Summary
Udskiftning af sundt muskelvæv med intramuskulært fedt er et fremtrædende træk ved menneskelige sygdomme og tilstande. Denne protokol skitserer, hvordan man visualiserer, afbilder og kvantificerer intramuskulært fedt, hvilket muliggør en streng undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for intramuskulær fedtdannelse.
Abstract
Fibro-adipogene forfædre (FAPs) er mesenkymale stromale celler, der spiller en afgørende rolle under skeletmuskelhomeostase og regenerering. FAPs bygger og vedligeholder den ekstracellulære matrix, der fungerer som et molekylært myofiberstillads. Derudover er FAC'er uundværlige for myofiberregenerering, da de udskiller en lang række gavnlige faktorer, der registreres af muskelstamcellerne (MuSC'er). I syge tilstande er FAPs imidlertid den cellulære oprindelse af intramuskulært fedt og fibrotisk arvæv. Denne fede fibrose er et kendetegn for sarkopeni og neuromuskulære sygdomme, såsom Duchenne muskeldystrofi. En væsentlig barriere for at bestemme, hvorfor og hvordan FAPs differentierer sig til intramuskulært fedt, er effektiv konservering og efterfølgende visualisering af adipocytter, især i frosne vævsafsnit. Konventionelle metoder til behandling af skeletmuskulaturvæv, såsom snapfrysning, bevarer ikke morfologien af individuelle adipocytter korrekt og forhindrer derved nøjagtig visualisering og kvantificering. For at overvinde denne forhindring blev der udviklet en streng protokol, der bevarer adipocytmorfologi i skeletmuskelafsnit, hvilket muliggør visualisering, billeddannelse og kvantificering af intramuskulært fedt. Protokollen skitserer også, hvordan man behandler en del af muskelvæv til RT-qPCR, hvilket gør det muligt for brugerne at bekræfte observerede ændringer i fedtdannelse ved at se forskelle i ekspressionen af adipogene gener. Derudover kan den tilpasses til at visualisere adipocytter ved helmonteret immunfluorescens af muskelprøver. Endelig skitserer denne protokol, hvordan man udfører genetisk afstamningsporing af Pdgfrα-ekspressive FAPs for at studere den adipogene konvertering af FAPs. Denne protokol giver konsekvent høj opløsning og morfologisk nøjagtige immunofluorescerende billeder af adipocytter sammen med bekræftelse af RT-qPCR, hvilket giver mulighed for robust, streng og reproducerbar visualisering og kvantificering af intramuskulært fedt. Sammen er analysepipelinen beskrevet her det første skridt til at forbedre vores forståelse af, hvordan FAPs differentierer sig til intramuskulært fedt, og giver en ramme til validering af nye interventioner for at forhindre fedtdannelse.
Introduction
Infiltration af sundt muskelvæv med fedtfibrose er et fremtrædende træk ved Duchenne muskeldystrofi (DMD) og andre neuromuskulære sygdomme samt sarkopeni, fedme og diabetes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Selvom øget fedtinfiltration under disse forhold er stærkt forbundet med nedsat muskelfunktion, er vores viden om hvorfor og hvordan intramuskulære fedtformer stadig begrænset. FAC'er er en multipotent mesenkymal stromal cellepopulation, der findes i de fleste voksne organer, herunder skeletmuskulatur11,12. Med alderen og i kroniske sygdomme producerer FAPs imidlertid fibrotisk arvæv og differentierer sig til adipocytter, som er placeret mellem individuelle myofibre og danner intramuskulært fedt 13,14,15,16,17,18,19,20.
For at begynde at bekæmpe intramuskulær fedtdannelse skal mekanismerne for, hvordan FAPs bliver til adipocytter, defineres. PDGFRα er "guldstandard" -markøren i marken for at identificere FAPs inden for musklen hos flere arter 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. Som følge heraf er der genereret flere murin tamoxifen-inducerbare Cre-linjer under kontrol af Pdgfrα-promotoren, hvilket muliggør genetisk manipulerende FAPs in vivo ved hjælp af Cre-LoxP-systemet 27,28,29. For eksempel ved at kombinere denne inducerbare Cre-linje med en genetisk reporter kan afstamning af FAPs udføres, en strategi, vi med succes har anvendt til skæbnekortlægning af FAPs i muskel- og hvidt fedtvæv 20,30. Udover afstamning giver disse Cre-linjer værdifulde værktøjer til at studere FAP-til-fedt-konverteringen.
En væsentlig hindring for at definere mekanismen for den adipogene omdannelse af FAPs til intramuskulært fedt er evnen til strengt og reproducerbart at kvantificere mængden af intramuskulært fedt, der er dannet under forskellige forhold. Nøglen er at afbalancere bevarelsen af muskel- og fedtvæv og matche dette med de tilgængelige farvningsmetoder til at visualisere adipocytter. For eksempel er skeletmuskulatur ofte snapfrosset uden forudgående fiksering, hvilket bevarer myofibre, men forstyrrer adipocytmorfologi (figur 1). I modsætning hertil fjerner fiksering efterfulgt af paraffinindlejring, mens den viser den bedste vævshistologi, herunder adipocytter, alle lipider og derved gør de fleste lipofile farvestoffer, såsom det almindeligt anvendte farvestof Oil Red O, ubrugelige.
Figur 1: Repræsentative billeder af intramuskulært fedt i snapfrosset versus fastspændt muskelvæv. (A) Skematisk oversigt over forsøgsopstillingen. Immunofluorescerende billeder, der viser adipocytter (gul), myofibre (grå) og kerner (cyan) inden for både (B) snapfrosne og (C) faste TA'er 21 dage efter glycerolskade. Skalastænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protokollen beskrevet her bevarer myofiber- og adipocytmorfologi og tillader visualisering og analyse af flere celletyper. Denne fremgangsmåde er baseret på immunfluorescensfarvning af adipocytter i paraformaldehyd (PFA)-fikseret muskelvæv, hvilket muliggør co-farvning med flere antistoffer. Det kan også let tilpasses til rumligt at vise intramuskulært fedt i intakt væv ved hjælp af helmonteret billeddannelse og derved give information om det cellulære mikromiljø af fedt i musklen. Derudover kan denne protokol kombineres med vores nyligt offentliggjorte tilgang til bestemmelse af tværsnitsarealet af myofibre i faste muskelvæv31, en vigtig måling til vurdering af muskelsundhed. Ved at kombinere denne tilgang med genetisk afstamningsporing for at skæbnekortlægge differentieringen af FAPs i adipocytter er også skitseret her. Den alsidige protokol, der er beskrevet her, muliggør således en streng og reproducerbar vurdering af FAPs og deres differentiering i intramuskulært fedt i vævssektioner og intakt væv.
Figur 2: Oversigt over skematisk protokol. Skematisk oversigt over vævsbehandling, hvor en tredjedel af TA fjernes, snap-fryses og homogeniseres til efterfølgende RNA-isolering og transkriptionsanalyse via RT-qPCR. De andre to tredjedele af TA er PFA-fikseret og behandlet til immunostaining på frosne sektioner eller helmonterede fibre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Alle dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Florida.
1. Genetisk afstamning af FAPs
BEMÆRK: Hvis genetisk afstamning af FAPs ikke ønskes, kan trin 1 springes over.
- For at udføre afstamning af FAPs skal du opnå de nødvendige musealleller.
BEMÆRK: Flere tamoxifen-inducerbare Cre-linjer, under kontrol af Pdgfrα-promotoren , er blevet genereret for med succes at målrette FAPs, herunder fra Laboratorierne Hogan29, Rando27 og Bergles32 . Som genetisk reporter af Cre-aktivitet er der adskillige Rosa26-reporter-alleler tilgængelige, såsom Rosa26EYFP33. Mens det foreslås for hvert laboratorium at bestemme, hvilken Cre-Reporter-kombination der er mest effektiv, ved at krydse PdgfrαCreERT2-mus (29 og Jax # 032770) til Rosa26EYFP (33 og Jax # 006148) reporter, den resulterende PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-muskan bruges til effektivt og specifikt at markere FAPs20. For at spore skæbnen for modne FAPs anbefales det at vente, indtil mus har nået mindst ~ 10 uger, før de administrerer tamoxifen. Afstamningssporingsforsøg kan udføres på både mænd og kvinder. - Administration af Tamoxifen gennem oral gavaging
- Forbered 40 mg / ml tamoxifen i majsolie og hvirvelbrønd for at blande 1 dag før gavaging. O/N inkuberes ved 37 °C i en roterende hybridovn.
FORSIGTIG: Tamoxifen er kræftfremkaldende og bør håndteres omhyggeligt. Brug altid handsker ved håndtering og brug en maske, når du vejer den som et pulver, da der er fare for indånding. - Rengør området i henhold til protokollen, og fastgør en strømnål til en 1 ml sprøjte. Træk 200 μL tamoxifen ind i sprøjten.
- Scruff PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP mus (10 uger gamle; begge køn brugt) ved at placere dem på en plan overflade og fast gribe fat i bunden af halen. Brug en fri hånd til at gribe fat i midten af musen med tommelfingeren og pegefingeren, og skub derefter forsigtigt og med let tryk grebet, indtil lige forbi skuldrene.
- Klem huden tilbage med tommelfingeren og pegefingeren, tag musen op og vend hånden, så musen vender mod brugeren, og stik halen mellem pinky og ringfinger på hånden, der holder musen.
- På dette tidspunkt skal du sikre dig, at musen er godt immobiliseret og ude af stand til at bevæge hovedet eller armene. Indsæt gavagingsnålen i munden og brug den til let at vippe musens hoved tilbage; dette gør det muligt for spiserøret at være bedre tilgængeligt.
- Indsæt forsigtigt og langsomt nålen i spiserøret. Tving ikke nålen, hvis der er mødt modstand; nålen skal let glide ned. Injicer tamoxifen langsomt. Overvåg musene i 15-20 minutter for at sikre, at der ikke opstår problemer under gavaging.
BEMÆRK: Administration af tamoxifen på 2 på hinanden følgende dage resulterer typisk i ~ 75% -85% rekombinationseffektivitet af FAPs uden at forårsage nogen bivirkninger. Det anbefales, at brugeren venter i 1-2 uger, før han fremkalder skade, hvilket gør det muligt at fjerne det resterende tamoxifen fra systemet og eventuelt resterende protein vendes.
- Forbered 40 mg / ml tamoxifen i majsolie og hvirvelbrønd for at blande 1 dag før gavaging. O/N inkuberes ved 37 °C i en roterende hybridovn.
2. Skade på tibialis forreste (TA) muskel
BEMÆRK: For at studere intramuskulært fedt anbefales det at anvende en glycerolbaseret skademodel (50% glycerol i steril saltvand), hvilket resulterer i massiv intramuskulær fedtdannelse 34,35,36,37.
- Forbered bedøvelsesmaskinen ved at tilsætte isofluran og sikre, at rørene til både musekammeret og næsekeglen er åbne. Rengør kammeret og arbejdsområdet med enten 70% ethanol- eller peroxidopløsning (afhængigt af protokoller).
- Oxygenstrømningshastigheden indstilles til 2,5 l/min og isoflurankoncentrationen til 2,5 %. Placer en mus i anæstesikammeret og vent ~ 5 minutter på, at den bliver bedøvet.
- Placer musen ned liggende på en ren varmepude og indsæt næsen i næsekeglen. Påfør forsigtigt dyrlæge oftalmisk salve på øjnene med en bomuldsspidsapplikator for at forhindre tørhed under anæstesi. Overvåg kontinuerligt anæstesi og udfør en tåknips på musen inden skaden for at sikre, at musen er fuldt bedøvet.
- Rengør benet, der skal injiceres, med en frisk spritserviet for at desinficere.
- Træk 30-50 μL 50% glycerol (afhængigt af musenes størrelse) op i insulinsprøjten. Børst forsigtigt håret på skinnebenet for at afsløre placeringen af TA.
BEMÆRK: Det er lettere at bevæge håret og opnå bedre visualisering, når det stadig er vådt fra spritservietten. - Efter at have lokaliseret TA (lige lateralt til skinnebenet, stikker den lidt ud gennem huden og kan mærkes med blid palpation), indsæt nålen i TA distalt nær anklen. Indsæt nålen helt i musklen og injicer langsomt glycerol, mens nålen gradvist trækkes tilbage, hvilket hjælper med at skade det meste af musklen.
BEMÆRK: Det er bedst at indsætte nålen parallelt med benet med kun en let forhøjet vinkel. En god skade forårsager typisk dorsiflexion, da TA trækker sig sammen efter tilbagetrækning af nålen. Hvis musens tæer spredes ud, er det sandsynligt, at extensor digitorum longus (EDL) muskel blev injiceret. - Placer musen tilbage i buret og overvåg i ca. 15-20 minutter for at sikre anæstesigendannelse.
- Kassér nålen i en skarp beholder. Opsummer aldrig en nål.
BEMÆRK: Analgesi efter glycerolinjektion skal gives som godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee. Adipocytter kan observeres så snart 5 dage efter skade (dpi). Ved 7 dpi er alle adipocytter dannet, og med 21 dpi er de fuldt modnet.
3. Vævshøst
- Forbered 4% PFA i 1x PBS og læg den på is, inden høsten påbegyndes.
- Placer plader (12- eller 24-brønde), der bruges til muskelfiksering på is, og tilsæt 4% PFA til hver brønd, og sørg for, at hver brønd har 10-20 gange mere volumen PFA end vævet, der fastgøres.
- Mellem 7 og 21 dage efter glycerolskade aflives musen i henhold til institutionelle retningslinjer (dvs. isofluranoverdosis efterfulgt af cervikal dislokation).
- Begynd at høste væv, der skal bruges til histologi eller RNA-isolering.
BEMÆRK: Væv skal snap-fryses eller placeres i PFA inden for 10-15 minutter efter ofring (figur 2). - Sprøjt liberalt alle områder af musen, der skal skæres i med 70% ethanol for at hjælpe med at holde håret væk fra dissekeringsområde og instrumenter.
- Brug en saks til at skære huden rundt om toppen af benet, nær bækkenet (figur 3A).
- Træk forsigtigt benets hud fra toppen ned til anklen (figur 3B).
BEMÆRK: TA er en dråbeformet muskel med en klart defineret distal sene, der fastgøres til den mediale kileskrift og første metatarsale knogle. Det er lateralt til skinnebenet og strækker sig op til underknæet. - Fjern først det ydre bindevævslag (epimysium) ved hjælp af en skarpspidset pincet inden høst af TA (figur 3C). Brug et dissekeringsmikroskop til at visualisere epimysiumet bedre.
- Skub pincetten under TA fra bunden af musklen, startende ved den distale sene, og træk forsigtigt opad mod knæet (figur 3D). Stop i slutningen af musklen; skub ikke forbi modstanden, der mærkes ved underknæet.
- Hvis der er betydelig modstand, inden du når det nederste knæ, skal du stoppe og fortsætte med at fjerne resterende lag af bindevæv.
BEMÆRK: Der er en anden distal sene lige lateralt til TA-senen, der fastgøres til EDL, som er en slank muskel lateral til TA. At være forsigtig med kun at skubbe pincetten under TA-senen forhindrer utilsigtet høst af EDL, men den kan også let fjernes efter fiksering. - Når TA er delvist løftet fra benet med pincetten, skal du bruge den samme bevægelse med en skalpel til at afbryde forbindelsen mellem TA og det nederste knæ (figur 3E). Skær senen ved anklen med en saks for at fjerne TA'en helt. Håndter kun musklen ved senen for at undgå at beskadige fibrene.
- Skær 1/3 af TA i enden overfor senen (figur 3F), læg den i et mikrocentrifugerør, og snap-frys ved at droppe den i flydende nitrogen (figur 3H).
- Nedsænk de andre 2/3 af vævet i en mærket brønd med 4% PFA for histologi (figur 3I). Sørg for at holde styr på, hvornår det første og sidste væv blev placeret i fikseringsmiddel. Anbring på en ryster i 2-2,5 timer ved 4 °C.
- Varigheden af fiksering afhænger af vævet og dets størrelse. Bestem den varighed, der kræves for at fastgøre vævene. Fastsættelse af TA'er i 2-2,5 timer ved 4 °C bevarer typisk adipocytmorfologien godt uden at forårsage overfiksering af vævet.
BEMÆRK: Hvis du planlægger at bruge TA til helmonteret immunfluorescerende farvning, skal du springe resten af denne protokol over, indtil du når afsnit 7: "Hel mount immunofluorescerende farvning". - Efter fiksering fjernes PFA fra brøndene, vævene skylles med koldt 1x PBS 2-3 gange, og vaskes derefter 2-3 gange med koldt 1x PBS i 5 min pr. vask.
- PBS fjernes fra hullerne, og der tilsættes tilstrækkeligt 30% saccharose i 1x PBS, så vævet kan flyde. Placer på shakeren ved 4 °C natten over.
Figur 3: Resumé af vævshøst. (A) Huden skæres i bunden af benet, og (B) bagbenets muskler udsættes. (C) Når epimysium er fjernet fra TA, (D) tang bruges til delvist at adskille musklen og sikre, at epimysium er fjernet fuldstændigt. (E) Ta skæres fra benet med en skalpel og fjernes efter overskæring af senen. (G) Efter at have skåret DEN TEKNISKE BISTAND i en tredjedel og en to tredjedele stykke, snap-fryses (H) en tredjedel i flydende nitrogen til RT-qPCR-analyse, og (I) de andre to tredjedele fastsættes i 4% PFA for histologi. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Indlejring
- Forbered prøveformene, der skal bruges til indlejring ved mærkning og påfyldning med nok indlejringsmedium til fuldt ud at nedsænke vævene.
- Fjern væv fra brøndene, tør overskydende saccharose på et papirhåndklæde, og flyt til de frysende mellemfyldte prøveforme.
BEMÆRK: Det er nyttigt at vide, i hvilken retning formen med være sektioneret på kryostaten. På denne måde kan brugeren orientere vævene i formen på en måde, der gør det let tilgængeligt for interesseområdet. For TA opnås dette ved at sætte den tykkeste ende (modsat senesiden) mod overfladen, der vil blive sektioneret. Dette gør det muligt let at sektionere TA i sin tykkeste del (mave) og tillader tværsnitsskæring af muskelfibrene. - Forbered en isopentanopslæmning ved delvist at nedsænke en beholder, der holder isopentan, i flydende nitrogen. Sørg for, at der er nok flydende isopentan i beholderen til at nedsænke ca. halvdelen af prøveformen, der skal bruges til at indlejre vævene.
- Begynd at fryse formene ved forsigtigt at lægge dem i isopentanopslæmningen og sørg for, at ca. halvdelen af formen er nedsænket. Sørg også for, at formen fryser lige fra alle fire sider.
- Tag formen ud af isopentanen lige før hele formen er synligt frosset over fra toppen. Hvor lang tid dette tager afhænger af de forme, der bruges.
- Opbevar de frosne forme i en beholder med tøris, mens du fryser resten af blokkene, og opbevar dem derefter ved -80 ° C.
BEMÆRK: Isopentan til frysning kan genbruges. Sæt i en glasflaske, men stram ikke låget, før isopentan når stuetemperatur (RT). Ellers kan ændringen i trykket knuse flasken.
5. Sektionering
- Indstil kryostaten til -22 til -24 °C, tilsæt forme indeholdende TA'er i kryostaten, og vent mindst 30 minutter på temperaturakklimatisering. I mellemtiden skal du mærke en række positivt ladede mikroskopbilleder.
- Indsæt en anti-rulleplade og juster til kryostaten, så der er minimale hak i pladen, hvor den kommer i kontakt med prøveblokken. Sikker på plads.
- Sæt et frisk kryostatblad i knivholderen, og fastgør det på plads.
FORSIGTIG: Bladet er skarpt. Dæk bladet, når du manipulerer andre dele af kryostaten eller frosne forme. - Fjern den frosne blok fra formen. Tilføj et ensartet lag af indlejringsmedium til cryostat chuck og placer blokken i mediet. Lad det sidde i 1-3 minutter, indtil indlejringsmediet er helt frosset (uigennemsigtigt hvidt).
BEMÆRK: For TA'er skal det tykkeste område (mave) være synligt, når det er på chucken. - Placer cryostat chuck med vævsblokken i kryostaten. Afdæk klingen, og før kryostaten fremad, indtil den bare kommer i kontakt med klingen. Sektion gennem blokken ved 25 μm sektioner, indtil vævet ikke længere er skjult af indlejringsmediet.
BEMÆRK: Under sektionering skal du justere kryostatens vinkel og / eller scenens position, så sektionerne har ensartet tykkelse. Det kan være nyttigt at samle et par sektioner for at sikre ensartethed i sektionstykkelse. Det anbefales, at brugeren finder den korrekte anti-rullepladeposition inden sektionering til det område, der er af interesse inden for TA (maven), da dette giver brugeren mulighed for at prøve flere positioner af anti-rullepladen, indtil sektionerne kommer lige ud uden at spilde væv. - Skift sektionstykkelse til 10-12 μm, og saml sektionerne på mærkede mikroskopglas. Seriel sektionering anbefales ved at samle tilstødende sektioner på 6-10 dias (mærket 1-x), hvilket giver mulighed for farvning til flere markører. Brug om nødvendigt en tynd børste til at løsne sektioner, før du samler dem på diaset.
BEMÆRK: Hvis sektioner krøller, skal du kontrollere, at temperaturen holder sig stabil inden for området -22 til -24 ° C. Hvis der er lodrette striber i sektioner, kan dette skyldes et hak i anti-rullepladen eller bladet; dette kan løses ved at justere anti-rullepladens position og/eller skifte til en ny klinge. - Efter opsamling af tilstødende sektioner af det samme sektionsplan på hvert dias, juster tykkelsen tilbage til 25 μm for at gå 150-200 μm gennem blokken, juster derefter tykkelsen tilbage til 10-12 μm og begynd sektionering igen.
BEMÆRK: Denne serielle sektionering giver brugeren mulighed for at visualisere, afbilde og kvantificere på forskellige dybder gennem TA; tre til fire serielle sektioner pr. dias er tilstrækkeligt. - Slides og vævsblokke opbevares ved -80 °C.
6. Immunofluorescerende (IF) farvning af vævssektioner
BEMÆRK: Da antistofkoncentrationer kan variere mellem partier og producenter, anbefales optimering ved at evaluere flere forskellige koncentrationer af antistofferne på testbilleder inden farvning af dias af interesse.
- Tø/tør glider enten ved RT eller på en varm plade ved 37 °C i 10-20 min.
- Brug en hydrofob pen til at tegne en linje ved kanten af diasets papiroverflade, hvor den møder glasset.
- Læg diasene i en Coplin-krukke og vask med 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x på en shaker i mindst 5 minutter pr. vask for at rehydrere vævssektionerne.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det vigtigt ikke at lade diasene sidde uden at være nedsænket i PBST (op til den hydrofobe linje), ellers tørrer vævssektionerne ud. - Placer diasene på stativet i et befugtningskammer, og overlejr diasene med 310-350 μL blokeringsopløsning (5% æselserum og 0,3% Triton X-100 i 1x PBS) i 1-2 timer ved RT.
BEMÆRK: Der er ikke behov for ekstra permeabiliseringstrin, da blokeringsopløsningen indeholder 0,3% Triton X-100, hvilket giver mulighed for tilstrækkelig permeabilisering af vævssektionerne. Ved anvendelse af primære antistoffer afledt af mus (dvs. PAX7 og MYOD1 anført nedenfor) anbefales det at inkludere et mus-mod-mus-blokeringstrin ved hjælp af Fab-fragmenter (1:50) i blokeringsopløsningen til blokeringstrinnet. Dette vil hjælpe med at reducere baggrunden på grund af uspecifik binding af musens sekundære antistof til andre antistoffer end det primære. - Fortynd de primære antistoffer, der skal anvendes i blokeringsopløsningen, kort før du går videre til næste trin som følger:
- Primære antistoffer til adipocytfarvning og hel sektionsbilleddannelse: Fortynd kanin-anti-perilipin ved et fortyndingsforhold på 1:1000.
- Primære antistoffer til afstamning af adipocytter: Fortynd kylling anti-GFP i et forhold på 1:1000 og kanin anti-Perilipin ved 1:1000.
- Primære antistoffer til sporing af afstamning af FAPs: Fortyndet kylling anti-GFP i et forhold på 1:1000 og ged anti-PDGFRα på 1:250.
- Primære antistoffer til myogene markører: Fortynd mus anti-PAX7 i et forhold på 1:25 eller mus anti-MYOD1 ved 1:250 og kanin anti-LAMININ ved 1:1000.
BEMÆRK: Mens antistofferne anført ovenfor er blevet vurderet med succes med denne protokol, er det sandsynligt, at andre markører og antistoffer til mærkning af FAPs, adipocytter og / eller andre celletyper også er kompatible med denne protokol. Det anbefales kraftigt, når der anvendes primære antistoffer for første gang, at brugeren inkluderer et negativt kontrolslide, hvor primære antistoffer udelades. Dette vil kontrollere for antistoffernes specificitet. Alle andre trin i protokollen følges, herunder tilsætning af sekundære antistoffer, men blokeringsopløsningen anvendes alene i næste trin i stedet for det primære antistof i blokeringsopløsningen.
- Blokeringsopløsningen dumpes af lysbillederne, og overlejres med 310-350 μL blokerende opløsning med primære antistoffer, og der inkuberes natten over ved 4 °C i befugtningskammeret.
- Den næste dag skal du dumpe blokeringsopløsningen / primære antistoffer fra diasene og placere dem i en Coplin-krukke. Skyl rutsjebanerne 2-3 gange med PBST og vask 3-5x med PBST på en shaker i mindst 5 min. pr. vask.
- Under den sidste vask skal du forberede de sekundære antistoffer eller eventuelle direkte konjugater, der skal anvendes i blokeringsopløsningen. Minimer den tid, disse antistoffer bruger i lyset for at undgå fotobleaching.
- Fortyndede sekundære antistoffer/direkte konjugater: 488 nm æsel anti-kylling (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller anti-mus (1:1000), 568 nm æsel anti-ged (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller Phalloidin (myofibre; 1:100), DAPI plet (kerner; 1:500).
- Overlejring af diasene med 310-350 μL af blokeringsopløsningen med sekundære antistoffer og / eller direkte konjugater i befugtningskammeret. Inkuberes ved RT i 1-2 timer. Beskyt prøver mod lys fra nu af.
- Dump blokeringsopløsningen / sekundære antistoffer og læg dem i en Coplin-krukke. Skyl med PBST én gang og vask 3-5x med PBST på en shaker i mindst 5 min pr. vask. Hold Coplin-krukken dækket for at forhindre lyseksponering.
- Tør gliderne så godt som muligt ved at trykke på kanterne og tørre ryggen mod et papirhåndklæde, men lad ikke vævssektionerne tørre ud.
- Tilsæt tre eller fire dråber vandigt monteringsmedium til den øverste vandrette kant af diaset, og tilsæt forsigtigt en dækslip. Tryk ikke ned eller bevæg dig, hvis der dannes luftbobler under dækslen; ethvert tryk eller bevægelse kan forvrænge adipocytternes skrøbelige cellulære arkitektur.
- Lad monteringsmediet sætte sig i mørke natten over før billeddannelse.
7. Helmonteret immunfluorescerende farvning
- Efter ~1 times fiksering (se trin 3.14) anvendes en pincet med skarpe spidser til at fjerne myofibre fra den faste ta.
- Anbring de adskilte fibre i en 24-brønds plade og vask 3x i 3 minutter hver med PBST. For alle efterfølgende inkubationer skal du sørge for at tilføje låget for at forhindre fordampning.
- Inkuberes i 1 time i 1% Triton X-100 i 1x PBS ved RT (200-300 μL) på en shaker for at muliggøre bedre penetration af antistoffer.
- Efter skylning et par gange med PBST overlejres med blokeringsopløsning (200-300 μL) og blokeres på en møtrik eller ryster natten over ved 4 °C.
- Fortynd de primære antistoffer ved den ønskede koncentration (fordobling af koncentrationen har tendens til at være et godt udgangspunkt) i blokeringsopløsningen. Prøverne (200-300 μL) inkuberes på en møtrik eller ryster natten over ved 4 °C.
- Vask prøverne grundigt med PBST hele dagen med hyppige skift ved RT på shakeren, ca. 4-6x i 30-60 min hver vask.
- Fortynd de sekundære antistoffer i blokeringsopløsningen ved den ønskede koncentration (1:500 har tendens til at fungere godt) plus nuklear farvning og inkuber prøverne (200-300 μL) på en møtrik eller ryster natten over ved 4 ° C.
- Vask prøverne grundigt med PBST hele dagen med hyppige skift ved RT på rysteren, ca. 4-6 gange i 30-60 minutter hver vask eller vask natten over ved 4 °C.
- For at montere skal du forsigtigt tørre overskydende PBST af og derefter placere fibrene i en eller to dråber monteringsmedium på et glasglas (figur 4A). For at hæve dækslippen (18 mm x 18 mm) tilsættes små lerfødder; dette forhindrer fibrene i at blive mast og fastgør dækslippen til diaset. Modelleringsforbindelser fungerer godt til dette. Når dækslippen er fastgjort, skal du tilføje mere medium til kanten, indtil området under dækslippen er fuldt.
BEMÆRK: I stedet for at bruge et monteringsmedium indeholdende anti-fading midler, kan vævet også flyttes gennem en stigende serie glycerol (30% til 80% glycerol i PBS). - Vent i 1-2 dage før billeddannelse for at tillade hærdning af monteringsmedium.
8. Billeddannelse af intramuskulært fedt
- Tænd mikroskopet, og start billedbehandlingssoftwaren. Fastgør diaset på scenen.
BEMÆRK: Til billeddannelse af adipocytter i muskelsektioner er et 5x eller 10x mål kombineret med widefieldmikroskopi ofte tilstrækkeligt. Til visualisering af WM-IF kræves et konfokalt mikroskop. - Brug en hvilken som helst kanal til at identificere det område, der skal afbildes.
- I billedbehandlingssoftwaren skal du justere forstærknings- og eksponeringstiden for hver kanal.
- Tag billeder af hele vævet i hver kanal (automatisk eller manuel i henhold til mikroskop og software, der anvendes) og flet individuelle fliser for at lave en sammensætning af det fulde TA-tværsnit.
BEMÆRK: Det anbefales at tage billeder af to eller tre forskellige sektioner af den samme TA på forskellige dybder. Ved at kvantificere adipocytterne i hvert afsnit og derefter rapportere de gennemsnitlige, lokaliserede forskelle i mængden af intramuskulært fedt på grund af for eksempel injektionsfejl undgås.
9. Kvantificering af adipocytter
- Hvis det ikke tidligere er installeret, skal du føje plug-in'en Cell Counter til ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
- Importer billederne til ImageJ som TIF-filer eller originale mikroskopfiler. Se hver kanal i ImageJ som en separat TIF-fil.
BEMÆRK: Hvis du bruger LIF eller lignende mikroskopfiltyper, skal du under Bio-Formats Import muligheder vælge Hyperstack for Vis stak med og markere afkrydsningsfeltet for Split Channels. Klik på OK for at åbne filen. Sørg også for, at feltet Autoskalering ikke er markeret. - Sørg for, at billeder for hver kanal er i 8-bit format (og grå): Billede > Type > 8-bit.
- Flet DAPI (blå), GFP (grøn), PERILIPIN (rød) og PHALLOIDIN (grå) billeder: Billede > Color > Flet kanaler.
- Kontroller, at skalaen (Analyze > Set Scale) er i mikron. Brug frihåndsudvælgelsesværktøjet til at skitsere den skadede og uskadte del af hvert tværsnit, derefter måle (Analyser > måle) og registrere det skadede vs. uskadte område i et regneark.
BEMÆRK: Skadet muskel kan identificeres som områder uden myofibre eller områder befolket af myofibre, der indeholder centralt placerede kerner. - Start Cell Counter: Plugins > CellCounter > Initialiser.
- Vælg en tællertype, og tæl derefter hver adipocyt. Optag det samlede antal adipocytter i et regneark, og beregn derefter antallet af adipocytter pr. 1 mm2 af det skadede område.
10. Adipogen genekspressionsanalyse ved hjælp af RT-qPCR
- RNA-isolering
- Inden påbegyndelse forvarmes RNasefrit vand til 45 °C, og der tilberedes frisk 70 % EtOH (350 μL pr. prøve).
- Der tilsættes 1.000 μL guanidiumthiocyanat til hvert rør, der indeholder prøven (se trin 3.12. Det er vigtigt, at der anvendes perlepiskergodkendte rør.
FORSIGTIG: Guanidium thiocyanat er giftigt. Brug passende personlige værnemidler og håndtag i en røghætte. - Tilsæt tre mellemstore perler eller en stor og en lille perle til hvert rør.
- Homogeniser vævet ved 50 Hz i 2-4 minutter ved hjælp af en perlepisker. Afhængigt af vævstype og prøvestørrelse kan det tage op til 10 minutter.
- Tilsæt 200 μL chloroform.
FORSIGTIG: Chloroform er giftig. Brug personlige værnemidler og håndtag i en røghætte. - Omryst prøverne i 15 s. Inkuberes i 2-3 min på RT.
- Centrifuger i 15 min ved 12.000 x g. 350 μL af det klare supernatant (øverste lag indeholdende RNA' et) pipetteres, og der tilsættes et nyt mikrocentrifugerør indeholdende 350 μL 70 % ethanol. Pas på ikke at aspirere de nedre protein- og / eller DNA-lag
- Overfør op til 700 μL af blandingen til en mini spin søjle placeret i et 2 ml opsamlingsrør. Fortsæt med RNA-isolering efter producentens anvisninger.
- Elute med 30-50 μL RNasefrit vand, afhængigt af forventet udbytte. Hold RNA på is og mål udbyttet ved hjælp af et spektrofotometer. Opbevar RNA'et ved -80 °C
BEMÆRK: Det er muligt at udelade DNase-behandlingstrinnet, da det er tilstrækkeligt at tage kun de øverste 350 μL af RNA-laget af for at forhindre DNA-forurening. Ud over RT-qPCR-analyse kan det isolerede RNA også bruges til RNA-sekventering, i hvilket tilfælde et DNase-behandlingstrin stærkt anbefales.
- cDNA syntese
- Brug op til 1 μg RNA til at syntetisere cDNA med et cDNA-syntesesæt efter producentens anvisninger.
- Når kørslen er afsluttet, tilsættes 80 μL RNase-frit vand. Prøverne opbevares ved -20 °C.
- RT-qPCR af adipocyt-selektive gener.
- Ved hjælp af et 384-brøndformat tilsættes 1 μL primer (~ 1 μM slutkoncentration) til bunden af hver brønd. Fortørring af primere resulterer i strammere tekniske replikater. Lad det være dækket, indtil primerne er fordampet helt (pladen kan placeres på en varmeblok indstillet til 37 °C for at fremskynde fordampningen).
- Opsæt prøvereaktioner med fire til otte tekniske replikater som følger: 2,5 μL farvestofbaseret RT-PCR-masterblanding, 2,1 μL RNasefrit vand og 0,4 μL cDNA (~ 1 ng) med 5 μL totalvolumen pr. Brønd. Følgende termiske cykelbetingelser blev anvendt: denatur ved 95 °C i 15 s og udglødning/forlængelse ved 60 °C i 25 s i 40 cyklusser.
- Normaliser rå CT -værdier (cyklustærskel) til husholdningsgener (dvs. Hprt og Pde12) niveauer ved at beregne ΔΔCT som beskrevet her38. Se20 for primersekvenser.
BEMÆRK: Standardpraksis for RT-qPCR-analyse skal følges, såsom brugen af en minus Reverse Transcription (-RT) kontrol, PCR-reaktion og primervalidering.
Representative Results
Immunofluorescerende visualisering af intramuskulært fedt
Ved at følge ovenstående trin og se figur 1A blev TA-vævsafsnit indsamlet fra en 21-dages post glycerolskade, der enten blev snapfrosset umiddelbart efter høst i LN2-afkølet isopentan eller blev fastgjort i 4% PFA i 2,5 timer. Efter kryosektion og farvning af begge prøver blev der taget billeder i midten af maven, det største område af TA. PERILIPIN+ adipocytter fra de ikke-fikserede TA'er (figur 1B) har signifikant ændret morfologi sammenlignet med faste sektioner (figur 1C), hvilket gør deres identifikation, visualisering og efterfølgende kvantificering meget vanskeligere og potentielt unøjagtig. For at bemærke blev de første PERILIPIN + lipiddråber detekteret omkring 5 dage efter skade, hvor de fleste adipocytter var dannet på dag 7. Ved 21 dage efter skade var adipocytter fuldt modnet.
Da mængden af fedt pr. TA stærkt korrelerer med sværhedsgraden af den inducerede skade, skal TA'erne skades betydeligt for effektivt at observere og studere intramuskulær fedtdannelse. Øvelse af injektioner ved hjælp af blæk i kadaver-TA'er er en fantastisk måde at forbedre skadens sværhedsgrad på. Succesfulde skader har tendens til at være over 50% af musklen. For at bemærke repræsenterer skadede områder af musklen områder uden muskelfibre eller områder, der er befolket af muskelfibre, der indeholder mindst en centralt placeret kerne, et kendt kendetegn for en regenererende muskelfiber.
Denne protokol kan let tilpasses til pletter til FAPs og fedt i 3D. Til dette blev flere myofibre fra TA-postfikseringen omhyggeligt adskilt efterfulgt af helmonteret immunfluorescens. Nøglen er at fastgøre fibrene korrekt til glasglasset og samtidig undgå overkompression af vævet. Ved at bruge formbare lerfødder kan brugeren justere den krævede tykkelse og fastgøre dækslippen til diaset, hvilket endda tillader brug af et omvendt mikroskop (figur 4A). Denne metode blev anvendt med succes til at mærke PDGFRα + FAPs, Phalloidin + myofibre og PERILIPIN-udtrykkende adipocytter (figur 4B, supplerende video 1 og supplerende video 2). Efter at have opnået billeder på flere z-planer, der spænder over op til 150 μm i tykkelse, blev 3D-gengivelsesmodulet i mikroskopsoftwaren brugt til at skabe en 3D-rekonstruktion.
Figur 4: Helmonteret immunfluorescerende farvning. (A) Top- og sidebillede af, hvordan prøven monteres og tilsætter dækslip til helmonteret farvning. (B) Repræsentative 3D-rekonstruktioner af FAPs (grøn; venstre) og adipocytter (rød; højre) sammen med myofibre (grå) og kerner (blå). Skalastænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Kvantificering af intramuskulært fedt
Når der er taget billeder af intramuskulært fedt, blev celletællerfunktionen i ImageJ/FIJI brugt til manuelt at tælle antallet af PERLIPIN+ adipocytter (figur 5A). Dernæst blev det samlede areal af muskelsektionen såvel som det skadede område, defineret af centralt placerede kerner i myofibre, bestemt. For at kontrollere for skadens sværhedsgrad blev det samlede antal adipocytter divideret med det skadede område, hvilket resulterede i antallet af fedtceller pr. 1 mm2 skadet muskel. Normalt er TA'er, der viser < 30% skade, udelukket fra kvantificeringerne. For at bemærke, at selvom adipocytter er sjældne uden skade, der spænder fra nul til otte pr. Tværsnitsareal, normaliseres det samlede antal adipocytter stadig af det samlede areal. Som fremhævet i figur 5B forårsager en glycerolskade massive mængder intramuskulært fedt sammenlignet med en uskadt TA-muskel. Alternativt, da Perilipin-farvning er meget ren med et højt signal-støj-forhold, er det også muligt at bruge funktionen Analyze Particle til at bestemme det samlede areal, der er optaget af Perilipin. Denne metode vil imidlertid ikke være i stand til at skelne mellem mindre vs. færre adipocytter. Op til tre sektioner fra mindst fire individuelle dyr blev afbildet og kvantificeret, og det gennemsnitlige antal fedtceller, der var til stede pr. Mus, blev rapporteret.
Figur 5: Kvantificeringer af intramuskulært fedt. (A) Repræsentativt billede af, hvordan man tæller PERILIPIN+ adipocytter (hvid) ved hjælp af celletællerfunktionen i ImageJ. Skalabjælke: 50 μm. (B) Hele TA-adipocytkvantificeringer 21 dage efter glycerolinjektion normaliseret til 1 mm2 af det skadede område. Hver prik repræsenterer gennemsnittet af en mus. Fejllinjer vist som SEM. **** = p < 0,0001. (C) RNA-lag efter homogenisering og efterfølgende faseseparation med chloroform anvendes til RT-qPCR-analyse. (D) Fold ændringer i ekspressionsniveauer af Pparg og Cepbα, tidlige adipogene gener og Plin1 og Adipoq, to modne adipocytmarkører, på forskellige tidspunkter efter glycerolskade. Hver prik repræsenterer gennemsnittet af en mus. Fejllinjer vist som SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
For uafhængigt at bekræfte mængden af intramuskulært fedt til stede kan genekspressionsniveauer af forskellige adipogene markører bestemmes. Til dette kan RNA isoleres fra en del af den samme TA-muskel, der anvendes til immunfluorescens (se trin ovenfor) på forskellige punkter efter skade. En perlepisker blev brugt i kombination med guanidiumthiocyanat til homogenisering af vævet. Efter tilsætning af chloroform efterfulgt af centrifugering blev det øvre RNA-holdige lag omhyggeligt ekstraheret, og mini spin-kolonner blev anvendt til RNA-oprydning (figur 5C). Denne metode producerer rutinemæssigt høj kvalitet og mængde RNA, der er egnet til alle downstream-analyser såsom RT-qPCR og RNAseq. For RT-qPCR blev de relative ekspressionsniveauer af adipogene til husholdningsgener bestemt, og eventuelle relative ændringer blev vurderet efter ΔΔCT-metoden38. Som beskrevet i figur 5D, sammenlignet med uskadt TA-muskel, inducerer glycerolskade ekspression af tidlige adipogene markører såsom Pparg og Cebpα så snart som 3 dage efter skade. Modne markører, såsom Adiponectin (Adipoq) og Perilipin (Plin1), kan detekteres så tidligt som 5 dage efter glycerolskade.
Genetisk afstamning sporing af adipocytter
Adipocytfarvningsprotokollen, der præsenteres her, kan let tilpasses til at omfatte genetisk afstamning af FAPs for at kortlægge og følge deres skæbne i adipocytter. Vi har for eksempel tidligere påvist, at rekombination kunne induceres via tamoxifenadministration i PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-mus 2 uger før skaden, hvilket effektivt fjerner den floxede stopkodning og uudsletteligt aktiverer EYFP-ekspression i FAPs (figur 6A). Vi opnåede høje rekombinationseffektiviteter med tamoxifenregimet, der præsenteres her, med ~ 75% af PDGFRα + FAPs, der udtrykker EYFP20, svarende til hvad andre laboratorier har rapporteret 27,39,40. For at demonstrere, at FAPs faktisk er den cellulære oprindelse af intramuskulært fedt, er størstedelen af FAPs blevet til EYFP + PERILIPIN-ekspressive adipocytter 7 dage efter glycerolskade (figur 6B).
Figur 6: Afstamning af FAPs. (A) Skematisk oversigt over forsøgsopstillingen. (B) Repræsentative immunfluorescerende billeder, der viser vellykket rekombination og aktivering af EYFP (gul) inden for PDGFRα+ FAPs (rød, pilespidser) og PERILIPIN+ adipocytter (rød, stjerner). Skalastænger: 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Registrering af flere celletyper
Denne protokol kan også bruges til at visualisere det myogene rum. Ved hjælp af antistoffer mod PAX7 og MYOD1 kan muskelstamceller (MuSC'er) og myoblaster let påvises 5 dage efter glycerolskade, selv i PFA-fikseret muskelvævssektion (figur 7). Således er den præsenterede protokol alsidig og kan tilpasses ikke kun etiket- og billedadipocytter og FAPs, men også andre celletyper af den myogene afstamning.
Figur 7: Muskelstamcelle og myoblast immunfluorescerende farvning. (A) Skematisk oversigt over forsøgsopstillingen. (B) Repræsentative immunfluorescerende billeder, der viser vellykket farvning af muskelstamceller (MuSC) (gul, venstre) med PAX7 og myoblaster (gul, højre) med MYOD1. LAMININ skitserer myofibrene (hvide), og kernerne er i cyan. Skalastænger: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video 1: 3D-gengivelse af FAPs. Tredimensionel rekonstruktion af myofibre, FAPs og kerner farvet for henholdsvis PHALLOIDIN (grå), PDGFRα (grøn) og DAPI (blå) 21 dage efter skade. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 2: 3D-gengivelse af intramuskulært fedt. Volumetrisk gengivelse af myofiberbundter (grå, PHALLOIDIN) og intramuskulært fedt (rød, PERILIPIN), som har erstattet en myofiber 21 dage efter glycerolskade. Klik her for at downloade denne video.
Discussion
Denne protokol skitserer en omfattende og detaljeret protokol, der giver mulighed for effektiv visualisering og streng kvantificering af intramuskulært fedt. Ved at opdele den samme muskel i to dele, hvor den ene bruges til immunfluorescens og den anden til RT-qPCR-analyse, er denne protokol også meget alsidig. Det kan også kombineres med genetisk afstamning af FAPs for at studere deres omdannelse til adipocytter under visse betingelser og er meget tilpasningsdygtig til at mærke og afbilde flere yderligere celletyper.
De mest almindeligt anvendte måder at visualisere intramuskulært fedt på er paraffinsektioner efterfulgt af hæmatoxylin og eosinfarvning eller frosne sektioner farvet til lipofile farvestoffer såsom Oil Red O (ORO). Men mens paraffinforarbejdede væv opretholder den bedste histologi, ekstraherer den samme proces også alle lipider, der forhindrer brugen af lipofile farvestoffer. Selvom lipofile farvningsmetoder vil fungere på både PFA-faste og ikke-fikserede vævssektioner, forskydes lipiddråber let ved at påføre tryk på dækslippen og derved forvrænge den rumlige fordeling af intramuskulært fedt. For at omgå dette etablerede en nylig undersøgelse en streng protokol til at visualisere ORO + adipocytter ved hjælp af en helmonteret tilgang. Til dette decellulariserede forfatterne TA for at visualisere den rumlige fordeling af intramuskulært fedt gennem hele TA41. Så kraftfuld som denne teknik er, forhindrer den også brugen af andre co-pletter til at markere yderligere cellulære strukturer. Hele mount immunofluorescence-tilgangen, der præsenteres her, kan bruges til at co-plette adipocytter med en række markører, der muliggør fin kortlægning af det cellulære miljø. En stor udfordring er imidlertid vævsindtrængning af antistofferne. Jo flere fibre der holdes sammen, jo vanskeligere vil det være for antistofferne at trænge lige ind og binde alle tilgængelige antigener. Således er denne metode mest effektiv, når man ser på små grupper af fibre. Samtidig er dette også en begrænsning, da den samlede anatomiske placering af intramuskulært fedt går tabt, når man kun fokuserer på små, skrællede fiberbundter. Men med den nuværende udvikling af nye vævsrensningsmetoder plus ny billeddannelsesteknologi vil større vævsindtrængning og visualisering være mulig i fremtiden 42,43,44.
Mens forudgående fiksering af muskelvæv bevarer adipocytmorfologi, skaber det også en udfordring at vurdere størrelsen af myofibre, en vigtig måling af muskelsundhed. Myofiberstørrelse bestemmes ved at måle myofiberens tværsnitsareal. Vi har tidligere rapporteret, at forudgående fiksering af muskelvæv vil medføre, at de fleste markører, der er tilgængelige for at skitsere myofibre, fejler31. For at overvinde denne forhindring har vi udviklet en ny billedsegmenteringspipeline, som gør det muligt at måle myofiberstørrelse selv i faste muskelafsnit31. Således har vi etableret en robust og effektiv vævsbehandlingsrørledning, der kombineret med denne protokol overvinder de fleste ulemper forårsaget af forudgående fiksering af muskelvæv.
En anden stor fordel ved denne tilgang er alsidighed. Ved at opdele TA i to dele maksimeres mængden af information, der kan opnås fra en muskel. Dette reducerer ikke kun antallet af dyr, men tilføjer også et ekstra lag af kontrol ved at bekræfte histologi gennem genekspression og omvendt. Derudover kan mange forskellige gener undersøges ud over adipogene gener. Det isolerede RNA kan også bruges til et helt muskel RNAseq eksperiment. Endelig kan det snapfrosne muskelstykke også bruges til proteinarbejde. En begrænsning i denne protokol er muligheden for, at skaden ikke er konsekvent i hele DEN TEKNISKE BISTAND's fulde længde. Dette kan føre til et scenarie, hvor de to muskeldele afviger i mængden af intramuskulært fedt, de indeholder, og kan berettige udelukkelse af en sådan prøve fra enhver downstream-analyse. Det anbefales derfor ikke blot at stole på RT-qPCR for at drage store konklusioner om mængden af intramuskulært fedt, men snarere som understøttende data til de histologiske kvantificeringer.
Sammen skitserer denne protokol en robust, effektiv og streng vævsbehandlingspipeline, der muliggør visualisering og kvantificering af intramuskulært fedt, det første skridt i udviklingen af nye behandlingsmuligheder til bekæmpelse af fedtfibrose. Samtidig er den alsidig og kan tilpasses mange forskellige celletyper i musklen samt adipocytter i andre væv.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af Kopinke-laboratoriet for at hjælpe med dataindsamlinger og kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også medlemmerne af Myology Institute ved University of Florida for deres værdifulde input til manuskriptet. Arbejdet blev støttet af NIH-bevillingen 1R01AR079449. Figur 2 blev oprettet med Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) | Electron Miscroscopy Sciences | 15710 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating |
| 2-Methylbutane (4 L) | Fisher Chemical | O3551-4 | isopentane |
| Absolute Ethanol (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | mouse-on-mouse blocking |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A21206 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody | Invitrogen | A11057 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody | Invitrogen | A12380 | Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution) |
| BioLite 24-well Multidishes | ThermoFisher Scientific | 930186 | 24 well plate for PFA tissue incubation |
| Biometra TOne | analytikjena | 8462070301 | Thermal cycler |
| Chicken anti-GFP antibody | Aves Labs | GFP-1020 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free | ThermoFisher Scientific | AC327155000 | |
| Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
| DAPI stain | Invitrogen | D1306 | 150 µM working solution in dH2O |
| Donkey Serum (100 mL) | Millipore Sigma | 5058837 | for blocking solution |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | sharp-tipped tweezers |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | mounting medium |
| Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) | Acros Organics | 327255000 | |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D | AF1062 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | for Tamoxifen incubation |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | hydrophobic pen |
| Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) | BD | 329461 | |
| Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL | BD | 329654 | Insulin syringe without needle, for oral gavaging |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 78938441 | |
| Leica DMi8 inverted microscope | Leica | micrscope used for widefield IF and confocal imaging | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | positively charged microscope slides |
| mouse anti-MYOD antibody | Invitrogen | MA1-41017 | |
| mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) | DSHB | AB 428528 | |
| MX35 Premier+ Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 3052835 | microtome blades |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000 | spectrophotometer for RNA yield |
| Play-Doh | Hasbro | modeling compound | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | A25742 | green dye PCR master mix |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | 17033-211-38 | vet ophthalmic ointment |
| QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System | Applied Biosystems | 4485694 | qPCR machine |
| Rabbit anti-perilipin antibody | Cell Signaling Technology | 9349S | |
| Red-Rotor Shaker | Hoefer Scientific | PR70-115V | shaker for IF staining |
| Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass | ThermoFisher Scientific | 152460 | coverslips |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | contains mini spin columns |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural | Eppendorf | 22363204 | |
| Sample Tubes RB (2 mL) | QIAGEN | 990381 | |
| Sodium azide | Alfa Aesar | 14314 | |
| Stainless Steel Beads, 2.8 mm | Precellys | KT03961-1-101.BK | small beads |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | QIAGEN | 69989 | medium beads |
| Stainless Steel Beads, 7 mm | QIAGEN | 69990 | large beads |
| Stainless Steel Disposable Scalpels | Miltex | 327-4102 | scalpel |
| Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight | Instech Laboratories | FTSS-20S-3 | gavage needle |
| Tamoxifen | Toronto Research Chemicals | T006000 | |
| Tissue Plus O.C.T. Compound | Fisher HealthCare | 4585 | embedding medium |
| TissueLyser LT | QIAGEN | 85600 | bead beater |
| TissueLyser LT Adapter, 12-Tube | QIAGEN | 69980 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura | 4566 | specimen molds |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | guanidium thiocyanate |
| Tween20 (500 mL) | Fisher BioReagents | BP337-500 | |
| VWR Micro Slides - Superfrost Plus | VWR | 48311703 | |
| Wheaton Coplin staining jars | Millipore Sigma | S6016 | Coplin jar |
References
- Milad, N., et al. Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 7 (1), 19 (2017).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
- Goodpaster, B. H., et al. The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Burakiewicz, J., et al. Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).
- Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. MRI of normal and pathologic skeletal muscle. American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).
- Willcocks, R. J., et al. Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort. Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).
- Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).
- Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skeletal Muscle. 11 (1), 16 (2021).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Joe, A. W., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration. Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).
- Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).
- Hogarth, M. W., et al. Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B. Nature Communications. 10 (1), 2430 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Stumm, J., et al. Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury. Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells. PLoS One. 7 (10), 47496 (2012).
- Sun, Y. -M., et al. PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424 (2017).
- Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750 (2021).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Santini, M. P., et al. Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner. Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).
- Uezumi, A., et al. Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle. Cell Death & Disease. 5, 1186 (2014).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Soliman, H., et al. Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
- Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).
- Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
- Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle. Scientific Reports. 11 (1), 11793 (2021).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), 71084 (2013).
- Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).
- Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).
- Kawai, H., et al. Experimental glycerol myopathy: a histological study. Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Uezumi, A., et al. Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617 (2021).
- Biferali, B., et al. Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair. Science Advances. 7 (23), 9371 (2021).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).
- Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease. iScience. 23 (8), 101432 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
