単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化
Summary
このプロトコルは、外部細菌を除去するための低温麻痺および表面漂白後の個々の細菌的にコロニー形成された Caenorhabditis elegansの 96ウェル破壊を記載している。得られた懸濁液を寒天プレートに播種し、多数の個々のワームにおける細菌負荷の正確で中程度のスループット定量を可能にする。
Abstract
線虫 Caenorhabditis elegans は、宿主-微生物および宿主-微生物叢相互作用のモデル系である。これまでの多くの研究では、個々のワームサンプルではなくバッチ消化を使用して、この生物の細菌負荷を定量化しています。ここでは、 C. elegans 腸の細菌コロニー形成に見られる大きな個人間変動が有益であり、バッチ消化法は条件間の正確な比較に重要な情報を破棄すると主張している。これらのサンプルに固有の変動を記述するにつれて、多数の個体を必要とし、個々のワームの破壊およびコロニーメッキのための便利な96ウェルプレートプロトコルが確立される。
Introduction
宿主と微生物の関連における不均一性は遍在的に観察され、個体間の変動は、競争と共存1から疾患伝染2、3、4までの集団レベルのプロセスに寄与する要因としてますます認識されている。 C. elegansでは、アイソジェニック集団内の「隠れた不均一性」が繰り返し観察されており、個体のサブ集団はヒートショック応答5,6、老化、寿命7,8,9,10,11、および生理学および発達の他の多くの側面において明確な表現型を示している12.亜集団構造を同定しようとするほとんどの解析は、同種異系の同期ワーム5,7,8の実験集団における2つの亜集団の証拠を提供するが、他のデータは、別個のグループではなく集団内の形質分布の可能性を示唆している7,12,13.ここでの関連性は、微生物の共有供給源からコロニー化されたワームの同種性集団内においても腸集団における実質的な不均一性が観察され13、14、15、16であり、この不均一性は、ワームにおける細菌定量のために広く使用されているバッチ消化測定17、18、19、20によって隠蔽することができる。
この研究は、宿主と微生物の関連における単一ワーム測定への依存度を高める必要性を示唆するデータと、単一ワームの中断における精度とスループットを向上させるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、個々のワームの乳棒ベースの破壊よりも優れた再現性とサンプルあたりの労力を提供しながら、生存可能な細菌負荷の定量化のために多数の 個々のC. elegans の機械的破壊を容易にするように設計されています。破壊の準備の前にワームが熱死した 大腸菌 を食べることが許可されている推奨される腸内パージステップは、最近摂取された他の一過性(非付着)細菌からの寄与を最小限に抑えるために含まれています。これらのプロトコルには、低濃度の表面漂白剤処理でキューティクルを洗浄するための冷麻痺法が含まれる。表面漂白は、単一ワーム破壊の準備ステップとして、または生きた外部無菌ワームを調製するための方法として使用することができる。この表面漂白方法は、広範囲の外部微生物を除去するのに十分であり、低温処理は、従来のレバミゾールベースの麻痺に代わるものを提供する。レバミゾールは寒さに敏感な実験に好まれるが、冷たい麻痺は有害な廃棄物の流れへの寄与を最小限に抑え、正常な活動の迅速な再開を可能にする。完全なプロトコルは、ワームが既知の細菌にコロニー形成される実験室実験を説明しているが、ワームの洗浄および単一ワーム破壊の手順は、野生のサンプルから単離されたワームまたは小宇宙実験でコロニー化されたワームに容易に適用することができる。ここで説明するプロトコルは、ワームの腸から抽出された生細菌を産生し、個々のワームのコロニー形成単位(CFU)のメッキおよび定量化に適しています。シーケンシングベースの腸群集分析では、その後の細胞溶解および核酸抽出ステップをこれらのプロトコルに追加する必要があります。
Protocol
これらの実験で使用されたワームは、NIH研究インフラプログラム局(P40 OD010440)が資金提供している Caenorhabditis 遺伝子センターから入手した。ブリストルN2はワイルドタイプです。DAF-2/IGF変異体 daf-16(mu86)I( CGC CF1038)および daf-2(e1370)III(CGC CB1370) は、腸内細菌負荷の違いを説明するために使用される。 pos-1 RNAiベクターを搭載したHT115(DE3)大腸菌</em…
Representative Results
生きた虫の漂白剤滅菌表面漂白されたワームは、運動性が戻り、排泄が再開するまで、外部細菌を効果的に含まない。ここで使用した条件下では、低温麻痺したワームの腸内関連細菌を乱すことなく(図1A-C、補足図2、ビデオ1)、緩衝液中の細菌の急速な絶滅が観察される(図1D-F、ビデオ2</s…
Discussion
ここでは、 C. elegansにおける細菌負荷の単一ワーム定量化の利点と、このタイプの大規模なデータセットの迅速かつ一貫した取得を可能にする96ウェル破壊プロトコルに関するデータが提示されています。既存の方法33と比較して、これらのプロトコルは、ワーム内の腸内微生物群集のより高いスループット測定を可能にする。
このアプローチは?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、H. SchulenbergとC. LaRockがこれらの実験で使用した細菌株を寛大に共有したことを認めたいと考えている。この研究は、エモリー大学とNSF(PHY2014173)からの資金提供によって支援されました。
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
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Cite This Article
Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).