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Biology

कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस-बैक्टीरियल इंटरैक्शन में विषमता को मापने के लिए एकल-कृमि डेटा का उपयोग करना

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

यह प्रोटोकॉल बाहरी बैक्टीरिया को हटाने के लिए ठंड पक्षाघात और सतह विरंजन के बाद व्यक्तिगत जीवाणु उपनिवेशित कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस के 96-अच्छी तरह से व्यवधान का वर्णन करता है। परिणामस्वरूप निलंबन को बड़ी संख्या में व्यक्तिगत कीड़े में बैक्टीरिया लोड के सटीक, मध्यम-थ्रूपुट परिमाणीकरण की अनुमति देने के लिए अगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है।

Abstract

नेमाटोड कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस मेजबान-सूक्ष्मजीव और मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन के लिए एक मॉडल प्रणाली है। आज तक के कई अध्ययन इस जीव में बैक्टीरिया के भार को मापने के लिए व्यक्तिगत कृमि नमूनों के बजाय बैच डाइजेस्ट का उपयोग करते हैं। यहां यह तर्क दिया जाता है कि सी एलिगेंस आंत के जीवाणु उपनिवेशण में देखी गई बड़ी अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता जानकारीपूर्ण है, और बैच डाइजेस्ट विधियां उन सूचनाओं को त्याग देती हैं जो स्थितियों में सटीक तुलना के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन नमूनों में निहित भिन्नता का वर्णन करने के लिए बड़ी संख्या में व्यक्तियों की आवश्यकता होती है, व्यक्तिगत कीड़े के विघटन और कॉलोनी चढ़ाना के लिए एक सुविधाजनक 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रोटोकॉल स्थापित किया जाता है।

Introduction

मेजबान-सूक्ष्मजीव संघों में विषमता सर्वव्यापी रूप से देखी जाती है, और व्यक्तियों के बीच भिन्नता को प्रतिस्पर्धा और सह-अस्तित्व1 से रोग संचरण 2,3,4 तक जनसंख्या स्तर की प्रक्रियाओं में योगदान कारक के रूप में तेजी से पहचाना जाता है। एलिगेंस में, आइसोजेनिक आबादी के भीतर "छिपी हुई विषमता" को बार-बार देखा गया है, व्यक्तियों की उप-आबादी गर्मी सदमे प्रतिक्रिया5,6, उम्र बढ़ने और जीवनकाल 7,8,9,10,11, और शरीर विज्ञान और विकास के कई अन्य पहलुओं में अलग-अलग फेनोटाइप दिखाती है12 . अधिकांश विश्लेषण जो उप-जनसंख्या संरचना की पहचान करने का प्रयास करते हैं, आइसोजेनिक, सिंक्रनाइज़ किए गए कीड़े 5,7,8 की प्रयोगात्मक आबादी में दो उप-आबादी के लिए सबूत प्रदान करते हैं, हालांकि अन्य डेटा अलग-अलग समूहों 7,12,13 के बजाय लक्षणों के भीतर-जनसंख्या वितरण की संभावना का सुझाव देते हैं . यहां प्रासंगिकता की, आंतों की आबादी में पर्याप्त विषमता रोगाणुओं13,14,15,16 के साझा स्रोत से उपनिवेशित कीड़े की आइसोजेनिक आबादी के भीतर भी देखी जाती है, और इस विषमता को बैच डाइजेस्ट माप द्वारा छुपाया जा सकता है जो व्यापक रूप से कृमि में जीवाणु परिमाणीकरण के लिए 17,18,19,20 का उपयोग किया जाता है।

यह काम होस्ट-माइक्रोब एसोसिएशन में एकल-कृमि माप पर अधिक निर्भरता की आवश्यकता का सुझाव देने वाले डेटा प्रस्तुत करता है, साथ ही एकल-कृमि व्यवधान में सटीकता और थ्रूपुट बढ़ाने के लिए प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करता है। इन प्रोटोकॉल को व्यवहार्य जीवाणु भार की मात्रा का ठहराव के लिए बड़ी संख्या में व्यक्तिगत सी एलिगेंस के यांत्रिक व्यवधान की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि व्यक्तिगत कीड़े के मूसल-आधारित व्यवधान की तुलना में प्रति नमूना बेहतर पुनरावृत्ति और कम प्रयास प्रदान करता है। एक अनुशंसित आंत-शुद्धिकरण कदम, जहां कीड़े को गर्मी से मारे गए ई कोलाई पर भोजन करने की अनुमति दी जाती है व्यवधान की तैयारी से पहले, हाल ही में निगला और अन्य क्षणिक (गैर-पालन) बैक्टीरिया से योगदान को कम करने के लिए शामिल किया गया है। इन प्रोटोकॉल में कम एकाग्रता सतह ब्लीच उपचार के साथ छल्ली की सफाई के लिए एक ठंड-पक्षाघात विधि शामिल है; सतह विरंजन का उपयोग एकल-कृमि व्यवधान में प्रारंभिक चरण के रूप में या जीवित, बाहरी रूप से रोगाणु मुक्त कीड़े तैयार करने के लिए एक विधि के रूप में किया जा सकता है। यह सतह-विरंजन विधि बाहरी रोगाणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला को हटाने के लिए पर्याप्त है, और ठंड उपचार पारंपरिक लेवामिसोल-आधारित पक्षाघात का विकल्प प्रदान करता है; जबकि लेवामिसोल को ठंड-संवेदनशील प्रयोगों के लिए पसंद किया जाएगा, ठंड पक्षाघात खतरनाक अपशिष्ट धाराओं में योगदान को कम करता है और सामान्य गतिविधि को तेजी से फिर से शुरू करने की अनुमति देता है। जबकि पूर्ण प्रोटोकॉल एक प्रयोगशाला प्रयोग का वर्णन करता है जहां कीड़े ज्ञात बैक्टीरिया के साथ उपनिवेशित होते हैं, कीड़े और एकल-कृमि व्यवधान की सफाई के लिए प्रक्रियाओं को आसानी से जंगली नमूनों से अलग कीड़े पर लागू किया जा सकता है या सूक्ष्म ब्रह्मांड प्रयोगों में उपनिवेशित किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल कृमि आंत से निकाले गए जीवित बैक्टीरिया का उत्पादन करते हैं, जो व्यक्तिगत कीड़े में कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की चढ़ाना और मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त हैं; अनुक्रमण आधारित आंतों के सामुदायिक विश्लेषण के लिए, बाद में सेल लिसिस और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण कदम इन प्रोटोकॉल में जोड़ा जाना चाहिए।

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Protocol

इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले कीड़े कैनोरहाब्डिटिस जेनेटिक सेंटर से प्राप्त किए गए थे, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी 010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। ब्रिस्टल एन 2 जंगली प्रकार है। आईजीएफ म्यूटेंट डीएएफ -16 (एमयू 86) आई (सीजीसी सीएफ 1038) और डीएएफ -2 (ई 1370 ) III (सीजीसी सीबी 1370) का उपयोग आंतों के जीवाणु भार में अंतर को स्पष्ट करने के लिए किया जाता है।

एचटी 115 (डीई 3) ई कोलाई पीओएस -1 आरएनएआई वेक्टर ले जाने वाला अहरिंगर लाइब्रेरी21 से है। एलिगेंस देशी आंत बैक्टीरिया22 का एमवाईबी संग्रह शूलेनबर्ग प्रयोगशाला से प्राप्त किया गया था। साल्मोनेला एंटरिका एलटी 2 (एटीसीसी 700720) एटीटीबी: जीएफपी-केएमआर इस प्रयोगशाला से है। स्यूडोमोनास मोसेली को इस प्रयोगशाला में अलग किया गया था। स्टैफिलोकोकस ऑरियस एमएसएसए न्यूमैन पीटीआरकेएच 3-एमजीएफपी एमोरी विश्वविद्यालय में लारॉक प्रयोगशाला से प्राप्त किया गया था।

सभी कृमि बफर और मीडिया मामूली संशोधनों के साथ पहले प्रकाशित साहित्य24 के अनुसार तैयार किए जाते हैं ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)।

1. सिंक्रनाइज़ बाँझ सी एलिगेंस की तैयारी

नोट: इस खंड में, चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं को प्रजनन बाँझ वयस्क कीड़े की सिंक्रनाइज़ आबादी उत्पन्न करने के लिए वर्णित किया गया है। संतान के उत्पादन को रोकने के लिए यहां पीओएस -1 आरएनएआई प्लेटों पर भोजन का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह हस्तक्षेप भ्रूण घातक है; पीओएस - 1 आरएनएआई पर वयस्कता के लिए उठाए गए एल 1 लार्वा अंडे देने वाले हेर्मैफ्रोडाइट्स में विकसित होते हैं, लेकिन ये अंडे अव्यवहार्य25 हैं। आरएनएआई फीडिंग प्रोटोकॉल वर्मबुक26 के "रिवर्स जेनेटिक्स" अध्याय के रूप में है।

  1. कीड़े को सिंक्रनाइज़ करने से पहले, सुनिश्चित करें कि ताजा 10 सेमी एनजीएम + पीओएस -1 आरएनएआई प्लेटें उपलब्ध हैं। प्लेटों को केंद्रित प्रेरित तरल संस्कृति (+ एम्प + आईपीटीजी) से ताजा तैयार किया जा सकता है या एनजीएम + 100 μg / एमएल एम्पीसिलिन + 1 एमएम आईपीटीजी पर लॉन के रूप में टीका लगाया जा सकता है और 1 दिन27 के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने की अनुमति दी जा सकती है।
    नोट: कार्बेनिसिलिन (25 μg / एमएल) का उपयोग अक्सर आरएनएआई प्लेटों पर एम्पीसिलीन के बजाय किया जाता है। एम्पीसिलीन कम महंगा लेकिन कम स्थिर है; यदि एम्पीसिलीन का उपयोग करते हैं, तो प्लेटों को सूखने के बाद तुरंत वरीयता दी जानी चाहिए और जितनी जल्दी हो सके उपयोग किया जाना चाहिए (4 डिग्री सेल्सियस पर <1 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है)27। यहां अनुशंसित उच्च एंटीबायोटिक एकाग्रता पर्याप्त चयन सुनिश्चित करने में मदद करेगी।
  2. ग्रेविड हेर्मैफ्रोडाइट्स की बड़ी आबादी के साथ कई (आमतौर पर दो से चार) एनजीएम प्लेटों से शुरू करें। ब्लीच-एनएओएच सिंक्रनाइज़ेशन का उपयोग करके अंडे को अलग करें24.
    1. बाँझडीडीएच 2ओ प्रति प्लेट के 2 मिलीलीटर का उपयोग करके अगर प्लेटों से कीड़े धो लें। तरल को समान रूप से 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफुग ट्यूबों (प्रति प्लेट या हेर्मैफ्रोडाइट्स प्रति एक ट्यूब) में वितरित करें।
    2. वयस्कों को ट्यूबों के नीचे खींचने के लिए बेंचटॉप मिनीसेंट्रिफ्यूज (2,000 एक्स जी) में ~ 5 एस के लिए स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला बंद विंदुक और त्यागें।
    3. बाँझ डीडीएच2ओ के 1 मिलीलीटर के साथ धो लें; पहले की तरह नीचे स्पिन करें और सतह पर तैरनेवाला त्याग दें।
    4. शेष जीवाणु मलबे को कम करने के लिए पिछले चरण को दोहराएं।
    5. बाँझ डीडीएच2ओ के 1 एमएल में प्रत्येक ट्यूब की सामग्री को फिर से निलंबित करें प्रत्येक ट्यूब में वाणिज्यिक ब्लीच के 130 μL (8.25% सोडियम हाइपोक्लोराइट) और 5 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच, अंतिम एकाग्रता 0.5 एन) के 130 μL जोड़ें।
    6. वयस्क शरीर टूटने तक हर 2 मिनट में कम से कम 10-15 एस के लिए भंवर ट्यूब सख्ती से। अंडे को मारने से बचने के लिए ब्लीच-एनएओएच उपचार को 5 मिनट से अधिक समय तक न जाने दें।
    7. अंडे गोली के लिए 2,000 एक्स जी पर 30-60 एस के लिए एक मिनीसेंट्रिफ्यूज में स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला बंद विंदुक और त्यागें। एक दृश्यमान गोली हो सकती है या नहीं भी हो सकती है, यह सामान्य है।
    8. एम 9 वर्म बफर के 1 एमएल जोड़ें और 2000 एक्स जी पर 30-60 एस के लिए स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    9. ब्लीच-एनएओएच मिश्रण को अच्छी तरह से हटाने के लिए कुल्ला चरण (1.2.8) 5x दोहराएं, अंडे की गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    10. टोपी के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब या 30 एमएल संस्कृति ट्यूब में एम 9 कृमि बफर के 10 मिलीलीटर में अंडे स्थानांतरित करें। यदि शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग कर रहे हैं, तो ढक्कन को थोड़ा सा छोड़ दें और इसे सुरक्षित रखने के लिए थोड़ा टेप का उपयोग करें। लार्वा हैच करने के लिए अनुमति देने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर रात भर (16 घंटे) मिलाते हुए के साथ सेते हैं।
  3. वयस्कता तक बढ़ने के लिए आरएनएआई प्लेटों में सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा स्थानांतरित करें।
    1. प्रत्येक एल 1 ट्यूब में बाँझ एम 9 बफर + 0.01% ट्राइटन एक्स -100 (अब से एम 9 टीएक्स -01) के 2 एमएल जोड़ें और पूरी मात्रा (12 एमएल) को 15 एमएल स्क्रू-टॉप शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. लार्वा आंदोलन को धीमा करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एल 1 कीड़े के साथ 15 एमएल ट्यूब रखें।
    3. एक बड़े टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों को स्पिन करें (3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 एक्स जी ; त्वरण और मंदी अधिकतम के 80% से अधिक नहीं होनी चाहिए)।
    4. ध्यान से एल 1 गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. प्रत्येक ट्यूब में ठंडे एम 9 टीएक्स -01 के 12 मिलीलीटर जोड़ें। सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं। ध्यान से पिपेट बंद करें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। प्रत्येक ट्यूब में ~ 200 μL शेष होना चाहिए।
    6. कीड़े को प्लास्टिक से चिपकने से रोकने के लिए एम 9 टीएक्स -01 में 200 μL पिपेट टिप कुल्ला, फिर कृमि गोली को फिर से निलंबित करने के लिए इस टिप का उपयोग करें। जीवाणु लॉन पर तरल की बूंदों को पाइप करके पीओएस -1 प्लेटों को तैयार करने के लिए पुन: निलंबित कीड़े स्थानांतरित करें।
    7. वयस्कता के पहले दिन तक 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते हैं।
      नोट: यदि पीओएस -1 आरएनएआई प्लेटों पर कीड़े बढ़ रहे हैं, तो कीड़े को आरएनएआई बैक्टीरिया पर विज्ञापन लिबिटम खिलाना चाहिए जब तक कि वे भ्रूण-घातक फेनोटाइप के उच्च प्रवेश को सुनिश्चित करने के लिए वयस्कता में पूरी तरह से संक्रमण न कर लें। 24 और 48 घंटे में प्लेटों की जाँच करें। यदि प्लेटें भूखे या लगभग भूखे दिखाई देती हैं, तो कीड़े को पूर्ण आकार के वयस्कों में बढ़ने के लिए ताजा प्लेटों में ले जाने की आवश्यकता होगी। कीड़े उगाए जाने से पहले प्लेटों को कम करने से बचने के लिए, प्रत्येक 10 सेमी आरएनएआई प्लेट में 250-500 एल 1 लार्वा जोड़ने का लक्ष्य रखें।
  4. रोगाणु मुक्त कीड़े बनाने के लिए वयस्कों और स्पष्ट आंतों ई कोलाई फसल।
    1. प्रति प्लेट एम 9 टीएक्स -01 के 5 एमएल का उपयोग करके प्लेटों से वयस्क कीड़े कुल्ला। एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए बफर + कीड़े स्थानांतरण और वयस्कों ट्यूब के नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. ताजा एम 9 टीएक्स -01 बफर के 10 मिलीलीटर के परिवर्तनों में वयस्कों को कुल्ला जब तक कि कोई दृश्यमान जीवाणु मैलापन न हो (आमतौर पर 1-2 एक्स)। ट्यूबों को गोली कीड़े के लिए 30 एस के लिए 700 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है, या वयस्कों को गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने की अनुमति दी जा सकती है।
    3. बाहरी बैक्टीरिया को कम करने के लिए एम 9 टीएक्स -01 के 10 एमएल के साथ एक अतिरिक्त धोएं।
    4. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों या 30 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूबों में कीड़े स्थानांतरित करें जिसमें 5 एमएल एस मध्यम + 2 एक्स गर्मी से मारे गए ई कोलाई ओपी 50 (~ 5 एक्स 109 मारे गए कोशिकाओं / एमएल) + 200 μg / एमएल जेंटामाइसिन + 50 μg / एमएल क्लोरैम्फेनिकॉल शामिल हैं। यदि शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग कर रहे हैं, तो ढक्कन को थोड़ा सा छोड़ दें और इसे सुरक्षित रखने के लिए थोड़ा टेप का उपयोग करें। कीड़े को चिपकने से रोकने के लिए एम 9 टीएक्स -01 में ग्लास पिपेट या कुल्ला प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें।
    5. रोगाणु मुक्त वयस्कों का उत्पादन करने के लिए 24-48 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 25 डिग्री सेल्सियस पर वयस्कों सेते हैं।
      नोट: यदि कीड़े >24 घंटे के लिए एंटीबायोटिक दवाओं में रहना चाहते हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए अधिक गर्मी से मारे गए ओपी 50 को जोड़ना पड़ सकता है कि कीड़े के पास पर्याप्त खाद्य स्रोत है। 24 घंटे में ट्यूबों की जांच करें और गर्मी से मारे गए ओपी 50 के साथ पूरक करें यदि मैलापन स्पष्ट रूप से कम हो जाता है।
  5. बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण के लिए स्वच्छ, प्रजनन बाँझ, सिंक्रनाइज़ वयस्क-केवल स्टॉक प्राप्त करने के लिए वर्मबुक प्रोटोकॉल24 के अनुसार सुक्रोज वयस्कों को धोएं।
    1. सुनिश्चित करें कि 60% सुक्रोज, एम 9 वर्म बफर और एम 9 टीएक्स -01 की ठंडी मात्रा उपयोग के लिए तैयार है। सादगी के लिए, इन्हें रात से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ा जा सकता है।
    2. प्रत्येक नमूने को धोने के लिए, एम 9 टीएक्स -01 के 8 एमएल युक्त एक लेबल 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब बनाएं और बर्फ पर अलग सेट करें। चरण 1.5.10 में इनकी आवश्यकता होगी।
    3. एल 1 लार्वा युक्त प्रत्येक 50 एमएल ट्यूब में एम 9 टीएक्स -01 के 5 एमएल जोड़ें। एक खाली 15 एमएल स्क्रू-टॉप शंक्वाकार ट्यूब में पूरी मात्रा (अब 10 एमएल) स्थानांतरित करें और वयस्कों को ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें।
    4. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला से पिपेट और त्यागें।
    5. प्रत्येक ट्यूब में 10 एमएल एम 9 टीएक्स -01 जोड़ें और ट्यूबों को 5-10 मिनट के लिए बर्फ की बाल्टी में ले जाएं।
      नोट: इस बिंदु पर शुरू, कीड़े और सभी बफर बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक बड़े टेबलटॉप अपकेंद्रित्र ठंडा करने के लिए "तेज अस्थायी" सेटिंग का उपयोग करें।
    7. किसी भी शेष मलबे को कुल्ला करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 10 मिलीलीटर ठंडा एम 9 टीएक्स -01 जोड़ें। कीड़े को बर्फ पर बसने दें; सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें।
    8. सुक्रोज फ्लोट: प्रत्येक ट्यूब में 5 एमएल ठंडा एम 9 बफर और 5 एमएल ठंडा 60% सुक्रोज समाधान जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं। फिर, प्रत्येक ट्यूब में सुक्रोज-बफर मिश्रण के शीर्ष पर ठंडे एम 9 बफर के 1 एमएल को सावधानीपूर्वक फ्लोट करें। फ्लोट जोड़ने के बाद मिश्रण न करें।
      सावधानी: अगले कुछ चरणों के लिए जल्दी से आगे बढ़ें-कीड़े बहुत लंबे समय तक सुक्रोज की उच्च सांद्रता के संपर्क में आने पर सूख सकते हैं!
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। लाइव वयस्क कीड़े एम 9 और सुक्रोज के इंटरफ़ेस पर होंगे, ट्यूब के शीर्ष से लगभग 1 एमएल।
    10. ठंडे एम 9 टीएक्स -01 (चरण 1.5.2 से) के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तैयार करने के लिए कृमि परत को स्थानांतरित करने के लिए एक ग्लास 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। सुक्रोज की बहुत अधिक पाइपिंग के बिना जीवित कीड़े की परत प्राप्त करने के लिए बहुत सावधान रहें।
    11. यदि आवश्यक हो, तो 10-12 एमएल / ट्यूब के बराबर वॉल्यूम प्राप्त करने के लिए एम 9 टीएक्स -01 जोड़ें। 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र, फिर सतह पर तैरनेवाला बंद पिपेट। कीड़े को इस बिंदु पर कमरे के तापमान पर लौटाया जा सकता है।
    12. धोने के चरण 1.5.11 को दो बार दोहराएं, गति को 4 डिग्री सेल्सियस पर 700 एक्स जी और समय को 30 एस तक कम करें।

2. तरल संस्कृति में जीवित बैक्टीरिया पर कीड़े खिलाना

नोट: इस प्रोटोकॉल तरल संस्कृति (पूरक चित्रा 1) में अच्छी तरह से मिश्रित स्थितियों में प्रयोगशाला में विकसित बैक्टीरिया के साथ कीड़े उपनिवेश करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कीड़े को शुद्ध संस्कृति से अलग-अलग आइसोलेट्स (जैसे, एंटरोकोकस मल28,29) या आइसोलेट्स के मिश्रण (जैसे, न्यूनतम माइक्रोबायोमसमुदाय14) से अलग-अलग आइसोलेट्स के साथ उपनिवेशित किया जा सकता है।

  1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में प्रोटोकॉल चरण 1.5 से सुक्रोज धोया सिंक्रनाइज़ वयस्क कीड़े के साथ शुरू करो। एस बफर के 12 मिलीलीटर में एक बार कीड़े धो लें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  2. प्रयोग के लिए आवश्यक एस माध्यम की मात्रा में धोए गए कीड़े को फिर से निलंबित करें। प्रयोगात्मक स्थितियों की मात्रा पर विचार करें, उन स्थितियों की संख्या जिन पर कीड़े विभाजित होंगे, और कीड़े और बैक्टीरिया की अंतिम सांद्रता।
    नोट: कीड़े में खिलाना बैक्टीरिया की उपलब्धता30 के साथ भिन्न होता है और कीड़ेको भीड़ 31 द्वारा जोर दिया जा सकता है। तरल संस्कृति में उपनिवेशीकरण के लिए, <1000 कीड़े / एमएल और >107 सीएफयू / एमएल की सिफारिश की जाती है; एमएल को ई कोलाई32 पर "विज्ञापन लिबिटम" खिला घनत्व माना जाता है।
  3. जीवाणु संस्कृतियों को स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला डालो; आकांक्षा या पाइपिंग का उपयोग ढीले छर्रों का निर्माण करने वाले बैक्टीरिया के लिए सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए किया जा सकता है।
    नोट: संस्कृतियों >5 एमएल के लिए, 8-10 मिनट के लिए एक बड़े टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में ~ 2800 एक्स जी पर 15 एमएल ट्यूबों और स्पिन में स्थानांतरित करें। संस्कृतियों <5 एमएल को 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित किया जा सकता है और एक छोटे टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 1-2 मिनट के लिए 9000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज किया जा सकता है। अत्यधिक गतिशील बैक्टीरिया (उदाहरण के लिए, स्यूडोमोनास की कई प्रजातियां) को एक स्थिर गोली के गठन की सुविधा के लिए 10-15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करने की आवश्यकता हो सकती है, और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करना बेहतर हो सकता है।
  4. गोली के लिए फिर से एस बफर और अपकेंद्रित्र की एक मात्रा में जीवाणु संस्कृतियों को फिर से निलंबित करें। सतह पर तैरनेवाला को पहले की तरह निकालें और त्यागें।
  5. प्रयोग के लिए वांछित घनत्व पर एस माध्यम में जीवाणु संस्कृतियों को फिर से निलंबित करें, साथ ही चयन के लिए किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं। उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक्स, यदि कोई हो, उपनिवेशीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया के प्रतिरोध प्रोफ़ाइल पर निर्भर करेगा।
  6. एम 9 टीएक्स -01 में लेपित एक पिपेट टिप का उपयोग करना, पिपेट कीड़े धीरे-धीरे ऊपर और नीचे जब तक कीड़े एस माध्यम में अच्छी तरह से पुन: निलंबित नहीं होते हैं, फिर जीवाणु उपनिवेशण के लिए ट्यूबों या प्लेट कुओं में स्थानांतरित हो जाते हैं।
  7. वांछित जीवाणु एकाग्रता और अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रत्येक कृमि संस्कृति में जीवाणु निलंबन जोड़ें।
  8. यदि उपनिवेशीकरण के लिए एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर रहे हैं, तो प्लेट को बाँझ 96-अच्छी तरह से गैस-पारगम्य सीलिंग झिल्ली के साथ कवर करें।
  9. इनक्यूबेशन के दौरान बैक्टीरिया को बसने से रोकने के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए सेते हैं।

3. 96-अच्छी तरह से प्रारूप में व्यक्तिगत कीड़े का यांत्रिक व्यवधान

नोट: यह खंड व्यक्तिगत जीवाणु उपनिवेशित सी एलिगेंस के यांत्रिक व्यवधान के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल (3.1-3.8) में पहला कदम कृमि आंत से गैर-पालन वाले बैक्टीरिया को शुद्ध करने और ठंडे पक्षाघात और सतह-विरंजन का उपयोग करके कीड़े के बाहरी हिस्से की सफाई के लिए एक विधि का वर्णन करता है। ये कदम स्वच्छ, जीवित वयस्क कीड़े का उत्पादन करेंगे जिन्हें यांत्रिक रूप से जीवाणु सामग्री (3.8-अंत) की मात्रा का ठहराव के लिए बाधित किया जा सकता है या आगे के प्रयोगों (पूरक चित्रा 1) के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल तरल संस्कृति (धारा 2), अगर प्लेटों पर, या प्राकृतिक या सूक्ष्म जगत मिट्टी से उपनिवेश कीड़े में बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. ठंडा करने के लिए बर्फ पर एम 9 टीएक्स -01 का एक विभाज्य रखें (एमएल में नमूनों की संख्या 4-5x)।
  2. एम 9 टीएक्स -01 + ब्लीच (6% सोडियम हाइपोक्लोराइट, 1: 1000 या 1: 2000 वी / वी, 1 एमएल प्रति नमूना + 1 एमएल अतिरिक्त) का एक विभाज्य तैयार करें और ठंडा करने के लिए बर्फ पर रखें। इस विभाज्य चरण 3.8 में इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. बाधित कृमि नमूनों के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करें।
    1. ढक्कन के साथ बाँझ 300 μL क्षमता 96 अच्छी तरह से प्लेटें प्राप्त करें; इस प्रोटोकॉल 12 कीड़े पचा प्रति एक कमजोर पड़ने प्लेट का उपयोग करता है।
    2. 1x पीबीएस बफर के 180 μL के साथ प्रत्येक 96 अच्छी तरह से प्लेट (300 μL क्षमता) की पंक्तियों बी-डी को भरने के लिए 96-अच्छी तरह से मल्टीचैनल पिपेटर का उपयोग करें। शीर्ष पंक्ति को खाली छोड़ दें। पंक्तियाँ बी-डी कृमि डाइजेस्ट [0.1x, 0.01x, 0.01x] के 10x सीरियल कमजोर पड़ने बन जाएंगी।
    3. प्लेटों को एक तरफ रख दें। कमजोर पड़ने प्लेटों चरण 3.13 में इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एम 9 टीएक्स -01 के 1 एमएल में प्रत्येक कृमि के नमूने को फिर से निलंबित करें।
  5. गोली वयस्कों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर कम गति मिनीसेंट्रिफ्यूज (2,000 एक्स जी) में संक्षेप में (2-3 एस) स्पिन ट्यूब। सतह पर तैरनेवाला से विंदुक और त्यागें, कीड़ा गोली परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है।
  6. चरण 3.5 में सेंट्रीफ्यूजेशन सेटिंग्स का उपयोग करके, बाहरी बैक्टीरिया को कम करने के लिए एम 9 टीएक्स -01 के 1 एमएल के साथ दो बार कीड़े कुल्ला, फिर एक बार एम 9 वर्म बफर के 1 एमएल के साथ।
  7. कृमि आंत से गैर-पालन बैक्टीरिया को शुद्ध करें।
    1. एक संस्कृति ट्यूब में एस मध्यम + 2 एक्स गर्मी से मारे गए ओपी 50 के 1 एमएल में कीड़े के प्रत्येक नमूने को फिर से निलंबित करें।
    2. आंत से किसी भी गैर-पालन बैक्टीरिया के पारित होने की अनुमति देने के लिए 20-30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: यह लुमेन से किसी भी बाह्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन को भी शुद्ध करेगा और आंतों के उपकला का पालन करने वाले लेबल वाले बैक्टीरिया के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देगा, खासकर जब एसिड-फास्ट फ्लोरोफोरस (जैसे, एमचेरी, डीएसरेड) का उपयोग किया जाता है।
  8. बाहरी बैक्टीरिया को साफ करने के लिए सतह ब्लीच कीड़े।
    1. ठंडे एम 9 टीएक्स -01 के 1 एमएल के साथ दो बार शुद्ध कीड़े कुल्ला और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    2. ट्यूबों को बर्फ (पसंदीदा) या 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ठंडा करने की अनुमति दें। यह कीड़े को पंगु बना देगा और ब्लीच के अंतर्ग्रहण को रोक देगा।
      नोट: अन्य प्रोटोकॉल एक रासायनिक पक्षाघात एजेंट जैसे लेवामिसोल का उपयोग करते हैं; यह एक स्थापित दृष्टिकोणहै जिसके लिए एक खतरनाक अपशिष्ट धारा को जोड़ने की आवश्यकता होती है।
    3. प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा एम 9 कृमि बफर + अनसुगंधित ब्लीच (8.25% सोडियम हाइड्रॉक्साइड, 1: 1000 या 1: 2000 वी / ट्यूबों को बाहरी बैक्टीरिया को मारने के लिए कम से कम 10 मिनट के लिए बर्फ (पसंदीदा) या 4 डिग्री सेल्सियस पर बैठने की अनुमति दें।
      नोट: ब्लीच की 1: 1000 एकाग्रता से अधिक न करें। लकवाग्रस्त कीड़े में भी, मृत्यु दर का परिणाम हो सकता है।
    4. ब्लीच बफर बंद पिपेट और त्यागें; यह सुनिश्चित करने के लिए बर्फ पर ट्यूब लौटाएं कि ब्लीच साफ होने तक कीड़े पंपिंग को फिर से शुरू न करें।
    5. प्रत्येक ट्यूब में ठंडे एम 9 टीएक्स -01 के 1 एमएल जोड़ें। एक मिनीसेंट्रिफ्यूज (25 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 एक्स जी ) में ~ 5 एस के लिए स्पिन; बर्फ के लिए ट्यूबों को वापस करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें।
    6. ठंडे एम 9 टीएक्स -01 के एक और 1 मिलीलीटर के साथ इस कुल्ला चरण को दोहराएं, जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      नोट: आगे प्रयोगों के लिए कीड़े का उपयोग कर रहे हैं, तो पारगम्यता कदम (प्रोटोकॉल 3.9) छोड़ दें और इसके बजाय एक 6 सेमी पेट्री डिश में बर्फ-ठंड बफर करने के लिए ताजा सतह प्रक्षालित वयस्कों हस्तांतरण और प्रोटोकॉल 3.10 में के रूप में प्रयोगात्मक स्थितियों में कीड़े अलग। गतिशीलता को फिर से शुरू करने से रोकने के लिए कीड़े को ठंडा रखें लेकिन जल्दी से काम करें - बर्फ पर >30 मिनट के लिए कीड़े रखने से संभावित रूप से सामान्य गतिविधि34 की <100% बहाली हो सकती है।
  9. सोडियम डोडेसिल सल्फेट और डाइथियोथ्रिटोल (0.25% एसडीएस + 300 एमएम डीटीटी) के साथ कृमि छल्ली का रासायनिक पारगम्यता (35 के आधार पर)
    सावधानी: डीटीटी एक कम करने वाला एजेंट और अड़चन है। पीपीई पहनें और सूखे स्टॉक या समाधान को संभालते समय धूआं हुड में काम करें। एक खतरनाक अपशिष्ट प्रवाह की आवश्यकता होती है।
    1. धूआं हुड में, प्रत्येक नमूने के लिए 100 μL की अनुमति देने के लिए पर्याप्त एसडीएस / 1 एमएल के लिए, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एम 9 वर्म बफर या एम 9 टीएक्स -01 के 965 μL के लिए, 5% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस के 5 μL और 1 एम डीटीटी के 30 μL जोड़ें।
      नोट: 1 एम डीटीटी समाधान (जलीय) ताजा तैयार किया जाना चाहिए या शक्ति सुनिश्चित करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य में संग्रहीत किया जाना चाहिए। अत्यधिक फ्रीज-पिघलना साइकिल चालन से बचने के लिए दो से तीन प्रयोगों में उपयोग करने के लिए विभाज्य का आकार दिया जाना चाहिए।
    2. सतह-प्रक्षालित कीड़े युक्त माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को कमरे के तापमान ट्यूब रैक में ले जाएं। प्रत्येक ट्यूब बफर के ~ 20 μL में कीड़े होना चाहिए।
    3. प्रत्येक कृमि नमूने के लिए एसडीएस/डीटीटी समाधान के 100 μL जोड़ें। उपयुक्त खतरनाक अपशिष्ट प्रवाह में किसी भी शेष एसडीएस / डीटीटी समाधान का निपटान करें।
    4. वयस्क कीड़े के प्रतिरोधी छल्ली को आंशिक रूप से तोड़ने के लिए बेंच पर 8 मिनट तक उपचार को आगे बढ़ने की अनुमति दें। कीड़े मर जाएंगे और इस समय के दौरान ट्यूब के नीचे बस जाएंगे।
    5. पारगम्यता का समय समाप्त होने के बाद, एसडीएस / डीटीटी सतह पर तैरनेवाला से सावधानीपूर्वक पिपेट करें और इसे उपयुक्त एसडीएस / डीटीटी खतरनाक अपशिष्ट धारा में निपटाएं।
    6. प्रत्येक ट्यूब में एम 9 टीएक्स -01 के 1 एमएल जोड़ें। कीड़े गोली मारने के लिए एक टेबल-टॉप अपकेंद्रित्र में संक्षेप में स्पिन करें या कीड़े को ट्यूबों के नीचे गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने की अनुमति दें, फिर सतह पर तैरनेवाला खींचें और एसडीएस /
    7. उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 1 एमएल एम 9 वर्म बफर + 0.1% ट्राइटन एक्स -100 में कीड़े को फिर से निलंबित करें।
  10. यांत्रिक व्यवधान के लिए सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट के साथ एक गहरी 96-अच्छी तरह से प्लेट में कीड़े को अलग करें। नीचे के रूप में 96 अच्छी तरह से व्यवधान प्लेट तैयार करें।
    1. एक बाँझ 2 एमएल गहरी अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से प्लेट और एक मिलान सिलिकॉन 96-अच्छी तरह से प्लेट कवर प्राप्त करें।
      नोट: ऊतक विघटनकर्ता के लिए 96-अच्छी तरह से एडाप्टर के साथ संगत प्लेटों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। बाहरी आयामों में छोटे अंतर एक प्लेट के बीच अंतर बनाते हैं जिसे एडाप्टर से हटाया जा सकता है और जो नहीं कर सकता है।
    2. एक बाँझ स्कूप स्पैटुला का उपयोग करके, प्लेट के प्रत्येक कुएं में बाँझ 36-ग्रिट सिलिकॉन कार्बाइड की एक छोटी मात्रा जोड़ें जो एक कीड़ा प्राप्त करेगा। कुएं के नीचे मुश्किल से कवर करने के लिए पर्याप्त धैर्य का उपयोग करें (लगभग 0.2 ग्राम प्रति अच्छी तरह से)। अत्यधिक सामग्री सामग्री को पुनः प्राप्त करते समय कुएं के नीचे एक पिपेट टिप प्राप्त करना मुश्किल बना देगी।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एम 9 कृमि बफर के 180 μL जोड़ें।
    4. कॉलम या पंक्तियों को यह इंगित करने के लिए लेबल करें कि प्रत्येक नमूना कहां जाएगा, फिर प्लेट को सिलिकॉन 96-अच्छी तरह से प्लेट कवर के साथ शिथिल रूप से कवर करें।
  11. व्यवधान के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट में व्यक्तिगत कीड़े स्थानांतरित करें।
    1. ~ 1 सेमी की गहराई तक पकवान को भरने के लिए पर्याप्त एम 9 टीएक्स -01 युक्त एक छोटे (35 या 60 मिमी) पेट्री डिश में ध्यान से पारगम्य कीड़े ले जाएं।
      नोट: यदि बड़ी संख्या में कीड़े मौजूद हैं, तो पूरे नमूने को स्थानांतरित करना संभव नहीं हो सकता है क्योंकि तरल भीड़ हो जाएगा और व्यक्तिगत कीड़े को पिपेट करना मुश्किल होगा।
    2. एक विदारक माइक्रोस्कोप या अन्य कम आवर्धन डिवाइस का उपयोग करके, 20 μL वॉल्यूम में व्यक्तिगत कीड़े से पिपेट, और इन कीड़े को 96-अच्छी तरह से प्लेट के अलग-अलग कुओं में स्थानांतरित करें।
      नोट: केवल ताजा मारे गए कीड़े की कटाई करना सबसे अच्छा है। कठोर रैखिक आकार वाले कीड़े से बचें, क्योंकि ये कीड़े कुछ समय के लिए मर चुके होंगे। सामान्य सकल शरीर विज्ञान और एक बरकरार आंत के साथ घुमावदार या एस-आकार के कीड़े लेने की कोशिश करें।
    3. प्रत्येक वॉल्यूम को स्थानांतरित करने के बाद, सुनिश्चित करें कि चयनित कीड़ा वास्तव में कुएं में बाहर निकाला गया था। ऐसा करने के लिए, पेट्री डिश के एक स्पष्ट क्षेत्र से एम 9 टीएक्स -01 के 20 μL तक पिपेट करें और डिश में पूरी मात्रा वापस जारी करें; यह आम तौर पर कीड़ा बाहर निकाल देगा अगर यह विंदुक से चिपक गया है। यदि कृमि अटक गया था, तो कुएं से 20 μL निकालें और स्थानांतरण को फिर से आज़माएं।
    4. एक बार जब सभी कीड़े स्थानांतरित हो जाते हैं, तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लचीली पेपर-समर्थित सीलिंग फिल्म (2 x 2 वर्ग) की एक शीट के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट को कवर करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सीलिंग फिल्म का पेपर-समर्थित पक्ष नमूना कुओं पर नीचे का सामना कर रहा है। सावधान रहें कि सीलिंग फिल्म को बहुत पतला न खींचें, अन्यथा बाद में इसे हटाना बहुत मुश्किल होगा।
    5. लचीली सीलिंग फिल्म के शीर्ष पर हल्के ढंग से सिलिकॉन सीलिंग चटाई रखें; इस समय कवर को कुओं में न दबाएं।
    6. 30-60 मिनट के लिए ठंडा करने के लिए प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाएं। यह व्यवधान के दौरान ओवर-हीटिंग को रोक देगा, जो नमूनों को नुकसान पहुंचा सकता है।
      नोट: यह प्रोटोकॉल में एक विराम बिंदु है। ज्यादातर मामलों में, प्लेट को पीसने से पहले 4 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ा जा सकता है। कीड़े को रात भर न छोड़ें, क्योंकि इससे बैक्टीरिया की गिनती बदल जाएगी।
  12. कृमि ऊतकों को तोड़ने और आंतों के बैक्टीरिया को छोड़ने के लिए एक ऊतक विघटनकारी पर 96-अच्छी तरह से प्लेटें लोड करें।
    नोट: (वैकल्पिक) यदि डाइजेस्ट के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेटों की एक विषम संख्या का उपयोग करते हैं, तो आगे बढ़ने से पहले एक काउंटरवेट तैयार करना आवश्यक है। एक खाली गहरी 96-अच्छी प्लेट का उपयोग करें और कुओं को पानी से भरें जब तक कि इसका वजन पहली प्लेट के समान न हो।
    1. सिलिकॉन सीलिंग चटाई को सील बनाने के लिए कुओं में दृढ़ता से दबाएं, सुनिश्चित करें कि ढक्कन प्लेट की पूरी सतह पर सपाट है।
      नोट: यदि लचीली सीलिंग फिल्म खींचने के बाद बहुत मोटी है, तो सिलिकॉन ढक्कन को सुरक्षित करना मुश्किल होगा जैसे कि यह सभी कुओं में फ्लैट झूठ बोल रहा है। इसके परिणामस्वरूप झटकों के दौरान अपर्याप्त सील और अच्छी तरह से संदूषण होगा।
    2. 96-अच्छी तरह से प्लेट एडाप्टर का उपयोग करके ऊतक विघटनकारी में सुरक्षित प्लेटें। 30 हर्ट्ज पर 1 मिनट के लिए प्लेटों को हिलाएं, फिर प्लेटों को 180 ° घुमाएं और 1 मिनट के लिए फिर से हिलाएं। यह प्लेट के सभी कुओं में व्यवधान सुनिश्चित करने में मदद करेगा।
    3. लचीली सीलिंग फिल्म से किसी भी धैर्य को हटाने के लिए बेंच पर दो या तीन बार प्लेटों को दृढ़ता से टैप करें।
    4. दो 96-अच्छी तरह से प्लेट एडाप्टर के साथ एक बड़े अपकेंद्रित्र का उपयोग करके, कुओं के नीचे सभी सामग्री इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए 2400 x g पर प्लेटों को स्पिन करें।
    5. सिलिकॉन ढक्कन निकालें और ध्यान से लचीला सीलिंग फिल्म खींचें।
      नोट: यदि लचीली सीलिंग फिल्म किसी भी कुएं में चिपक जाती है, तो इसे हटाने के लिए 200 μL विंदुक टिप का उपयोग करें। यह आम है जब लचीली सीलिंग फिल्म बहुत पतली फैली हुई थी।
  13. क्रमिक रूप से 96-अच्छी तरह से प्लेटों में 300 μL में कृमि पाचन नमूने पतला।
    1. 200 μL के लिए सेट एक बहु अच्छी तरह से पिपेटर का उपयोग करते हुए, पिपेट कई बार धीरे-धीरे और सावधानी से कुओं की सामग्री को फिर से मिश्रण करने के लिए, फिर जितना संभव हो उतना तरल खींचें। चरण 3.3 में तैयार 96-अच्छी तरह से प्लेटों की शीर्ष पंक्तियों में इस तरल को स्थानांतरित करें।
    2. 20 μL करने के लिए सेट एक 96 अच्छी तरह से पिपेटर का उपयोग कर, शीर्ष पंक्ति से तरल की इस मात्रा को हटाने और पंक्ति बी पिपेट ऊपर और नीचे 8-10x मिश्रण करने के लिए वितरण। युक्तियों को त्यागें।
    3. पंक्ति सी में 0.01x कमजोर पड़ने के नमूने बनाने के लिए पंक्ति बी में 0.1x नमूने से शुरू, चरण 3.13.2 दोहराएँ।
    4. पंक्ति C से पंक्ति D तक जाते हुए, चरण 3.13.2 को फिर से दोहराएँ।
    5. बैक्टीरिया मात्रा का ठहराव के लिए ठोस अगर पर प्लेट। मोनो-उपनिवेशित कीड़े के लिए, यह आम तौर पर अगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने [1x-0.001x] की 10-20 μL बूंदों को प्लेट करने के लिए पर्याप्त है। बहु-प्रजातियों के उपनिवेशीकरण के लिए, 10 सेमी अगर प्लेट पर 100 μL पाइपिंग करके प्रत्येक कमजोर पड़ने को अलग से प्लेट करें; ग्लास चढ़ाना मोती का उपयोग करके तुरंत फैलाएं।

4. फिर से उपयोग के लिए सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट की सफाई

नोट: इस प्रक्रिया का उपयोग प्रयोगों के बाद पुन: उपयोग के लिए पीसने वाली सामग्री, सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट को साफ और निष्फल करने के लिए किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को पहले उपयोग से पहले अपनी संपूर्णता में पालन किया जाना चाहिए, क्योंकि सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट एक औद्योगिक उत्पाद है और पूर्व-निष्फल नहीं आता है। सीसी) एक घनी, खुरदरी धार वाली सामग्री है जो कठिन नमूनों को बाधित करने के लिए कुशलतापूर्वक काम करती है। हालांकि, कण बार-बार उपयोग पर पहन सकते हैं और पहनने के स्पष्ट होने पर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। सौभाग्य से, सामग्री सस्ती है, और आमतौर पर बेचे जाने वाले आकार (~ 1 पाउंड) कई प्रयोगों के लिए पर्याप्त हैं।

  1. चढ़ाना के लिए नमूने हटाने के बाद, 96 अच्छी तरह से प्लेट के सभी कुओं के लिए 10% ब्लीच समाधान जोड़ें और कम से कम 10 मिनट के लिए बैठने दें।
  2. एक छोटे से उच्च पक्षीय ट्रे या खाली P1000 विंदुक टिप कंटेनर पर तेजी से उलटा सभी सामग्री को पकड़ने के लिए काफी बड़ा 96 अच्छी तरह से थाली पलटकर धैर्य के थोक निकालें। ग्रिट ट्रे के नीचे तुरंत डूब जाएगा। ब्लीच घोल को सिंक में डालें।
  3. नल के पानी के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट को फिर से भरें और शेष धैर्य को कुल्ला करने के लिए उसी ट्रे में पलटें। पानी को सिंक में डालें।
  4. नल के पानी के साथ एक से तीन बार दोहराएं जब तक कि प्लेट धैर्य से पूरी तरह से स्पष्ट न हो जाए।
  5. हर बार ट्रे भरने, नल के पानी में ग्रिट 2x कुल्ला।
    नोट: 96-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से प्लेट को प्रयोगशाला डिशवॉशर में धोया जा सकता है, पन्नी के साथ सुरक्षित रूप से कवर किया जा सकता है, और अन्य पुन: प्रयोज्य प्लास्टिक के साथ आटोक्लेव किया जा सकता है। ग्रिट को तुरंत धोने की आवश्यकता नहीं है और इस बिंदु पर अलग रखा जा सकता है। प्रयुक्त धैर्य आमतौर पर धोने और आटोक्लेविंग से पहले कई प्रयोगों से जमा होता है।
  6. 30 मिनट के लिए प्रयोगशाला डिटर्जेंट के समाधान में धैर्य धो लें, कभी-कभी धातु स्पैटुला के साथ घूमने या मिश्रण करके आंदोलन करें।
  7. नल के पानी के कई (8-10) परिवर्तनों में डिटर्जेंट के सभी निशान को कुल्लाएं, फिर आसुत जल के साथ 2x कुल्लाएं।
  8. एक खुली ट्रे में धैर्य फैलाएं, जैसे कि उथले पॉलीप्रोपाइलीन आटोक्लेव ट्रे, और कई घंटों के लिए 40-70 डिग्री सेल्सियस पर सूखा।
    नोट: यदि शुष्क होने पर ग्रिट क्लंपी होता है, तो इसे पर्याप्त रूप से साफ या कुल्ला नहीं किया गया था। चरण 4.6 से शुरू होने वाले सफाई प्रोटोकॉल को दोहराएं, चरण 4.7 में अतिरिक्त कुल्ला जोड़ें।
  9. स्क्रू-टॉप ऑटोक्लेवेबल ग्लास की बोतलों में 5-6 सेमी की अधिकतम गहराई तक साफ, शुष्क धैर्य वितरित करें। निष्फल करने के लिए 30 मिनट के लिए पूर्व वैक्यूम चक्र पर आटोक्लेव।

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Representative Results

जीवित कीड़े की ब्लीच नसबंदी
सतह-प्रक्षालित कीड़े प्रभावी रूप से बाहरी बैक्टीरिया से मुक्त होते हैं जब तक कि गतिशीलता वापस नहीं आती है और उत्सर्जन फिर से शुरू नहीं होता है। यहां उपयोग की जाने वाली स्थितियों के तहत, बफर में बैक्टीरिया का तेजी से विलुप्त होना मनाया जाता है (चित्रा 1 ए-सी, पूरक चित्रा 2, वीडियो 1) ठंडे लकवाग्रस्त कीड़े (चित्रा 1 डी-एफ, वीडियो 2) में आंत से जुड़े बैक्टीरिया को परेशान किए बिना। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि सतह विरंजन का उपयोग आंतों की सामग्री से समझौता किए बिना बाहरी रूप से कीड़े को साफ करने के लिए प्रभावी ढंग से किया जा सकता है (सतह-प्रक्षालित बनाम नो-ब्लीच कृमि से जुड़े सीएफयू गिनती की तुलना गैर-महत्वपूर्ण है, विलकॉक्सन रैंक-योग परीक्षण पी > 0.05)।

बहु-नमूना यांत्रिक व्यवधान पर विविधताएं
कीड़े के यांत्रिक विघटन के लिए 96-अच्छी तरह से तकनीक उपयोग की जाने वाली विशिष्ट सामग्रियों के लिए मजबूत है, और व्यावहारिक विचार पीसने वाली सामग्री की पसंद को निर्धारित करते हैं। पिछली रिपोर्ट33 के समान, मैनुअल व्यवधान (चित्रा 2 ए) के परिणामस्वरूप सभी बफर स्थितियों में मानक 96-अच्छी तरह से प्रोटोकॉल (सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट, चित्रा 2 बी) (वर (लॉग10सीएफयू) = 0.499) की तुलना में अधिक विषमता हुई, जबकि सी-कार्बाइड के लिए 0.229, बड़े ग्लास मोतियों के लिए 0.243 (चित्रा 2 सी), और छोटे ग्लास मोती के लिए 0.227 ). फिर भी, सीएफयू / कृमि वितरण में अधिकांश अंतर महत्वपूर्ण नहीं थे (क्रुस्कल-वालेस, पी = 0.017 डीएफ = 3 के साथ; बड़े मोतियों बनाम छोटे मोतियों के लिए महत्वपूर्ण पोस्ट-हॉक विलकॉक्सन परीक्षण, पी = 0.021, और बड़े मोती बनाम सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट, पी = 0.02)। एक सर्फैक्टेंट के रूप में ट्राइटन एक्स -100 का उपयोग उपज में किसी भी महत्वपूर्ण अंतर से जुड़ा नहीं था जब एक व्यक्तिगत कारक (क्रुस्कल-वालेस, पी = 0.94, डीएफ = 3) के रूप में माना जाता है, हालांकि नो-ट्राइटन बनाम ट्राइटन युक्त नमूनों में उपज में स्पष्ट वृद्धि होती है जब बड़े मोती (2.7 मिमी) का उपयोग किया जाता था (चित्रा 2 सी), संभवतः इन कुओं में देखे गए अत्यधिक "फोमिंग" के लिए जिम्मेदार था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि बड़े ग्लास मोती, जबकि होमोजेनाइजेशन ट्यूब33 में उपयोग के लिए आदर्श हैं, 96-अच्छी तरह से तकनीक के लिए उपयुक्त नहीं हैं। जबकि छोटे ग्लास मोती उचित परिणाम (चित्रा 2 डी) का उत्पादन किया, वे लगातार मिश्रण और चढ़ाना के दौरान 200 μL विंदुक युक्तियों भरा हुआ। इस परख में मानक सामग्री, सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट, सस्ती है, मानक युक्तियों को बंद करने के लिए बहुत बड़ी है, और कांच के मोतियों की तरह ऑटोक्लेविंग के बाद धोया और पुन: उपयोग किया जा सकता है। ग्रिट बफर में "धूल" की एक छोटी मात्रा जारी करता है, जो चढ़ाना में हस्तक्षेप नहीं करता है, लेकिन प्रवाह साइटोमेट्री के लिए व्यवधान के उत्पादों का उपयोग करने पर फ़िल्टर करने की आवश्यकता होती है।

वयस्क कीड़े में जीवाणु उपनिवेशण में विषमता
व्यक्तिगत कीड़े के सफल विघटन से जीवाणु उपनिवेशीकरण में विषमता का पता चलता है। कीड़े की आइसोजेनिक सिंक्रनाइज़ आबादी के व्यक्ति, बैक्टीरिया के एक ही पूल पर एक ही समय में उपनिवेशित, आंतों के जीवाणु भार में लगातार 100 गुना या उससे अधिक रेंज दिखाते हैं। यह विभिन्न जीवाणु उपनिवेशवादियों (चित्रा 3 ए) के लिए और बहु-प्रजाति बैक्टीरिया समुदायों (चित्रा 3 बी) पर उपनिवेशीकरण के दौरान मनाया जाता है। यह विषमता प्रतिदीप्ति के व्यक्तिगत-कृमि माप में भी स्पष्ट है जब कीड़े फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) (चित्रा 3 सी-डी) व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया के साथ उपनिवेशित होते हैं। मेजबान के गुण इस विषमता को आकार देने में एक भूमिका निभाते हैं, जैसा कि जंगली प्रकार के उपनिवेशीकरण की तुलना करके देखा जा सकता है ब्रिस्टल एन 2 कीड़े डीएएफ -2 / आईजीएफ म्यूटेंट में एक ही बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशीकरण के लिए; यह डीएएफ -16 उत्परिवर्ती एन 2 की तुलना में कई बैक्टीरिया की बड़ी आबादी का समर्थन करता है, जबकि डीएएफ -2 बैक्टीरिया36 (चित्रा 3 बी, डी) की एक श्रृंखला द्वारा उपनिवेशीकरण के लिए प्रतिरोधी है। यह विषमता विशेषता है, मेजबान और उपनिवेशवादी (ओं) के विभिन्न संयोजनों में भिन्नता दिखारही है, जबकि एक ही प्रयोग (चित्रा 3 ई-एफ) के विभिन्न रनों पर एक सुसंगत संरचना को बनाए रखती है।

समूहों की सटीक तुलना के लिए व्यक्तिगत विषमता का महत्व
व्यक्तिगत विषमता के महत्व को आसानी से देखा जा सकता है कि बैच डाइजेस्ट डेटा के वितरण को कैसे बदल सकता है। देशी माइक्रोबायोम बैक्टीरिया एमवाईबी 53 (रोडोकोकस एरिथ्रोपोलिस) और एमवाईबी 120 (क्रिसोबैक्टीरिया एसपीपी) द्वारा उपनिवेशीकरण। एन 2 वयस्कों में (चित्रा 3 ए, 4 ए) उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है। व्यक्तिगत कृमि डेटा वितरण में स्पष्ट रूप से समान हैं (दो-पूंछ वाले टी-टेस्ट, पी = 0.9, विलकॉक्सन रैंक योग, पी = 0.59)। बैच डाइजेस्ट के प्रभावों का अनुकरण करने के लिए इन डेटा को पुन: नमूना देते समय, बैच एक्सट्रपलेशन सीएफयू / कीड़ा इन वितरणों में सकारात्मक तिरछा (माध्यिका >) के कारण डेटा के ऊपरी क्वांटाइल की ओर खींचता है। जैसा कि बैचिंग प्रभावी रूप से एक बैच के भीतर व्यक्तियों पर औसत होता है, बैच-एक्सट्रपोलेटेड सीएफयू / कीड़ा व्यक्तिगत डेटा के अंकगणितीय माध्य के आसपास केंद्रित होगा, इस माध्य की घटती दूरी के साथ क्योंकि बैच केंद्रीय सीमा प्रमेय (चित्रा 4 बी-डी) के अनुसार बड़े हो जाते हैं। तदनुसार, जैविक भिन्नता से संकेत जल्दी से खो जाता है; कृमि माप औसत की ओर अभिसरण करते हैं, जो इन लॉग-स्केल-वितरित डेटा का प्रतिनिधि मीट्रिक नहीं है। एमवाईबी 53 बनाम एमवाईबी 120 द्वारा अनुमानित उपनिवेशीकरण में अंतर जल्दी से नकली बैच डाइजेस्ट (टी-टेस्ट बैच 5, पी = 0.049; बैच 10, पी = 2.27 ई -4; बैच 20, पी = 1.19 ई -15) में महत्वपूर्ण हो जाता है; विलकॉक्सन रैंक योग परीक्षण बैच 5, पी = 2.27 ई -4; बैच 10, पी = 2.70 ई-06; बैच 20, पी = 1.80 ई -09) के रूप में मूल संकेत अस्पष्ट है।

माइक्रोबियल संचरण पर व्यक्तिगत विषमता के प्रभाव
चूंकि व्यक्तिगत कीड़े जीवाणु उपनिवेशण में पर्याप्त विषमता दिखाते हैं, इसलिए यह पूछना उचित है कि क्या इस विषमता का डाउनस्ट्रीम प्रभाव है। उदाहरण के लिए, यह उम्मीद करना उचित है कि संचरण आंतों के जीवाणु भार का एक कार्य हो सकता है। व्यक्तिगत सतह-प्रक्षालित कीड़े को स्वच्छ वातावरण में स्थानांतरित करके, उत्सर्जित जीवित बैक्टीरिया के साथ पर्यावरण के टीकाकरण का निरीक्षण करना संभव है। इन प्रयोगों में, सतह-प्रक्षालित पूर्व-उपनिवेशित वयस्कों, आम तौर पर पर्याप्त आबादी (103-10 5 सीएफयू / कीड़ा, चित्रा 5) ले जाने वाले कमेंसल ओक्रोबैक्ट्रम एमवाईबी 14-जीएफपी या रोगजनक एस ऑरियस-जीएफपी, को 1.5 घंटे के लिए एनजीएम अगर पर गर्मी से मारे गए ओपी 50 लॉन पर घूमने की अनुमति दी गई थी। जब इन कीड़ों को उत्सर्जन प्लेटों से फिर से काटा जाता है और जीवाणु परिमाणीकरण के लिए बाधित किया जाता है, तो जीवाणु भार और जीवित बैक्टीरिया के उत्सर्जन दर के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध नहीं होता है (लॉग-रूपांतरित कॉलोनियों / घंटा और सीएफयू / कीड़े के बीच पियर्सन सहसंबंध: एमवाईबी 14 आरएचओ = 0.19, पी = 0.45; एस ऑरियस आरएचओ = 0.02, पी = 0.9) (चित्रा 5)। न ही प्लेट पर कॉलोनियों की उपस्थिति /अनुपस्थिति और आंतों के जीवाणु भार (कारक के रूप में लॉग-परिवर्तित सीएफयू / कीड़े के साथ द्विपद लॉजिस्टिक प्रतिगमन: पी = 0.15 डीएफ = 53 के साथ) के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध है। प्लेटों का एक बड़ा अंश नई वृद्धि से मुक्त रहा (एमवाईबी 14 के लिए 9/18 प्लेटें, एस ऑरियस के लिए 10/36 प्लेटें), कम समग्र उत्सर्जन दर का संकेत देता है।

जब कीड़े को अगर प्लेटों पर उत्सर्जित करने की अनुमति दी जाती है, तो प्रति कीड़ा जीवित उत्सर्जित बैक्टीरिया की वास्तविक संख्या "खेती" से चकित हो जाती है, जहां कीड़े कॉलोनियों से गुजरते हैं और नई वृद्धि (चित्रा 6) 37 के निशान बनाते हैं। एन कॉलोनियों के साथ एक प्लेट कम से कम एक का प्रतिनिधित्व करती है, और अधिक से अधिक एन, ऐसी घटनाएं जहां लाइव कॉलोनी बनाने वाले बैक्टीरिया उत्सर्जित होते थे। इस अवलोकन से, यह जानना संभव नहीं है कि (1,एन) में वास्तव में कितनी उत्सर्जन घटनाएं हुईं, न ही यह जानना संभव है कि प्रत्येक घटना में कितने बैक्टीरिया उत्सर्जित हुए थे। इसलिए इन आंकड़ों का उपयोग करके आंत से जीवित बैक्टीरिया की उत्सर्जन दर का सटीक अनुमान लगाना संभव नहीं है। हालाँकि, कुछ सीमाओं का अनुमान लगाना संभव है। यद्यपि प्रति प्लेट कॉलोनियों की संख्या बहुत जानकारीपूर्ण नहीं है, उपस्थिति /अनुपस्थिति डेटा का उपयोग उत्सर्जन दरों के मोटे अनुमान के लिए किया जा सकता है। सादगी के लिए, यदि यह माना जाता है कि जीवित बैक्टीरिया की उत्सर्जन दर जीवाणु भार का एक कार्य नहीं है और उत्सर्जन एक पॉइसन प्रक्रिया है, तो 18 परीक्षणों में कम से कम नौ घटनाओं को देखने का ~ 50% मौका है जब ` एमवाईबी 14 में 0.33 कृमि -1 घंटा -1 ≈ है। एस ऑरियस के लिए, 0.2 कृमि -1 घंटा -1 ≈ λ की समान प्रशंसनीय दरें प्राप्त की जाती हैं। जबकि ये मोटे गणना जीवित बैक्टीरिया के उत्सर्जन की कम दरों का सुझाव देते हैं, विश्वसनीय अनुमान प्राप्त करने के लिए बड़ी संख्या में व्यक्तिगत कीड़े पर इस प्रक्रिया का अधिक सटीक परिमाणीकरण आवश्यक होगा।

डेटा उपलब्धता:
यहां दिखाए गए डेटा ड्रायड (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2) पर उपलब्ध हैं।

Figure 1
चित्र 1. कम एकाग्रता सतह-विरंजन उपचार तेजी से बफर में बैक्टीरिया को मारता है लेकिन ठंड-लकवाग्रस्त कीड़े में आंतों के समुदायों को परेशान नहीं करता है। (ए-सी) एमएल तीन अलग-अलग सांद्रता (1: 1000, 1: 2000, 1: 5000 वी / वी; तुलना के लिए बिना ब्लीच नियंत्रण) पर सतह विरंजन के दौरान एम 9 वर्म बफर में बैक्टीरियल सीएफयू / नमूने 20 मिनट पोस्ट-एक्सपोजर तक इंगित समय बिंदुओं पर लिए गए थे और प्लेटों पर कॉलोनियों को मारने से ब्लीच को रोकने के लिए बाँझ बफर के साथ दो बार धोया गया था। 1: 1000 स्थिति के लिए डेटा थोड़ा ऑफसेट किया जाता है ताकि ये डेटा प्लॉट पर दिखाई दें। (डी-एफ) व्यक्तिगत एन 2 कीड़े में आंतों के बैक्टीरिया (एन = 24 कीड़े प्रति प्रयोग, अलग-अलग दिनों में दो या तीन स्वतंत्र रन)। सतह-प्रक्षालित और नो-ब्लीच कृमि से जुड़े सीएफयू गिनती की सभी तुलनाएं गैर-महत्वपूर्ण हैं (विलकॉक्सन रैंक-योग परीक्षण पी > 0.05)। ग्रे क्षैतिज रेखाएं पहचान की दहलीज का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिसे घनत्व (40 सीएफयू / कीड़ा) के रूप में परिभाषित किया गया है, जिस पर कम से कम एक कॉलोनी को देखने की संभावना ~ 60% है जब 200 μL वॉल्यूम से 10 μL विभाज्य चढ़ाना होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. 96-अच्छी तरह से व्यवधान प्रोटोकॉल लगातार परिणाम पैदा करता है और सामग्री की पसंद के लिए मजबूत है। मोसेली) को मानक प्रोटोकॉल के अनुसार सतह प्रक्षालित और पारगम्य किया गया था, फिर व्यक्तिगत कीड़े (एन = 24 प्रति स्थिति) यांत्रिक रूप से सीएफयू चढ़ाना के लिए बाधित थे (ए) व्यक्तिगत 0.5 एमएल ट्यूबों में मैनुअल व्यवधान का उपयोग करके, मोटरचालित मूसल या (बी-डी) का उपयोग करके ) प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित 96-अच्छी तरह से व्यवधान प्रोटोकॉल पर विविधताएं। एम 9 वर्म बफर में विघटन किया गया था जिसमें ट्राइटन एक्स -100 (एक्स-अक्ष, 0-0.1%, वी / वी) और (बी) 36-ग्रिट सिलिकॉन कार्बाइड, (सी) छोटे (425-600 μm) ग्लास मोती, या (डी) बड़े (2.7 मिमी) ग्लास मोती में से एक की अलग-अलग सांद्रता थी। सभी भूखंडों के लिए, दिखाए गए डेटा लॉग10 (सीएफयू / कीड़ा) हैं, और प्रत्येक बिंदु एक व्यक्तिगत कीड़ा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. "सी एलिगेंस आंत का विषम जीवाणु उपनिवेशण".. (ए) एन 2 वयस्क हेर्मैफ्रोडाइट्स के एकल-प्रजाति उपनिवेशीकरण के रूप में तैयार किया गया तरीकों में। बैक्टीरिया एमवाईबी देशी कृमि माइक्रोबायोम संग्रह (डिर्कसेन एट अल 2016) (एन = 24 कीड़े, प्रत्येक एक प्रयोग) और दो रोगजनकों, स्टेफिलोकोकस ऑरियस एमएसएसए न्यूमैन (एसए) और साल्मोनेला एंटरिका एलटी 2 (एसई) (एन = दो / देशी माइक्रोबायोम प्रजातियों द्वारा उपनिवेशीकरण का मूल्यांकन तरल एस मध्यम + 108 सीएफयू / एमएल बैक्टीरिया में 25 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद किया गया था; रोगजनकों द्वारा उपनिवेशीकरण का मूल्यांकन 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 (एसए) या 48 (एसई) एच के लिए एनजीएम वर्म अगर पर लॉन पर इनक्यूबेशन के बाद किया गया था। (48 घंटे में, एस ऑरियस पर कीड़े ज्यादातर मर गए हैं। (बी) एन 2, डीएएफ -16 (एमयू 86), और डीएएफ -2 (ई 1370) वयस्कों में कुल सीएफयू / (सी-डी) "जीएफपी-व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया के साथ उपनिवेशित व्यक्तिगत कीड़े में हरी प्रतिदीप्ति, बड़ी वस्तु प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा देखी गई". (सी) में, एन 2 वयस्कों की सिंक्रनाइज़ आबादी को ओपी 50 (गैर-फ्लोरोसेंट, एन = 1908 व्यक्तिगत वयस्क कीड़े), एस ऑरियस (जीएफपी, एन = 968), या एस एंटरिका (जीएफपी, एन = 1153) के साथ उपनिवेशित किया गया था जैसा कि (ए) में वर्णित है; ओपी 50 नियंत्रण दिन -3 वयस्क एन 2 कीड़े में ग्रीन-चैनल ऑटोफ्लोरेसेंस के विशिष्ट स्तर को इंगित करता है। (डी) में, एन 2 (एन = 1165), डीएएफ -16 (एमयू 86) (एन = 1180), और डीएएफ -2 (ई 1370) (एन = 2267) वयस्कों की सिंक्रनाइज़ आबादी को (ए) में वर्णित प्लेटों पर 2 दिनों के लिए कमेंसल ओक्रोबैक्ट्रम एमवाईबी 14-जीएफपी के साथ उपनिवेशित किया गया था। (ई-एफ) ऑरियस (ई) और एस एंटरिका (एफ) द्वारा उपनिवेशण में दिन-प्रतिदिन भिन्नता (पैनल ए और चित्रा 1 के समान डेटा, एन = 48 कीड़े प्रति प्रयोग)। एक्स-अक्ष नमूनाकरण के दिन को इंगित करता है। ग्रे क्षैतिज रेखाएं पता लगाने की दहलीज का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिसे घनत्व के रूप में परिभाषित किया गया है, जिस पर कम से कम एक कॉलोनी को देखने की संभावना ~ 60% है (एकल-प्रजाति उपनिवेशण के लिए 40 सीएफयू / कीड़ा और बहु-प्रजातियों के उपनिवेशीकरण के लिए चार सीएफयू / कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. बैचिंग तिरछे लॉग-स्केल डेटा में जैविक भिन्नता को मिटा देता है। चित्रा 3 से सीएफयू/वर्म डेटा को प्रत्येक बैच आकार के लिए नकली डेटा के एन = 25 प्रतिकृति सेट बनाने के लिए प्रतिस्थापन के साथ पुन: नमूना दिया गया था, जहां आकार प्रति बैच व्यक्तिगत कीड़े की संख्या है। कृमि प्रत्येक नकली बैच में कुल सीएफयू है जो प्रति बैच कीड़े की संख्या से विभाजित है। कच्चे डेटा (पैनल ए ) में, एमवाईबी 53 के लिए औसत सीएफयू / कीड़ा 4450.8 (103.6) है, और एमवाईबी 120, 1398.3 (103.1) के लिए; बैच-अनुमानित संख्याएं इन मानों में अभिसरण करती हैं क्योंकि बैच आकार बढ़ता है (बी, पांच कीड़े / सी, 10 कीड़े / बैच), केंद्रीय सीमा प्रमेय से अपेक्षाओं के अनुरूप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. जीवित बैक्टीरिया का उत्सर्जन व्यक्तिगत कीड़े की आंत में सीएफयू लोड के साथ खराब सहसंबद्ध है। यहां, एन 2 वयस्कों को एस ऑरियस-जीएफपी या एमवाईबी 14-जीएफपी के लॉन पर क्रमशः 1 या 2 दिनों के लिए खिलाकर उपनिवेशित किया गया था। पता लगाने योग्य जीएफपी प्रतिदीप्ति (बड़ी वस्तु प्रवाह साइटोमीटर पर कुल जीएफपी > 1.8 लॉग) के साथ कीड़े थोक आबादी से क्रमबद्ध किए गए थे, सतह को विधियों में वर्णित के रूप में प्रक्षालित किया गया था, और व्यक्तिगत रूप से एनजीएम + गर्मी से मारे गए ओपी 50 प्लेटों में स्थानांतरित किया गया था। लॉग-रूपांतरित कॉलोनियों/एच और सीएफयू/कृमि के बीच पियर्सन सहसंबंध गैर-महत्वपूर्ण हैं (एमवाईबी 14 आरएचओ = 0.19, पी = 0.45; ऑरियस आरएचओ = 0.02, पी = 0.9)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6. बैक्टीरियल "खेती" अगर प्लेटों पर उत्सर्जन की घटनाओं की संख्या को अस्पष्ट करती है। यहां कृमि मलमूत्र से एमवाईबी 14-जीएफपी कॉलोनियों के साथ दो प्लेटें हैं। पहली प्लेट (ए) में कृमि पथों के साथ "खेती" का स्पष्ट प्रमाण है और कॉलोनियों में जीएफपी अभिव्यक्ति (पीले रंग के रंजकता के रूप में दिखाई देने वाले) में अंतर के आधार पर कम से कम दो अलग-अलग उत्सर्जन घटनाओं का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि दूसरी प्लेट (बी) अधिक अस्पष्ट है, कॉलोनियों की स्थिति के आधार पर खेती से इनकार नहीं किया जा सकता है। इन प्रयोगों में, एमवाईबी 14-जीएफपी के लॉन युक्त अगर प्लेटों पर खिलाकर एन 2 वयस्क कीड़े को 48 घंटे के लिए पूर्व-उपनिवेशित किया गया था। उपनिवेशीकरण के बाद, कीड़े तैयार किए गए थे और तरीकों के अनुसार सतह प्रक्षालित किए गए थे, फिर एम 9 कृमि बफर + 0.1% ट्राइटन एक्स -100 से 6 सेमी एनजीएम + गर्मी से मारे गए ओपी 50 प्लेटों के 5 μL विभाज्य में स्थानांतरित किया गया था (सतह पर सूखने के लिए 5x केंद्रित गर्मी से मारे गए ओपी 50 के 50 μL धब्बे की अनुमति देकर तैयार)। कीड़े को 25 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए घूमने की अनुमति दी गई थी, फिर प्लेटों से उठाया गया और सीएफयू / वर्म चढ़ाना (मोटरचालित मूसल का उपयोग करके व्यक्तिगत 0.5 एमएल ट्यूबों में 20 μL बफर में मैनुअल व्यवधान) के लिए बाधित किया गया। प्लेटों को गिनती से पहले 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1. सतह विरंजन के बिना जीएफपी फ्लोरोसेंट एस ऑरियस के साथ उपनिवेशित एन 2 कीड़े का दृश्य। छल्ली पर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की एक छोटी संख्या फोकस में और बाहर जाती है क्योंकि छवि कृमि के शरीर से गुजरती है, और आंत का स्थानिक रूप से विषम उपनिवेशीकरण दिखाई देता है क्योंकि दृश्य का क्षेत्र शरीर की सतह से आंत में जाता है। जेड-स्टैक छवि एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर 20x आवर्धन पर ली गई थी। ब्राइट-फील्ड और जीएफपी फ़िल्टर्ड फ्लोरोसेंट छवियों को मढ़ा गया था, और विक्रेता सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके जेड-स्टैक में छवियों को एक साथ सिला गया था। छवि पूरक चित्रा 2 ए के रूप में एक ही स्लाइड से है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2. सतह विरंजन के साथ जीएफपी फ्लोरोसेंट एस ऑरियस के साथ उपनिवेशित एन 2 कीड़े का दृश्य (20 मिनट के लिए 1: 1000 वी / फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया द्वारा स्थानिक रूप से विषम उपनिवेशण इस व्यक्ति की आंत में दिखाई देता है, और बैक्टीरिया ने शरीर के ऊतकों में घुसपैठ की है, जो उन्नत संक्रमण का संकेत देता है। छल्ली पर कोई बैक्टीरिया दिखाई नहीं देता है। जेड-स्टैक छवि एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर 20x आवर्धन पर ली गई थी। ब्राइट-फील्ड और जीएफपी फ़िल्टर्ड फ्लोरोसेंट छवियों को मढ़ा गया था, और विक्रेता सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके जेड-स्टैक में छवियों को एक साथ सिला गया था। छवि पूरक चित्रा 2 बी में के रूप में एक ही स्लाइड से है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्र 1. प्रोटोकॉल का अवलोकन। यहां, सिंक्रनाइज़ वयस्क कीड़े को लाल बैक्टीरिया के साथ मोनो-उपनिवेशित किया जाता है, सतह-प्रक्षालित किया जाता है, और 96-अच्छी तरह से प्रारूप में व्यक्तिगत कीड़े के यांत्रिक विघटन से पहले पारगम्य होता है। आंत से जारी बैक्टीरिया को सीएफयू / कृमि मात्रा का ठहराव के लिए 10x श्रृंखला में कमजोर पड़ना चढ़ाया जाता है; दिखाए गए प्लेटें मनाया विषमता के लिए विशिष्ट हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2. सतह विरंजन के साथ और बिना जीएफपी फ्लोरोसेंट एस ऑरियस के साथ उपनिवेशित एन 2 कीड़े का दृश्य (20 मिनट के लिए 1: 1000 वी / (ए) बिना ब्लीच किए गए नमूने में, बाहरी बैक्टीरिया कम आवर्धन पर दिखाई देते हैं क्योंकि हरे प्रतिदीप्ति के क्षेत्र कीड़े या कृमि शरीर के टुकड़ों से जुड़े नहीं होते हैं। (बी) सतह-प्रक्षालित नमूने में, जीएफपी प्रतिदीप्ति कृमि निकायों के इंटीरियर तक सीमित है (एक कृमि शरीर का टुकड़ा मध्य छवि दिखाई देता है)। सभी छवियों को एक उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर 4x आवर्धन पर लिया गया था। ब्राइट-फील्ड और जीएफपी फ़िल्टर्ड फ्लोरोसेंट छवियों को मढ़ा गया था, और विक्रेता सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, दृश्य के आसन्न क्षेत्रों से छवियों को एक साथ सिला गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: बफर और समाधान व्यंजनों। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एलिगेंस में बैक्टीरिया लोड के एकल-कृमि मात्रा का ठहराव के फायदों पर डेटा प्रस्तुत किया जाता है, साथ ही इस प्रकार के बड़े डेटा सेटों के तेजी से और लगातार अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए 96-अच्छी तरह से व्यवधान प्रोटोकॉल के साथ। मौजूदा तरीकों33 की तुलना में, ये प्रोटोकॉल कृमि में आंतों के माइक्रोबियल समुदायों के उच्च-थ्रूपुट माप की अनुमति देते हैं।

इस दृष्टिकोण में दर-सीमित कदम के रूप में चढ़ाना है और वास्तव में "उच्च-थ्रूपुट" नहीं है। बड़ी-वस्तु प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 3 सी, डी) व्यक्तिगत कीड़े16 में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी उच्च-थ्रूपुट विधि है, हालांकि एक साथ फ्लोरोफोरस की संख्या बहु-प्रजातियों के समुदायों में एक सीमा है। सामुदायिक अनुक्रमण के साथ बहु-अच्छी तरह से प्लेट व्यवधान को जोड़ना थ्रूपुट बढ़ाने का एक और तरीका है; हालाँकि, यहां वर्णित 96-अच्छी तरह से व्यवधान प्रक्रिया को विशेष रूप से जीवाणु कोशिकाओं को बरकरार रखने के लिए अनुकूलित किया गया था। अनुक्रमण-आधारित विश्लेषण, जहां कोशिकाओं की पूरी तरह से लाइसिस वांछनीय है, जीवित बैक्टीरिया के बजाय सेल सामग्री निकालने के लिए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण चरण या बीटिंग प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल 3.10-3.11) के संशोधन के अलावा की आवश्यकता होगी। एकल-कृमि व्यवधान और न्यूक्लिक एसिड के निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल कहीं और38,39 प्रकाशित किए गए हैं।

कृमि आंत में बैक्टीरिया की कुल बहुतायत विषम है, और यहां दिखाए गए डेटा से पता चलता है कि बैच-आधारित माप समूहों के बीच तुलना में गलत परिणाम उत्पन्न कर सकता है। हालांकि, कृमि में जीवाणु समुदायों के अन्य उपाय बैचिंग के प्रभावों के प्रति कम संवेदनशील हो सकते हैं। ध्यान दें, कृमि से जुड़े समुदायों में सापेक्ष बहुतायत बहुत कम भिन्न होती है यदि कुल आंतों की आबादी के आकार के साथ, भले ही रोगाणुओं के बीच बातचीत तटस्थ40 हो या नहीं14। यह प्रशंसनीय है कि, गिनती डेटा की तुलना में, सापेक्ष बहुतायत उपाय वर्णित झूठी-सकारात्मक दर मुद्दे के लिए कम संवेदनशील होंगे। अनुक्रमण-आधारित सामुदायिक विश्लेषण, जो सामुदायिक संरचना के लिए सापेक्ष बहुतायत डेटा उत्पन्न करता है, इसलिए एकल कीड़े के माप की आवश्यकता नहीं हो सकती है। इस मामले में और जांच की जरूरत है।

यहां, हम सतह विरंजन के लिए कीड़े को पंगु बनाने के लिए ठंडे उपचार का उपयोग करते हैं। अन्य काम में पाया गया है कि कीड़े सामान्य गतिविधि को तेजी से फिर से शुरू करते हैं (<15 मिनट) अगर बर्फ पर समय 30 मिनट से कम रखा जाता है, तो रासायनिक पक्षाघात एजेंटों के विपरीत, आगे परख में तत्काल उपयोग की अनुमति मिलती है, जिसके लिए पूर्ण वसूली34 से पहले विस्तारित अवधि की आवश्यकता हो सकती है। यदि बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव के लिए कीड़े को तुरंत बाधित किया जाना है, तो यह सुविधा डिस्पेंसबल है, और चिलिंग बनाम रासायनिक पक्षाघात का मुख्य लाभ नियंत्रित अपशिष्ट धारा की आवश्यकता से परहेज कर रहा है। तनाव प्रतिक्रियाओं की जांच करते समय विस्तारित ठंडे उपचार का उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए, खासकर अगर तापमान से ज्ञात संबंध है। यहां वर्णित ठंड पक्षाघात प्रोटोकॉल ठंड तनाव (20-30 मिनट बनाम 2+ एच 2-4 डिग्री सेल्सियस पर) 41,42,43 के लिए प्रयोगों में उपयोग की तुलना में कम तीव्र ठंड जोखिम पर जोर देते हैं, और 1 घंटे ठंडा झटका जंगली प्रकार के कीड़े 43 में कोई स्पष्ट फेनोटाइप पैदा नहीं करता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक (90 मिनट) इनक्यूबेशन ठंडे तनाव जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन को प्रेरित करता है (टीएमईएम -135 की अभिव्यक्ति द्वारा मापा जाता है:: जीएफपी रिपोर्टर), लेकिन कीड़े कमरे के तापमान34 पर लौटने के बाद अभिव्यक्ति मिनटों के भीतर तनावरहित स्तर पर लौट आती है। हालांकि, तनाव-संवेदनशील कृमि जीनोटाइप पर प्रभाव जंगली प्रकार की तुलना में अधिक गंभीर हो सकता है। इस प्रक्रिया का उपयोग प्रयोगात्मक शर्तों के तहत मान्य किया जाना चाहिए।

यहां वर्णित सतह विरंजन प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगों में बाहरी रोगाणुओं के पासिंग को सीमित करने या समाप्त करने के तरीके के रूप में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग सतह विरंजन द्वारा कवक दूषित पदार्थों को साफ करने और केवल एल 1 /एल 2 लार्वा को ताजा प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए भी किया गया है (सतह-प्रक्षालित वयस्कों के हस्तांतरण के परिणामस्वरूप संदूषक को साफ करने में विफलता हुई, संभवतः बड़े जानवरों की आंतों में गाड़ी के कारण)। यह सुनिश्चित करना गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है कि ब्लीच एकाग्रता 1: 1000 वी / वी से अधिक नहीं है, क्योंकि कीड़े और मृत्यु दर को नुकसान होगा। यह प्रक्रिया प्रयोगात्मक मेजबान-सूक्ष्मजीव विकास और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन में उपयोगी हो सकती है। उदाहरण के लिए, यहां देखे गए जीवित बैक्टीरिया की कम उत्सर्जन दर हेर्मैफ्रोडाइट्स सेसंतानों तक जीवाणु संचरण के लिए देखी गई अत्यधिक परिवर्तनशील दरों को समझाने में मदद कर सकती है 15. यहां देखे गए आंतों के जीवाणु भार और उत्सर्जन दर के बीच सहसंबंध की कमी दिलचस्प है लेकिन आगे की जांच की आवश्यकता है; यह अवलोकन कहां (या क्या) होगा, यह निर्धारित करने के लिए शर्तों की एक श्रृंखला में बड़ी संख्या में डेटा बिंदुओं की आवश्यकता होगी।

सतह विरंजन द्वारा प्रदान की गई सीमा तक कीड़े को साफ करना हमेशा आवश्यक नहीं हो सकता है। बाँझ बफर में एकाधिक धोने की संभावना पर्याप्त है जब कीड़े आंतरिक रूप से एक ही सूक्ष्मजीव के साथ उपनिवेशित कर रहे हैं यदि न्यूनतम अपेक्षित सीएफयू / कीड़ा बफर सतह पर तैरनेवाला में बैक्टीरिया की एकाग्रता की तुलना में बहुत अधिक (10-100 गुना) है, क्योंकि यह कैरीओवर न्यूनतम मायने रखता है ( चित्रा 1 देखें)। इसके अतिरिक्त, यदि ब्याज के सूक्ष्मजीव (ओं) मुख्य रूप से छल्ली (ओं) उपनिवेश करते हैं, तो सतह विरंजन से स्पष्ट रूप से बचा जाना चाहिए। मिश्रित माइक्रोबियल समुदायों से निपटने के दौरान सटीकता सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से सफाई अधिक महत्वपूर्ण है (यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूने में सभी कॉलोनियां / पढ़ते हैं और पर्यावरण से नहीं हैं), जब छल्ली का पालन करने वाले बैक्टीरिया आंतरिक आबादी को पढ़ने में हस्तक्षेप करते हैं, जब अपेक्षित न्यूनतम सीएफयू /

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले जीवाणु उपभेदों के उदार साझाकरण के लिए एच शुलेनबर्ग और सी लारॉक को स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को एमोरी विश्वविद्यालय और एनएसएफ (पीएचवाई 2014173) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

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References

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जीव विज्ञान अंक 185 कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस माइक्रोबायोम विषमता मेजबान-सूक्ष्मजीव बैक्टीरिया संचरण
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Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

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