Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Använda enmaskdata för att kvantifiera heterogenitet i Caenorhabditis elegans-bakteriella interaktioner

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Detta protokoll beskriver en 96-brunnsstörning av individuellt koloniserad Caenorhabditis elegans efter kall förlamning och ytblekning för att avlägsna yttre bakterier. Den resulterande suspensionen pläteras på agarplattor för att möjliggöra noggrann kvantifiering av bakteriebelastningen i ett stort antal enskilda maskar.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans är ett modellsystem för värd-mikrob- och värd-mikrobiominteraktioner. Många studier hittills använder batchsmältningar snarare än enskilda maskprover för att kvantifiera bakteriebelastningen i denna organism. Här hävdas att den stora interindividuella variationen som ses vid bakteriell kolonisering av C. elegans-tarmen är informativ, och att batchsmältningsmetoder kasserar information som är viktig för korrekt jämförelse mellan tillstånd. Eftersom beskrivningen av variationen som är inneboende för dessa prover kräver ett stort antal individer, upprättas ett bekvämt 96-brunnsplattprotokoll för störning och koloniplätering av enskilda maskar.

Introduction

Heterogenitet i värd-mikrobföreningar observeras allestädes närvarande, och variation mellan individer erkänns alltmer som en bidragande faktor i processer på befolkningsnivå från konkurrens och samexistens1 till sjukdomsöverföring 2,3,4. I C. elegans har "dold heterogenitet" inom isogena populationer observerats upprepade gånger, med delpopulationer av individer som visar distinkta fenotyper i värmechockrespons 5,6, åldrande och livslängd 7,8,9,10,11 och många andra aspekter av fysiologi och utveckling12 . De flesta analyser som försöker identifiera subpopulationsstruktur ger bevis för två delpopulationer i experimentella populationer av isogena, synkroniserade maskar 5,7,8, även om andra data tyder på möjligheten till fördelningar inom populationen av egenskaper snarare än distinkta grupper 7,12,13 . Av relevans här observeras betydande heterogenitet i tarmpopulationer även inom isogena populationer av maskar koloniserade från en delad källa till mikrober 13,14,15,16, och denna heterogenitet kan döljas av batchsammanfattningsmätningarna som används allmänt 17,18,19,20 för bakteriell kvantifiering i masken.

Detta arbete presenterar data som tyder på ett behov av större beroende av mätningar av enstaka maskar i värd-mikrobassociation, samt protokoll för att öka noggrannheten och genomströmningen vid störningar av enstaka maskar. Dessa protokoll är utformade för att underlätta mekanisk störning av ett stort antal enskilda C. elegans för kvantifiering av livskraftig bakteriebelastning, samtidigt som de ger bättre repeterbarhet och lägre ansträngning per prov än stötbaserad störning av enskilda maskar. Ett rekommenderat tarmrensningssteg, där maskar får livnära sig på värmedödad E. coli före beredningen för störning, ingår för att minimera bidrag från nyligen intagna och andra övergående (icke-vidhäftade) bakterier. Dessa protokoll inkluderar en kallförlamningsmetod för rengöring av nagelbandet med en ytblekmedelsbehandling med låg koncentration; ytblekning kan användas som ett förberedande steg vid störning av enstaka maskar eller som en metod för beredning av levande, externt bakteriefria maskar. Denna ytblekningsmetod är tillräcklig för att avlägsna ett brett spektrum av yttre mikrober, och kallbehandling ger ett alternativ till konventionell levamisolbaserad förlamning; medan levamisol kommer att föredras för köldkänsliga experiment, minimerar kall förlamning bidrag till farliga avfallsströmmar och möjliggör snabb återupptagande av normal aktivitet. Medan det fullständiga protokollet beskriver ett laboratorieexperiment där maskar koloniseras med kända bakterier, kan procedurerna för rengöring av maskar och störningar av enstaka maskar lätt tillämpas på maskar isolerade från vilda prover eller koloniserade i mikrokosmosexperiment. Protokollen som beskrivs här producerar levande bakterier extraherade från masktarmen, lämpliga för plätering och kvantifiering av kolonibildande enheter (CFUs) i enskilda maskar; För sekvenseringsbaserad tarmsamhällesanalys bör efterföljande celllys och nukleinsyraextraktionssteg läggas till i dessa protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Maskar som användes i dessa experiment erhölls från Caenorhabditis Genetic Center, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 är den vilda typen. DAF-2/IGF-mutanterna daf-16(mu86) I (CGC CF1038) och daf-2(e1370) III (CGC CB1370) används för att illustrera skillnader i tarmens bakteriebelastning.

HT115(DE3) E. coli som bär pos-1 RNAi-vektorn kommer från Ahringerbiblioteket21. MYb-samlingen av C. elegans inhemska tarmbakterier22 erhölls från Schulenburg-labbet. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR är från detta labb23. Pseudomonas mosselii isolerades i detta laboratorium. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP erhölls från LaRock-labbet vid Emory University.

Alla maskbuffertar och media bereds enligt tidigare publicerad litteratur24 med mindre modifieringar (se tilläggsfil 1).

1. Beredning av synkroniserad steril C. elegans

OBS: I det här avsnittet beskrivs steg-för-steg-procedurer för att generera en synkroniserad population av reproduktivt sterila vuxna maskar. Matning på pos-1 RNAi-plattor används här för att förhindra produktion av avkomma eftersom denna störning är embryonal dödlig; L1-larver uppvuxna till vuxen ålder på pos-1 RNAi utvecklas till äggläggande hermafroditer, men dessa ägg är oföränderliga25. RNAi-utfodringsprotokollet är som i kapitlet "Omvänd genetik" i Wormbook26.

  1. Innan du synkroniserar maskar, se till att färska 10 cm NGM + pos-1 RNAi-plattor finns tillgängliga. Plattor kan framställas färska från koncentrerad inducerad vätskekultur (+Amp +IPTG) eller inokuleras som gräsmattor på NGM + 100 μg/ml ampicillin + 1 mM IPTG och får växa vid 25 °C i mörker under 1 dag27.
    OBS: Carbenicillin (25 μg / ml) används ofta istället för ampicillin på RNAi-plattor. Ampicillin är billigare men mindre stabilt; Om ampicillin används skall plattorna sås omedelbart när de är torra och användas så snart som möjligt (kan förvaras i <1 vecka vid 4 °C)27. Den höga antibiotikakoncentrationen som rekommenderas här hjälper till att säkerställa adekvat urval.
  2. Börja med flera (vanligtvis två till fyra) NGM-plattor med stora populationer av gravida hermafroditer. Isolera ägg med blekmedel-NaOH-synkronisering24.
    1. Tvätta maskar från agarplattor med 2 ml steril ddH2O per platta. Fördela vätskan jämnt i 1,5 ml mikrocentrifugrör (ett rör per platta eller hermafroditer).
    2. Snurra ner i ~ 5 s i en minicentrifug på bänkskivan (2 000 x g) för att dra vuxna till botten av rören. Pipettera av supernatanten och kassera.
    3. Tvätta med 1 ml steril ddH2O; snurra ner som tidigare och kassera supernatanten.
    4. Upprepa föregående steg för att minska kvarvarande bakteriellt skräp.
    5. Återställ innehållet i varje rör i 1 ml sterilddH2O. Tillsätt till varje rör 130 μL kommersiellt blekmedel (8,25% natriumhypoklorit) och 130 μL 5 N natriumhydroxid (NaOH, slutkoncentration 0,5 N).
    6. Vortex rör kraftigt i minst 10-15 s var 2: e min tills vuxna kroppar har brutit upp. Låt inte blekmedel-NaOH-behandling gå längre än 5 minuter för att undvika att döda ägg.
    7. Snurra i en minicentrifug i 30-60 s vid 2 000 x g för att pelletera äggen. Pipettera av supernatanten och kassera. Det kan eller kanske inte finnas en synlig pellet, detta är normalt.
    8. Tillsätt 1 ml M9 maskbuffert och snurra i 30-60 s vid 2000 x g. Kassera supernatanten.
    9. Upprepa sköljsteget (1.2.8) 5x för att noggrant avlägsna blekmedel-NaOH-blandningen och ta bort så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa äggpelletsen.
    10. Överför ägg till 10 ml M9-maskbuffert i ett 50 ml koniskt rör eller 30 ml odlingsrör med lock. Om du använder koniska rör, låt locket skruvas loss något och använd lite tejp för att hålla det säkert. Inkubera med skakning över natten (16 timmar) vid 25 °C och 200 rpm så att larverna kan kläckas.
  3. Överför synkroniserade L1-larver till RNAi-plattor för att växa till vuxen ålder.
    1. Tillsätt 2 ml steril M9-buffert + 0,01% Triton X-100 (hädanefter M9TX-01) till varje L1-rör och överför hela volymen (12 ml) till ett 15 ml skruvtoppkoniskt rör.
    2. Placera 15 ml rör med L1-maskar vid 4 °C i 10 minuter för att bromsa larvrörelsen.
    3. Snurra ner 15 ml koniska rör i en stor bordscentrifug (1 500 x g vid 4 °C i 3 minuter; acceleration och retardation bör inte vara högre än 80 % av maximalt).
    4. Pipettera försiktigt bort supernatanten utan att störa L1-pelleten. Kassera supernatanten.
    5. Tillsätt 12 ml kall M9TX-01 till varje rör. Upprepa centrifugeringen. Pipettera försiktigt av och kassera supernatanten. Varje rör ska ha ~200 μL kvar.
    6. Skölj en 200 μL pipettspets i M9TX-01 för att förhindra att maskar fastnar på plasten, använd sedan detta tips för att återsuspendera maskpelleten. Överför återsuspenderade maskar till beredda pos-1-plattor genom att pipettera droppar vätska på bakteriegräsmattan.
    7. Inkubera plattorna vid 25 °C fram till den första dagen i vuxen ålder.
      OBS: Om växande maskar på pos-1 RNAi-plattor måste maskar mata ad libitum på RNAi-bakterierna tills de helt har övergått till vuxen ålder för att säkerställa hög penetrans av den embryonala dödliga fenotypen. Kontrollera plattorna vid 24 och 48 timmar. Om plattorna verkar svälta eller nästan svälta, måste maskarna flyttas till färska tallrikar för att sluta växa till fullstora vuxna. För att undvika att tömma plattor innan maskar odlas, sikta på att lägga till 250-500 L1-larver till varje 10 cm RNAi-platta.
  4. Skörda vuxna och rensa tarmen E. coli för att skapa bakteriefria maskar.
    1. Skölj vuxna maskar från plattor med 5 ml M9TX-01 per tallrik. Överför buffert + maskar till ett 15 ml koniskt rör och låt vuxna sätta sig till botten av röret.
    2. Skölj vuxna i förändringar på 10 ml färsk M9TX-01-buffert tills ingen synlig bakteriell grumlighet kvarstår (vanligtvis 1-2x). Rör kan centrifugeras vid 700 x g i 30 s till pelletsmaskar, eller vuxna kan tillåtas att bosätta sig genom tyngdkraften.
    3. Utför ytterligare en tvätt med 10 ml M9TX-01 för att minska externa bakterier.
    4. Överför maskar till 50 ml koniska rör eller 30 ml odlingsrör som innehåller 5 ml S Medium + 2x värmedödad E. coli OP50 (~ 5 x 109 dödade celler / ml) + 200 μg / ml gentamycin + 50 μg / ml kloramfenikol. Om du använder koniska rör, låt locket skruvas loss något och använd lite tejp för att hålla det säkert. Använd glaspipetter eller skölj plastpipetter i M9TX-01 för att förhindra att maskarna fastnar.
    5. Inkubera vuxna vid 25 °C med skakning vid 200 rpm i 24-48 timmar för att producera bakteriefria vuxna.
      OBS: Om maskarna ska finnas kvar i antibiotika i >24 timmar kan fler värmedödade OP50 behöva tillsättas för att säkerställa att maskarna har en tillräcklig matkälla. Kontrollera rören i 24 timmar och komplettera med värmedödad OP50 om grumligheten är synligt reducerad.
  5. Sackaros tvättar vuxna enligt Wormbook-protokollen24 för att få rena, reproduktivt sterila, synkroniserade vuxna endast lager för bakteriell kolonisering.
    1. Se till att kalla volymer på 60% sackaros, M9 maskbuffert och M9TX-01 är redo att användas. För enkelhetens skull kan dessa lämnas vid 4 °C kvällen innan.
    2. För varje prov som ska tvättas, skapa ett märkt 15 ml koniskt rör innehållande 8 ml M9TX-01 och lägg åt sidan på is. Dessa kommer att behövas i steg 1.5.10.
    3. Tillsätt 5 ml M9TX-01 till varje 50 ml rör som innehåller L1-larver. Överför hela volymen (nu 10 ml) till ett tomt 15 ml koniskt skruvrör och låt vuxna sätta sig till botten av röret.
    4. Pipettera försiktigt bort supernatanten och kassera.
    5. Tillsätt 10 ml M9TX-01 till varje rör och flytta rören till en ishink i 5-10 minuter.
      OBS: Från och med nu bör maskar och alla buffertar hållas på is.
    6. Använd inställningen "snabb temperatur" för att kyla en stor bordscentrifug till 4 °C.
    7. Tillsätt 10 ml kall M9TX-01 till varje rör för att skölja bort eventuellt kvarvarande skräp. Låt maskar sätta sig på is; ta bort supernatanten och kassera.
    8. Sackarosflotta: Tillsätt 5 ml kall M9-buffert och 5 ml kall 60% sackaroslösning till varje rör, blanda noggrant. Flyt sedan försiktigt 1 ml kall M9-buffert ovanpå sackaros-buffertblandningen i varje rör. Blanda inte efter att flottören har tillsatts.
      VARNING: Rör dig snabbt för de närmaste stegen- maskar kan torka ut om de utsätts för höga koncentrationer av sackaros för länge!
    9. Centrifugera vid 1500 x g i 3 min vid 4 °C. Levande vuxna maskar kommer att ligga vid gränssnittet mellan M9 och sackarosen, cirka 1 ml från toppen av röret.
    10. Använd en 5 ml serologisk pipett av glas för att överföra maskskiktet till beredda 15 ml koniska rör med kall M9TX-01 (från steg 1.5.2). Var mycket försiktig med att få lagret av levande maskar utan att pipettera upp för mycket av sackarosen.
    11. Tillsätt vid behov M9TX-01 för att få lika stora volymer på 10-12 ml/rör. Centrifugera vid 1500 x g vid 4 °C i 1 min och pipettera sedan bort supernatanten. Ormar kan återföras till rumstemperatur vid denna tidpunkt.
    12. Upprepa tvättsteg 1.5.11 två gånger och sänk hastigheten till 700 x g vid 4 °C och tiden till 30 s.

2. Mata maskar på levande bakterier i flytande kultur

OBS: Detta protokoll används för att kolonisera maskar med laboratorieodlade bakterier under välblandade förhållanden i flytande odling (kompletterande figur 1). Maskar kan koloniseras med enskilda isolat från ren kultur (t.ex. patogener såsom Enterococcus faecium28,29) eller blandningar av isolat (t.ex. minimala mikrobiomsamhällen14).

  1. Börja med sackarostvättade synkroniserade vuxna maskar från protokollsteg 1.5 i ett 15 ml koniskt rör. Tvätta maskarna en gång i 12 ml S-buffert och kassera supernatanten.
  2. Resuspendera de tvättade maskarna i volymen S-medium som behövs för experimentet. Tänk på volymen av experimentella förhållanden, antalet förhållanden över vilka maskar kommer att delas upp och de slutliga koncentrationerna av maskar och bakterier.
    OBS: Utfodring i maskar varierar med bakterietillgång30 och maskar kan stressas genom trängsel31. För kolonisering i flytande kultur rekommenderas <1000 maskar / ml och >107 CFU / ml; 1011 CFU/ml anses vara "ad libitum"-matningstäthet på E. coli32.
  3. Snurra ner bakteriekulturer. Häll av supernatanten; aspiration eller pipettering kan användas för att avlägsna supernatanten för bakterier som bildar lösa pellets.
    OBS: För kulturer >5 ml, överför till 15 ml rör och snurra vid ~ 2800 x g i en stor bordscentrifug i 8-10 minuter. Kulturer <5 ml kan överföras till 1,5 ml rör och centrifugeras vid 9000 x g i 1-2 minuter i en liten bordscentrifug. Mycket rörliga bakterier (t.ex. många arter av Pseudomonas) kan behöva kylas vid 4 °C i 10-15 minuter för att underlätta bildandet av en stabil pellet, och det kan vara bättre att centrifugera vid 4 °C.
  4. Resuspendera bakteriekulturer i en volym S-buffert och centrifugera igen till pellets. Ta bort och kassera supernatanten som tidigare.
  5. Resuspendera bakteriekulturer i S-medium vid önskad densitet för experimentet, plus eventuella antibiotika för selektion. De antibiotika som ska användas, om några, beror på resistensprofilen för de bakterier som används för kolonisering.
  6. Med hjälp av en pipettspets belagd i M9TX-01, pipettmaskar försiktigt upp och ner tills maskar är ordentligt återsuspenderade i S-medium och överför sedan till rör eller plattbrunnar för bakteriell kolonisering.
  7. Tillsätt bakteriesuspension till varje maskkultur för att nå önskad bakteriekoncentration och slutlig volym.
  8. Om du använder en flerbrunnsplatta för kolonisering, täck plattan med ett sterilt 96-brunns gasgenomsläppligt tätningsmembran.
  9. Inkubera med skakning vid 200 rpm för att förhindra att bakterier sätter sig under inkubation.

3. Mekanisk störning av enskilda maskar i ett 96-brunnsformat

OBS: Detta avsnitt beskriver ett 96-brunns plattformatprotokoll för mekanisk störning av individuellt koloniserad C. elegans. De första stegen i protokollet (3.1-3.8) beskriver en metod för att rensa icke-vidhäftade bakterier från masktarmen och rengöra maskarnas utsida med kall förlamning och ytblekning. Dessa steg kommer att producera rena, levande vuxna maskar som kan störas mekaniskt för kvantifiering av bakterieinnehåll (3.8-end) eller användas för ytterligare experiment (kompletterande figur 1). Detta protokoll kan anpassas för att kvantifiera bakterier i maskar koloniserade i flytande kultur (avsnitt 2), på agarplattor eller från naturlig eller mikrokosmosjord.

  1. Placera en alikvot M9TX-01 på is för att kyla (4-5 gånger antalet prover i ml).
  2. Förbered en alikvot M9TX-01 + blekmedel (6% natriumhypoklorit, 1:1000 eller 1:2000 v/v, 1 ml per prov + 1 ml extra) och lägg på is för att kyla. Denna alikvot kommer att användas i steg 3.8.
  3. Förbered 96-brunnsplattor för seriell utspädning av störda maskprover.
    1. Skaffa sterila 300 μL kapacitet 96-brunnsplattor med lock; detta protokoll använder en utspädningsplatta per 12 maskar som smälts.
    2. Använd en 96-brunns flerkanalig pipettor för att fylla raderna B-D på varje 96 brunnsplatta (300 μL kapacitet) med 180 μL 1x PBS-buffert. Lämna den översta raden tom. Raderna B-D blir 10x seriella utspädningar av masksmältningarna [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Ställ tallrikar åt sidan. Utspädningsplattor kommer att användas i steg 3.13.
  4. Resuspendera varje maskprov i 1 ml M9TX-01 i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  5. Snurra rör kort (2-3 s) i en minicentrifug med låg hastighet (2 000 x g) vid 25 °C till vuxna pellets. Pipettera av supernatanten och kassera, var noga med att inte störa maskpelleten.
  6. Använd centrifugeringsinställningarna i steg 3.5, skölj maskar två gånger med 1 ml M9TX-01, sedan en gång med 1 ml M9 maskbuffert, för att minska externa bakterier.
  7. Rensa icke-vidhäftade bakterier från masktarmen.
    1. Resuspendera varje prov av maskar i 1 ml S medium + 2x värmedödad OP50 i ett odlingsrör.
    2. Inkubera vid 25 °C i 20-30 min för att tillåta passage av eventuella icke-vidhäftade bakterier från tarmen.
      OBS: Detta kommer också att rensa bort allt extracellulärt fluorescerande protein från lumen och möjliggöra tydligare visualisering av märkta bakterier som fästs vid tarmepitelet, särskilt när syrafasta fluoroforer (t.ex. mCherry, dsRed) används.
  8. Ytblekmaskar för att rensa yttre bakterier.
    1. Skölj rensade maskar två gånger med 1 ml kall M9TX-01 och kassera supernatanten.
    2. Låt rören kyla i 10 minuter på is (föredras) eller vid 4 °C. Detta kommer att förlamna maskar och förhindra intag av blekmedel.
      OBS: Andra protokoll använder ett kemiskt förlamningsmedel såsom levamisol; Detta är en etablerad metod33 som kräver att ett flöde av farligt avfall läggs till.
    3. Tillsätt 1 ml iskall M9-maskbuffert + oparfymerat blekmedel (8,25% natriumhydroxid, 1:1000 eller 1:2000 v/v) till varje rör. Låt rören sitta på is (föredras) eller vid 4 °C i minst 10 minuter för att döda externa bakterier.
      OBS: Överskrid inte 1: 1000 koncentration av blekmedel. Även i förlamade maskar kan dödligheten uppstå.
    4. Pipettera bort blekmedelsbufferten och kassera; återför rör till is för att säkerställa att maskar inte återupptar pumpningen förrän blekmedel har rensats.
    5. Tillsätt 1 ml kall M9TX-01 till varje rör. Snurra i ~5 s i en minicentrifug (2 000 x g vid 25 °C); återföra rör till is. Ta bort supernatanten och kassera.
    6. Upprepa detta sköljsteg med ytterligare 1 ml kall M9TX-01 och kassera så mycket av supernatanten som möjligt.
      OBS: Om du använder maskar för ytterligare experiment, hoppa över permeabiliseringssteget (protokoll 3.9) och överför istället nyblekta vuxna till iskall buffert i en 6 cm petriskål och separera maskar till experimentella förhållanden som i protokoll 3.10. Håll maskarna kalla för att förhindra att rörligheten återupptas men arbeta snabbt - att hålla maskar i >30 minuter på is kan potentiellt leda till att <100% återupptas normal aktivitet34.
  9. Kemisk permeabilisering av maskkutikel med natriumdodecylsulfat och ditiotrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (baserat på35)
    VARNING: DTT är ett reduktionsmedel och irriterande. Använd personlig skyddsutrustning och arbeta i dragskåp när du hanterar torra lager eller lösningar. Ett farligt avfallsflöde krävs.
    1. Förbered tillräckligt med SDS/DTT-lösning i dragskåpet för att tillåta 100 μl för varje prov. För 1 ml, till 965 μl M9-maskbuffert eller M9TX-01 i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 5 μl 5% (w / v) SDS och 30 μL 1M DTT.
      OBS: 1 M DTT-lösning (vattenhaltig) bör beredas färsk eller förvaras i alikvoter vid -20 °C för att säkerställa styrka. Alikvoter bör dimensioneras för att användas i två till tre experiment för att undvika överdriven frys-tina cykling.
    2. Flytta mikrocentrifugrör som innehåller ytblekta maskar till ett rörställ i rumstemperatur. Varje rör ska innehålla maskar i ~ 20 μL buffert.
    3. Tillsätt 100 μl SDS/DTT-lösning till varje maskprov. Kassera eventuell återstående SDS/DTT-lösning i lämpligt farligt avfallsflöde.
    4. Låt behandlingen fortsätta i upp till 8 minuter på bänken för att delvis bryta ner den resistenta nagelbandet hos de vuxna maskarna. Ormar kommer att dö och sätta sig i botten av röret under denna tid.
    5. När permeabiliseringstiden är slut, pipettera försiktigt bort SDS / DTT-supernatanten och kassera den i en lämplig SDS / DTT-farlig avfallsström.
    6. Tillsätt 1 ml M9TX-01 till varje rör. Snurra kort i en bordscentrifug för att pelletera maskarna eller låt maskar sätta sig genom tyngdkraften till botten av rören, dra sedan av supernatanten och kasta i en SDS / DTT farlig avfallsström.
    7. Resuspend maskar i 1 ml M9 maskbuffert + 0,1% Triton X-100 tills de är klara att användas.
  10. Separera maskar i en djup 96-brunnsplatta med kiselkarbidkorn för mekanisk störning. Förbered störningsplattan med 96 brunnar som under.
    1. Skaffa en steril 2 ml djupbrunnsplatta med 96 brunnar och ett matchande plåtlock med 96 brunnar av kisel.
      OBS: Det är viktigt att använda plattor som är kompatibla med 96-brunnsadaptrarna för vävnadsstöraren. Små skillnader i yttre dimensioner gör skillnaden mellan en platta som kan tas bort från adaptrarna och en som inte kan.
    2. Använd en steril skopa spatel, tillsätt en liten mängd steril 36-korn kiselkarbid till varje brunn på plattan som kommer att få en mask. Använd tillräckligt med grus för att knappt täcka botten av brunnen (ca 0,2 g per brunn). Överdriven material gör det svårt att få en pipettspets till botten av brunnen när innehållet hämtas.
    3. Tillsätt 180 μl M9 maskbuffert till varje brunn.
    4. Märk kolumnerna eller raderna för att ange vart varje prov ska gå och täck sedan plattan löst med kiselplåthöljet med 96 brunnar.
  11. Överför enskilda maskar till 96-brunnsplattan för störningar.
    1. Flytta permeabiliserade maskar försiktigt till en liten (35 eller 60 mm) petriskål som innehåller tillräckligt med M9TX-01 för att fylla skålen till ett djup av ~ 1 cm.
      OBS: Om ett stort antal maskar är närvarande kanske det inte är möjligt att överföra hela provet eftersom vätskan blir trångt och det blir svårt att pipettera enskilda maskar.
    2. Använd ett dissekeringsmikroskop eller annan lågförstoringsanordning, pipettera av enskilda maskar i 20 μL volymer och överför dessa maskar till enskilda brunnar på 96-brunnsplattan.
      OBS: Det är bäst att skörda endast nyligen dödade maskar. Undvik maskar med en styv linjär form, eftersom dessa maskar kan ha varit döda under en tid. Försök att ta maskar som är böjda eller S-formade, med normal grovfysiologi och en intakt tarm.
    3. Efter överföring av varje volym, se till att den valda masken faktiskt kastades ut i brunnen. För att göra detta, pipettera upp 20 μL M9TX-01 från ett klart område av petriskålen och släpp hela volymen tillbaka i skålen; detta kommer normalt att mata ut masken om den sitter fast vid pipetten. Om masken fastnade, ta bort 20 μL från brunnen och försök överföringen igen.
    4. När alla maskar har överförts, täck 96-brunnsplattan med ett ark med kommersiellt tillgänglig flexibel pappersbackad tätningsfilm (2 x 2 rutor) och se till att den pappersryggade sidan av tätningsfilmen är vänd nedåt mot provbrunnarna. Var försiktig så att du inte sträcker tätningsfilmen för tunn, annars blir det mycket svårt att ta bort senare.
    5. Placera silikontätningsmattan lätt ovanpå den flexibla tätningsfilmen; tryck inte ner locket i brunnarna just nu.
    6. Flytta plattan till 4 °C för att kyla i 30-60 min. Detta förhindrar överuppvärmning under störningar, vilket kan skada proverna.
      OBS: Detta är en brytpunkt i protokollet. I de flesta fall kan plattan lämnas vid 4 °C i upp till 4 timmar innan slipning. Lämna inte maskarna över natten, eftersom detta kommer att förändra bakterieantalet.
  12. Ladda 96-brunnsplattor på en vävnadsstörare för att bryta upp maskvävnader och frigöra tarmbakterier.
    OBS: (Valfritt) Om du använder ett udda antal 96-brunnsplattor för smältning, är det nödvändigt att förbereda en motvikt innan du fortsätter. Använd en tom djup 96-brunnsplatta och fyll brunnar med vatten tills den väger samma som den första plattan.
    1. Tryck ner tätningsmattan av kisel ordentligt i brunnarna för att skapa en tätning och se till att locket ligger plant över hela plattans yta.
      OBS: Om den flexibla tätningsfilmen är för tjock efter sträckning blir det svårt att säkra silikonlocket så att det ligger platt i alla brunnar. Detta kommer att resultera i en otillräcklig tätning och kontaminering från källa till brunn under skakning.
    2. Säkra plattorna i vävnadsstöraren med hjälp av 96-brunnsplattadaptrarna. Skaka plattorna i 1 min vid 30 Hz, rotera sedan plattorna 180 ° och skaka igen i 1 min. Detta kommer att bidra till att säkerställa jämn störning i alla brunnar på plattan.
    3. Knacka fast plattorna på bänken två eller tre gånger för att lossa eventuellt grus från den flexibla tätningsfilmen.
    4. Använd en stor centrifug med två 96-brunnsplattadaptrar och snurra ner plattorna vid 2400 x g i 2 minuter för att samla allt material till botten av brunnarna.
    5. Ta bort silikonlocket och dra försiktigt av den flexibla tätningsfilmen.
      OBS: Om den flexibla tätningsfilmen fastnar i någon av brunnarna, använd en 200 μL pipettspets för att ta bort den. Detta är vanligt när den flexibla tätningsfilmen sträcktes för tunn.
  13. Seriellt utspädda masksmältprover i 300 μl i 96-brunnsplattor.
    1. Använd en pipettor med flera brunnar inställd på 200 μL, pipettera upp och ner flera gånger långsamt och försiktigt för att blanda om innehållet i brunnarna och dra sedan av så mycket av vätskan som möjligt. Överför denna vätska till de översta raderna på 96-brunnsplattorna som förbereddes i steg 3.3.
    2. Använd en 96-brunns pipettor inställd på 20 μL, ta bort denna volym vätska från den övre raden och fördela i rad B. Pipettera upp och ner 8-10x för att blanda. Kassera tips.
    3. Upprepa steg 3.13.2 med början från 0,1x-proverna på rad B för att skapa 0,01x utspädningsprover i rad C.
    4. Upprepa steg 3.13.2 igen och gå från rad C till rad D.
    5. Platta på fast agar för bakteriell kvantifiering. För monokoloniserade maskar är det i allmänhet tillräckligt att platta 10-20 μL droppar av varje utspädning [1x-0,001x] på agarplattor. För kolonisering av flera arter, pläter varje utspädning separat genom att pipettera 100 μL på en 10 cm agarplatta; spridas omedelbart med glaspläteringspärlor.

4. Rengöring av kiselkarbidkorn för återanvändning

OBS: Denna procedur används för att rengöra och sterilisera slipmaterialet, kiselkarbidkorn, för återanvändning efter experiment. Detta protokoll bör följas i sin helhet före första användningen, eftersom kiselkarbidkorn är en industriprodukt och inte kommer försteriliserad. Si-karbidkorn (3,2 g/cc) är ett tätt, grovkantat material som arbetar effektivt för att störa tuffa prover. Partiklarna kan dock slitas ner vid upprepad användning och bör bytas ut när slitaget blir uppenbart. Lyckligtvis är materialet billigt, och de storlekar som vanligtvis säljs (~ 1 lb) är tillräckliga för många experiment.

  1. Efter att ha tagit bort prover för plätering, tillsätt 10% blekmedelslösning till alla brunnar på 96-brunnsplattan och låt sitta i minst 10 minuter.
  2. Ta bort huvuddelen av gruset genom att snabbt invertera 96-brunnsplattan över en liten högsidig bricka eller tom P1000-pipettspetsbehållare som är tillräckligt stor för att fånga upp allt innehåll. Kornet sjunker omedelbart till botten av brickan. Häll av blekmedelslösningen i ett handfat.
  3. Fyll 96-brunnsplattan igen med kranvatten och vänd i samma bricka för att skölja ut kvarvarande grus. Häll av vattnet i diskhon.
  4. Upprepa en till tre gånger till med kranvatten tills plattan är helt fri från grus.
  5. Skölj korn 2x i kranvatten och fyll brickan varje gång.
    OBS: 96-brunns djupbrunnsplattan kan tvättas i en laboratoriediskmaskin, täckas ordentligt med folie och autoklaveras med annan återanvändbar plast. Grus behöver inte tvättas omedelbart och kan läggas åt sidan vid denna tidpunkt. Använt grus ackumuleras vanligtvis från flera experiment före tvätt och autoklavering.
  6. Tvätta grus i en lösning av laboratorietvättmedel i 30 minuter, omrör ibland genom att virvla eller blanda med en metallspatel.
  7. Skölj bort alla spår av tvättmedel i flera (8-10) byten av kranvatten och skölj sedan 2x med destillerat vatten.
  8. Sprid grus i en öppen bricka, t.ex. en grund autoklavbricka av polypropen, och torka vid 40–70 °C i flera timmar.
    OBS: Om gruset är klumpigt när det är torrt, har det inte rengjorts eller sköljts tillräckligt. Upprepa rengöringsprotokollet från och med steg 4.6 och lägg till ytterligare sköljningar i steg 4.7.
  9. Fördela rent, torrt grus i autoklaverbara glasflaskor med skruvtillkant till ett maximalt djup av 5-6 cm. Autoklavera på förvakuumcykel i 30 min för att sterilisera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bleksterilisering av levande maskar
Ytblekta maskar är effektivt fria från yttre bakterier tills rörligheten återvänder och utsöndringen återupptas. Under de förhållanden som används här observeras snabb utrotning av bakterier i buffert (figur 1A-C, kompletterande figur 2, video 1) utan att störa de tarmassocierade bakterierna i kallförlamade maskar (figur 1D-F, video 2). Dessa data indikerar att ytblekning kan användas effektivt för att sanera maskar externt utan att kompromissa med tarminnehållet (jämförelser av ytblekt och no-bleach maskassocierade CFU-antal är icke-signifikanta, Wilcoxon rank-sum test p > 0,05).

Variationer på mekanisk störning med flera prover
96-brunnstekniken för mekanisk störning av maskar är robust för de specifika material som används, och praktiska överväganden dikterar valet av slipmaterial. I likhet med en tidigare rapport33 resulterade manuella störningar (figur 2A) i mer heterogenitet än standardprotokollet med 96 brunnar (kiselkarbidkorn, figur 2B) (var(log10CFU) = 0,499) under alla buffertförhållanden, jämfört med 0,229 för sikarbid, 0,243 för stora glaspärlor (figur 2C) och 0,227 för små glaspärlor (figur 2D ). Ändå var de flesta skillnaderna i CFU/ maskfördelningar inte signifikanta (Kruskal-Wallace, p = 0,017 med df = 3; signifikanta post-hoc Wilcoxon-tester för stora pärlor kontra små pärlor, p = 0,021 och stora pärlor kontra kiselkarbidkorn, p = 0,02). Användningen av Triton X-100 som ytaktivt medel var inte förknippad med någon signifikant skillnad i utbyte när den betraktades som en individuell faktor (Kruskal-Wallace, p = 0,94, df = 3), även om det finns en uppenbar ökning av utbytet i prover som inte innehåller Triton jämfört med Triton när stora pärlor (2,7 mm) användes (figur 2C), möjligen hänförlig till den överdrivna "skumning" som observerades i dessa brunnar när Triton var närvarande. Dessa resultat indikerar att stora glaspärlor, även om de är idealiska för användning i homogeniseringsrör33, inte är lämpliga för 96-brunnstekniken. Medan små glaspärlor gav rimliga resultat (figur 2D), täppte de konsekvent till 200 μL pipettspetsar under blandning och plätering. Standardmaterialet i denna analys, kiselkarbidkorn, är billigt, för stort för att täppa till standardspetsar och kan liksom glaspärlor tvättas och återanvändas efter autoklavering. Gruset släpper ut en liten mängd "damm" i bufferten, vilket inte stör plätering men måste filtreras bort om störningsprodukterna ska användas för flödescytometri.

Heterogenitet i bakteriell kolonisering hos vuxna maskar
Framgångsrik störning av enskilda maskar avslöjar heterogenitet vid bakteriell kolonisering. Individer från isogena synkroniserade populationer av maskar, koloniserade samtidigt på samma bakteriepool, visar konsekvent 100-faldigt eller större intervall i tarmbakteriebelastning. Detta observeras för olika bakteriekolonisatörer (figur 3A) och under kolonisering på bakteriesamhällen med flera arter (figur 3B). Denna heterogenitet är också tydlig i individuella maskmätningar av fluorescens när maskar koloniseras med bakterier som uttrycker ett fluorescerande protein (GFP) (Figur 3C-D). Värdens egenskaper spelar en roll i att forma denna heterogenitet, vilket kan ses genom att jämföra kolonisering av bristol N2-maskar av vild typ med kolonisering av samma bakterier i DAF-2 / IGF-mutanter; denna daf-16 mutant stöder större populationer av många bakterier jämfört med N2, medan daf-2 är resistent mot kolonisering av en rad bakterier36 (figur 3B, D). Denna heterogenitet är karakteristisk och visar variation mellan olika kombinationer av värd och kolonist(er), samtidigt som den behåller en konsekvent struktur över olika körningar av samma experiment (figur 3E-F).

Betydelsen av individuell heterogenitet för korrekt jämförelse av grupper
Vikten av individuell heterogenitet kan lätt ses genom att överväga hur batchsammanfattningar kan förändra fördelningen av data. Kolonisering av inhemska mikrobiombakterier MYb53 (Rhodococcus erytropolis) och MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Figur 3A, 4A) hos vuxna N2 används som exempel. De enskilda maskdata är tydligt lika i fördelning (två-tailed t-test, p = 0,9, Wilcoxon rank sum, p = 0,59). Vid omsampling av dessa data för att simulera effekterna av batchsammanfattningar drar batchen extrapolerad CFU/mask mot de övre kvantilerna av data på grund av den positiva skevningen i dessa fördelningar (medelvärde > median). Eftersom batchning effektivt medelvärden över individerna inom en sats, kommer batch-extrapolerad CFU / mask att centreras kring det aritmetiska medelvärdet av de enskilda data, med minskande avstånd till detta medelvärde när batcher blir stora enligt den centrala gränssatsen (Figur 4B-D). Följaktligen förloras signal från biologisk variation snabbt; batch-härledda CFU/maskmätningar konvergerar mot medelvärdet, vilket inte är ett representativt mått för dessa logskala-distribuerade data. Skillnader i härledd kolonisering av MYb53 jämfört med MYb120 blir snabbt signifikanta i simulerade batchsmältningar (t-test batch 5, p = 0,049; batch 10, p = 2,27e-4; batch 20, p = 1,19e-15; Wilcoxon rangsumma testbatch 5, p = 2,27e-4; sats 10, p = 2,70e-06; batch 20, p = 1,80e-09) eftersom den ursprungliga signalen är dold.

Effekter av individuell heterogenitet på mikrobiell överföring
Eftersom enskilda maskar visar betydande heterogenitet vid bakteriell kolonisering är det rimligt att fråga om denna heterogenitet har nedströms effekter. Det är till exempel rimligt att förvänta sig att överföring kan vara en funktion av tarmens bakteriebelastning. Genom att överföra enskilda ytblekta maskar till en ren miljö är det möjligt att observera ympning av miljön med utsöndrade levande bakterier. I dessa experiment tilläts ytblekta förkoloniserade vuxna, som i allmänhet bar betydande populationer (103-10 5 CFU/mask, figur 5) av kommensal Ochrobactrum MYb14-GFP eller patogen S. aureus-GFP, ströva omkring på värmedödade OP50-gräsmattor på NGM-agar i 1,5 timmar. När dessa maskar skördas från utsöndringsplattor och störs för bakteriell kvantifiering finns det inget signifikant samband mellan bakteriebelastning och utsöndringshastighet för levande bakterier (Pearson-korrelationer mellan logtransformerade kolonier / timme och CFU / mask: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (Figur 5). Det finns inte heller något signifikant samband mellan förekomst/frånvaro av kolonier på en platta och tarmens bakteriebelastning (binomial logistisk regression med logtransformerad CFU/mask som faktor: p = 0,15 med df = 53). En betydande del av plattorna förblev fria från ny tillväxt (9/18 plattor för MYb14, 10/36 plattor för S. aureus), vilket indikerar låga totala utsöndringshastigheter.

När maskar tillåts utsöndras på agarplattor förvirras det faktiska antalet levande utsöndrade bakterier per mask av "jordbruk", där maskar passerar genom kolonier och skapar spår av ny tillväxt (Figur 6)37. En platta med n kolonier representerar minst en, och högst n, händelser där levande kolonibildande bakterier utsöndrades. Från denna observation är det inte möjligt att veta hur många utsöndringshändelser i (1,n) som faktiskt inträffade, och det är inte heller möjligt att veta hur många bakterier som utsöndrades i varje händelse. Det är därför inte möjligt att exakt uppskatta utsöndringshastigheter för levande bakterier från tarmen med hjälp av dessa data. Det är dock möjligt att dra slutsatsen om vissa gränser. Även om antalet kolonier per platta inte är särskilt informativt, kan närvaro/ frånvarodata användas för grov inferens av utsöndringshastigheter. För enkelhetens skull, om det antas att utsöndringshastigheten för levande bakterier inte är en funktion av bakteriebelastningen och att utsöndring är en Poisson-process, finns det en ~ 50% chans att observera minst nio händelser i 18 studier när λ ≈ 0,33 mask-1 timme-1 i MYb14. För S. aureus erhålles liknande troliga hastigheter av λ ≈ 0,2 mask-1 tim-1 . Även om dessa grova beräkningar tyder på låga utsöndringshastigheter av levande bakterier, kommer mer exakt kvantifiering av denna process över ett större antal enskilda maskar att vara nödvändig för att få tillförlitliga uppskattningar.

Data tillgänglighet:
Data som visas här finns tillgängliga på Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Figur 1. Ytblekningsbehandling med låg koncentration dödar snabbt bakterier i buffert men stör inte tarmsamhällen i kallförlamade maskar. (A-C) Bakteriell CFU/ml i M9-maskbuffert under ytblekning vid tre olika koncentrationer (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; oblekt kontroll för jämförelse), inriktning (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2 eller (C) E. coli OP50. Proverna togs vid angivna tidpunkter upp till 20 minuter efter exponering och tvättades två gånger med steril buffert för att förhindra att blekmedel dödar kolonier på plattor. Data för 1:1000-villkoret förskjuts något så att dessa data är synliga på diagrammet. (D-F) Tarmbakterier i enskilda N2-maskar (n = 24 maskar per experiment, två eller tre oberoende körningar på separata dagar). Alla jämförelser av ytblekta och icke-blekmedelsmaskassocierade CFU-antal är icke-signifikanta (Wilcoxon rank-sum test p > 0,05). Grå horisontella linjer representerar detektionströskeln, definierad som densiteten (40 CFU/mask) vid vilken sannolikheten för att observera minst en koloni är ~ 60% vid plätering av 10 μL alikvoter från 200 μL volymer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. 96-brunnsstörningsprotokollet ger konsekventa resultat och är robust för materialvalet. N2 vuxna maskar koloniserade med en enda bakterieart i 48 timmar (P. mosselii) ytblektades och permeabiliserades enligt standardprotokoll, sedan stördes enskilda maskar (n = 24 per tillstånd) mekaniskt för CFU-plätering med (A) manuell störning i enskilda 0,5 ml rör, med hjälp av en motoriserad stöt eller (B-D ) variationer av 96-brunnsstörningsprotokollet som beskrivs i detalj i protokollet. Störning utfördes i M9-maskbuffert innehållande varierande koncentrationer av Triton X-100 (x-axel, 0-0,1%, v/v) och en av (B) 36-korn kiselkarbid, (C) små (425-600 μm) glaspärlor eller (D) stora (2,7 mm) glaspärlor. För alla områden är data som visas logg10 (CFU / mask), och varje punkt är en enskild mask. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Heterogen bakteriell kolonisering av C. elegans-tarmen. (A) Kolonisering av en art av vuxna N2-hermafroditer framställda som i metoder. Bakterier är fyra arter från MYb:s inhemska maskmikrobiomsamling (Dirksen et al. 2016) (n = 24 maskar, ett experiment vardera) och två patogener, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) och Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 maskar över två/tre oberoende experiment). Kolonisering av inhemska mikrobiomarter bedömdes efter en 48 timmars inkubation vid 25 ° C i flytande S-medium + 108 CFU / ml bakterier; kolonisering av patogener bedömdes efter inkubation på gräsmattor på NGM-maskagar i 24 (SA) eller 48 (SE) h vid 25 °C. (Vid 48 h har maskar på S. aureus mestadels dött.) (B) Totalt CFU / mask i N2, daf-16 (mu86) och daf-2 (e1370) vuxna koloniserade i 4 dagar i flytande media på ett åtta arter minimalt inhemskt mikrobiom (data från Taylor och Vega, 2021)14. (C-D) Grön fluorescens hos enskilda maskar koloniserade med GFP-uttryckande bakterier, observerade av stor objektflödescytometri. I (C) koloniserades synkroniserade populationer av N2 vuxna med OP50 (icke-fluorescerande, n = 1908 enskilda vuxna maskar), S. aureus (GFP, n = 968) eller S. enterica (GFP, n = 1153) som beskrivs i (A); OP50-kontrollen indikerar typiska nivåer av grönkanals autofluorescens hos dag-3 vuxna N2-maskar. I (D) koloniserades synkroniserade populationer av N2 (n = 1165), daf-16(mu86) (n = 1180) och daf-2(e1370) (n = 2267) vuxna med commensal Ochrobactrum MYb14-GFP i 2 dagar på plattor som beskrivs i (A). (E-F) Daglig variation i kolonisering av S. aureus (E) och S. enterica (F) (samma data som i panel A och figur 1, n = 48 maskar per experiment). X-axeln anger provtagningsdagen. Grå horisontella linjer representerar detektionströskel, definierad som densiteten vid vilken sannolikheten för att observera minst en koloni är ~ 60% (40 CFU / mask för kolonisering av en art och fyra CFU / mask för kolonisering av flera arter, på grund av olika pläteringsvolymer på 10 μL respektive 100 μL av 200 μL). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Batchning raderar biologisk variation i skeva loggskaledata. CFU/maskdata från figur 3 samplades om med ersättning för att skapa n = 25 replikerade uppsättningar simulerade data för varje batchstorlek, där storleken är antalet enskilda maskar per batch. CFU/mask är den totala CFU i varje simulerad sats dividerat över antalet maskar per sats. I rådata (panel A) är genomsnittlig CFU /mask för MYb53 4450,8 (103,6) och för MYb120, 1398,3 (103,1); de batch-härledda siffrorna konvergerar till dessa värden när batchstorleken ökar (B, fem maskar/batch; C, 10 maskar/sats; D, 20 maskar/sats), i överensstämmelse med förväntningarna från central gränssats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Utsöndring av levande bakterier är dåligt korrelerad med CFU-belastning i tarmarna hos enskilda maskar. Här koloniserades N2 vuxna genom utfodring i 1 respektive 2 dagar på gräsmattor av S. aureus-GFP eller MYb14-GFP. Maskar med detekterbar GFP-fluorescens (total GFP-> 1,8 stockar på storobjektflödescytometer) sorterades från bulkpopulationen, ytblektes enligt beskrivningen i Metoder och överfördes individuellt till NGM + värmedödade OP50-plattor. Pearson-korrelationer mellan logtransformerade kolonier/h och CFU/mask är icke-signifikanta (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Bakteriell "farming" döljer antalet utsöndringshändelser på agarplattor. Här är två plattor med MYb14-GFP-kolonier från maskutskiljning. Den första plattan (A) har tydliga bevis på "jordbruk" längs maskvägar och verkar representera minst två separata utsöndringshändelser baserat på skillnader i GFP-uttryck (synligt som gulaktig pigmentering) över kolonier. Medan den andra plattan (B) är mer tvetydig, kan jordbruk inte uteslutas baserat på koloniernas positioner. I dessa experiment förkoloniserades N2 vuxna maskar i 48 timmar genom att mata på agarplattor innehållande gräsmattor av MYb14-GFP. Efter kolonisering framställdes maskar och ytblektades enligt metoder och överfördes sedan i 5 μL alikvoter M9 maskbuffert + 0,1% Triton X-100 till 6 cm NGM + värmedödade OP50-plattor (framställda genom att låta 50 μL fläckar av 5x koncentrerad värmedödad OP50 torka på ytan). Maskar tilläts ströva omkring i 1,5 timmar vid 25 °C, plockades sedan från plattor och stördes för CFU/maskplätering (manuell störning i 20 μl buffert i enskilda 0,5 ml rör, med hjälp av en motoriserad stöt). Plattorna inkuberades vid 25 °C i 2 dagar innan de räknades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Videoklipp 1. Visualisering av N2-maskar koloniserade med GFP-fluorescerande S. aureus utan ytblekning. Ett litet antal fluorescerande celler på nagelbandet rör sig in och ut ur fokus när bilden passerar genom maskens kropp, och rumsligt heterogen kolonisering av tarmen blir synlig när synfältet rör sig från kroppsytan in i tarmen. Z-stack-bilden togs med 20x förstoring på ett inverterat fluorescerande mikroskop. Ljusfälts- och GFP-filtrerade fluorescerande bilder överlagrades och bilder över Z-stacken syddes ihop med hjälp av leverantörens programvara. Bilden är från samma bild som i kompletterande figur 2A. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Videoklipp 2. Visualisering av en N2-mask koloniserad med GFP-fluorescerande S. aureus med ytblekning (1:1000 v/v i 20 min). Rumsligt heterogen kolonisering av fluorescerande bakterier är synlig i tarmen hos denna individ, och bakterier har infiltrerat kroppsvävnaderna, vilket indikerar avancerad infektion. Inga bakterier syns på nagelbandet. Z-stack-bilden togs med 20x förstoring på ett inverterat fluorescerande mikroskop. Ljusfälts- och GFP-filtrerade fluorescerande bilder överlagrades och bilder över Z-stacken syddes ihop med hjälp av leverantörens programvara. Bilden är från samma bild som i kompletterande figur 2B. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande figur 1. Översikt över protokollet. Här monokoloniseras synkroniserade vuxna maskar med röda bakterier, ytblektas och permeabiliseras före mekanisk störning av enskilda maskar i ett 96-brunnsformat. Bakterier som frigörs från tarmen späds ut i 10x-serien för CFU/ maskkvantifiering; plattor som visas är typiska för observerad heterogenitet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2. Visualisering av N2-maskar koloniserade med GFP-fluorescerande S. aureus med och utan ytblekning (1:1000 v/v i 20 min). (A) I det oblekt provet är yttre bakterier synliga vid låg förstoring som områden med grön fluorescens som inte är associerade med maskar eller maskkroppsfragment. (B) I det ytblekta provet är GFP-fluorescensen begränsad till det inre av maskkroppar (ett maskkroppsfragment är synligt mitt i bilden). Alla bilder togs med 4x förstoring på ett inverterat fluorescerande mikroskop. Ljusfälts- och GFP-filtrerade fluorescerande bilder överlagrades och bilder från intilliggande synfält syddes ihop med hjälp av leverantörens programvara. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 1: Buffert- och lösningsrecept. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenteras data om fördelarna med enmaskkvantifiering av bakteriebelastning i C. elegans, tillsammans med ett 96-brunns störningsprotokoll för att möjliggöra snabb och konsekvent insamling av stora datamängder av denna typ. Jämfört med befintliga metoder33 möjliggör dessa protokoll högre genomströmningsmätning av tarmmikrobiella samhällen i masken.

Den här metoden har plätering som ett hastighetsbegränsande steg och är inte riktigt "high-throughput". Flödescytometri med stora objekt (figur 3C,D) är en användbar metod med hög genomströmning för att kvantifiera fluorescerande märkta bakterier i enskilda maskar16, även om antalet samtidiga fluoroforer är en begränsning i samhällen med flera arter. Att koppla störningar i flera brunnar med samhällssekvensering är ett annat sätt att öka genomströmningen; emellertid optimerades 96-brunnsstörningsproceduren som beskrivs här specifikt för att lämna bakterieceller intakta. Sekvenseringsbaserad analys, där grundlig lys av celler är önskvärt, kommer att kräva tillsats av ett nukleinsyraextraktionssteg eller modifiering av slagprotokollet (protokoll 3.10-3.11) för att extrahera cellinnehåll istället för levande bakterier. Protokoll för störningar av enstaka maskar och extraktion av nukleinsyror har publicerats på andra håll38,39.

Bakteriell total förekomst i masktarmen är heterogen, och de data som visas här tyder på att batchbaserad mätning kan ge felaktiga resultat i jämförelser mellan grupper. Andra mått på bakteriesamhällen i masken kan dock vara mindre känsliga för effekterna av batchning. Observera att relativa förekomster i maskassocierade samhällen verkar variera mycket lite om alls med total tarmpopulationsstorlek, oavsett om interaktioner mellan mikrober är neutrala40 eller inte14. Det är troligt att, jämfört med räkningsdata, kommer relativa överflödsmått att vara mindre mottagliga för det falskt positiva frekvensproblemet som beskrivs. Sekvenseringsbaserad samhällsanalys, som genererar relativa överflödsdata för samhällssammansättning, kanske därför inte kräver mätning av enstaka maskar. Ytterligare utredning behövs på denna punkt.

Här använder vi kallbehandling för att förlama maskar för ytblekning. Annat arbete har visat att maskar återupptar normal aktivitet snabbt (<15 min) om tiden på is hålls under 30 minuter, vilket möjliggör omedelbar användning vid ytterligare analyser, i motsats till kemiska förlamningsmedel som kan kräva längre perioder före full återhämtning34. Om maskar ska störas omedelbart för bakteriell kvantifiering är denna funktion dispenserbar, och den största fördelen med kylning kontra kemisk förlamning är att undvika behovet av en kontrollerad avfallsström. Förlängd kallbehandling bör användas med försiktighet vid undersökning av stressreaktioner, särskilt om det finns ett känt samband med temperatur. De protokoll för kall förlamning som beskrivs här innebär kortare akut kall exponering än vad som används i experiment för kall stress (20-30 min vs 2+ h vid 2-4 ° C) 41,42,43, och en 1 h kall chock ger ingen uppenbar fenotyp i vildtypmaskar43. Kortvarig (90 min) inkubation vid 4 °C inducerar förändringar i kallstressgenuttryck (mätt genom uttryck av en TMEM-135::GFP-reporter), men uttrycket återgår till ostressade nivåer inom några minuter när maskar återförs till rumstemperatur34. Effekterna på stresskänsliga maskgenotyper kan dock vara allvarligare än i vildtyp. Detta förfarande bör valideras under de experimentella förhållanden som skall användas.

Ytblekningsprotokollet som beskrivs här kan användas som ett sätt att begränsa eller eliminera passaging av externa mikrober i experiment. Denna metod har dessutom använts för att rensa svampföroreningar genom ytblekning och överföring av endast L1/ L2-larver till färska plattor (överföring av ytblekta vuxna resulterade i att föroreningen inte rensades, förmodligen på grund av transport i tarmarna hos de större djuren). Det är kritiskt viktigt att se till att blekmedelskoncentrationen inte överstiger 1: 1000 v / v, eftersom skador på maskarna och dödligheten kommer att uppstå. Denna procedur kan vara användbar vid experimentell värd-mikrobutveckling och värd-patogeninteraktioner. Till exempel kan den låga utsöndringshastigheten för levande bakterier som observerats här hjälpa till att förklara de mycket varierande hastigheterna som observerats för bakteriell överföring från hermafroditer till avkomma15. Bristen på korrelation mellan intestinal bakteriebelastning och utsöndringshastighet som observerats här är intressant men kräver ytterligare undersökning; ett större antal datapunkter över en rad villkor kommer att behövas för att avgöra var (eller om) denna observation kommer att hålla.

Det kanske inte alltid är nödvändigt att rengöra maskar i den utsträckning som ytblekning ger. Flera tvättar i steril buffert är sannolikt tillräckliga när maskar koloniseras internt med en enda mikrobe om den minsta förväntade CFU / masken är mycket högre (10-100 gånger) än koncentrationen av bakterier i buffertsupnatanten, eftersom denna överföring minimalt kommer att påverka antalet (se figur 1). Dessutom, om mikroben /mikroberna av intresse främst koloniserar nagelbandet, bör ytblekning tydligt undvikas. Grundlig rengöring är viktigare för att säkerställa noggrannhet vid hantering av blandade mikrobiella samhällen (för att säkerställa att alla kolonier / läsningar i ett prov kommer från maskassocierade bakterier och inte från miljön), när bakterier som fäster vid nagelbandet stör läsningen av den internaliserade populationen, när förväntat minimum CFU / mask är lågt, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill uppmärksamma H. Schulenberg och C. LaRock för deras generösa delning av bakteriestammar som används i dessa experiment. Detta arbete stöddes av finansiering från Emory University och NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Biologi utgåva 185 Caenorhabditis elegans mikrobiom heterogenitet värdmikrob bakterier överföring
Använda enmaskdata för att kvantifiera heterogenitet i <em>Caenorhabditis elegans-bakteriella</em> interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter