Summary
誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、 インビボでの活性化、増殖、遊走、および/または分化の空間的および時間的分析を可能にする。系統追跡は、系統のコミットメント、介入に対する応答、および多能性に関する新しい情報を明らかにすることができる。
Abstract
「Tet-On」系oTet-CreマウスをTertプロモーターに連結した新規な逆テトラサイクリントランスアクチベーター(rtTA)導入遺伝子と交差させることにより、成体組織幹細胞の挙動と運命を調査するためにテロメラーゼ逆転写酵素(Tert)系統追跡マウス系統が開発され、成体脳幹細胞の新規集団を示すことが実証された。ここで、テトラサイクリン誘導体ドキシサイクリンをmTert-rtTA::oTet-Creマウスに投与すると、遺伝子Tertのプロモーター領域の4.4 kbフラグメントを発現する細胞集団を不滅にマークする。Rosa-mTmGレポーターを併用すると、mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスは、ドキシサイクリン処理がTertも発現する細胞においてmTomato発現を膜EGFP(mGFP)で置換することを誘導するまで、膜tdTomato(mTomato)を発現する。したがって、これらのトリプルトランスジェニック系統追跡マウスがドキシサイクリン(TERT発現細胞がマークされる「パルス」期間)を受けると、これらの細胞は不滅にマークされたmGFP+細胞となり、その後にTert発現が失われても、ドキシサイクリン除去後(「追跡」期間)の任意の望ましい時間追跡することができる。次に、幹細胞の活性化、増殖、系統のコミットメント、さまざまな脳ニッチへの移行、成熟した細胞型への分化の変化を解釈するために、脳を灌流固定し、免疫蛍光やその他の下流アプリケーション用に処理します。このシステムを使用して、任意のrtTAマウスをoTet-CreおよびRosaレポーターに交配させ、幹細胞のマーカーを使用してドキシサイクリン誘導性「パルスチェイス」系統追跡実験を行うことができる。
Introduction
マウス線をトレースする系統の値
このような細胞を調べる多くのアッセイは、動物の死時にこれらの細胞を特徴付けることにのみ焦点を当てているため、 インビボでの 幹細胞の分析は困難な場合があります。前駆細胞、中間/移行細胞型、成熟細胞の増殖、分化、および遊走のプロセスを経時的によりよく理解するためには、縦断的な分析アプローチが必要です。これは、ステム/前駆細胞が不滅にマークされ、その後任意の時間続くことができる系統追跡研究で達成することができます1。
成体哺乳動物の脳では、成体が生まれたニューロンが幹細胞および前駆細胞から作られる神経新生の過程を、チミジン-H3 2,3,4または5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)5,6,7,8による標識保持を介して最初に分析した。.これらの研究では、増殖性細胞は、複製および細胞分裂/増殖の間に細胞のDNAに組み込まれたチミン類似体でマークされた。したがって、マークされた細胞およびその子孫にはこの類似体が含まれ、死後に同定された。しかし、チミジン-H3およびBrdUは、幹細胞がほとんど理解されていない脳領域における増殖性細胞およびその子孫のマーキングを可能にしたが、これらの研究はこれらのツールの欠点によって妨げられた。チミジン-H3は細胞周期停止、アポトーシス、および用量依存的DNA合成阻害9を誘導し、BrdUは投与経路10に応じて異なるレベルで細胞をマークし、修復またはアポトーシスの間、ならびに細胞分裂11の間に細胞に取り込まれる。最近、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)による標識など、より効率的な標識法が利用されているが、BrdUと同じ問題の多くは依然として12のままである。これらのアプローチは、幹細胞だけでなく、増殖性細胞をマークするという点でも制限されており、したがって結果の解釈を混乱させる可能性がある。神経原性系統では、すべての幹細胞および前駆細胞が有糸分裂能力を保持し、終末期/成熟ニューロンのみが増殖性ではない。アストロサイトおよびミクログリアの場合、希突起膠細胞ではないが、増殖は無期限に維持される13、14、15。
したがって、ここで使用している成体幹細胞を同定するために確認されたような、目的のタンパク質を発現する細胞のみを系統追跡するために使用されるトランスジェニックマウスは、幹細胞およびその子孫を調査する際により一般的になっている。マウストランスジェニックアプローチを通じて生成することは困難であるが、系統追跡マウスラインは、脳内の特異的にマークされた細胞の追跡を可能にし、増殖のみに依存しない。Tet-Onトランスジェニックマウス系において、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン(テトラサイクリン誘導体)の投与は、目的のプロモーターによって転写される逆テトラサイクリントランスアクチベーター(rtTA)で操作された細胞におけるCre-リコンビナーゼ発現を誘導する。Tet誘導性Cre駆動組換えは、その後、使用されるRosa-レポーターマウスに応じて、目的の細胞における消えない蛍光または発光タンパク質の発現を活性化する。これらの不滅のマークされた細胞は、分裂、分化、または遊走後もこのレポーターを発現し続け、これらの細胞およびその子孫の経時的または異なる介入後に追跡することを可能にする16。トランスジェニック系統追跡アプローチの利点には、1)rtTAによって特徴付けられる特定の細胞系譜または前駆細胞/幹細胞へのトレースの特異性、2)細胞の代謝回転または分化にもかかわらず蛍光タンパク質または発光タンパク質の消去不能な発現、3)低毒性、4)動物のライフサイクルの任意の時点における条件付き活性化、および5)一般的なアッセイによる使いやすさ、 免疫染色/免疫蛍光を含む16.
マウスにおける時間的に誘導可能なレポーターツールの他の方法には、ROSA-GFP、ROSA-mTmG、または他の蛍光レポーター導入遺伝子と対合することができるCre-ERT2マウスの使用が含まれる。これらの動物では、目的のプロモーターまたはエンハンサー領域などの細胞特異的調節エレメントがCreリコンビナーゼの産生を駆動し、これはタモキシフェンの投与を介してのみ活性化され得る。Cre-ERT2マウス株は特定の細胞株におけるCreの誘導を可能にするが、成人の神経新生に対するタモキシフェンの効果を詳述する豊富な知識がある17,18。さらに、YFPまたはCFPを含むGFPまたはmTmGの代わりに利用できる多くのROSA駆動蛍光レポーター遺伝子が存在し、他の蛍光波長における代替蛍光標識を可能にする。これらの蛍光レポーター遺伝子は、Tet-OnまたはCre-ERT2系と共に使用することができる。
テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)は、ホロ酵素テロメラーゼの律速成分であり、細胞分裂中にテロメアが短縮された後にテロメアを伸長させる働きをする19,20。TERTは、腸21、22、骨髄21、肝臓23、脂肪24、子宮内膜25、26、および骨1における成体組織幹細胞のマーカーとして同定されている。これらの成体幹細胞におけるTERT発現が、テロメラーゼ伸長活性のみのためであるか、または非正規のTERT役割27を実行するかは、依然として不明である。TERT発現静止成体幹細胞(qASC)は、これらの幹細胞の多能性と自己複製能、ならびに活性化、増殖、分化、および遊走の可能性を研究するために、トランスジェニック系統追跡マウスを用いて体全体で同定および追跡されている1,22,23,28。Tert-rtTA導入遺伝子の作成は、以前にも行われてきた1.本稿では、成体マウス脳における新規ASC集団として同定されたTERT+qASCを研究するために、TERTマウス系統をトレースする系統の使用について説明する。
トランスジェニック系統追跡マウス系統の生成
Tet-Onシステムを使用して系統追跡マウス系統を生成するには、マウスの交配を通じて3つの導入遺伝子を1つの動物内で組み合わせる必要があります。第1はrtTAであり、目的遺伝子のプロモーターの制御下で発現する(我々のものはTERT-rtTAである)。したがって、目的のこの遺伝子を発現する細胞では、rtTAが発現される。2つ目はoTet-Cre遺伝子で、rtTA融合転写産物とテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの両方の存在下でCreリコンビナーゼの転写を可能にするテトラサイクリン応答エレメント(TRE)を含む。テトラサイクリンまたはドキシサイクリンは、飲料水または固形物29を介して動物に投与することができる。最後に、Creリコンビナーゼ切断によって活性化される遺伝子がなければならない。この原稿では、我々が説明する標識遺伝子はRosa26-mTmG遺伝子であり、Cre組換えまではmTomo(すべての細胞における膜赤色蛍光)を遍在的に転写する。しかし、細胞がrtTA転写産物を発現し、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを含む場合、mTomato部位とmGFP部位の間のlox P部位のセットのCre再結合はR26部位を変化させ、細胞が膜トマトの代わりに膜EGFP(mGFP、または膜緑色蛍光)を産生する原因となる。このmGFPシグナルの消えない性質は、細胞が増殖、遊遊、分化する際のin vivo標識および追跡を可能にする。痕跡に続いて、標準的な凍結切片またはより厚い光学的にクリアされた脳における免疫蛍光を介して、細胞のGFP発現について分析することができる。
本稿では、特定のマウスラインmTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGの使用について説明します。このトリプルトランスジェニックマウスラインを作成するために、我々はまずoTet-Cre動物(ジャクソンラボ株#006234)をRosa-mTmG動物(ジャクソンラボ株#007676)に交配させ、oTet-Cre::Rosa-mTmGダブルトランスジェニックマウスを作成した。これらの動物を、補足表1および2に示されるプライマーおよびPCRテンプレートを用いて遺伝子型決定した。mTert−rtTAマウス(David Breault 1によって作成された)をoTet−Cre::Rosa−mTmG動物に交配させ、mTert−rtTA::oTet−Cre::Rosa−mTmGマウスを作成した(図1A)1、30。mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスラインの作用機序を図1Bに示す。
ドキシサイクリン誘導およびパルスチェイス設計
実験を計画する際には、ドキシサイクリン誘導時の動物の年齢、ドキシサイクリン投与の長さ(「パルス」期間)、組織採取前のドキシサイクリン除去後の時間の長さ(「追跡」期間)、およびこれらのプロセス中の介入のタイミングなど、系統追跡実験の結果に影響を与えるいくつかの要因を考慮することが重要です。これらの研究デザインの考慮事項は、実験の終了時に標識細胞とその子孫を理解するために不可欠です。このプロセスの最初のステップは、動物の関心のある年齢およびドキシサイクリン投与の長さを同定することである。より長いパルス期間は、より多くの細胞がrtTA結合プロモーターを発現し、より多くの関心のある細胞が不変にマーキングされる可能性を可能にする。目的遺伝子の一過性発現を示す細胞型は、目的遺伝子を連続的に発現する細胞よりも長いパルス期間を必要とし得る。しかし、研究の目標が目的の細胞の短期的な影響または急性介入を理解することである場合、細胞がマークされると、パルス期間の残りの部分の間に任意の数の変化をたどるため、パルス期間が長すぎることはありません。我々の研究のいくつかでは、追跡期間のない2日間のパルスを使用して、TERTの直接レポーターをより厳密に模倣した。これは、Rosa-mTmG遺伝子の組換えのための最小時間の長さが2日間31であるからである。
パルスチェイス実験における次の重要な期間は、ドキシサイクリンの除去と動物の灌流との間の長さであり、「チェイス」としても知られている。マウスにおけるドキシサイクリンの半減期は、投与経路にかかわらず約170分であり、ドキシサイクリン誘導は除去の数時間後にもはや起こらなくなる可能性が高いという結論を可能にする32。しかし、ドキシサイクリン代謝は高齢マウスでは遅く、若い動物よりも長い効果的な「パルス」期間につながる可能性があることに注意することが重要です33。
追跡期間中、標識された細胞は、増殖、分化、または遊走後でさえも標識され続けるであろう。これらの細胞の子孫も標識されるであろう。この研究の目標は、パルスチェイスパラダイムの長さを形作るでしょう。この研究の目標が、関心のある細胞との長期間にわたる組織の再生を理解することである場合、長い追跡期間が必要になることがあります。最後に、介入または治療のタイミングを決定する必要があります。パルス期間中の投与は、目的の遺伝子を発現する細胞およびこの間に作成された任意の子孫に影響を及ぼすが、追跡期間中の投与は、標識細胞が分裂または分化する速度に依存するが、目的の細胞の主に子孫に影響を及ぼす可能性がある。我々が利用したパルスチェイス実験計画の例を 図2Aに概説する。
また、発現の漏れによるバックグラウンドGFPシグナルの可能性に注意することも重要である。漏出発現は、ドキシサイクリンの非存在下でのrtTAとOtet配列との間の固有の結合能、およびrtTAの非存在下でのOtet導入遺伝子の残存活性の結果として生じる(34でレビュー)。漏出性発現は、Tet系の1つの弱点を表し、漏出はしばしば系にとって許容可能な欠点であるが、漏出性発現が毒性および死亡率をもたらし得る状況、例えば、Otet−DTA動物における双翅目毒素(DTA)は、これらの系の使用を制限することができる35。
顕微鏡検査のための薄切片の脳処理、切片化、免疫蛍光
系統追跡実験後にマウスの脳を分析するには、まず心経灌流 を介して マウスを灌流し、脳内で高い自己蛍光をもたらす可能性のある血液およびCSFを除去する必要があります。動物に灌流することができる2つの一般的に使用される固定剤があります:組織固定剤、グリオキサール固定剤(GF)、または4%パラホルムアルデヒド(PFA)。グリオキサール固定剤は、PFAよりも架橋の少ない比較的穏やかな固定プロセスを可能にする。これにより、組織の硬さが軽減され、抗原検索の必要性が軽減され、免疫染色中の抗体溶液の濃縮度が低くなります。しかしながら、それらがメタノールを含む場合、これは自己蛍光36を増加させるのに役立ち得る。一方、PFAはより強固な固定を可能にすることが多く、免疫染色では抗原賦活化が必要になりますが、PFA固定組織でのみ機能する抗体もあり、後述する光クリアリング技術には4%PFAとの灌流が必要です。
次の灌流は固定後ステップであり、脳は一晩の灌流中に利用されるのと同じタイプの固定液に浸漬される。これにより、灌流中に完全に固定されなかった可能性のある脳領域が修正し続けることができます。次に、脳をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のスクロース中でインキュベートし、凍結工程の前にできるだけ多くの水分を除去し、組織内の氷形成を防止する(「凍結保存」)。その後、脳は、処理のために任意の数の矢状、冠状、または横方向の組織切片に切断され得る。精度と再現性の両方のために、較正された脳ブロックは、動物間で一貫したブレグマカットを保証する方法で使用する必要があります。脳のセクショニング方法に影響を与える最も重要な要因は、関心のある脳領域です。例えば、矢状切断は、1つの組織切片でより多くの脳領域を分析することを可能にするかもしれないが、この切断は、側心室の側方および内側の側面がその次元で識別することは不可能であり、冠状面においてよりよく観察されるため、心室 - 脳室下領域(V-SVZ)の神経/グリオージェニック領域の分析を可能にしない。これは、側脳室の側方に神経原性V-SVZが含まれ、側脳室の内側壁がよりグリオージェニックなニッチであるため、成人の神経新生研究において重要な区別となり得る37。
組織を冠状、矢状、または横方向に分割した後、最適冷却温度(OCT)包埋溶液を使用してブロックに凍結します。ここでは、脳はこの包埋材料内で、ドライアイスとエタノールの混合物を使用して凍結されます。薄切片分析が必要な場合は、ブロックをクライオスタット上でスライスし、下流分析に応じて、正に帯電したスライドガラスを薄切片(<20μm)として接着することができます。充電されていないスライドガラスも使用することができるが、非充電スライドの使用は、組織がスライド38から立ち往生しなくなる結果となり得る。中程度の厚さの自由浮遊組織切片(>20μm)が必要な場合は、組織は自由浮遊切片として収集されます。厚い切片(0.5〜4mm)が必要な場合は、ビブラトームで非凍結脳切片をスライスする必要があります。-20 ~ -80 °C での凍結を必要とするスライド上のセクションと、4 °C で保存されるフリーフローティングセクションの保管の違いに注意することが重要です。
脳クリアリングとホールマウント免疫蛍光共焦点顕微鏡
マウス脳内の系統トレース細胞のより広範で、まだ詳細ではない分析が必要な場合は、iDISCO脳クリアリング39 に続いて免疫染色およびタイル状zスタック共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡法を用いて、脳組織のより厚いセグメントの包括的な分析が可能である。ここでは、マウス脳の大部分が光学的にクリアされ(脱脂プロセス39)、1mmの組織切片全体にわたって蛍光シグナルイメージングがより良好に可能になる。このプロセスの欠点は、より伝統的な方法(薄い凍結切片または自由に浮遊する切片)と比較して必要な作動距離の増加により、高い自己蛍光と細胞形態の高解像度画像および詳細な共染色分析を得る能力の低下である。このため、個々の細胞の特性評価や解析を試みるのではなく、複数の脳領域にわたる大規模な系統追跡結果を解析するために、脳クリアリングを推奨します。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、オハイオ州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 実験コホートマウスのテトオン系統追跡系統の作成、育種戦略、ジェノタイピング
注:ここでは、Cre組換えを受ける蛍光レポーター遺伝子としてRosa-mTmGを用いたTet-Onマウスシステムの作成について概説するが、Tet-Onシステムでも他の様々なCre組換え駆動型レポーターラインを利用することができる。
- 1 匹の oTet-Cre (+/-) オスと 1 人以上の R26 (mTmG) (+/+) メスの交配ケージを設定します。実験的なマウスの嵌合セットアップの概要については、 図 1 を参照してください。
- 結果として得られる子犬 (F1) は、oTet-Cre (+/-) または oTet-Cre (-/-) および R26 (mTmG) (+/-) になります。補足表1のプライマーおよび補足表2のプロトコールに従ってジェノタイピングを行う。
- 離乳時には、各離乳期から耳のパンチを取って生殖細胞系列検査を行います。GFP/FITCスペクトルの落射蛍光顕微鏡下で耳パンチを調べ、動物が発達中に生殖細胞系列組換えを受けたかどうかを判断します。もしそうなら、動物はすべての細胞でGFPを発現し、耳のパンチはmGFPシグナルで蛍光を発します。これらの動物は交配や実験には使用できません。
注:生殖細胞系ではないマウスのイヤークリップは、顕微鏡下で内因性蛍光のみを示し(図1C)、生殖細胞系列動物は明るいGFPシグナルを示す(図1D)。対照耳は、蛍光導入遺伝子を含まないマウスに由来することができる。注意点として、耳毛は内因性蛍光が高く、決定因子として使用してはならない(図1C)。さらに、白と黒の毛色のマウス間で内因性蛍光の違いが観察され、試験対象のマウスと同じ毛色のマウスのコントロールをこの分析に使用する必要があります。 - 1匹の雄のオテットクレ(+/-)x R26(mTmG)(+/-)と1匹以上のメスのオテットクレ(-/-)×R26(mTmG)マウスを交配させる。
- 結果として得られる世代(F2)は、1/4 R26 (mTmG) (+/+) および 1/2 Cre (+/-) になります。1匹のoTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) (+/+) を 1 つ以上の mTert-rtTA (+/+) 動物と交配させることにより、これらの動物を mTert-rtTA (+/+) 動物と交配させます。
注:我々はmTert−rtTA(+/+)動物を使用したが、このプロセスは任意のrtTAマウスライン30で行うことができる。 - 実験動物の場合、mTert-rtTA (+/+) または (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) または (+/-) を生成するように飼育を設定します。
2. Creのドキシサイクリン誘導とパルスチェイス設計
- 動物が研究を開始するのに適切な年齢になったら、飲料水をドックス水(5%スクロースと2mg / mLのドキシサイクリンヒクレートを含む飲料水)に置き換えてください。実験動物と同じドキシサイクリンパルスチェイスを受けたCre陰性動物を、得られた蛍光発現パターンの対照群として使用してください。
- 調製後、ドックス水を4°Cで最大1ヶ月間保存する。詳しくは、 表 1 を参照してください。ドックス水は、ドックス水が室温で長期間放置されると真菌の増殖が起こる可能性があるため、交換される前に飲料ボトルで動物に最大5日間投与することができます。
注:mTmG導入遺伝子を利用する場合(初期mTmG論文)のmGFPシグナルの誘導には、少なくとも2日間のドキシサイクリンパルスが必要です。
注:2mg/mL以外のドキシサイクリン濃度は試験していません。以前の文献は、この濃度が飲料水29を介して投与された場合に最も高い効果を有することを同定している。送達されるドキシサイクリンの量は、各動物が行う飲酒量によって異なる場合があります。ドキシサイクリン注射または経管栄養はまた、動物40間で一貫しているために行われてもよい。
- 調製後、ドックス水を4°Cで最大1ヶ月間保存する。詳しくは、 表 1 を参照してください。ドックス水は、ドックス水が室温で長期間放置されると真菌の増殖が起こる可能性があるため、交換される前に飲料ボトルで動物に最大5日間投与することができます。
- パルス期間が終了したら、ケージからドックス水を取り出し、通常の飲料水と交換してください。動物たちは今、死ぬまで「追いかけっこ」の期間にいるでしょう。
3. 心経灌流と脳解剖
- ケージからマウスを取り出し、左手の親指と人差し指で動物を拘束します。100 mg/mL ケタミンと 20 mg/mL キシラジンの溶液を 0.9% 滅菌生理食塩水に浸し、終濃度 200 mg/kg のケタミンと 20 mg/kg キシラジンを 腹腔内 (i.p.) 注射で動物に注射します。詳しくは、 表 1 を参照してください。
警告: 麻酔のプロトコルは国によって異なる場合があります。さらに、脳の収集および分析を目的として灌流を行う際に理解しなければならないミクログリアの形態および作用およびコルチコステロンレベルの変化を含む、脳に対する麻酔薬の効果がある41,42。 - 約1〜2分後、動物はその右反射を失います。これをテストするには、動物を背中に転がすだけで、足にロールバックできない場合、正しい反射を失いました。
- 約5〜10分後、動物はペダル反射を失います。ペダルの反射を確認するには、親指と人差し指を使って動物のそれぞれの足をつまみます。ジャンプや筋肉のけいれんの形で反応がない場合は、親指と人差し指の爪を使って動物のそれぞれの足をつまみます。反応がない場合、動物はペダル反射を失っています。
注:動物が注射後15分以上ペダル反射に反応する場合は、最初のケタミン/キシラジン注射の1/2の追加注射が必要な場合があります。年齢、性別、遺伝子型、表現型、および治療は、この薬物カクテルに対する動物の応答に影響を与える可能性がある。 - 右方向反射とペダル反射が失われたら、手袋をはめた指でマウスの眼球に軽く接触させて眼反射をテストします。応答の欠如は、眼反射が失われたことを示す。
- マウスを臥位に置き、足をピン留め可能な作業面に固定します。
- 剣状突起から約1〜2cm下の胸部正中線に沿って外科用はさみで皮膚を切開する。剣状突起まで優れたカット。
- 剣状突起の軟骨を鉗子でつかむ。はさみを挿入し、筋肉組織と胸郭をマウスの右側に沿って鎖骨のレベルまで斜めに切ります。
- 鉗子で胸部の筋肉組織を上げ、心臓が視覚化されるまで横隔膜を切り裂きます。次に、マウスの左側に沿って同じ対角線をカットし、心臓との接触を防ぐようにします。胸部の筋肉組織を腔から遠ざけるために止血剤を使用してください。
注:この時点で、マウスはもはや呼吸することができないので、次のステップの前に死を防ぐために素早く働きます。
- 鉗子で胸部の筋肉組織を上げ、心臓が視覚化されるまで横隔膜を切り裂きます。次に、マウスの左側に沿って同じ対角線をカットし、心臓との接触を防ぐようにします。胸部の筋肉組織を腔から遠ざけるために止血剤を使用してください。
- 鈍い鉗子で鼓動する心臓を固定し、大動脈弓の基部を通って左心室に調剤針を挿入します。
- 挿入部位のすぐ上の左心室に針基部をクランプします。
- 右心房に切開を行い、血流の最初の徴候で、8.11mL/分で20mLの1x PBSで動物を灌流し始める。
- 1x PBSが身体を灌流した後、下流適用のための適切な固定液に切り替え、マウスに20mLの固定液を灌流する。
- 凍結切片化および免疫染色のために、動物を脳クリアリング用のグリオキサール固定液と灌流し、動物を1x PBS(pH 7.4)中の4%PFAと灌流する。
注:灌流が成功した兆候には、動物のこわばり(グリオキサールのわずかなこわばり、PFAの強いこわばり)と組織全体の目に見える血管の欠如が含まれます。
- 凍結切片化および免疫染色のために、動物を脳クリアリング用のグリオキサール固定液と灌流し、動物を1x PBS(pH 7.4)中の4%PFAと灌流する。
- マウスを首を切り落とし、脳幹にはさみを挿入し、扁平上皮縫合糸に沿って両側の前頭顎骨縫合糸まで切断することによって脳を除去する。その後、フォントナサル縫合糸を切って頭蓋骨キャップを取り外し、嗅球を傷つけないように注意します。そこから、頭蓋骨を逆さまにし、湾曲した鉗子を使用して脳を取り除き、視神経を切断するようにします。
- 灌流した脳を組織カートリッジに入れ、動物を灌流するために使用する固定液に4°Cで一晩浸漬する。
4. 脳の治療、スライス、免疫染色
- 脳の治療とスライス
- グリオキサール固定液から脳カートリッジを取り出し、1x PBS中の15%スクロース中で4°Cで2日間、または脳が沈むまでインキュベートする。
- 15%スクロースから脳カートリッジを取り出し、1x PBS中の30%スクロース中で4°Cで2日間、または脳が沈むまでインキュベートする。
メモ: 詳細については、 表 1 を参照してください。 - 1x PBS中の30%スクロースから脳を除去し、冠状脳ブロックまたは矢状脳ブロックを使用して脳を様々な「ブロック」に分離する。
- 脳切片をドライアイスとエタノール(EtOH)の混合物の上に置くことによってOCT化合物に冠状または矢状脳切片を埋め込む。OCTが白色に変色して固体になったら、ドライアイス-EtOH混合物から取り出し、パラフィルムで包み、-20°Cの気密袋に入れて保管する。
- 冷凍庫から冷凍ブロックを取り出し、内部温度を-20°Cに設定したクライオスタットの中に置きます。 OCTを使用してブロックを金属チャックに取り付け、組織がしっかりと取り付けられるようにします。組織がチャックまで凍るまで〜5分間待ちます。組織を7μmでスライスし、各組織スライスを荷電スライドガラス上に置く。
- スライドを37°Cで一晩焼くのを待ってから、免疫染色に使用するまで-20°Cに置きます。
- 免疫染色
- 室温(RT)に温め、氷冷アセトンで15分間固定後固定します。
- スライドを1xリンス緩衝液(例えば、IHCセレクトTBSリンス緩衝液)中で5分間洗浄し、各ステップの間にRTで60rpmで振とうする。
- 0.3% Triton X-100 で核抗原を RT で 10 分間染色するには透過処理します。RT で 0.3% Tween-20 で細胞質抗原を 10 分間染色するには透過処理します。
- 50-100 mLの1x DAKO抗原検索溶液中のスライドを10分間、2回、ローで電子レンジで電子レンジで包み込み、抗原検索を行います。その後、すすぎバッファーでRTで5分間リンスします。
- スライドを70%EtOH中の0.3%タイポジェンブラック中でRTで20分間インキュベートした後、すすぎ緩衝液で洗浄します。
- 組織を乾燥させずに、各組織の周囲に疎水性バリアを描画します。その後、組織あたり1滴のミリポアブロッキング試薬を用いて37°Cで20分間ブロッキングする。その後、抗体希釈液で希釈した一次抗体100 μLを各組織に加え、4°Cで一晩インキュベートした。
- 翌日、Alexa Fluor二次抗体中の切片をRTで10分間インキュベートする。その後、すすぎ緩衝液でスライドを洗浄します。
- AlexaFluor 488にコンジュゲートした1:500抗GFP抗体100μLで脳切片を覆い、トレースされた細胞にマーキングされた内因性GFPシグナルをブーストし、4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、すすぎ緩衝液で2x洗浄し、次いでDI水を流して5分間洗浄する。
注:スライド自体に流水が付着して、スライドから脳の部分が取り除かれることがないように注意しながら、DI水で優しく洗ってください。 - 100 ng/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で5分間のカウンターステイン。その後、流したDI水で5分間洗浄する。
- 各組織セクションの上にマウント媒体を滴加え、22 mm x 22 mmカバースリップでシールします。最適な信号を確保するために、取り付け当日にイメージングをお勧めします。
5. iDISCOブレインクリアリング(39から適応)
- 固定と切断
- 4%PFAで脳を4°Cで一晩固定した後、RTで1時間再度固定します。
- 1x PBSで1時間、2回、RTで脳を洗い流します。その後、必要な脳ブロックを使用して厚さ1mmの切片に切断し、1x PBSを含む5mLの微量遠心チューブに入れます。
- メタノール前処理(メタノール使用時)
注:メタノールが特定のタンパク質の免疫染色に影響を与える可能性があるため、著者らは、メタノールを含まないiDISCOプロトコルの代替案39のプロトコルについて、Renier et al. 2014に読者を指摘させたいと考えている。このセクションの次の解決策の詳細については、 表 1 を参照してください。- 1x PBSでRTで1時間2回(振とう)洗浄します。
- RTで50%メタノール(PBS単位)で1時間(振とう)洗浄します。
- RTで80%メタノールで1時間(振とう)洗浄します。
- 100%メタノールでRTで1時間2回(振とう)洗浄します。
- 20%ジメチルスルホキシド(DMSO)/メタノール(1容量30%H2O2/1容量DMSO/4容量メタノール、氷冷)中に5%過酸化水素(H2O2)を入れたサンプルを4°Cで一晩(振とう)漂白します。
- 漂白後、メタノール中でサンプルをRTで1時間2回洗浄(振とう)する。
- 20%DMSO/メタノールでRTで1時間2回(振とう)洗浄します。
- RTで80%メタノールで1時間(振とう)洗浄します。
- RTで50%メタノールで1時間(振とう)洗浄します。
- PBSでRTで1時間2回(振とう)洗います。
- PBS/0.2% Triton X-100 で RT で 1 時間 2 回 (振とう) 洗います。
- クリアリング脳の免疫染色
- 1x PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M グリシン中でサンプルをオービタルシェーカー上で 37 °C で一晩インキュベートします。
- 1x PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% ヤギ血清を37°Cで3日間オービタルシェーカーでブロックします。
- ブタ粘膜由来の1x PBS/0.2% Tween-20/10 μg/mLヘパリンナトリウム塩中でサンプルを37°Cで1時間2回洗浄した後、1x PBS/0.2% Tween-20/10 μg/mLヘパリン/5% DMSO/3%ヤギ血清に1:500濃度のウサギ抗GFP AlexaFluor 488を含む37°Cで2日間インキュベートします。
- 1x PBS/0.2% Tween-20 中のサンプルを 10 μg/mL ヘパリンでオービタルシェーカーで 37 °C で 1 時間、3 回、その後 1 日 1 回、2 日間洗浄します。
- 15 mL の円錐形チューブ中で、10 mL の 50% v/v テトラヒドロフラン (THF)/H2O 中でサンプルを一晩インキュベートします。
- 80%THF/H2Oの10mL中でサンプルを1時間インキュベートする。
- 100%THF中でサンプルを1時間2回インキュベートします。
- 滅菌ワイプで乾燥したサンプルをジクロロメタン中でインキュベートし、バイアルの底に沈むまで(約40分間)。60分>インキュベートしないでください。
注:ジクロロメタンはヒュームフードの下で必ず取り扱ってください。 - サンプルを18 mLのジベンジルエーテル(DBE)中で透明になるまで(>2時間)インキュベートします。
- イメージを作成する準備ができるまで、サンプルを RT の DBE に保存します。
メモ: 最良の結果を得るには、クリアが完了した後、できるだけ早くサンプルをイメージすることが重要です。
6. 染色されたスライドまたはクリアされた脳のイメージング
- 免疫染色された脳切片を画像化するには、複数の抗体の共発現が確認できる共焦点顕微鏡 で スライドを分析します。HyD Sハイブリッド検出器を搭載したライカステラリス5顕微鏡を使用していますが、どの点走査型共焦点顕微鏡でも機能します。目標は、HC PL APO 10x/0.40 CS2、HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2、HC PL APO 63x/1.40です。
- 正しいレーザーラインと発光フィルターを設定します。必要なレーザーとそれに対応するレーザー強度は、使用されている顕微鏡と蛍光色素分子の組み合わせによって異なります。
注:ダイオード405nmと白色光レーザーを組み合わせて使用し、クロストークを低減および排除するために使用される各蛍光色素分子または蛍光色素分子のグループの励起スペクトルと発光スペクトルを微調整します。従来のレーザー/フィルターの組み合わせを使用しても同様の結果が得られますが、チャネルブリードスルーには細心の注意を払ってください。ブリードスルーは、目的の各発光フィルタの組み合わせと組み合わせて単一のレーザーラインをオンにして、各特定のレーザーによって影響を受けるチャンネルを確認することによって識別できます。例えば、405nmレーザーのダイオードがGFP発光フィルタで可視蛍光を生じている場合、ブリードスルーが発生することがある。複数のチャンネルをフレームごとに順番に画像化して、ブリードスルーの発生を大幅に減らすようにします。 - mTmGレポーターで共染色したTet-On脳の場合、DAPI(例:405nm、em.450nm)、GFP(例:488nm、em.509nm)、tdTomato(例:555nm、em.582nm)、および対応する遠赤色蛍光色素分子を選択して、二次抗体に使用した蛍光色素分子に一致させます。Alexa Fluor 647 (例: 651 nm, em. 667 nm) をお勧めします。
- まず、GFPと蛍光二次の両方で染色されたCre-コントロール脳で設定を確立します。これらの脳スライスは、蛍光抗体からのバックグラウンド蛍光を制御し、実際のGFPシグナルを示さない。
- 各脳セクションを上から下、左から右に分析し、分析で信号が欠落していないことを確認します。さまざまな倍率で同じ脳断面をイメージングする場合は、高倍率の方がmTomato信号をより迅速に漂白するため、低い倍率を最初に使用することをお勧めします。
- 正しいレーザーラインと発光フィルターを設定します。必要なレーザーとそれに対応するレーザー強度は、使用されている顕微鏡と蛍光色素分子の組み合わせによって異なります。
- クリアされた脳を画像化するには、自動ステージと自動タイリング機能を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用します。ライカステラリス5顕微鏡を使用しています。サンプルは非常に厚い(>500μm)ため、より大きな作動距離が必要となり、効果的に達成できる倍率が制限されます。HC PL APO 10x/0.40 CS2 目標を、すべてのクリアされた脳イメージングに使用します。
- まず、透明な脳の部分をガラス底の皿に平らに置き、ジベンジルエーテルに浸します。
注:ジベンジルエーテルは、ほとんどの対物レンズおよびほとんどのプラスチックに腐食性があります。このため、ガラス底皿の内部プラスチックは、速乾性シリコーンエラストマーでコーティングする必要があります。 - 正しいレーザーラインと発光フィルターを設定します。mTmGレポーターで共染色したTet-On脳の場合、DAPI、GFP、tdTomato、および対応する遠赤色蛍光色素分子を選択して、二次抗体で使用した蛍光色素分子に一致させます。希望の解像度を設定し、少なくとも1024 x 1024をお勧めします。ピンホールを 1 AU に設定します。
- レーザー強度と検出器ゲインを最初に確立するには、GFPと蛍光セカンダリの両方で染色されたCre-コントロール脳を使用します。これらの脳スライスは、蛍光抗体からのバックグラウンド蛍光を制御し、実際のGFPシグナルを示さない。
- レーザー強度と検出器ゲインを最適化したら、イメージングのために脳をマッピングします。まず、脳断面の全周囲を位置特定して、画像取得のX軸とY軸を設定します。次に、焦点を組織の中心深さにほぼ設定してZ軸を特定し、Z位置決めコントロールを使用して組織の「最も高い」点(最も正のZ値)を見つけます。必要に応じて最大Z軸高さを上げて組織の様々な領域をスキャンする。
- 組織の厚さ全体を得るために必要な「最も低い」(最も負のZ値)点について繰り返します。ステラリス5には、焦点の250 um±制限があります。これにより、光学断面の厚さはZ軸で500μmに制限されます。脳断面の3D領域が現在知られている。
- Zステップサイズを6μmに設定し、画像の取得を開始します。集録時間はいくつかの要因に依存し、所望のパラメータに応じて数時間から数日の範囲であり得る。画像の取得時間を短縮するには、解像度を下げるか、レーザースキャン速度を上げるか、ステップサイズを大きくします。
- クリアされた脳断面全体のタイル状の画像がキャプチャされたら、必要に応じて分析します。
- まず、透明な脳の部分をガラス底の皿に平らに置き、ジベンジルエーテルに浸します。
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Representative Results
蛍光レポーターを備えたTet-Onシステムから生じる蛍光シグナルは、目的のプロモーターおよび使用される蛍光色素によって異なるが、我々は、mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG動物を用いて所見をどのように分析したかを説明する。パルスチェイス後の成体脳の分析は、様々な解剖学的ニッチ全体にわたって膜GFP発現細胞をもたらした。様々な細胞型間の蛍光強度の違いに注意しなければならない。蛍光強度に関する1つの変数は、細胞膜のサイズである。例えば、脈絡叢内の脈絡膜上皮細胞(CPEC)は、厚い細胞膜と強い蛍光シグナルを有し、周囲の細胞と容易に区別できる(図4A、B)。しかし、脈絡叢間質における他のより小さく、現在同定されていない細胞型は、より弱いGFPシグナルを有していた(図4C)。小脳では、バーグマングリア細胞はバスケット細胞よりも高いレベルのmGFPを発現し、個々のバスケット細胞間でもmGFP発現のばらつきが存在した(図4D)。嗅球の糸球体層内の嗅覚感覚ニューロン軸索も高レベルのmGFPを発現した(図4A、E)。したがって、すべてのmGFP+細胞を確実に同定するためには、mTmG動物の脳全体で明るいGFP+細胞と薄暗いGFP+細胞の両方を同定することが重要です。mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG動物において、大脳皮質を含む脳領域にわたって低いバックグラウンドmGFP発現が観察された(図4A)。興味深いことに、小脳および脳幹は、このようにしてより低いバックグラウンドmGFP発現を示した(図4A)。
系統トレース後の脳組織の分析中に、脳領域と細胞型の両方でmGFPとmTomatoの発現パターンに違いがあります。嗅球の糸球体層を満たす嗅覚感覚ニューロン軸索は、同じニューロンがmGFP+であっても、他のほとんどの脳領域と比較して高レベルの膜トマトを発現し、一部の細胞がmTomatoシグナルをよりゆっくりと失うように見えることを示している(図4D)。対照的に、脈絡叢では、mGFP+細胞は低mTomatoを発現した(図4B、C)。他のほとんどの脳領域では、トマトシグナルは細胞タイプ間で均等に広がり、内皮細胞は蛍光シグナルが赤色蛍光の背景から目立つほど明るい唯一の細胞の一部です(図4B)。組換え中のmGFP発現の活性化およびゲノムからのmTomatoの切断は、mTomato発現の喪失をもたらすが、膜上に発現されるmTomato蛍光色素分子は、それらが分解するまで保持される。このため、mGFP+細胞はしばしば可変mTomatoシグナルを発現し、これは組換えの最新性、細胞型、および細胞膜のサイズに依存する。したがって、mGFPの発現に基づいて細胞を解析し、mGFPとmTomatoの両方を発現している場合は解析から除外しないことが重要です。
代替レポーターは、Tet-Onシステムと組み合わせて利用することもできます。Cre組換えは、通常、Rosa−GFPまたはRosa−RFP動物において蛍光タグを発現しない細胞においてGFPまたはRFPの発現を誘導するように作用し得る。ここで、GFPまたはRFPの分析は、目的のプロモーターの発現を示し、mTmG動物のようなフルオロフォアシグナルは除去されないであろう。単一蛍光色素レポーターは、mTmG動物のメンブレントマトが赤色波長での染色を防ぐため、より多くの蛍光抗体の組み合わせによる免疫染色を可能にします。
図1.Tet-On マウスラインの生成。(A) 個々のマウス系統からmTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスを作製するための育種スキームの概要。(B) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスラインにおけるTet-On系の概略図。(C-D)非生殖細胞系列(C)および生殖細胞系列(D)mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスからのエピ蛍光顕微鏡のFITCチャネルで画像化されたイヤークリップの代表的な画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.テットオンマウスの系統追跡による実験計画。 Tet-Onマウスで可能な実験の実例(1)から、再生や再平衡化を追いかけないドックスパルス中の治療(2)、長期的な効果を視覚化する機会を伴うパルス中の介入(3)。その後の追跡なしで2日間の短いパルスは、これらの細胞が活性化、増殖、移動、または分化する時間がほとんどないため、TERT+細胞の基底に近い状態への洞察を提供します(4)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウス脳の脳クリアリング。 (A)固定後の1mm脳切片の矢状切片化。(b)個々の脳切片を、iDISCO脳クリアリング39のために5mLチューブに入れる。(C)クリアされた脳をガラス底皿に入れ、画像取得時の屈折率マッチングのためにDBEに沈める。(D)脳の全領域を一連のZスタックとしてキャプチャし、それらを並べて脳の1つの包括的な3D画像を形成する。次に、Z-最大強度を投影して、3D データセットから 2D イメージを作成できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.成体mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウス脳の3週間のパルスおよびドキシサイクリンの11日間の追跡後の系統追跡。(a)成体mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmGマウスの脳切片を、mGFPシグナルの特定の領域をインセットで示した(N=3雄マウス)。(B-C)mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG 脈絡膜神経叢の代表的な画像で、mGFP+ CPEC (B) およびより小さく、より薄い mGFP+ 細胞型 (C;N = 男性4人、N = 女性6人)。(D)mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG小脳ベルクマングリア(明るい)および小脳の分子層におけるバスケット細胞(薄暗い;N = 男性4人、N = 女性6人)。(E) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG脳の嗅覚糸球体層の代表的な画像。点線は糸球体区画(N = 4人の男性、N = 6人の女性)を示す。スケール バーは 100 μm です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
インビボで成体マウス脳内のマウス系統マーキング幹細胞をトレースするトリプルトランスジェニック系統の作成、利用、および解析のための方法が記載されている。免疫染色または脳クリアリングと組み合わせると、脳全体のトレースされた蛍光細胞の同定および特性評価を達成することができる。この技術は、標識幹細胞が活性化、遊遊、分化、または増殖する際に、標識幹細胞の塑性/再生/リモデリングの可能性を理解する能力を提供する。チミジン−H3およびBrdUによる標識保持を介して得られた以前のデータは、V−SVZ、嗅球、および歯状回の顆粒下帯が成体哺乳動物2、3、4、5、6、7、8、43における唯一の神経原性脳領域であると結論付けたが、成人の神経新生は皮質44においても起こることが今や理解され、視床下部45、46、および線条体47、48、49、ならびに十分に研究されていない潜在的に他の新規ニッチ。グリア前駆細胞が新生児アストロサイトと希突起膠細胞を作り出すプロセスである成体グリオジェネシスは、脳全体と同様に37で起こり、グリアとニューロンは同じ多能性幹細胞に由来すると仮説されています。これらの理由から、系統追跡研究は、成体哺乳動物の脳におけるニューロンおよびグリアの補充および再生に寄与する様々な幹細胞型の役割を理解する上で不可欠であった(50でレビュー)。
成人の脳可塑性の研究の場合、最適な年齢は、マウス脳が発達を完了した12週齢である51。ドキシサイクリンパルスとそれに続くチェイスの長さを計画する場合、目的のプロセスを理解することが重要であるため、パルスチェイスのタイミングは、目的のプロセスが発生するのに十分な長さになります。例えば、V-SVZにおける成体神経幹細胞(ANSC)からの嗅球における新生児ニューロンの生成は、以前の系統追跡研究によって決定されるように、約4週間である52。したがって、V-SVZ内のANSCを標識するパルスチェイス研究は、V-SVZ内のANSCが分裂し、これらのANSCが中間細胞型に分化し、これらの中間細胞型が嗅球に移行して成人生まれのニューロンに分化することを可能にするために、その時間枠内になければならない。追跡の長さは、標識された細胞およびその子孫がそれらの遊走および分化を継続しなければならない時間の長さを決定するが、これらのプロセスはパルス中にも起こる。まとめると、各系統追跡実験のタイムラインは適切なプロセスの発生を可能にする必要があるため、関連するプロセスを理解することが重要です。
この原稿はTet-Onシステムを詳述しているが、利用され得る他の系統追跡導入遺伝子が存在する。CreERT2 導入遺伝子は、タモキシフェンまたはタモキシフェン誘導体である4-OHTの存在下でのみ活性であるCreリコンビナーゼの発現を可能にする。このCreが目的のプロモーターによって調節される場合、4−OHTまたはタモキシフェン投与は、そのプロモーターを発現する細胞においてのみCre組換えを生じるであろう。Rosa-LSL-GFPまたはRosa-mTmGなどのレポーター遺伝子と対になる場合、Cre-lox組換えは、タモキシフェン投与中にCreを発現する細胞を不滅にマークします。このシステムの欠点の1つは、出生前および成人の脳の両方において神経新生に長期的な悪影響を及ぼすタモキシフェンの使用である17。このため、CreERT2 ラインを使用したリネージュトレース研究は、関連する警告を考慮する必要があります。
成人脳における系統追跡研究は、しばしば、Nestinなどの幹細胞のマーカーまたはNG253,54を含むグリア前駆細胞のマーカーを用いて行われる。得られたデータは、これらの細胞の代謝回転および新生児成熟細胞型への分化を示すが、成人脳における様々な他の細胞型によるこれらのマーカーの発現は交絡し得る。例えば、有糸分裂55に関与する中間フィラメントタンパク質であるNestinも、成熟ニューロン56および髄膜細胞型57によって発現される。他の幹細胞マーカーには、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)58、59、およびグルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター1(GLAST)60が含まれ、これらは成人脳全体にわたってアストロサイトによって発現される61。このため、追加のマーカーを用いた系統追跡研究が必要である。脳における成人可塑性の広範な影響についてさらに学ぶにつれて、これらのプロセスにおいて役割を果たす細胞とその子孫の特性評価および分析は、神経変性健康などに関与する神経原性およびグリオーゲン性経路の理解にとって依然として極めて重要である。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、ダイアナ・カルロン博士(ボストン小児病院、ハーバード大学医学部)とマシュー・ラインズ博士(ジョスリン糖尿病センター;メイン州医療センター研究所)の動物を利用した指導のため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | Agilent | S080983-2 | |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent | S2367 | |
| anti-GFP antibody | Invitrogen | A2311 | Use at 1:500-1:000 |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J | The Jackson Laboratory | JAX:006234 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX:007676 | |
| Blocking Solution (IHC) | Millipore Sigma | 20773 | |
| Blunt needle | BSTEAN | X0012SYHIV | |
| Coronal brain block | Braintree | BS-2000C | |
| Cover slip | Corning | 2850-22 | |
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D564 | |
| Dibenzyl ether | Millipore Sigma | 33630 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Doxycycline Hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | |
| Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative | Amresco | H120 | This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265) |
| Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| IHC Select TBS Rinse Buffer | Millipore Sigma | 20845 | |
| Ketamine | Westward | 0143-95095-10 | This product requires a DEA license for storage and use. |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Milipore Block | Millipore | 20773 | |
| Mounting medium | Millipore Sigma | 5013 | |
| Optimal Cutting Temperature Solution | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS Solution (10X) | Teknova | P0496 | |
| Sagittal brain block | Braintree | RBM-2000S | |
| Saline | Braun | S8004-5264 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Sudan (Typogen) Black | Millipore Sigma | 199664 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Tissue cartridge | Simport | M512 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween-20 | Millipore Sigma | 655205 | |
| Xylazine | AnaSed | sc-362950Rx |
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