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Neuroscience

成年小鼠大脑中诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

Published: May 20, 2022 doi: 10.3791/63998
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,2
1Graduate School of Biomedical Science and Engineering, University of Maine, 2Department of Neurosurgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

Summary

使用诱导的转基因谱系追踪小鼠系，用荧光团永久标记干细胞及其后代的能力允许对 体内的活化，增殖，迁移和/或分化进行空间和时间分析。谱系追踪可以揭示有关谱系承诺、对干预的反应和多能性的新信息。

Abstract

开发了一种端粒酶逆转录酶（Tert）谱系追踪小鼠系，通过将“Tet-On”系统oTet-Cre小鼠与与Tert启动子相关的新型反向四环素转激活剂（rtTA）转基因杂交，研究成体组织干细胞的行为和命运，我们已经证明这是一种新的成体脑干细胞群。在这里，向mTert-rtTA：：oTet-Cre小鼠施用四环素衍生物多西环素将不可磨灭地标记表达Tert基因启动子区域的4.4 kb片段的细胞群。当结合罗莎-mTmG报告基因时，在也表达特特的细胞中，多西环素处理诱导用膜EGFP（mGFP）取代多托马托表达。因此，当这些三重转基因谱系追踪小鼠接受多西环素（标记TERT表达细胞的“脉冲”期）时，这些细胞将变得不可磨灭地标记mGFP +细胞，即使在多西环素去除后（“追逐”期）可以跟踪任何理想的时间量，即使Tert表达随后丢失。然后将大脑灌注固定并处理为免疫荧光和其他下游应用，以解释干细胞活化，增殖，谱系承诺，迁移到各种脑壁以及分化成熟细胞类型的变化。使用该系统，任何rtTA小鼠都可以与oTet-Cre和Rosa报告基因交配，以使用干细胞标记进行多西环素诱导的“脉冲追逐”谱系追踪实验。

Introduction

谱系跟踪鼠标行的值
体内干细胞的分析可能很困难，因为许多检查这些细胞的测定只集中在动物死亡时表征这些细胞，这代表了时间上的最终快照。为了更好地了解祖细胞、中间/过渡细胞类型和成熟细胞随时间推移的增殖、分化和迁移过程，需要一种纵向分析方法。这可以通过谱系追踪研究来实现，其中干细胞/祖细胞被不可磨灭地标记，并且可以在之后的任何时间长度内跟踪1。

在成年哺乳动物大脑中，首先通过胸腺嘧啶-H 3 2，3，4或5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）5，6，7，8的标记保留来分析从干细胞和祖细胞产生成人出生的神经元的神经发生过程.在这些研究中，增殖细胞用胸腺嘧啶类似物标记，胸腺嘧啶类似物在复制和细胞分裂/增殖期间被掺入细胞的DNA中。因此，标记的细胞以及它们的后代包含这种类似物，然后在死后识别出来。然而，虽然胸苷-H3和BrdU允许在干细胞知之甚少的大脑区域中标记增殖细胞及其后代，但这些研究受到这些工具的缺点的阻碍。胸苷-H3诱导细胞周期停滞，细胞凋亡和剂量依赖性DNA合成抑制9，而BrdU根据给药途径10标记不同水平的细胞，并在修复或凋亡期间以及细胞分裂11期间被细胞吸收。最近已经使用了更有效的标记方法，例如用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记，但许多与BrdU相同的问题仍然存在12。这些方法也有局限性，因为它们标记了任何增殖细胞，而不仅仅是干细胞，因此对结果的解释可能会混淆。在神经源性谱系中，所有干细胞和祖细胞都保留有丝分裂能力，只有终末/成熟神经元不增殖。对于星形胶质细胞和小胶质细胞，但不是少突胶质细胞，增殖无限期地维持13，14，15。

因此，在研究干细胞及其后代时，转基因小鼠习惯于仅对表达感兴趣蛋白质的细胞进行谱系追踪，例如我们在这里使用的确认鉴定成体干细胞的细胞。虽然很难通过小鼠转基因方法产生，但谱系追踪小鼠品系允许追踪大脑中特定标记的细胞，并且不仅仅依赖于增殖。在Tet-On转基因小鼠系统中，施用四环素或多西环素（一种四环素衍生物）诱导使用反向四环素反式激活剂（rtTA）工程的细胞中的Cre-重组酶表达，该细胞由感兴趣的启动子转录。然后，Tet诱导的Cre驱动的重组将激活目标细胞中不可磨灭的荧光或发光蛋白的表达，这取决于所使用的Rosa报告小鼠。这些不可磨灭标记的细胞在分裂，分化或迁移后继续表达该报告基因，允许随着时间的推移或在不同干预之后跟踪这些细胞及其后代16。转基因谱系示踪方法的优点包括：1）追踪到RTTA标记的特定细胞谱系或祖细胞/干细胞的特异性，2）尽管细胞更新或分化，荧光或发光蛋白的不可磨灭表达，3）低毒性，4）在动物生命周期的任何一点有条件活化，以及5）易于使用常见测定， 包括免疫染色/免疫荧光16.

在小鼠中时间诱导报告工具的其他方法包括使用Cre-ERT2小鼠，其可以与ROSA-GFP，ROSA-mTmG或其他荧光报告基因转基因配对。在这些动物中，细胞特异性调节元件，例如感兴趣的启动子或增强子区域，驱动Cre重组酶的产生，其只能通过施用他莫昔 芬来激活 。虽然Cre-ERT2小鼠品系允许在特定细胞系中诱导Cre，但有大量知识详细介绍了他莫昔芬对成人神经发生的影响17，18。此外，还有许多ROSA驱动的荧光报告基因可以代替GFP或mTmG，包括YFP或CFP，这将允许在其他荧光波长上进行交替荧光标记。这些荧光报告基因可与检测开启或 Cre-ERT2 系统一起使用。

端粒酶逆转录酶（TERT）是全酶端粒酶的限速组分，其在细胞分裂期间缩短端粒19，20后起作用延长端粒。TERT已被确定为肠道21，22，骨髓21，肝脏23，脂肪24，子宫内膜25，26和骨1中成体组织干细胞的标志物。TERT在这些成体干细胞中的表达是仅用于端粒酶延伸活性还是执行非规范的TERT作用27仍然是未知的。TERT表达的静止成体干细胞（qASCs）已被鉴定出来，并与转基因谱系追踪小鼠一起在全身进行追踪，以研究这些干细胞的多能性和自我更新能力，以及它们激活，增殖，分化和迁移的潜力1，22，23，28。特-rtTA转基因的产生以前已经进行过1。在本文中，我们将描述使用谱系追踪TERT小鼠系来研究TERT + qASCs，我们已经将其确定为成年小鼠大脑中的新型ASC群体。

转基因谱系追踪小鼠系的产生
要使用Tet-On系统生成谱系追踪小鼠谱系，必须通过小鼠交配在单个动物内组合三种转基因。第一种是rtTA，在目的基因的启动子的控制下表达（我们的是TERT-rtTA）。因此，在表达该目的基因的细胞中，rtTA将被表达。第二个是oTet-Cre基因，它含有四环素响应元件（TRE），该元件允许在rtTA融合转录本和四环素或多西环素存在的情况下转录Cre重组酶。四环素或多西环素 可以通过饮用水或 chow29给予动物。最后，必须有一个基因将被Cre重组酶裂解激活。在这份手稿中，我们将描述的标记基因是Rosa26-mTmG基因，直到Cre重组之前，它将无处不在地转录mTomato（所有细胞中的膜红色荧光）。然而，如果一个细胞表达rtTA转录本并含有四环素或多西环素，则在mTomato和mGFP位点之间重组一组lox P位点的Cre重组将改变R26位点并导致细胞产生膜EGFP（mGFP或膜绿色荧光）而不是膜番茄。这种mGFP信号的不可磨灭性将允许在细胞增殖，迁移和分化时进行 体内 标记和追踪。在迹线之后，可以通过免疫荧光在标准冷冻切片或更厚的光学清除大脑中分析细胞的 GFP表达 。

在本文中，我们将描述特定小鼠线的使用，即为了创建这种三重转基因小鼠品系，我们首先将oTet-cre动物（杰克逊实验室菌株#006234）与罗莎-mTmG动物（杰克逊实验室菌株#007676）交配，以产生oTet-Cre：：Rosa-mTmG双转基因小鼠。用补充表1和2中指示的引物和PCR模板对这些动物进行基因分型。将小鼠（由大卫·布雷奥特1创建）与oTet-cre：：罗莎-m-mG动物交配以产生图1B说明了鼠线的作用机制。

多西环素诱导和脉搏追逐设计
在计划实验时，重要的是要考虑将影响谱系追踪实验结果的几个因素，包括多西环素诱导时动物的年龄，多西环素给药的长度（“脉冲”期），多西环素去除后组织收集前的时间长度（“追逐”期），以及这些过程中任何干预的时间。这些研究设计考虑因素对于在实验结束时了解标记细胞及其后代至关重要。该过程的第一步是确定动物感兴趣的年龄和多西环素给药的长度。更长的脉冲周期将允许更多的细胞表达rtTA连接的启动子表达，并且更多的感兴趣的细胞被不可磨灭地标记。表现出目的基因瞬时表达的细胞类型可能需要比连续表达目的基因的细胞更长的脉冲周期。然而，如果研究的目标是了解感兴趣的细胞或急性干预的短期影响，则脉搏周期不能太长，因为一旦标记了细胞，它将在脉冲周期的剩余时间内通过任意数量的变化进行追踪。在我们的一些研究中，没有追逐期的2天脉冲被用来更接近地模仿TERT的直接报告者。这是因为Rosa-mTmG基因重组的最短时间为2天31。

脉搏追逐实验的下一个重要时期是去除多西环素和灌注动物之间的长度，也称为“追逐”。无论给药途径如何，多西环素在小鼠中的半衰期约为170分钟，从而得出结论，多西环素诱导可能在去除后数小时不再发生32。然而，重要的是要注意，多西环素在老年小鼠中的代谢较慢，这可能导致比年轻动物更长的有效“脉冲”期33。

在追逐期间，标记的细胞将继续被标记，即使在增殖，分化或迁移之后也是如此。这些细胞的后代也将被标记。该研究的目标将塑造脉冲追逐范式的长度。如果研究的目的是了解组织在很长一段时间内与目标细胞的再生，则可能需要很长的追逐期。最后，必须决定任何干预或治疗的时间。在脉冲期间施用将影响表达目的基因的细胞以及在此期间产生的任何后代，而在追逐期间施用可能主要影响目标细胞的后代，尽管这将取决于标记细胞分裂或分化的速度。 图2A概述了我们利用的脉冲追逐实验设计示例。

同样重要的是要注意由于表达泄漏而产生背景GFP信号的可能性。在没有多西环素的情况下，rtTA和Otet序列之间的固有结合电位以及在没有rtTA的情况下Otet转基因的残余活性（在34中回顾）导致泄漏表达。渗漏表达代表了Tet系统的一个弱点，尽管泄漏通常是系统可接受的缺点，但泄漏表达可能导致毒性和死亡的情况，例如Otet-DTA动物中的白喉毒素（DTA）可以限制这些系统的使用35。

用于显微镜检查的薄片的脑处理、切片和免疫荧光
为了在谱系追踪实验后分析小鼠的大脑，必须首先 通过 经心灌注来灌注小鼠，以去除可能导致大脑中高自发荧光的血液和脑脊液。动物可能灌注两种常用的固定剂：组织回旋组织固定剂，乙二醛固定剂（GF）或4%多聚甲醛（PFA）。乙二醛固定剂允许相对温和的固定过程，交联比PFA少。这降低了组织僵硬，减少了抗原检索的需求，并允许在免疫染色过程中较少浓缩的抗体溶液。然而，如果它们含有甲醇，这可能有助于增加自发荧光36。另一方面，PFA通常允许更健壮的固定，虽然在免疫染色过程中需要抗原检索，但有些抗体只能与PFA固定的组织一起工作，并且需要灌注4%PFA用于后面描述的光学清除技术。

灌注后是注固后的步骤，其中大脑浸入灌注过夜期间使用的相同类型的固定剂中。这允许任何在灌注过程中可能尚未完全固定的大脑区域继续修复。接下来，大脑将在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的蔗糖中孵育，以在冷冻步骤之前除去尽可能多的水，以防止组织内结冰（“冷冻保存”）。然后，可以将大脑切成任意数量的矢状、冠状或横向组织切片进行处理。为了提高精度和可重复性，需要以一种确保动物之间一致的切割方式使用校准的脑块。可以影响大脑如何分割的最重要因素是感兴趣的大脑区域。例如，虽然矢状切口可能允许在一个组织切片中分析更多的脑区域，但这种切口将不允许分析心室下区（V-SVZ）的神经/胶质区域，因为外侧心室的外侧和内侧在该维度上无法识别，并且在冠状平面上可以更好地观察到。这可能是成人神经发生研究中要做出的重要区分，因为外侧心室的侧侧包含神经源性V-SVZ，而侧脑室的内侧壁是更强的胶质生态位37。

将组织分成冠状，矢状或横截面后，使用最佳冷却温度（OCT）包埋溶液将其冷冻成块。在这里，大脑被冻结在这种嵌入材料中，使用干冰和乙醇的混合物。如果需要薄片分析，则块将在低温恒温器上切片，并且根据所需的下游分析，可以作为薄片（<20μm）粘附在带正电的载玻片上。也可以使用未带电的载玻片，但使用未带电的载玻片可能导致组织从载玻片38中脱陷。如果需要中等厚度的自由漂浮组织切片（>20μm），组织将被收集为自由浮动切片。如果需要厚切片（0.5-4 mm），则需要使用振动切片机切割非冷冻脑切片。重要的是要注意载玻片上各部分之间的储存差异，这些切片需要在-20至-80°C下冷冻，而自由漂浮的部分则需要在4°C下储存。

脑清除和全山免疫荧光共聚焦显微镜检查
如果需要对小鼠大脑中的谱系追踪细胞进行更广泛但不太详细的分析，则可以使用iDISCO脑清除39 对较厚的脑组织片段进行全面分析，然后进行免疫染色和平铺z-stack共聚焦显微镜或光片显微镜检查。在这里，小鼠大脑的大部分将被光学清除（脱脂过程39），这更好地允许在1毫米的组织切片上进行荧光信号成像。该过程的缺点是高自发荧光，并且由于与更传统的方法（薄冷冻切片或自由浮动切片）相比所需的工作距离增加，因此获得高分辨率细胞形态图像和详细共染色分析的能力降低。出于这个原因，我们建议大脑清除来分析整个大脑区域的大规模谱系追踪结果，而不是试图表征或分析单个细胞。

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Protocol

这里描述的所有方法都已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 创建系谱系追踪Tet-On小鼠系，育种策略和实验队列小鼠的基因分型

注意：在这里，我们概述了使用Rosa-mTmG作为经历Cre重组的荧光报告基因的Tet-On小鼠系统的创建，但是其他各种Cre-重组驱动的报告基因系也可以与Tet-On系统一起使用。

  1. 将一只雌鸟（+/-）雄性与一只或多只R26（mTmG）（+/+）雌性建立交配笼。有关实验性鼠标配接设置的概述，请参见 图1 。
  2. 生成的幼崽 （F1） 将是 o十三进制 （+/-） 或 o十四进制 （-/-） 和 R26 （mTmG） （+/-）。根据 补充表1 中的引物和 补充表2中的方案进行基因分型。
  3. 在断奶时，通过从每次断奶中取耳击来进行种系测试。在GFP / FITC光谱中的落射荧光显微镜下检查耳冲，以确定动物是否在发育过程中经历了种系重组。如果是这样，动物将在每个细胞中表达GFP，并且耳击器将发出mGFP信号的荧光。这些动物不能用于交配或实验。
    注意：来自非种系小鼠的耳夹在显微镜下仅显示内源性荧光（图1C），而种系动物显示明亮的GFP信号（图1D）。对照耳朵可以来自不含荧光转基因的小鼠。请注意，耳毛具有高内源性荧光，不得用作决定因素（图1C）。此外，在白色和黑色毛色的小鼠之间观察到内源性荧光的差异，并且需要使用与被测小鼠相同毛色的小鼠的对照。
  4. 将一只雄性卵肠癌（+/-）×R26（甲基摄氏体）（+/-）与一只雌性卵肠癌（+/-）×R26（m摄氏体）小鼠交配。
  5. 生成的生成 （F2） 将为 1/4 R26 （mTmG） （+/+） 和 1/2 Cre （+/-）。通过将一只动物与一只或多只猫咪交配，将这些动物与一只或多只猫咪交配（+/+）。
    注意：我们使用的是 mTert-rtTA （+/+） 动物，但此过程可以使用任何 rtTA 鼠标线30 执行。
  6. 对于实验动物，设置育种以生成三元/三元/+或 （+/-） x 另一种检测酶 （+/-） x R26 （mTmG） （+/+） 或 （+/-）。

2. 多西环素诱导的Cre和脉搏追逐设计

  1. 当动物处于研究开始的正确年龄时，用dox水代替饮用水：饮用水含有5%蔗糖和2 mg / mL多西环素菌素。使用接受与实验动物相同的多西环素脉冲追逐的克雷阴性动物作为所得荧光表达模式的对照组。
    1. 制备后，将dox水储存在4°C下长达1个月。有关详细信息，请参阅 表 1 。在更换之前，可以在饮用瓶中向动物施用Dox水长达5天，因为如果将Dox水在室温下长时间放置，则会发生真菌生长。
      注意：当使用mTmG转基因（初始mTmG论文）时，需要至少2天的多西环素脉冲来诱导mGFP信号。
      注意：我们尚未测试除2 mg / mL以外的多西环素浓度。先前的文献已经确定，当通过饮用水29施用时，这种浓度具有最高的影响。多西环素的量可能因每只动物的饮酒量而异。多西环素注射或强饲法也可以进行，以便在动物40之间保持一致。
  2. 脉冲期结束后，从笼子中取出dox水，并用普通饮用水代替。这些动物现在将处于“追逐”期，直到死亡。

3. 经心灌注和脑夹层

  1. 将鼠标从笼子中取出，并用左拇指和食指约束动物。 通过 腹膜内（即）注射将100mg / mL氯胺酮和20mg / mL甲苯噻嗪的溶液在0.9%无菌盐水中注射动物，最终浓度为200mg / kg氯胺酮和20mg / kg木拉嗪。有关详细信息，请参阅 表 1 。
    注意：麻醉方案可能因国家/地区而异。此外，麻醉剂对大脑的影响包括小胶质细胞形态和作用的变化以及皮质酮水平，在进行灌注以进行大脑收集和分析时必须了解这些变化41，42。
  2. 大约1-2分钟后，动物将失去其矫正反射。要测试这一点，只需将动物仰卧，如果它不能滚回脚上，它就失去了矫正反射。
  3. 大约5-10分钟后，动物将失去其踏板反射。要检查踏板反射，请使用拇指和食指捏住动物的每只脚。如果没有反应，以跳跃或肌肉痉挛的形式，使用拇指和食指的指甲捏住动物的每只脚。如果没有反应，动物已经失去了踏板反射。
    注意：如果动物在注射后对踏板反射的反应超过15分钟，则可能需要额外注射初始氯胺酮/甲苯噻嗪注射的1/2。年龄，性别，基因型，表型和治疗可能会影响动物对这种药物鸡尾酒的反应。
  4. 在失去矫正和踏板反射后，通过戴手套的手指轻轻接触小鼠眼球来测试眼反射。缺乏反应表明眼反射已经丧失。
  5. 将鼠标固定在仰卧位，将爪子固定在可固定的工作台面上。
  6. 用手术剪刀沿着胸中线在剑突下方约1-2厘米处穿过皮肤。切割优越，直到在剑突工艺。
  7. 用镊子抓住剑突的软骨。插入剪刀，沿着鼠标右侧斜切肌肉组织和胸腔，直到锁骨的水平。
    1. 用镊子抬起胸肌组织，穿过隔膜，直到可以看到心脏。然后沿着鼠标的左侧进行相同的对角线切割，确保防止与心脏的任何接触。使用止血剂使胸肌组织远离腔。
      注意：此时，鼠标将无法再呼吸，因此请快速工作以防止死亡，然后再执行后续步骤。
  8. 用钝镊子固定跳动的心脏，并通过主动脉弓的底部将分配针插入左心室。
  9. 将针根夹在插入部位正上方的左心室。
  10. 在右心房做一个切口，在血流的第一个迹象时，开始以8.11 mL /分钟的速度向动物注入20 mL的1x PBS。
  11. 在 1x PBS 灌注身体后，切换到适合下游应用的固定剂，并用 20 mL 固定剂灌注小鼠。
    1. 对于冷冻切片和免疫染色，用乙二醛固定剂灌注动物以清除脑，灌注动物在1x PBS（pH 7.4）中灌注4%PFA。
      注意：灌注成功的迹象包括动物僵硬（乙二醛轻微僵硬，PFA强烈僵硬）和整个组织中缺乏可见的血管。
  12. 将小鼠斩首，通过将剪刀插入脑干并沿着鳞状缝合线切入每侧的额髁窝缝合线来移除大脑。然后切开坸鼻缝合线以取下颅骨帽，小心不要损坏嗅球。从那里，将头骨倒置，并使用弯曲的镊子去除大脑，确保切断视神经。
  13. 将灌注的大脑放入组织盒中，并在4°C下浸入用于灌注动物过夜的固定剂中。

4. 脑部治疗、切片和免疫染色

  1. 脑部治疗和切片
    1. 从乙二醛固定剂中取出脑盒，并在1x PBS中加入15%蔗糖，在4°C下孵育2天或直到大脑下沉。
    2. 从15%蔗糖中取出脑盒，并在1x PBS中加入30%蔗糖，在4°C下孵育2天或直到大脑下沉。
      注：有关详细信息 ，请参阅表 1 。
    3. 在1x PBS中从30%蔗糖中取出大脑，并使用冠状脑阻滞或矢状脑阻滞将大脑分离成各种“块”。
    4. 通过将脑切片放在干冰和乙醇（EtOH）的混合物上，将冠状动脉或矢状脑切片嵌入OCT化合物中。在OCT变白并变成固体后，从干冰- EtOH混合物中取出并包裹在石蜡膜中，储存在-20°C的气密袋中。
    5. 从冰箱中取出冷冻块，并放入内部温度设置为-20°C的低温恒温器内。 使用OCT将块连接到金属卡盘上，以便组织牢固地连接。等待约5分钟，使组织冻结到卡盘上。将组织切成7μm，将每个组织切片放在带电的载玻片上。
    6. 让载玻片在37°C下烘烤过夜，然后在-20°C下放置，直到用于免疫染色。
  2. 免疫染色
    1. 将载玻片加热至室温（RT），并用冰冷的丙酮后固定15分钟。
    2. 在 1x 冲洗缓冲液（例如 IHC Select TBS 冲洗缓冲液）中洗涤载玻片 5 分钟，每步之间以 60 rpm 的 RT 转速摇动。
    3. 在室温下用0.3%Triton X-100透化以染色核抗原10分钟。
    4. 通过微波载玻片在50-100 mL的1x DAKO抗原检索溶液中低速进行抗原检索10分钟，两次。然后在室温下用漂洗缓冲液冲洗5分钟。
    5. 在室温下将载玻片在70%EtOH中孵育0.3%酪胺原黑中20分钟，然后用冲洗缓冲液洗涤。
    6. 在每个组织周围绘制疏水屏障，而不让组织干燥。然后在37°C下用每组织1滴密孔封闭试剂封闭20分钟。然后将稀释在抗体稀释剂中的100μL一抗加入到每个组织中，并在4°C下孵育过夜。
    7. 第二天，在Alexa Fluor二抗中孵育切片在室温下10分钟。然后在冲洗缓冲液中清洗载玻片。
    8. 在100μL与AlexaFluor 488偶联的1：500抗GFP抗体中覆盖脑切片，以增强标记示踪细胞的内源性GFP信号，并在4°C下孵育过夜。
    9. 第二天，用冲洗缓冲液洗涤2x，然后在流解性离子水中洗涤5分钟。
      注意：请务必用去离子水轻轻清洗，注意避免滑梯上有任何流水，以免从载玻片上去除脑部。
    10. 用100 ng / mL 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染5分钟。然后在流动的DI水中洗涤5分钟。
    11. 在每个组织切片的顶部添加一滴安装介质，并用22 mm x 22 mm盖玻片密封。建议在安装当天进行成像，以确保获得最佳信号。

5. iDIS科大脑清除术（改编自39）

  1. 固定和切片
    1. 在4%PFA下在4°C下固定后大脑过夜，然后在室温下再次固定1小时。
    2. 在1x PBS中洗脑一小时，两次，在RT。然后使用必要的脑块切成1毫米厚的部分，并放入含有1x PBS的5 mL微量离心管中。
  2. 甲醇预处理（用甲醇）
    注意：由于甲醇可能影响某些蛋白质的免疫染色，作者希望向读者指出Renier等人2014年无甲醇iDISCO方案替代方案39的方案。有关本节中以下解决方案的详细信息，请参阅 表 1 。
    1. 用1x PBS在室温下洗涤两次（摇动）1小时。
    2. 在室温下用50%甲醇（PBS）洗涤1小时（摇动）。
    3. 在室温下用80%甲醇洗涤1小时（摇动）。
    4. 在室温下用100%甲醇洗涤1小时两次（摇动）。
    5. 用5%过氧化氢（H2O 2）在20%二甲基亚砜（DMSO）/甲醇（1体积30%H2O2/1体积DMSO / 4体积甲醇，冰冷）中漂白样品，在4°C下过夜（振荡）。
    6. 漂白后，在室温下用甲醇洗涤样品1小时两次（摇动）。
    7. 在室温下用20%DMSO /甲醇洗涤1小时两次（摇动）。
    8. 在室温下用80%甲醇洗涤1小时（摇动）。
    9. 在室温下用50%甲醇洗涤1小时（摇动）。
    10. 在PBS中洗涤1小时两次（摇动）室温。
    11. 在PBS / 0.2%曲拉通X-100中洗涤1小时两次（摇动）在室温下。
  3. 清除大脑的免疫染色
    1. 将样品在1x PBS / 0.2%曲拉通X-100 / 20%DMSO / 0.3M甘氨酸中在37°C下在轨道振荡器上孵育过夜。
    2. 在37°C下阻断1x PBS / 0.2%曲拉通X-100 / 10%DMSO / 6%山羊血清3天。
    3. 将样品从猪粘膜中洗涤1x PBS / 0.2%吐温-20/10μg/ mL肝素钠盐中，在37°C下洗涤1小时1小时，然后在轨道振荡器上在1x PBS / 0.2%吐温-20/10μg/ mL肝素/ 5%DMSO / 3%山羊血清中孵育2天，其中含有1：500浓度的兔抗GFP AlexaFluor 488。
    4. 用10μg/ mL肝素在1x PBS / 0.2%吐温-20中在轨道振荡器上在37°C下洗涤样品1小时，三次，然后每天一次，持续2天。
    5. 将样品在 10 mL 50% v/v 四氢呋喃 （THF）/H2O 的 15 mL 锥形管中孵育过夜。
    6. 将样品在 10 mL 80% THF/H2O 中孵育 1 小时。
    7. 将样品在100%THF中孵育两次1小时。
    8. 用无菌擦拭干燥样品并在二氯甲烷中孵育，直到它们沉入小瓶底部（约40分钟）。不要孵育>60分钟。
      注意：确保在通风橱下处理二氯甲烷。
    9. 将样品在18mL二苄基醚（DBE）中孵育至透明（>2小时）。
    10. 将样本存储在 RT 的 DBE 中，直到准备好成像。
      注意：为了获得最佳效果，在清除完成后尽快对样品进行成像非常重要。

6. 染色载玻片或清除大脑的成像

  1. 为了对免疫染色的脑切片进行成像， 通过 共聚焦显微镜分析载玻片，其中可以确认多种抗体的共同表达。我们使用带有HyD S混合探测器的徕卡恒星5显微镜，但任何点扫描共聚焦显微镜都可以工作。目标包括耿聪英超APO 10倍/0.40 CS2、耿聪英超APO 40倍/1.30油CS2和耿聪英超APO 63倍/1.40。
    1. 配置正确的激光线和发射滤光片。所需的激光器和相应的激光强度取决于所使用的显微镜和荧光团组合。
      注意：我们利用二极管405 nm和白光激光器的组合来微调每个荧光团或荧光团组的激发和发射光谱，以减少和消除串扰。使用传统的激光/滤光片组合也可以获得类似的结果，但要密切注意通道渗漏。通过结合每个所需的发射滤光片组合打开单个激光线，可以识别渗漏，以查看每个特定激光器影响的通道。例如，如果二极管405nm激光器在GFP发射滤光片中产生可见的荧光，则会发生渗出。确保逐帧依次对多个通道进行成像，以大大减少任何渗漏的发生。
    2. 对于具有mTmG报告基因的共染色Tet-On大脑，请选择DAPI（例如405nm，em 450nm），GFP（例如488nm，em.509nm），tdTomato（例如555nm，em 582nm）和相应的远红荧光团以匹配二抗上使用的荧光团。我们推荐Alexa Fluor 647（例如651纳米，667纳米）。
    3. 首先使用同时沾有GFP和荧光次级的Cre-对照脑建立设置。这些脑切片将控制来自荧光抗体的背景荧光，并且不会显示真正的GFP信号。
    4. 从上到下，从左到右分析每个大脑切片，以验证分析中没有遗漏任何信号。如果以不同的放大倍率成像相同的大脑切片，建议首先使用较低的放大倍率，因为较高的放大倍率将更快地漂白mTomato信号。
  2. 要对清除的大脑进行成像，请使用具有自动载物台和自动平铺功能的倒置共聚焦显微镜。我们使用徕卡恒星5显微镜。由于样品非常厚（>500μm），因此需要更大的工作距离，这限制了可以有效实现的放大倍率。我们使用HC PL APO 10x/ 0.40 CS2物镜进行所有清除脑成像。
    1. 首先将一个清除的大脑部分平放在玻璃底皿上，并浸没在二苄醚中。
      注意：二苄基醚对大多数物镜和大多数塑料具有腐蚀性。因此，玻璃底培养皿中的任何内部塑料都需要涂覆快干有机硅弹性体。
    2. 配置正确的激光线和发射滤光片。对于具有mTmG报告基因的共染色Tet-On大脑，选择DAPI，GFP，tdTomato和相应的远红荧光团以匹配二抗上使用的荧光团。设置所需的分辨率，我们建议至少为1024 x 1024。将针孔设置为 1 AU。
    3. 首先用同时沾有GFP和荧光二次染色的Cre-控制脑建立激光强度和检测器增益。这些脑切片将控制来自荧光抗体的背景荧光，并且不会显示真正的GFP信号。
    4. 一旦激光强度和探测器增益得到优化，绘制出大脑进行成像。首先定位大脑部分的整个周长，以设置图像采集的X轴和Y轴。接下来，通过将焦点设置为大约组织的中心深度来识别 Z 轴，并使用 Z 定位控件定位组织的“最高”点（最正 Z 值）。根据需要扫描组织的各个区域，增加最大Z轴高度。
      1. 对获得组织整个厚度所需的“最低”（最负Z值）点重复上述步骤。恒星5的焦点限制为±250 um。这将Z轴上的光学切片限制为500μm厚。大脑切片的3D区域现在是已知的。
    5. 将Z步长设置为6μm并开始采集图像。采集时间取决于几个因素，根据所需参数，采集时间从几小时到几天不等。要减少图像采集时间，请尝试降低分辨率、提高激光扫描速度或增加步长。
    6. 一旦捕获了整个清除的大脑部分的平铺图像，请根据需要进行分析。

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Representative Results

虽然由具有荧光报告基因的Tet-On系统产生的荧光信号将根据感兴趣的启动子和所使用的荧光团而变化，但我们将描述如何使用mTert-rtTA：：oTet-Cre：：Rosa-mTmG动物分析结果。在脉搏追逐后对成人大脑的分析导致膜GFP表达细胞遍布各种解剖学壁龛。必须注意各种细胞类型之间荧光强度的差异。关于荧光强度的一个变量是细胞膜的大小。例如，脉络丛中的脉络膜上皮细胞（CPECs）具有厚厚的细胞膜和强烈的荧光信号，很容易与周围细胞区分开来（图4A，B）。然而，脉络丛基质中其他较小且目前未识别的细胞类型的GFP信号较弱（图4C）。在小脑中，伯格曼神经胶质细胞表达的mGFP水平高于篮细胞，并且单个篮细胞之间甚至存在mGFP表达的变化（图4D）。嗅球肾小球层内的嗅觉感觉神经元轴突也表达高水平的mGFP（图4A，E）。为了确保所有mGFP +细胞都被鉴定出来，因此在mTmG动物的整个大脑中识别明亮和暗淡的GFP +细胞非常重要。在包括大脑皮层在内的大脑区域观察到低背景mGFP表达（图4A）。有趣的是，小脑和脑干以这种方式显示出较低的背景mGFP表达（图4A）。

在谱系痕迹后对脑组织进行分析期间，脑区域和细胞类型的mGFP和mTomato表达模式将存在差异。与大多数其他大脑区域相比，填充嗅球肾小球层的嗅觉神经元轴突表达高水平的膜番茄，即使相同的神经元是mGFP +，也表明一些细胞似乎更慢地失去mTomato信号（图4D）。相反，在脉络丛中，mGFP +细胞表达低m托马托（图4B，C）。在大多数其他大脑区域，番茄信号在细胞类型之间均匀分布，内皮细胞是唯一一些荧光信号足够亮以从红色荧光背景中脱颖而出的细胞（图4B）。在重组过程中，mGFP表达的激活和mTomato从基因组中切割导致mTomato表达的损失，但是在膜上表达的mTomato荧光团被保留直到它们降解。因此，mGFP +细胞通常会表达可变的mTomato信号，这将取决于重组的最近性，细胞类型和细胞膜的大小。因此，基于mGFP的表达来分析细胞非常重要，如果它们同时表达mGFP和mTomato，则不要将它们排除在分析之外。

替代报告器也可以与Tet-On系统结合使用。克雷重组可能在细胞中诱导GFP或RFP的表达，这些细胞通常不会在罗莎-GFP或罗莎-RFP动物中表达任何荧光标签。在这里，GFP或RFP的分析将表明感兴趣的启动子的表达，并且不会像mTmG动物那样去除荧光团信号。单荧光基团报告基因允许使用更多的荧光抗体组合进行免疫染色，因为mTmG动物中的膜番茄可以防止红色波长的染色。

Figure 1
图 1.生成泰特 On 鼠标线。（A）从单个小鼠品系中创造蔷薇-rtTA：：蔷薇-mTmG小鼠的育种方案概述。（B） 在鼠线中，Tet-On系统示意图。（C-D）用落射荧光显微镜的FITC通道从非种系（C）和种系（D）的耳夹的代表性图像。请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2.具有谱系追踪的Tet-On小鼠的实验设计。 Tet-On小鼠从基础增殖，迁移和分化（1）到在dox脉冲期间进行治疗的实验图示，无需追逐再生或再平衡（2），脉冲期间的干预有机会可视化长期影响（3）。2天的短脉冲，没有后续的追逐，将提供对TERT +细胞近基础状态的洞察，因为这些细胞几乎没有时间激活，增殖，迁移或分化（4）。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3.大脑清除小鼠大脑： （A）固定后1mm脑切片的矢状切片。（B）将单个脑切片放置在5mL管中，用于iDISCO脑清除39。（C）将清除的大脑放置在玻璃底培养皿中，并浸没在DBE中，以便在图像采集过程中进行折射率匹配。（D）将大脑的整个区域捕获为一系列Z堆栈，这些Z堆栈将被平铺在一起以形成大脑的综合3D图像。然后，可以将其投影为 Z 轴最大强度，以从 3D 数据集创建 2D 图像。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4.成虫谱系追踪：：在多西环素的3周脉搏和11天的追逐后，罗莎-mTmG小鼠大脑的谱系追踪。 （A）清除成年小鼠的脑切片：：：蔷薇-mTmG小鼠，其中mGFP信号的特定区域用插图显示（N = 3只雄性小鼠）。（公元前-公元前）识别mGFP + 聚碳酸酯（B）和更小、更微弱的mGFP+细胞类型（C;N = 4名男性，N = 6名女性）。（D）小脑分子层中的小脑贝尔格曼胶质细胞（明亮）和篮状细胞（暗淡;N = 4名男性，N = 6名女性）。（E）蔷薇-rtTA：：罗莎-m-mTmG大脑嗅觉肾小球层的代表性图像。虚线表示肾小球区室（N = 4名男性，N = 6名女性）。比例尺为100 μm ，请点击此处查看此图的大图。

表 1.请按此下载此表格。

附表1.请按此下载此表格。

附表2.请按此下载此表格。

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Discussion

描述了一种在体内创建、利用和分析在成年小鼠脑内标记干细胞的三重转基因谱系追踪小鼠系的方法。当与免疫染色或脑清除相结合时，可以完成整个大脑中追踪荧光细胞的鉴定和表征。该技术提供了了解标记干细胞在激活，迁移，分化或增殖时的可塑性/再生/重塑潜力的能力。虽然以前通过胸腺嘧啶-H3和BrdU的标签保留获得的数据得出结论，V-SVZ，嗅球和齿状回的晶下区域是成年哺乳动物2，3，4，5，6，7，8，43中唯一的神经源性脑区域，但现在了解到成人神经发生也发生在皮层44，下丘脑45，46和纹状体47，48，49，以及尚未得到充分研究的其他潜在新生态位。成体胶质生成是神经胶质前体细胞产生新生星形胶质细胞和少突胶质细胞的过程，也发生在整个大脑中37，并且Glia和神经元被假设来自相同的多能干细胞。由于这些原因，谱系追踪研究在理解各种干细胞类型的作用方面是不可或缺的，这些干细胞类型有助于补充和再生成年哺乳动物大脑中的神经元和神经胶质细胞（在50中回顾）。

对于成人大脑可塑性的研究，最佳年龄为12周龄，当小鼠大脑完成发育51。在规划多西环素脉冲的长度和随后的追逐时，了解感兴趣的过程至关重要，以便脉冲追逐时间足够长，以允许感兴趣的过程发生。例如，根据先前的谱系追踪研究52，V-SVZ中的成体神经干细胞（ANSCs）在嗅球中产生新生神经元大约需要4周。因此，标记V-SVZ中ANSC的脉冲追逐研究必须在该时间范围内，以允许V-SVZ中的ANSC分裂，使这些ANSC分化为中间细胞类型，并使这些中间细胞类型迁移到嗅球并分化成成人出生的神经元。追逐的长度将决定标记的细胞及其后代必须继续其迁移和分化的时间量，尽管这些过程也将在脉冲期间发生。总而言之，了解所涉及的过程非常重要，因为每个谱系追踪实验的时间表必须允许发生正确的过程。

虽然这份手稿详细介绍了Tet-On系统，但存在其他可能被利用的谱系追踪转基因。CreERT2 转基因允许表达仅在他莫昔芬或 4-OHT（一种他莫昔芬衍生物）存在下才具有活性的 Cre 重组酶。当该Cre由感兴趣的启动子调节时，4-OHT或他莫昔芬给药只会在表达该启动子的细胞中产生Cre重组。当与罗莎-LSL-GFP或罗莎-mTmG等报告基因配对时，Cre-lox重组将不可磨灭地标记在他莫昔芬给药期间表达Cre的细胞。该系统的一个缺点是使用他莫昔芬，它对产前和成人大脑的神经发生具有长期的不良影响17。因此，使用CreERT2 谱系进行谱系追踪研究需要考虑所涉及的注意事项。

成人大脑中的谱系追踪研究通常使用干细胞的标志物（如Nestin）或神经胶质前体细胞（包括NG253，54）的标志物进行。虽然由此产生的数据表明这些细胞的周转和分化为新生成熟细胞类型，但这些标记物在成人大脑中由各种其他细胞类型表达可能会令人困惑。例如，Nestin是一种参与有丝分裂55的中间丝蛋白，也由成熟神经元56 和脑膜细胞57型表达。其他干细胞标志物包括神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）58，59和谷氨酸天冬氨酸转运蛋白1（GLAST）60，它们通过星形胶质细胞在整个成人大脑中表达61。因此，需要使用其他标记进行谱系追踪研究。随着我们更多地了解成人可塑性在大脑中的广泛影响，在这些过程中发挥作用的细胞及其后代的表征和分析对于我们理解神经退行性疾病健康等涉及的神经源性和胶质途径仍然至关重要。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢戴安娜·卡隆博士（哈佛医学院波士顿儿童医院）和马修·林恩斯博士（乔斯林糖尿病中心;缅因州医学中心研究所）用于利用mt-rtTA动物进行指导。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody diluent Agilent S080983-2
Antigen Retrieval Solution Agilent S2367
anti-GFP antibody Invitrogen A2311 Use at 1:500-1:000
Acetone Fisher Scientific A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J The Jackson Laboratory JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J The Jackson Laboratory JAX:007676
Blocking Solution (IHC) Millipore Sigma 20773
Blunt needle BSTEAN X0012SYHIV
Coronal brain block Braintree BS-2000C
Cover slip Corning 2850-22
Cryostat Leica CM1900
DAPI Sigma-Aldrich D564
Dibenzyl ether Millipore Sigma 33630
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Doxycycline Hyclate Sigma-Aldrich D9891
Glycine Bio-Rad 161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa Sigma-Aldrich H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative Amresco H120 This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich 516813
IHC Select TBS Rinse Buffer Millipore Sigma 20845
Ketamine Westward 0143-95095-10 This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Milipore Block Millipore 20773
Mounting medium Millipore Sigma 5013
Optimal Cutting Temperature Solution Sakura 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Solution (10X) Teknova P0496
Sagittal brain block Braintree RBM-2000S
Saline Braun S8004-5264
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Sudan (Typogen) Black Millipore Sigma 199664
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 186562
Tissue cartridge Simport M512
Triton X-100 Bio-Rad 1610407
Tween-20 Millipore Sigma 655205
Xylazine AnaSed sc-362950Rx

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成年小鼠大脑中诱导荧光标记干细胞的谱系示踪
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Jensen, G. S., Willows, J. W., Breault, D. T., Townsend, K. L. Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain. J. Vis. Exp. (183), e63998, doi:10.3791/63998 (2022).

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