行脂肪生成基因表达分析
- 核糖核酸分离
- 在开始之前，将不含RNase的水预热至45°C，并制备新鲜的70%EtOH（每个样品350μL）。
- 向含有样品的每个管中加入1，000μL硫氰酸胍（参见步骤3.12）。重要的是使用珠子敲击器批准的管子。
注意：硫氰酸閙是有毒的。在通风橱中穿戴适当的个人防护装备和手柄。 - 在每个管子上添加三个中等珠子或一个大珠子和一个小珠子。
- 使用磁珠敲打器在50 Hz下均质组织2-4分钟。根据组织类型和样品大小，可能需要长达10分钟。
- 加入200μL氯仿。
注意：氯仿是有毒的。在通风橱中穿戴个人防护装备和手柄。 - 摇动样品15秒。在室温下孵育2-3分钟。
- 以12，000 x g 离心15分钟。移出350μL透明上清液（上层含有RNA）并加入到含有350μL 70%乙醇的新微量离心管中。注意不要吸出较低的蛋白质和/或DNA层
- 将多达700μL的混合物转移到放置在2 mL收集管中的迷你离心柱中。按照制造商的说明继续进行RNA分离。
- 根据预期产量，用30-50μL无RNase水洗脱。将RNA保存在冰上，并使用分光光度计测量产量。将RNA储存在-80°C
注意：可以省略DNA酶处理步骤，因为小心地只取下RNA层的上部350μL就足以防止DNA污染。除了 RT-qPCR 分析外，分离的 RNA 还可用于 RNA 测序，在这种情况下，强烈建议使用 DNase 处理步骤。
- 二甲基烷合成
- 按照制造商的说明，使用多达 1 微克的 RNA 使用 cDNA 合成试剂盒合成 cDNA。
- 运行完成后，加入80μL无RN酶水。将样品储存在-20°C。
- 脂肪细胞选择性基因的 RT-qPCR。
- 使用384孔格式，向每个孔的底部加入1μL引物（约1μM终浓度）。预干燥底漆可产生更紧密的技术重复。盖上盖子直到引物完全蒸发（板可以放置在设置为37°C的加热块上以加速蒸发）。
- 使用四到八个技术重复设置样品反应，如下所示：2.5μL基于染料的RT-PCR预混液，2.1μL无RNase水和0.4μLcDNA（〜1 ng），每孔5μL总体积。使用以下热循环条件：在95°C下变性15秒，在60°C下退火/延伸25秒，持续40次循环。
- 通过计算ΔΔCT将原始CT（周期阈值）值归一化为管家基因（即 Hprt 和 Pde12）水平，如此处所述38。引物序列见20 。
注意：应遵循 RT-qPCR 分析的标准做法，例如使用减号逆转录 （-RT） 对照、PCR 反应和引物验证。
Representative Results
肌内脂肪的免疫荧光可视化
按照上述步骤并查看图1A，从甘油损伤后21天收集TA组织切片，这些切片要么在LN2冷却的异戊烷中收获后立即速冻，要么在4%PFA中固定2.5小时。在冷冻切片和染色两个样品后，在TA的最大区域腹部中部拍摄图像。与固定切片（图1C）相比，来自未固定的TA的PERILIPIN+脂肪细胞（图1B）显着改变了形态，使其鉴定，可视化和随后的定量更加困难且可能不准确。需要注意的是，在损伤后约5天检测到第一个PERILIPIN +脂质液滴，大多数脂肪细胞在第7天形成。到受伤后21天，脂肪细胞已经完全成熟。
由于每TA的脂肪量与诱导损伤的严重程度密切相关，因此TA必须严重受损才能有效地观察和研究肌内脂肪的形成。使用墨水练习注射尸体TA是改善损伤严重程度的好方法。成功的损伤往往超过肌肉的50%。需要注意的是，肌肉的受伤区域表示没有肌肉纤维的区域或由肌肉纤维填充的区域，这些肌肉纤维包含至少一个位于中央的细胞核，这是再生肌肉纤维的已知标志。
该方案可以很容易地适应于3D中FAP和脂肪的染色。为此，从TA固定后小心地分离出多个肌纤维，然后进行全载免疫荧光。关键是要将纤维正确固定在载玻片上，同时避免组织过度压缩。通过使用可模塑的粘土脚，用户可以调整所需的厚度并将盖玻片固定在载玻片上，甚至允许使用倒置显微镜（图4A）。该方法成功用于标记PDGFRα + FAPs，鬼笔蛋白+ 肌纤维和表达PERILIPIN的脂肪细胞（图4B，补充视频1和补充视频2）。在获得厚度高达150μm的多个z平面上的图像后，显微镜软件中的3D渲染模块用于创建3D重建。
图 4：全贴片免疫荧光染色 （A） 如何安装样品并添加盖玻片进行全载染色的顶视图和侧视图。（B）FAPs（绿色，左）和脂肪细胞（红色，右）以及肌纤维（灰色）和细胞核（蓝色）的代表性3D重建。比例尺：50 μm.请点击此处查看此图的大图。
肌内脂肪的定量
一旦拍摄了肌内脂肪的图像，ImageJ / FIJI中的细胞计数器功能用于手动计数PERLIPIN + 脂肪细胞的数量（图5A）。接下来，确定肌肉部分的总面积以及受伤区域，由肌纤维内位于中央的核定义。为了控制损伤的严重程度，将脂肪细胞的总数除以受伤区域，从而产生每1mm2 受伤肌肉的脂肪细胞数量。通常，显示<30%损伤的TA被排除在量化之外。需要注意的是，尽管脂肪细胞在没有损伤的情况下很少见，每个横截面积从零到八不等，但脂肪细胞的总数仍然按总面积归一化。如图 5B所示，与未受伤的TA肌肉相比，甘油损伤会导致大量的肌内脂肪。或者，由于佩里利平染色非常干净，信噪比高，因此也可以使用 分析颗粒 功能来确定佩里利平所占据的总面积。然而，这种方法将无法区分较小的脂肪细胞与较少的脂肪细胞。对至少四只个体动物的多达三个部分进行成像和定量，并报告了每只小鼠存在的脂肪细胞的平均数量。
图5：肌内脂肪的定量 （A）如何使用ImageJ中的细胞计数器功能计数PERILIPIN + 脂肪细胞（白色）的代表性图像。比例尺：50μm.（B）全TA脂肪细胞定量后甘油注射后21天归一化至受伤区域的1mm 2 。每个点表示一个鼠标的平均值。误差线显示为 SEM. **** = p < 0.0001。（C）匀浆后的RNA层以及随后通过氯仿相分离后用于RT-qPCR分析。（D）在甘油损伤后的不同时间点， 折叠Pparg 和 Cepbα，早期脂肪生成基因以及 Plin1 和 Adipoq（ 两个成熟的脂肪细胞标记物）表达水平的变化。每个点表示一个鼠标的平均值。误差线显示为SEM .请单击此处查看此图的大图。
为了独立确认肌内脂肪的存在量，可以确定各种脂肪形成标志物的基因表达水平。为此，RNA可以在损伤后的不同点从用于免疫荧光的同一TA肌肉的一部分分离（参见上面的步骤）。将磁珠打浆器与硫氰酸镧结合使用以匀化组织。加入氯仿然后离心后，仔细提取上部含RNA层，并使用迷你离心柱进行RNA纯化（图5C）。该方法通常产生高质量和数量的RNA，适用于所有下游分析，如RT-qPCR和RNAseq。对于RT-qPCR，确定了内务层基因脂肪原的相对表达水平，并按照ΔΔCT方法38评估了任何相对变化。如图5D所述，与未受伤的TA肌肉相比，甘油损伤在损伤后3天诱导早期脂肪形成标志物如Pparg和Cebpα的表达。成熟的标志物，如脂联素（Adipoq）和佩里利平（Plin1），最早可以在甘油损伤后5天检测到。
脂肪细胞的遗传谱系追踪
这里介绍的脂肪细胞染色方案可以很容易地适应，包括FAPs的遗传谱系追踪，以映射和跟踪它们的命运进入脂肪细胞。例如，我们之前已经证明，重组可以通过在PdgfrαCreERT2中通过他莫昔芬给药诱导;Rosa26EYFP小鼠在损伤前2周，有效地去除了絮凝的停止编码并不可磨灭地激活了FAPs中的EYFP表达（图6A）。我们在这里介绍的他莫昔芬方案实现了高重组效率，约75%的PDGFRα +FAPs表达EYFP20，类似于其他实验室报告的27，39，40。证明FAPs确实是肌内脂肪的细胞来源，大多数FAPs在甘油损伤后7天变成了表达EYFP +佩里利平的脂肪细胞（图6B）。
图 6：FAP 的谱系追踪 （A） 实验装置的示意图概述。（B）具有代表性的免疫荧光图像，显示PDGFRα +FAPs（红色，箭头）和佩里利平+脂肪细胞（红色，星号）内EYFP（黄色）的成功重组和活化。比例尺：25 μm.请点击此处查看此图的大图。
检测多种细胞类型
该方案也可用于可视化致肌区室。使用针对PAX7和MYOD1的抗体，肌肉干细胞（MuSCs）和肌母细胞分别可以在甘油损伤后5天轻松检测到，即使在PFA固定的肌肉组织切片中也是如此（图7）。因此，所提出的方案是多功能的，不仅适用于脂肪细胞和FAP的标记和图像，而且适用于肌源谱系的其他细胞类型。
图7：肌肉干细胞和肌母细胞免疫荧光染色。（B）具有代表性的免疫荧光图像，显示用PAX7对肌肉干细胞（MuSC）（黄色，左）和用MYOD1对成肌细胞（黄色，右）进行成功染色。层粘连蛋白勾勒出肌纤维（白色），细胞核为青色。比例尺：50 μm.请点击此处查看此图的大图。
补充视频 1：FAP 的 3D 渲染。 损伤后 21 天分别对肌纤维、FAPs 和细胞核进行三维重建，分别染色为鬼瘠苷（灰色）、PDGFRα（绿色）和 DAPI（蓝色）。 请按此下载此影片。
补充视频2：肌内脂肪的3D渲染。 肌纤维束（灰臼）和肌内脂肪（红色，PERILIPIN）的体积渲染，其在甘油损伤后21天取代了肌纤维。 请按此下载此影片。
Discussion
该协议概述了一个广泛而详细的协议，允许对肌内脂肪进行有效的可视化和严格的定量。通过将同一肌肉分成两部分，一部分用于免疫荧光，另一部分用于RT-qPCR分析，该方案也非常通用。它还可以与FAPs的遗传谱系追踪相结合，以研究它们在某些条件下转化为脂肪细胞，并且高度适应于标记和成像多种其他细胞类型。
可视化肌内脂肪最常用的方法是石蜡切片，然后是苏木精和曙红染色或冷冻切片，用于亲脂性染料（如油红O（ORO））。然而，虽然石蜡处理的组织保持最佳的组织学，但相同的过程也提取所有脂质，防止使用亲脂性染料。虽然亲脂染色方法对PFA固定和未固定的组织切片都有效，但脂质液滴很容易通过对盖玻片施加压力而移位，从而扭曲肌内脂肪的空间分布。为了避免这种情况，最近的一项研究建立了一个严格的方案，使用全装载方法可视化ORO +脂肪细胞。为此，作者将TA去细胞化，以可视化整个TA41中肌内脂肪的空间分布。尽管这种技术功能强大，但它也可以防止使用其他共染色剂来标记其他细胞结构。这里介绍的整个免疫荧光方法可用于将脂肪细胞与各种标记物共染色，从而可以精细地映射细胞环境。然而，一个主要挑战是抗体的组织渗透。保持在一起的纤维越多，抗体就越难以均匀地穿透和结合所有可用的抗原。因此，当观察小组纤维时，这种方法是最有效的。同时，这也是一个限制，因为当只关注小的，剥离的纤维束时，肌内脂肪的整体解剖位置正在丢失。然而，随着目前新型组织清除方法和新的成像技术的发展，在未来42，43，44中将有可能实现更大的组织渗透和可视化。
虽然先前的肌肉组织固定保留了脂肪细胞的形态，但它也给评估肌纤维的大小带来了挑战，肌纤维是肌肉健康的重要衡量标准。肌纤维大小是通过测量肌纤维的横截面积来确定的。我们之前已经报道过，先前对肌肉组织的固定将导致大多数可用于轮廓肌纤维的标志物失效31。为了克服这一障碍，我们开发了一种新颖的图像分割管道，即使在固定的肌肉部分31中也可以测量肌纤维的大小。因此，我们已经建立了一个强大而高效的组织处理管道，与该协议相结合，克服了先前固定肌肉组织引起的大多数缺点。
这种方法的另一个主要优点是多功能性。通过将TA分成两部分，可以从一块肌肉获得的信息量最大化。这不仅减少了动物数量，而且还通过基因表达确认组织学，从而增加了额外的控制层，反之亦然。此外，除了脂肪生成基因之外，还可以检查许多不同的基因。分离的RNA也可用于整个肌肉RNA酶实验。最后，速冻肌肉块也可用于蛋白质工作。该协议的一个限制是损伤在整个TA长度上不一致的可能性。这可能导致两个肌肉部位在它们所含的肌内脂肪量上出现差异的情况，并且可能需要从任何下游分析中排除此类样本。因此，建议不要简单地依靠RT-qPCR来得出关于肌内脂肪量的主要结论，而是作为组织学定量的支持数据。
总之，该协议概述了一个强大，高效和严格的组织处理管道，该管道将允许肌内脂肪的可视化和定量，这是开发对抗脂肪纤维化的新治疗方案的第一步。同时，它是多功能的，可以适应肌肉内的许多不同细胞类型以及其他组织中的脂肪细胞。
Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢Kopinke实验室的成员帮助收集数据并批判性地阅读手稿。我们还感谢佛罗里达大学真菌研究所的成员对手稿的宝贵意见。这项工作得到了NIH拨款1R01AR079449的支持。图 2 是使用生物渲染器创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) | Electron Miscroscopy Sciences | 15710 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating |
| 2-Methylbutane (4 L) | Fisher Chemical | O3551-4 | isopentane |
| Absolute Ethanol (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | mouse-on-mouse blocking |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A21206 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody | Invitrogen | A11057 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody | Invitrogen | A12380 | Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution) |
| BioLite 24-well Multidishes | ThermoFisher Scientific | 930186 | 24 well plate for PFA tissue incubation |
| Biometra TOne | analytikjena | 8462070301 | Thermal cycler |
| Chicken anti-GFP antibody | Aves Labs | GFP-1020 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free | ThermoFisher Scientific | AC327155000 | |
| Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
| DAPI stain | Invitrogen | D1306 | 150 µM working solution in dH2O |
| Donkey Serum (100 mL) | Millipore Sigma | 5058837 | for blocking solution |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | sharp-tipped tweezers |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | mounting medium |
| Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) | Acros Organics | 327255000 | |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D | AF1062 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | for Tamoxifen incubation |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | hydrophobic pen |
| Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) | BD | 329461 | |
| Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL | BD | 329654 | Insulin syringe without needle, for oral gavaging |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 78938441 | |
| Leica DMi8 inverted microscope | Leica | micrscope used for widefield IF and confocal imaging | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | positively charged microscope slides |
| mouse anti-MYOD antibody | Invitrogen | MA1-41017 | |
| mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) | DSHB | AB 428528 | |
| MX35 Premier+ Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 3052835 | microtome blades |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000 | spectrophotometer for RNA yield |
| Play-Doh | Hasbro | modeling compound | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | A25742 | green dye PCR master mix |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | 17033-211-38 | vet ophthalmic ointment |
| QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System | Applied Biosystems | 4485694 | qPCR machine |
| Rabbit anti-perilipin antibody | Cell Signaling Technology | 9349S | |
| Red-Rotor Shaker | Hoefer Scientific | PR70-115V | shaker for IF staining |
| Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass | ThermoFisher Scientific | 152460 | coverslips |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | contains mini spin columns |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural | Eppendorf | 22363204 | |
| Sample Tubes RB (2 mL) | QIAGEN | 990381 | |
| Sodium azide | Alfa Aesar | 14314 | |
| Stainless Steel Beads, 2.8 mm | Precellys | KT03961-1-101.BK | small beads |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | QIAGEN | 69989 | medium beads |
| Stainless Steel Beads, 7 mm | QIAGEN | 69990 | large beads |
| Stainless Steel Disposable Scalpels | Miltex | 327-4102 | scalpel |
| Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight | Instech Laboratories | FTSS-20S-3 | gavage needle |
| Tamoxifen | Toronto Research Chemicals | T006000 | |
| Tissue Plus O.C.T. Compound | Fisher HealthCare | 4585 | embedding medium |
| TissueLyser LT | QIAGEN | 85600 | bead beater |
| TissueLyser LT Adapter, 12-Tube | QIAGEN | 69980 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura | 4566 | specimen molds |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | guanidium thiocyanate |
| Tween20 (500 mL) | Fisher BioReagents | BP337-500 | |
| VWR Micro Slides - Superfrost Plus | VWR | 48311703 | |
| Wheaton Coplin staining jars | Millipore Sigma | S6016 | Coplin jar |
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