Summary
Evnen til permanent å markere stamceller og deres avkom med en fluorofor ved hjelp av en induserbar transgen linjesporingsmuselinje muliggjør romlig og tidsmessig analyse av aktivering, proliferasjon, migrasjon og / eller differensiering in vivo. Avstamningssporing kan avsløre ny informasjon om avstamningsforpliktelse, respons på intervensjon (er) og multipotens.
Abstract
En telomerase revers transkriptase (Tert) lineage-tracing muselinje ble utviklet for å undersøke oppførselen og skjebnen til voksne vevstamceller, ved å krysse 'Tet-On' -systemet oTet-Cre-musen med en ny omvendt tetracyklintransaktivator (rtTA) transgen knyttet til Tert-promotoren, som vi har demonstrert markerer en ny populasjon av voksne hjernestamceller. Her vil administrering av tetracyklinderivatet doksycyklin til mTert-rtTA::oTet-Cre mus uutslettelig markere en populasjon av celler som uttrykker et 4,4 kb fragment av promotorregionen av genet Tert. Når kombinert Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus vil uttrykke membran tdTomato (mTomato) inntil doksycyklin behandling induserer erstatning av mTomato uttrykk med membran EGFP (mGFP) i celler som også uttrykker Tert. Derfor, når disse trippeltransgene avstamningssporingsmusene mottar doksycyklin ("puls" -perioden der TERT-uttrykkende celler er merket), vil disse cellene bli uutslettelig merkede mGFP + -celler, som kan spores i en hvilken som helst ønskelig tid etter doxycyklinfjerning ("jakt" -perioden), selv om Tert-uttrykket senere går tapt. Hjerner blir deretter perfusjonsfaste og behandlet for immunfluorescens og andre nedstrømsapplikasjoner for å tolke endringer i stamcelleaktivering, proliferasjon, avstamningsforpliktelse, migrasjon til ulike hjernenisjer og differensiering til modne celletyper. Ved hjelp av dette systemet kan enhver rtTA-mus parres med oTet-Cre og en Rosa-reporter for å utføre doksycyklinininduserbare "pulsjakt" avstamningssporingseksperimenter ved hjelp av markører av stamceller.
Introduction
Verdien av en linjesporingsmuselinje
Analyse av stamceller in vivo kan være vanskelig siden mange analyser som undersøker slike celler bare fokuserer på å karakterisere disse cellene på tidspunktet for dyrets død, som representerer et terminalt øyeblikksbilde i tid. For bedre å forstå prosessene for proliferasjon, differensiering og migrasjon av stamfar, mellomliggende / overgangscelletyper og modne celler over tid, er det nødvendig med en langsgående analysetilnærming. Dette kan oppnås med avstamningssporingsstudier der stam-/stamceller merkes uutslettelig og kan følges i lengre tid etterpå1.
I den voksne pattedyrhjernen ble prosessen med nevrogenese der voksenfødte nevroner opprettes fra stam- og stamceller først analysert via etikettretensjon med tymidin-H3 2,3,4 eller 5-bromo-2'-deoksyuridin (BrdU)5,6,7,8 . I disse studiene ble proliferative celler merket med tyminanalogen, som ble inkorporert i cellenes DNA under replikasjon og celledeling / proliferasjon. Den merkede cellen, så vel som deres avkom, inneholdt derfor denne analogen, som deretter ble identifisert post mortem. Men mens tymidin-H3 og BrdU tillot merking av proliferative celler og deres avkom i hjernegrupper der stamceller var dårlig forstått, ble disse studiene hindret av ulempene ved disse verktøyene. Tymidin-H3 induserer cellesyklusarrest, apoptose og doseavhengig DNA-syntesehemming9, mens BrdU markerer celler i varierende nivåer avhengig av administrasjonsveien10 og tas opp av celler under reparasjon eller apoptose, samt under celledeling11. Mer effektive merkingsmetoder har blitt brukt nylig, for eksempel merking med 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU), men mange av de samme problemene som BrdU forblir fortsatt12. Disse tilnærmingene er også begrensende ved at de markerer enhver proliferativ celle, ikke bare stamceller, og dermed kan tolkning av resultatene bli forvirret. I den nevrogene linjen beholder alle stam- og stamceller mitotisk kapasitet, og bare terminale / modne nevroner er ikke proliferative. For astrocytter og mikroglia, men ikke oligodendrocytter, opprettholdes proliferasjon på ubestemt tid 13,14,15.
Transgene mus som brukes til å avstamme spor bare celler som uttrykker et protein av interesse, for eksempel en bekreftet for å identifisere voksne stamceller som vi bruker her, har derfor blitt vanligere når man undersøker stamceller og deres avkom. Selv om det er vanskelig å generere gjennom musetransgene tilnærminger, tillater avstamningssporing av muselinjer sporing av spesifikt merkede celler i hjernen, og er ikke avhengig av spredning alene. I Tet-On-transgent musesystem induserer administrering av tetracyklin eller doksycyklin (et tetracyklinderivat) Cre-recombinase-ekspresjon i celler som er konstruert med en omvendt tetracyklintransaktivator (rtTA), som transkriberes av en promotor av interesse. Den Tet-induserbare Cre-drevne rekombinasjonen vil da aktivere uttrykket av et uutslettelig fluorescerende eller luminescerende protein i cellene av interesse, avhengig av Rosa-reportermusen som brukes. Disse uutslettelig merkede cellene fortsetter å uttrykke denne reporteren etter deling, differensiering eller migrasjon, slik at sporing av disse cellene og deres avkom over tid eller etter forskjellige inngrep16. Fordeler med transgene avstamningssporingsmetoder inkluderer: 1) spesifisitet ved sporing til en bestemt cellelinje eller stamcelle /stamcelle markert med rtTA, 2) uutslettelig uttrykk for fluorescerende eller selvlysende protein til tross for celleomsetning eller differensiering, 3) lav toksisitet, 4) betinget aktivering under ethvert punkt i dyrets livssyklus, og 5) brukervennlighet med vanlige analyser, inkludert immunostaining/immunfluorescens16.
Andre metoder for tidsmessig induserbare reporterverktøy hos mus inkluderer bruk av Cre-ERT2 mus, som kan parres med ROSA-GFP, ROSA-mTmG eller andre fluorescerende reportertransgener. I disse dyrene driver et cellespesifikt reguleringselement, for eksempel en promotor eller forsterkerregion av interesse, produksjonen av Cre recombinase, som bare kan aktiveres ved administrering av tamoxifen. Mens Cre-ERT2 muselinjer tillater induksjon av Cre i spesifikke cellelinjer, er det et vell av kunnskap som beskriver effekten av tamoxifen på voksen neurogenese17,18. I tillegg eksisterer det mange ROSA-drevne fluorescerende reportergener som kan brukes i stedet for GFP eller mTmG, inkludert YFP eller CFP, noe som vil tillate alternativ fluorescerende merking i andre fluorescerende bølgelengder. Disse fluorescerende reportergenene kan brukes med Tet-On- eller Cre-ERT2-systemer.
Telomerase reverstranskriptase (TERT) er den hastighetsbegrensende komponenten i holoenzym telomerase, som arbeider for å utvide telomerer etter at de er forkortet under celledeling19,20. TERT har blitt identifisert som en markør for voksne vevsstamceller i tarmen21,22, benmarg21, lever23, fett24, endometrium25,26 og bein 1. Hvorvidt TERT-uttrykk i disse voksne stamcellene utelukkende er for telomeraseforlengende aktivitet eller for å utføre ikke-kanoniske TERT-roller27, er fortsatt ukjent. TERT-uttrykkende hvilende voksne stamceller (qASCs) har blitt identifisert og sporet gjennom hele kroppen med transgene avstamningssporingsmus for å studere multipotensen og selvfornyelsesevnen til disse stamcellene, samt deres potensial til å aktivere, spre, differensiere og migrere 1,22,23,28. Opprettelsen av Tert-rtTA-transgenet har blitt utført tidligere1. I dette papiret vil vi beskrive bruken av en avstamningssporing TERT-muselinje for å studere TERT + qASCs som vi har identifisert som en ny ASC-populasjon i den voksne musehjernen.
Generering av en transgen avstamningssporingsmuselinje
For å generere en avstamningssporingsmuselinje ved hjelp av Tet-On-systemet, må tre transgener kombineres i et enkelt dyr gjennom museparring. Den første er en rtTA, uttrykt under kontroll av promotoren av genet av interesse (vår er TERT-rtTA). I en celle som uttrykker dette genet av interesse, vil rtTA derfor bli uttrykt. Det andre er et oTet-Cre-gen, som inneholder et tetracyklinresponselement (TRE) som vil tillate transkripsjon av Cre recombinase i nærvær av både et rtTA-fusjonstransskript og tetracyklin eller doksycyklin. Tetracyklin eller doksycyklin kan administreres til et dyr via drikkevann eller chow29. Til slutt må det være et gen som vil bli aktivert av Cre recombinase cleavage. I dette manuskriptet er merkingsgenet vi vil beskrive Rosa26-mTmG-genet, som frem til Cre-rekombinasjon allestedsnærværende vil transkribere mTomato (membranrød fluorescens i alle celler). Men hvis en celle uttrykker rtTA-transkripsjonen og inneholder tetracyklin eller doksycyklin, vil Cre-rekombinasjon av et sett med lox P-steder mellom mTomato- og mGFP-stedene endre R26-stedet og føre til at cellen produserer membran EGFP (mGFP eller membrangrønn fluorescens) i stedet for membrantomat. Den uutslettelige naturen til dette mGFP-signalet vil tillate in vivo-merking og sporing av celler når de sprer seg, migrerer og differensierer. Etter sporet kan celler analyseres for ekspresjon av GFP via immunfluorescens i standard kryoseksjoner eller tykkere optisk ryddede hjerner.
I denne artikkelen vil vi beskrive bruken av den spesifikke muselinjen, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. For å lage denne trippel transgene muselinjen parret vi først oTet-Cre-dyr (Jackson Lab-stammen #006234) til Rosa-mTmG-dyr (Jackson Lab-stammen #007676) for å lage oTet-Cre::Rosa-mTmG dobbelttransgene mus. Disse dyrene ble genotypet med primere og PCR-maler angitt i tilleggstabell 1 og 2. mTert-rtTA mus (skapt av David Breault1) ble parret med oTet-Cre::Rosa-mTmG dyr for å lage mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus (Figur 1A)1,30. Virkningsmekanismen til mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muselinjen er illustrert i figur 1B.
Doxycyklin-induksjon og pulsjaktdesign
Når du planlegger eksperimenter, er det viktig å vurdere flere faktorer som vil påvirke utfallet av avstamningssporingseksperimenter, inkludert dyrets alder ved doksycyklininduksjon, lengden på doksycyklinadministrasjon ("puls" -perioden), lengden på tiden etter fjerning av doksycyklin før vevsinnsamling ("jakt" -perioden) og tidspunktet for eventuelle inngrep under disse prosessene. Disse studiedesignhensynene er avgjørende for å forstå de merkede cellene og deres avkom ved avslutningen av eksperimentet. Det første trinnet i prosessen er å identifisere dyrets alder av interesse og lengden på doxycyklinadministrasjonen. Lengre pulsperioder vil gjøre det mulig for flere celler å uttrykke den rtTA-koblede promotoren å bli uttrykt og flere celler av interesse for å bli uutslettelig merket. En celletype som utviser forbigående uttrykk for genet av interesse, kan kreve en lengre pulsperiode enn celler som kontinuerlig uttrykker genet av interesse. Men hvis målet med studien er å forstå kortsiktige effekter av cellen av interesse eller et akutt inngrep, kan pulsperioden ikke være for lang, da når en celle er merket, vil den spores gjennom en rekke endringer i løpet av resten av pulsperioden. I noen av våre studier ble en 2 dagers puls uten jaktperiode brukt til å etterligne en direktereporter for TERT. Dette skyldes at minimumstiden for rekombinasjon av Rosa-mTmG-genet er 2 dager31.
Den neste viktige perioden i et pulsjakteksperiment er lengden mellom fjerning av doksycyklin og perfusjon av dyret, også kjent som "jakten". Halveringstiden for doksysyklin hos mus er ca. 170 minutter uavhengig av administrasjonsvei, noe som gjør det mulig å konkludere med at doksysyklininduksjon sannsynligvis ikke lenger forekommer flere timer etter fjerning32. Det er imidlertid viktig å merke seg at doksysyklinmetabolismen er langsommere hos eldre mus, noe som kan føre til lengre effektive pulsperioder enn unge dyr33.
I løpet av jaktperioden vil merkede celler fortsette å bli merket, selv etter spredning, differensiering eller migrasjon. Avkommet til disse cellene vil også bli merket. Målet med studien vil forme lengden på pulsjaktparadigmet. Hvis målet med studien er å forstå regenerering av et vev over lang tid med cellene av interesse, kan det være nødvendig med en lang jaktperiode. Til slutt må tidspunktet for eventuelle inngrep eller behandlinger avgjøres. Administrasjon i pulsperioden vil påvirke cellene som uttrykker genet av interesse, så vel som ethvert avkom opprettet i løpet av denne tiden, mens administrasjon i jaktperioden kan påvirke for det meste avkom av cellene av interesse, selv om dette vil avhenge av hvor raskt de merkede cellene deler seg eller differensierer. Eksempler på pulsjakt eksperimentelle design vi har benyttet er skissert i figur 2A.
Det er også viktig å være klar over muligheten for GFP-signal i bakgrunnen på grunn av lekkende uttrykk. Lekkende ekspresjon oppstår som et resultat av iboende bindingspotensial mellom rtTA og Otet-sekvensene i fravær av doksycyklin, og gjenværende aktivitet av Otet-transgenet i fravær av rtTA (gjennomgått i34). Lekkende uttrykk representerer en svakhet ved Tet-systemene, og selv om lekkasjen ofte er en akseptabel ulempe for systemet, kan situasjoner der det lekkende uttrykket kan føre til toksisitet og dødelighet, for eksempel med diptheriatoksin (DTA) hos Otet-DTA-dyr begrense bruken av disse systemene35.
Hjernebehandling, seksjonering og immunfluorescens av tynne seksjoner for mikroskopi
For å analysere hjernen til mus etter et avstamningssporingseksperiment, må mus først perfunderes via transkardial perfusjon for å fjerne blod og CSF som kan føre til høy autofluorescens i hjernen. Det er to vanlige fikseringsmidler som dyret kan perfunderes med: Histochoice Tissue Fixative, et glyoksalfiksativ (GF) eller 4% paraformaldehyd (PFA). Glyoksale fikseringsmidler tillater en relativt skånsom fikseringsprosess med mindre kryssbinding enn PFA. Dette reduserer vevsstivhet, reduserer behovet for antigenuthenting, og muliggjør mindre konsentrerte antistoffløsninger under immunostaining. Men hvis de inneholder metanol, kan dette tjene til å øke autofluorescens36. På den annen side vil PFA ofte tillate en mer robust fiksering, og mens antigenuthenting vil være nødvendig under immunostaining, er det antistoffer som bare vil fungere med PFA-faste vev, og perfusjon med 4% PFA er nødvendig for den optiske clearingteknikken beskrevet senere.
Følgende perfusjon er et postfikseringstrinn, hvor hjernen er nedsenket i samme type fikseringsmiddel som brukes under perfusjonen over natten. Dette gjør det mulig for alle hjernegrupper som kanskje ikke har blitt fullstendig løst under perfusjonen å fortsette å fikse. Deretter vil hjernen inkuberes i sukrose i fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne så mye vann som mulig før frysetrinnet for å forhindre isdannelse i vevet ("kryobevaring"). Hjerner kan da kuttes i et hvilket som helst antall sagittale, koronale eller tverrgående vevsseksjoner for behandling. For både presisjon og reproduserbarhet må kalibrerte hjerneblokker brukes på en måte som sikrer konsistente bregma-kutt mellom dyr. Den viktigste faktoren som kan påvirke hvordan hjernen er seksjonert, er hjerneområdet (e) av interesse. For eksempel, mens et sagittalt kutt kan tillate at flere hjernegrupper analyseres i en vevsseksjon, vil dette kuttet ikke tillate analyse av nevro / gliogene regioner i den ventrikulære subventrikulære sonen (V-SVZ) da laterale og mediale sider av lateral ventrikel vil være umulig å skille i den dimensjonen og observeres bedre i koronalplanet. Dette kan være et viktig skille å gjøre i voksne nevrogenesestudier, da lateralsiden av lateral ventrikel inneholder den neurogene V-SVZ, mens medialveggen i lateral ventrikel er en mer gliogen nisje37.
Etter at vev har blitt delt inn i koronale, sagittale eller tverrgående seksjoner, vil de bli frosset i blokker ved hjelp av optimal kjøletemperatur (OCT) innebyggingsløsning. Her fryses hjerner i dette materialet, med bruk av en blanding av tørris og etanol. Hvis tynn seksjonsanalyse er nødvendig, vil blokker bli skåret på en kryostat, og avhengig av nedstrømsanalysen som kreves, kan man følge positivt ladede glassglass som tynne seksjoner (<20 μm). Glassglass som ikke er ladet kan også brukes, men bruk av usladede lysbilder kan føre til at vev løsner fra lysbildene38. Hvis det er behov for frittflytende vevsseksjoner med middels tykkelse (>20 μm), vil vev bli samlet som frittflytende seksjoner. Hvis tykke seksjoner (0,5-4 mm) er nødvendig, er det nødvendig å skjære ikke-frosne hjerneseksjoner med en vibratom. Det er viktig å merke seg lagringsforskjellene mellom seksjoner på lysbilder, som krever frysing ved -20 til -80 ° C og frittflytende seksjoner, som vil bli lagret ved 4 ° C.
Hjernerydding og heldekkende immunfluorescerende konfokalmikroskopi
Hvis en bredere, men mindre detaljert analyse av avstamningssporede celler i musehjernen er ønskelig, er en omfattende analyse av tykkere segmenter av hjernevev mulig med iDISCO hjernerydding39 etterfulgt av immunostaining og flislagt z-stack konfokal mikroskopi eller lysarkmikroskopi. Her vil store deler av musehjernen bli optisk ryddet (en prosess med delipidering39), noe som bedre muliggjør fluorescerende signalavbildning over en 1 mm vevsseksjon. Ulempene med denne prosessen er høy autofluorescens og redusert evne til å oppnå høyoppløselige bilder av cellemorfologi og detaljert samfargingsanalyse på grunn av de økte arbeidsavstandene som kreves sammenlignet med mer tradisjonelle metoder (tynne kryoseksjoner eller frittflytende seksjoner). Av denne grunn anbefaler vi hjernerydding for å analysere de store avstamningssporingsresultatene gjennom flere hjerneområder, i stedet for å forsøke å karakterisere eller analysere individuelle celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ohio State University.
1. Opprettelse av en avstamning som sporer Tet-On-muselinje, avlsstrategier og genotyping for eksperimentelle kohortmus
MERK: Her skisserer vi opprettelsen av et Tet-On-musesystem med Rosa-mTmG som det fluorescerende reportergenet som gjennomgår Cre-rekombinasjon, men forskjellige andre Cre-rekombinasjonsdrevne reporterlinjer kan også brukes med Tet-On-systemet.
- Sett opp et parringsbur av en oTet-Cre (+/-) hann med en eller flere R26 (mTmG) (+/+) hunner. Se figur 1 for en oversikt over det eksperimentelle museparringsoppsettet.
- Resulterende valper (F1) vil være oTet-Cre (+/-) eller oTet-Cre (-/-) og R26 (mTmG) (+/-). Utfør genotyping i henhold til primerne i tilleggstabell 1 og protokoller i tilleggstabell 2.
- Ved avvenning, utfør germline testing ved å ta et øreslag fra hver avvenning. Undersøk ørestansen under et epifluorescerende mikroskop i GFP / FITC-spekteret for å avgjøre om dyret hadde gjennomgått germline-rekombinasjon i utvikling. I så fall vil dyret uttrykke GFP i hver celle, og ørestansen vil fluorescere med mGFP-signal. Disse dyrene kan ikke brukes til parringer eller eksperimenter.
MERK: Øreklemmer fra mus som ikke er germline viser bare endogen fluorescens under mikroskopet (figur 1C), mens germline dyr viser et lyst GFP-signal (figur 1D). Kontrollører kan være fra mus som ikke inneholder fluorescerende transgener. Som et notat har ørehår høy endogen fluorescens og må ikke brukes som en avgjørende faktor (figur 1C). I tillegg observeres forskjeller i endogen fluorescens mellom mus med hvit vs. svart frakkfarge, og kontroller fra mus med samme pelsfarge som mus som testes, må brukes i denne analysen. - Parre en hann oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/-) med en eller flere kvinnelige oTet-Cre (-/-) x R26 (mTmG) mus.
- Den resulterende generasjonen (F2) vil være 1/4 R26 (mTmG) (+/+) og 1/2 Cre (+/-). Kryss disse dyrene med mTert-rtTA (+/+) dyr ved å parre ett oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) med ett eller flere mTert-rtTA (+/+) dyr.
MERK: Vi brukte mTert-rtTA (+/+) dyr, men denne prosessen kan utføres med hvilken som helst rtTA-muselinje30. - For forsøksdyr, sett opp avl for å generere mTert-rtTA (+/+) eller (+/-) x oTet-Cre (+/-) x R26 (mTmG) (+/+) eller (+/-).
2. Doxycyklin induksjon av Cre og pulsjakt design
- Når dyrene er i riktig alder for at studien skal begynne, erstatt drikkevannet med doxvann: drikkevann som inneholder 5% sukrose og 2 mg / ml doksycyklinhyklat. Bruk Cre-negative dyr som mottar samme doxycyklin pulsjakt som eksperimentelle dyr som en kontrollgruppe for de resulterende fluorescerende uttrykksmønstrene.
- Etter tilberedning skal doxvann oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. Se tabell 1 for mer informasjon. Doxvann kan administreres til dyr i drikkeflasker i opptil 5 dager før det skiftes ut, da soppvekst kan oppstå hvis doxvann blir utelatt ved romtemperatur i lengre perioder.
MERK: En doksycyklinpuls på minst 2 dager er nødvendig for induksjon av mGFP-signal ved bruk av mTmG-transgenet (innledende mTmG-papir).
MERK: Vi har ikke testet andre doksysyklinkonsentrasjoner enn 2 mg/ml. Tidligere litteratur har identifisert at denne konsentrasjonen har de høyeste effektene når den administreres gjennom drikkevann29. Mengden av doksycyklin levert kan variere avhengig av mengden av drikking gjort av hvert dyr. Doxycyklin injeksjon eller gavage kan også gjøres for å være konsistent mellom dyr40.
- Etter tilberedning skal doxvann oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned. Se tabell 1 for mer informasjon. Doxvann kan administreres til dyr i drikkeflasker i opptil 5 dager før det skiftes ut, da soppvekst kan oppstå hvis doxvann blir utelatt ved romtemperatur i lengre perioder.
- Etter at pulsperioden er avsluttet, fjern doxvann fra burene og erstatt med normalt drikkevann. Dyrene vil nå være i "jakt" -perioden til døden.
3. Transkardial perfusjon og hjernedisseksjon
- Fjern en mus fra buret og hold dyret ved hjelp av venstre tommel og pekefinger. Injiser dyret via intraperitoneal (dvs.p.) injeksjon med en oppløsning på 100 mg/ml ketamin og 20 mg/ml xylazin i 0,9 % sterilt saltvann for en endelig konsentrasjon på 200 mg/kg ketamin og 20 mg/kg xylazin. Se tabell 1 for mer informasjon.
FORSIKTIG: Protokollene for anestesi kan variere avhengig av land. I tillegg er det effekter av anestetika på hjernen, inkludert endringer i mikrogliamorfologi og virknings- og kortikosteronnivåer som må forstås når man utfører perfusjoner med henblikk på hjerneinnsamling og analyse41,42. - Etter ca. 1-2 min vil dyret miste sin retterefleks. For å teste dette, ruller du bare dyret på ryggen, og hvis det ikke kan rulle tilbake på føttene, har det mistet høyrerefleksen.
- Etter ca. 5-10 min mister dyret pedalrefleksen. For å sjekke pedalrefleksen, bruk tommelen og pekefingeren til å klemme hver av dyrets føtter. Hvis det ikke er noen respons, i form av et hopp eller muskelspasmer, bruk neglene på tommelen og pekefingeren til å klemme hver av dyrets føtter. Hvis det ikke er noe svar, har dyret mistet pedalrefleksen.
MERK: Hvis dyret reagerer på pedalrefleksen i mer enn 15 minutter etter injeksjon, kan det være nødvendig med en ekstra injeksjon på 1/2 av den første ketamin/xylazininjeksjonen. Alder, kjønn, genotype, fenotype og behandling kan påvirke dyrets respons på denne stoffcocktailen. - Etter at høyre- og pedalrefleksene er tapt, test den okulære refleksen ved å kontakte museøyebollet lett med en hansket finger. Manglende respons indikerer at den okulære refleksen har gått tapt.
- Fest musen i en liggende stilling med potene festet til en pinnable arbeidsflate.
- Gjør et snitt gjennom huden med kirurgisk saks langs thorax midtlinjen ca 1-2 cm under xiphoidprosessen. Kutt overlegen til ved xiphoid-prosessen.
- Ta tak i brusk i xiphoidprosessen med tang. Sett saks og skjær gjennom muskulaturen og brystkassen diagonalt langs musens høyre side til nivået av klaffene.
- Løft thoraxmuskulaturen med tang og skjær gjennom mellomgulvet til hjertet kan visualiseres. Lag deretter et identisk diagonalt kutt langs musens venstre side, og sørg for å forhindre kontakt med hjertet. Bruk en hemostat for å holde thoraxmuskulaturen borte fra hulrommet.
MERK: På dette tidspunktet vil musen ikke kunne puste lenger, så arbeid raskt for å forhindre død før de neste trinnene.
- Løft thoraxmuskulaturen med tang og skjær gjennom mellomgulvet til hjertet kan visualiseres. Lag deretter et identisk diagonalt kutt langs musens venstre side, og sørg for å forhindre kontakt med hjertet. Bruk en hemostat for å holde thoraxmuskulaturen borte fra hulrommet.
- Fest det bankende hjertet med butte tang og stikk en dispenseringsnål inn i venstre ventrikel gjennom bunnen av aortabuen.
- Klem nålebunnen til venstre ventrikel rett over innsettingsstedet.
- Gjør et snitt i høyre atrium, og ved første tegn på blodstrøm, begynn å perfusere dyret med 20 ml 1x PBS ved 8,11 ml / minutt.
- Etter at 1x PBS har perfundert kroppen, bytt til riktig fikseringsmiddel for nedstrømsapplikasjonen og perfuser musen med 20 ml fikseringsmiddel.
- For frossen snitting og immunostaining, perfuse dyr med glyoksal fiksativ for hjernerydding, perfuse dyr med 4% PFA i 1x PBS (pH 7,4).
MERK: Tegn på en vellykket perfusjon inkluderer dyrestivhet (svak stivhet med glyoksal, intens stivhet med PFA) og mangel på synlige blodkar i hele vevet.
- For frossen snitting og immunostaining, perfuse dyr med glyoksal fiksativ for hjernerydding, perfuse dyr med 4% PFA i 1x PBS (pH 7,4).
- Halshugg musen og fjern hjernen ved å sette saks inn i hjernestammen og skjære langs squamosal suturen gjennom til frontomaxillary suturen på hver side. Skjær deretter over fontonasal suturen for å fjerne skallehetten, vær forsiktig så du ikke skader den olfaktoriske pæren. Derfra snu skallen opp ned, og bruk buede tang for å fjerne hjernen, og sørg for å kutte optisk nerve.
- Plasser den perfuserte hjernen i en vevspatron og senk ned i fikseringsmiddelet som brukes til å perfusere dyret over natten ved 4 °C.
4. Hjernebehandling, kutting og immunostaining
- Hjernebehandling og kutting
- Fjern hjernepatroner fra glyoksalfiksativet og inkuber i 15% sukrose i 1x PBS i 2 dager ved 4 ° C eller til hjernen synker.
- Fjern hjernepatroner fra 15% sukrose og inkuber i 30% sukrose i 1x PBS i 2 dager ved 4 ° C eller til hjernen synker.
MERK: Se tabell 1 for mer informasjon. - Fjern hjerner fra 30% sukrose i 1x PBS og separer hjernen i forskjellige "blokker" ved hjelp av en koronal hjerneblokk eller sagittal hjerneblokk.
- Legg inn koronale eller sagittale hjerneseksjoner i OCT-forbindelsen ved å plassere hjerneseksjoner på en blanding av tørris og etanol (EtOH). Etter at OCT har blitt hvit og blitt fast, fjern den fra tørris-EtOH-blandingen og oppbevar den innpakket i parafilm, inne i en lufttett pose ved -20 °C.
- Fjern frosne blokker fra fryseren og plasser dem inne i en kryostat med en indre temperatur satt til -20 °C. Bruk OCT til å feste blokken til en metall chuck slik at vevet er solid festet. Tillat ~ 5 minutter for vevet å fryse til chucken. Skjær vevet på 7 μm, plasser hver vevskive på et ladet glassglass.
- La lysbildene stekes over natten ved 37 °C, og plasser deretter ved -20 °C til de brukes til immunsprekking.
- Immunostaining
- Varm glir til romtemperatur (RT) og etter fiksering med iskald aceton i 15 minutter.
- Vask lysbildene i 5 minutter i 1x skyllebuffer (f.eks. IHC Select TBS Skyllebuffer), risting ved 60 o / min ved RT mellom hvert trinn.
- Permeabiliser for farging av nukleære antigener med 0,3% Triton X-100 i 10 minutter ved RT. Permeabilize for farging av cytoplasmatiske antigener med 0,3% Tween-20 i 10 minutter ved RT.
- Utfør antigenuthenting ved å bytte lysbilder i 50-100 ml 1x DAKO Antigen Retrieval Solution på lav i 10 minutter, to ganger. Skyll deretter med skyllebuffer i 5 min ved RT.
- Inkuber lysbilder i 0.3% Typogen Black i 70% EtOH i 20 minutter ved RT og vask deretter med skyllbuffer.
- Tegn en hydrofob barriere rundt hvert vev uten å la vev tørke. Blokker deretter i 20 minutter ved 37 °C med 1 dråpe milliporeblokkerende reagens per vev. Tilsett deretter 100 μL primært antistoff fortynnet i antistofffortynningsmiddel til hvert vev og inkuber over natten ved 4 °C.
- Neste dag inkuberes seksjoner i Alexa Fluor sekundære antistoffer i 10 minutter ved RT. Vask deretter lysbildene i skyllebuffer.
- Dekk hjerneseksjoner i 100 μL av 1: 500 anti-GFP antistoff konjugert til AlexaFluor 488 for å øke det endogene GFP-signalet som markerer sporede celler og inkuberer over natten ved 4 ° C.
- Neste dag, vask med skyll buffer 2x, og vask deretter i rennende DI vann i 5 min.
MERK: Sørg for å vaske forsiktig med DI-vann, og pass på å unngå rennende vann på lysbilder selv som kan fjerne hjerneseksjoner fra lysbilder. - Counterstain med 100 ng / ml 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 min. Vask deretter i rennende DI-vann i 5 minutter.
- Legg til en dråpe monteringsmedium på toppen av hver vevsseksjon og forsegl med et deksel på 22 mm x 22 mm. Bildebehandling anbefales på monteringsdagen for å sikre optimalt signal.
5. iDISCO hjernerydding (tilpasset fra39)
- Fiksering og seksjonering
- Post-fix hjerner i 4% PFA over natten ved 4 ° C og deretter igjen i 1 time ved RT.
- Vask hjernen i 1x PBS i en time, to ganger, på RT. Skjær deretter i 1 mm tykke seksjoner ved hjelp av den nødvendige hjerneblokken og plasser i 5 ml mikrocentrifugerør som inneholder 1x PBS.
- Metanol forbehandling (med metanol)
MERK: På grunn av muligheten for at metanol påvirker immunostaining av visse proteiner, vil forfatterne gjerne henvise leseren til Renier et al. 2014 for en protokoll til et metanolfritt iDISCO-protokollalternativ39. Se tabell 1 hvis du vil ha mer informasjon om følgende løsninger i denne delen.- Vask med 1x PBS i 1 time to ganger (risting) ved RT.
- Vask i 50% metanol (i PBS) i 1 time (risting) ved RT.
- Vask i 80% metanol i 1 time (risting) ved RT.
- Vask i 100% metanol i 1 time to ganger (risting) ved RT.
- Blekemiddelprøver med 5 % hydrogenperoksid (H2O2) i 20 % dimetylsulfoksid (DMSO)/metanol (1 volum 30 % H2O2/1 volum DMSO/4 volum metanol, iskald) ved 4 °C over natten (risting).
- Etter bleking, vask prøver i metanol i 1 time to ganger (risting) ved RT.
- Vask i 20% DMSO / metanol i 1 time to ganger (risting) ved RT.
- Vask i 80% metanol i 1 time (risting) ved RT.
- Vask i 50% metanol i 1 time (risting) ved RT.
- Vask i PBS i 1 time to ganger (risting) ved RT.
- Vask i PBS/0,2% Triton X-100 i 1 time to ganger (risting) ved RT.
- Immunostaining av clearing hjerner
- Inkubere prøver i 1x PBS/0,2 % Triton X-100/20 % DMSO/0,3 M glycin ved 37 °C over natten på en orbital shaker.
- Blokk i 1x PBS/0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% geiteserum ved 37 °C i 3 dager på en orbital shaker.
- Vask prøvene i 1x PBS/0,2 % Tween-20/10 μg/ml heparinnatriumsalt fra svineslimhinnen i 1 time to ganger ved 37 °C, og inkuber deretter i 1x PBS/0,2 % Tween-20/10 μg/ml heparin/5 % DMSO/3 % geiteserum inneholdende 1:500 konsentrasjon av kanin anti-GFP AlexaFluor 488 ved 37 °C på en orbital shaker i 2 dager.
- Vask prøver i 1x PBS / 0,2% Tween-20 med 10 μg / ml heparin i 1 time ved 37 ° C på orbital shaker, tre ganger, og deretter en gang daglig i 2 dager.
- Inkuber prøver over natten i 10 ml 50 % v/v tetrahydrofuran (THF)/H2O i et 15 ml konisk rør.
- Inkuberprøver i 1 time i 10 ml med 80 % THF/H2O.
- Inkuber prøver to ganger i 1 time i 100% THF.
- Tørk prøvene med en steril våtserviett og rug i diklormetan til de synker til bunnen av hetteglasset (ca. 40 min). Skal ikke ruge >60 min.
MERK: Sørg for å håndtere diklormetan under en avtrekkshette. - Inkuber prøver i 18 ml dibenzyleter (DBE) til de er klare (>2 timer).
- Lagre prøver i DBE på RT til de er klare til å ta bilde.
MERK: For best resultat er det viktig å ta bildeprøver så snart som mulig etter at ryddingen er fullført.
6. Avbildning av flekkete lysbilder eller ryddede hjerner
- For å avbilde immunsekkede hjerneseksjoner, analyser lysbilder via konfokal mikroskopi, hvor samuttrykk av flere antistoffer kan bekreftes. Vi bruker et Leica Stellaris 5 mikroskop med HyD S hybriddetektorer, men ethvert punktskanningskonfokalmikroskop vil fungere. Målene inkluderer HC PL APO 10x/0.40 CS2, HC PL APO 40x/1.30 OIL CS2 og HC PL APO 63x/1.40.
- Konfigurer de riktige laserlinjene og utslippsfiltrene. De nødvendige lasere og tilhørende laserintensiteter er underlagt mikroskop- og fluoroforkombinasjonene som brukes.
MERK: Vi bruker en kombinasjon av diode 405 nm og hvite lyslasere for å finjustere eksitasjons- og utslippsspektra for hver fluorofor, eller grupper av fluoroforer, som brukes til å redusere og eliminere crosstalk. Lignende resultater kan også oppnås ved hjelp av tradisjonelle laser / filterkombinasjoner, men vær nøye med kanalblødningen. Utfallende gjennom kan identifiseres ved å slå på en enkelt laserlinje i forbindelse med hver av de ønskede utslippsfilterkombinasjonene for å se hvilke kanaler som påvirkes av hver spesifikke laser. For eksempel, hvis dioden 405 nm laser produserer synlig fluorescens i GFP-utslippsfilteret, blør det gjennom forekommende. Sørg for at flere kanaler avbildes sekvensielt bilde for bilde, slik at eventuelle utfallende utfallende sider reduseres. - For samfargede Tet-On-hjerner med en mTmG-reporter, velg DAPI (eks. 405 nm, em. 450 nm), GFP (eks. 488 nm, em. 509 nm), tdTomato (ex. 555 nm, em. 582 nm), og den tilsvarende langt røde fluoroforen for å matche fluoroforen som brukes på det sekundære antistoffet. Vi anbefaler Alexa Fluor 647 (f.eks. 651 nm, em. 667 nm).
- Etabler innstillinger først med en Cre-control hjerne farget med både GFP og fluorescerende sekundær. Disse hjerneskivene vil kontrollere for bakgrunnsfluorescens fra fluorescerende antistoffer og vil ikke vise noe reelt GFP-signal.
- Analyser hver hjerneseksjon fra topp til bunn, venstre til høyre, for å bekrefte at ingen signaler har blitt savnet i analysen. Hvis du avbilder den samme hjerneseksjonen ved forskjellige forstørrelser, anbefales det at de lavere forstørrelsene brukes først, da den høyere forstørrelsen raskere vil bleke mTomato-signalet.
- Konfigurer de riktige laserlinjene og utslippsfiltrene. De nødvendige lasere og tilhørende laserintensiteter er underlagt mikroskop- og fluoroforkombinasjonene som brukes.
- For å avbilde ryddede hjerner, bruk et omvendt konfokalt mikroskop med en automatisert scene og automatisert flisleggingsfunksjon. Vi bruker Leica Stellaris 5 mikroskop. Fordi prøvene er så tykke (>500 μm), kreves større arbeidsavstander som begrenser forstørrelsen som effektivt kan oppnås. Vi bruker HC PL APO 10x/0.40 CS2-målet for all klarert hjerneavbildning.
- Begynn med å legge en ryddet hjerneseksjon flatt mot en glassbunnsfat og senk ned i dibenzyleter.
MERK: Dibenzyleter er etsende for de fleste objektive linser og de fleste plasttyper. Av denne grunn må all innvendig plast i glassbunnsfatet belegges med hurtigtørkende silikonelastomer. - Konfigurer de riktige laserlinjene og utslippsfiltrene. For samfargede Tet-On-hjerner med en mTmG-reporter, velg DAPI, GFP, tdTomato og den tilsvarende langt røde fluoroforen for å matche fluoroforen som brukes på det sekundære antistoffet. Angi ønsket oppløsning, vi anbefaler minst 1024 x 1024. Sett pinhole til 1 AU.
- Etabler laserintensiteten og detektorøkningen først med en Cre-control hjerne farget med både GFP og fluorescerende sekundær. Disse hjerneskivene vil kontrollere for bakgrunnsfluorescens fra fluorescerende antistoffer og vil ikke vise noe reelt GFP-signal.
- Når laserintensiteter og detektorøkning er optimalisert, kartlegg hjernen for avbildning. Start med å finne hele omkretsen av hjerneseksjonen for å stille inn X- og Y-aksen for bildeoppkjøpet. Deretter identifiserer du Z-aksen ved å sette fokuspunktet til omtrent vevets senterdybde, og bruk Z-posisjoneringskontroller for å finne det "høyeste" punktet i vevet (mest positive Z-verdi). Skann ulike regioner av vevet og øk maksimal Z-aksehøyde etter behov.
- Gjenta for det "laveste" (mest negative Z-verdien) punktet som kreves for å oppnå hele tykkelsen av vevet. Stellaris 5 har en grense på ± 250 um av fokuspunktet. Dette begrenser optiske seksjoner til 500 μm tykke i Z-aksen. 3D-området i hjerneseksjonen er nå kjent.
- Sett Z-trinnsstørrelsen til 6 μm og begynn å anskaffe bildet. Anskaffelsestid er avhengig av flere faktorer og kan variere fra timer til dager avhengig av ønskede parametere. Hvis du vil redusere bildeopptakstiden, kan du prøve å redusere oppløsningen, øke laserskanningshastigheten eller øke trinnstørrelsen.
- Når det flislagte bildet av hele den ryddede hjerneseksjonen er tatt, analyser etter ønske.
- Begynn med å legge en ryddet hjerneseksjon flatt mot en glassbunnsfat og senk ned i dibenzyleter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens fluorescerende signal som følge av et Tet-On-system med en fluorescerende reporter vil variere avhengig av promotoren av interesse og fluorofor (er) som brukes, vil vi beskrive hvordan funnene ble analysert med mTert-rtTA: : oTet-Cre: : Rosa-mTmG dyr. Analyse av voksne hjerner etter en pulsjakt resulterte i membran GFP-uttrykkende celler gjennom ulike anatomiske nisjer. Forskjellen i fluorescerende intensitet mellom ulike celletyper må noteres. En variabel angående fluorescerende intensitet er størrelsen på cellemembranen. For eksempel har choroidepitelceller (CPEC) i choroid plexus en tykk cellemembran og sterkt fluorescerende signal som lett kunne skilles fra de omkringliggende cellene (figur 4A, B). Imidlertid hadde andre mindre og for tiden uidentifiserte celletyper i choroid plexus stroma et svakere GFP-signal (figur 4C). I lillehjernen uttrykte Bergmanns gliaceller høyere nivåer av mGFP enn kurvceller, og variasjon i mGFP-uttrykk eksisterte til og med mellom individuelle kurvceller (figur 4D). Olfaktoriske sensoriske nevronaksoner i det glomerulære laget av den olfaktoriske pæren uttrykte også høye nivåer av mGFP (figur 4A, E). For å sikre at alle mGFP+-celler identifiseres, er det derfor viktig å identifisere både lyse og svake GFP+-celler i hjernen til mTmG-dyr. I mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-dyr observerte vi lavt bakgrunns-mGFP-uttrykk på tvers av hjernegrupper, inkludert hjernebarken (figur 4A). Interessant nok viste lillehjernen og hjernestammen lavere bakgrunns-mGFP-uttrykk på denne måten (figur 4A).
Under analyse av hjernevev etter et avstamningsspor vil det være forskjeller i mGFP og mTomato uttrykksmønstre på tvers av både hjernegrupper og celletyper. Olfaktoriske sensoriske nevronaksoner som fyller det glomerulære laget av den olfaktoriske pæren uttrykte høye nivåer av membrantomat sammenlignet med de fleste andre hjernegrupper, selv når de samme nevronene er mGFP +, noe som indikerer at noen celler syntes å miste mTomato-signalet langsommere (figur 4D). I kontrast, i choroid plexus, uttrykte mGFP + celler lav mTomato (figur 4B, C). I de fleste andre hjernegrupper er tomatsignalet spredt jevnt mellom celletyper, med endotelceller som noen av de eneste cellene hvis fluorescerende signal var lyst nok til å skille seg ut fra den røde fluorescerende bakgrunnen (figur 4B). Aktiveringen av mGFP-ekspresjon og spaltning av mTomato fra genomet under rekombinasjon resulterer i tap av mTomato-ekspresjon, men mTomato-fluoroforene som uttrykkes på membranen beholdes til de nedbrytes. Av denne grunn vil mGFP + -celler ofte uttrykke variabelt mTomato-signal, som vil avhenge av rekombinasjonens rekombinasjon, celletypen og størrelsen på cellemembranen. Derfor er det viktig å analysere celler basert på uttrykket av mGFP og ikke utelukke dem fra analyse hvis de uttrykker både mGFP og mTomato.
Alternative journalister kan også brukes sammen med Tet-On-systemet. Cre-rekombinasjon kan virke for å indusere ekspresjon av GFP eller RFP i celler som normalt ikke vil uttrykke noen fluorescerende tag i Rosa-GFP eller Rosa-RFP dyr. Her vil analyse av GFP eller RFP indikere uttrykk for promotoren av interesse, og ingen fluoroforsignal vil bli fjernet, for eksempel med mTmG-dyr. Enkeltfluoroforreportere tillater immunostaining med mer fluorescerende antistoffkombinasjoner, da membrantomaten i mTmG-dyr forhindrer farging i den røde bølgelengden.
Figur 1. Generering av en Tet-On-muselinje. (A) Oversikt over avlsordningen for opprettelse av mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus fra individuelle muselinjer. (B) Skjematisk av Tet-On-systemet i mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muselinjen. (C-D) Representative bilder av øreklemmer avbildet med FITC-kanal av et epifluorescerende mikroskop fra ikke-germline (C) og germline (D) mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Eksperimentelle design med avstamning sporing Tet-On mus. Illustrasjoner av forsøk med Tet-On-mus fra basal proliferasjon, migrasjon og differensiering (1) til behandlinger under doxpuls uten jakt på regenerering eller relikevekt (2), intervensjoner under puls med mulighet til å visualisere langtidseffekter (3). En kort puls på 2 dager uten påfølgende jakt vil gi innsikt i en nær basal tilstand hos TERT+-celler, da disse cellene vil ha liten tid til å aktivere, proliferere, migrere eller differensiere (4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Hjernerydding av mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG musehjerner. (A) Sagittal snitt av 1 mm hjerneseksjoner etter fiksering. (B) Individuelle hjerneseksjoner er plassert i 5 ml rør for iDISCO hjernerydding39. (C) Rensede hjerner plasseres i glassbunnsfat og nedsenkes i DBE for brytningsindeksmatching under bildeopptak. (D) Fang hele området av hjernen som en serie Z-stabler som vil bli flislagt sammen for å danne et omfattende 3D-bilde av hjernen. Dette kan deretter forventes Z-maksimal intensitet for å lage et 2D-bilde fra 3D-datasettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Avstamningssporing av voksen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG musehjerner etter en 3 ukers puls og 11 dagers jakt på doksycyklin. (A) Fjernet hjerneseksjon av voksen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-mus med spesifikke områder av mGFP-signal vist med innfelt (N = 3 hannmus). (B-C) Representativt bilde av mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG choroid plexus som identifiserer mGFP+ CPECs (B) og mindre, svakere mGFP+ celletyper (C; N = 4 menn, N = 6 kvinner). (D) Representativt bilde av mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG lillehjernen Bergmann glia (lys) og kurvceller i det molekylære laget av lillehjernen (dim; N = 4 menn, N = 6 kvinner). (E) Representativt bilde av det olfaktoriske glomerulære laget av mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG hjerner. Stiplede linjer indikerer glomerulære rom (N = 4 menn, N = 6 kvinner). Skalastenger er 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 2. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode for opprettelse, utnyttelse og analyse av en trippel transgen linjesporing muselinje som markerer stamceller i den voksne musehjernen in vivo er beskrevet. Når det kombineres med immunostaining eller hjernerydding, kan identifisering og karakterisering av sporede fluorescerende celler over hele hjernen oppnås. Denne teknikken gir muligheten til å forstå plastikk / regenerativ / remodeling potensial av merkede stamceller som de aktiverer, migrere, differensiere, eller spre seg. Mens tidligere data oppnådd via etikettretensjon med tymidin-H3 og BrdU konkluderte med at V-SVZ, olfaktorisk pære og subgranulær sone av dentate gyrus var de eneste nevrogene hjerneområdene hos voksne pattedyr 2,3,4,5,6,7,8,43, er det nå forstått at voksen neurogenese også forekommer i cortex 44, hypothalamus45,46 og striatum 47,48,49, samt potensielt andre nye nisjer som ikke er godt studert. Voksen gliogenese, prosessen der glialforløperceller skaper nyfødte astrocytter og oligodendrocytter, forekommer i hele hjernen også37, og glia og nevroner antas å stamme fra samme multipotente stamcelle. Av disse grunner har avstamningssporingsstudier vært integrert i å forstå rollen som ulike stamcelletyper som bidrar til å fylle opp og regenerere nevroner og glia i den voksne pattedyrhjernen (gjennomgått i50).
For studier i voksen hjerneplastisitet er den optimale alderen 12 ukers alder, når den murine hjernen har fullført utvikling51. Når du planlegger lengden på doksycyklinpulsen og påfølgende jakt, er en forståelse av interesseprosessen avgjørende, slik at pulsjakttiden er lang nok til at prosessene av interesse kan skje. For eksempel er opprettelsen av nyfødte nevroner i olfaktorisk pære fra voksne nevrale stamceller (ANSC) i V-SVZ ca. 4 uker, som bestemt av tidligere avstamningssporingsstudier52. En pulsjaktstudie som vil merke ANSC-ene i V-SVZ, må derfor være innenfor den tidsrammen for å tillate ANSC-ene i V-SVZ å dele seg, for at disse ANSC-ene skal skille seg ut i mellomliggende celletyper, og for at disse mellomcelletypene skal migrere til olfaktorisk pære og differensiere til voksenfødte nevroner. Lengden på jakten vil bestemme hvor lang tid som merkede celler og deres avkom må fortsette sin migrasjon og differensiering, selv om disse prosessene også vil skje under pulsen. Samlet sett er det viktig å forstå prosessene som er involvert, da tidslinjen for hvert avstamningssporingseksperiment må tillate de riktige prosessene å skje.
Mens dette manuskriptet beskriver Tet-On-systemet, eksisterer det andre avstamningssporingstransgener som kan benyttes. CreERT2-transgenet tillater ekspresjon av en Cre-rekombinase som bare er aktiv i nærvær av tamoxifen eller 4-OHT, et tamoxifen-derivat. Når denne Cre er regulert av en promotor av interesse, vil 4-OHT eller tamoxifen administrasjon bare produsere Cre rekombinasjon i celler som uttrykker at promotor. Når parret med en reporter gen som Rosa-LSL-GFP eller Rosa-mTmG, vil Cre-lox rekombinasjon uutslettelig markere cellene som uttrykker Cre under tamoxifen administrasjon. En ulempe med dette systemet er bruken av tamoxifen, som har langvarige bivirkninger på nevrogenese i både prenatale og voksne hjerner17. Av denne grunn må avstamningssporingsstudier med CreERT2-linjer vurdere forbeholdene som er involvert.
Avstamningssporingsstudier i den voksne hjernen utføres ofte med markører av stamceller som Nestin eller markører av gliaforløperceller inkludert NG2 53,54. Mens resulterende data indikerer omsetningen og differensieringen av disse cellene til nyfødte modne celletyper, kan uttrykket av disse markørene av forskjellige andre celletyper i den voksne hjernen være forvirrende. For eksempel uttrykkes Nestin, et mellomliggende filamentprotein involvert i mitose55, også av modne nevroner56 og meningealcelletyper57. Andre stamcellemarkører inkluderer glial fibrillært surt protein (GFAP)58,59, og glutamat aspartattransportør 1 (GLAST)60, som uttrykkes av astrocytter i hele den voksne hjernen også61. Av denne grunn er det behov for avstamningssporingsstudier med ytterligere markører. Etter hvert som vi lærer mer om den brede effekten av voksen plastisitet i hjernen, forblir karakteriseringen og analysen av cellene som spiller en rolle i disse prosessene og deres avkom, avgjørende for vår forståelse av nevrogene og gliogene veier involvert i nevrodegenerativ helse og mer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Diana Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) og Dr. Matthew Lynes (Joslin Diabetes Center; Maine Medical Center Research Institute) for veiledning ved bruk av mTert-rtTA dyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody diluent | Agilent | S080983-2 | |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent | S2367 | |
| anti-GFP antibody | Invitrogen | A2311 | Use at 1:500-1:000 |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J | The Jackson Laboratory | JAX:006234 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX:007676 | |
| Blocking Solution (IHC) | Millipore Sigma | 20773 | |
| Blunt needle | BSTEAN | X0012SYHIV | |
| Coronal brain block | Braintree | BS-2000C | |
| Cover slip | Corning | 2850-22 | |
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D564 | |
| Dibenzyl ether | Millipore Sigma | 33630 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Doxycycline Hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | |
| Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative | Amresco | H120 | This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265) |
| Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | 516813 | |
| IHC Select TBS Rinse Buffer | Millipore Sigma | 20845 | |
| Ketamine | Westward | 0143-95095-10 | This product requires a DEA license for storage and use. |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Milipore Block | Millipore | 20773 | |
| Mounting medium | Millipore Sigma | 5013 | |
| Optimal Cutting Temperature Solution | Sakura | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS Solution (10X) | Teknova | P0496 | |
| Sagittal brain block | Braintree | RBM-2000S | |
| Saline | Braun | S8004-5264 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Sudan (Typogen) Black | Millipore Sigma | 199664 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Tissue cartridge | Simport | M512 | |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween-20 | Millipore Sigma | 655205 | |
| Xylazine | AnaSed | sc-362950Rx |
References
- Carlone, D. L., et al. Telomerase expression marks transitional growth-associated skeletal progenitor/stem cells. Stem Cells. 39 (3), 296-305 (2021).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
- Cameron, H. A., Gould, E. Adult neurogenesis is regulated by adrenal steroids in the dentate gyrus. Neuroscience. 61 (2), 203-209 (1994).
- Kaplan, M. S., Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science. 197 (4308), 1092-1094 (1977).
- Gould, E., et al. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult tree shrew is regulated by psychosocial stress and NMDA receptor activation. Journal of Neuroscience. 17 (7), 2492-2498 (1997).
- Eriksson, P. S., et al.
- Gould, E., et al. Neurogenesis in adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Science. 3 (5), 186-192 (1999).
- Hastings, N. B., Gould, E. Rapid extension of axons into the CA3 region by adult-generated granule cells. Journal of Comparative Neurology. 413 (1), 146-154 (1999).
- Hu, V. W., et al. 3H-thymidine is a defective tool with which to measure rates of DNA synthesis. The FASEB Journal. 16 (11), 1456-1457 (2002).
- Cifuentes, M., et al. A comparative analysis of intraperitoneal versus intracerebroventricular administration of bromodeoxyuridine for the study of cell proliferation in the adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 201 (2), 307-314 (2011).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Guizzetti, M., Kavanagh, T. J., Costa, L. G.
- Gomez-Nicola, D., et al. Regulation of microglial proliferation during chronic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2481-2493 (2013).
- Bradl, M., Lassmann, H.
- Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Current Gene Therapy. 16 (3), 156-167 (2016).
- Lee, C. M., et al. Single-cell RNA-seq analysis revealed long-lasting adverse effects of tamoxifen on neurogenesis in prenatal and adult brains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (32), 19578-19589 (2020).
- Smith, B. M., et al. Oral and injected tamoxifen alter adult hippocampal neurogenesis in female and male mice. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Greenberg, R. A., et al. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation and proliferation. Oncogene. 16 (13), 1723-1730 (1998).
- Cong, Y. S., Wright, W. E., Shay, J. W. Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 407-425 (2002).
- Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (30), 10420-10425 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 179-184 (2011).
- Lin, S., et al. Distributed hepatocytes expressing telomerase repopulate the liver in homeostasis and injury. Nature. 556 (7700), 244-248 (2018).
- Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. 40 (1), 102-111 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Telomerase reverse transcriptase expression in mouse endometrium during reepithelialization and regeneration in a menses-like model. Stem Cells and Development. 28 (1), 1-12 (2019).
- Deane, J. A., et al. The mouse endometrium contains epithelial, endothelial and leucocyte populations expressing the stem cell marker telomerase reverse transcriptase. Molecular Human Reproduction. 22 (4), 272-284 (2016).
- Thompson, C. A. H., Wong, J. M. Y. Non-canonical functions of telomerase reverse transcriptase: emerging roles and biological relevance. Current Topics in Medicinal Chemistry. 20 (6), 498-507 (2020).
- Lynes, M. D., et al. Telomerase reverse transcriptase expression marks a population of rare adipose tissue stem cells. Stem Cells. , (2021).
- Redelsperger, I. M., et al. Stability of doxycycline in feed and water and minimal effective doses in tetracycline-inducible systems. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 55 (4), 467-474 (2016).
- Jensen, G. J., et al. Telomerase reverse transcriptase (TERT)-expressing cells mark a novel stem cell population in the adult mouse brain. Peer Review. , (2022).
- Muzumdar, M. D., et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Bocker, R., et al. Comparison of distribution of doxycycline in mice after oral and intravenous application measured by a high-performance liquid chromatographic method. Arzneimittelforschung. 31 (12), 2116-2117 (1981).
- Lucchetti, J., et al. Plasma and brain concentrations of doxycycline after single and repeated doses in wild-type and APP23 mice. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 368 (1), 32-40 (2019).
- Sun, Y., Chen, X., Xiao, D. Tetracycline-inducible expression systems: new strategies and practices in the transgenic mouse modeling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 39 (4), 235-246 (2007).
- Lee, P., et al. Conditional lineage ablation to model human diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (19), 11371-11376 (1998).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as "gold standard" for immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 129 (3), 358-366 (2008).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Bratthauer, G. L. Preparation of frozen sections for analysis. Immunocytochemical Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 67-73 (2010).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Cawthorne, C., et al. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. Journal of Biomolecular Techniques. 18 (2), 120-123 (2007).
- Hristovska, I., et al. Ketamine/xylazine and barbiturates modulate microglial morphology and motility differently in a mouse model. PLoS One. 15 (8), 0236594 (2020).
- Pereira, G. C., et al. Anesthesia can alter the levels of corticosterone and the phosphorylation of signaling molecules. BMC Research Notes. 14 (1), 363 (2021).
- Markakis, E. A., Gage, F. H. Adult-generated neurons in the dentate gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406 (4), 449-460 (1999).
- Magavi, S. S., Leavitt, B. R., Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature. 405 (6789), 951-955 (2000).
- Evans, J., et al. Characterization of mitotic neurons derived from adult rat hypothalamus and brain stem. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 1076-1085 (2002).
- Kokoeva, M. V., Yin, H., Flier, J. S. Neurogenesis in the hypothalamus of adult mice: potential role in energy balance. Science. 310 (5748), 679-683 (2005).
- Parent, A., Cicchetti, F., Beach, T. G.
- Rich, E. L., Shapiro, M. Rat prefrontal cortical neurons selectively code strategy switches. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7208-7219 (2009).
- Suzuki, S. O., Goldman, J. E. Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration. Journal of Neuroscience. 23 (10), 4240-4250 (2003).
- Figueres-Onate, M., Sanchez-Gonzalez, R. -, Lopez-Mascaraque, L. - Deciphering neural heterogeneity through cell lineage tracing. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (5), 1971-1982 (2021).
- Hammelrath, L., et al. Morphological maturation of the mouse brain: An in vivo MRI and histology investigation. Neuroimage. 125, 144-152 (2016).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70 (4), 687-702 (2011).
- Sanchez-Gonzalez, R., Bribian, A., Lopez-Mascaraque, L. Cell fate potential of NG2 progenitors. Scientific Reports. 10 (1), 9876 (2020).
- Suzuki, T., et al. Cells of NG2 lineage increase in glomeruli of mice following podocyte depletion. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 315 (5), 1449-1464 (2018).
- Chou, Y. H., et al. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Molecular Biology of the Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Hendrickson, M. L., et al. Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain. PLoS One. 6 (4), 18535 (2011).
- Bifari, F., et al. Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 383 (2015).
- Doetsch, F., et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97 (6), 703-716 (1999).
- Seri, B., et al. Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. Journal of Neuroscience. 21 (18), 7153-7160 (2001).
- DeCarolis, N. A., et al. In vivo contribution of nestin- and GLAST-lineage cells to adult hippocampal neurogenesis. Hippocampus. 23 (8), 708-719 (2013).
- Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell and Tissue Research. 331 (1), 179-191 (2008).
