Summary
このプロトコルは、外部細菌を除去するための低温麻痺および表面漂白後の個々の細菌的にコロニー形成された Caenorhabditis elegansの 96ウェル破壊を記載している。得られた懸濁液を寒天プレートに播種し、多数の個々のワームにおける細菌負荷の正確で中程度のスループット定量を可能にする。
Abstract
線虫 Caenorhabditis elegans は、宿主-微生物および宿主-微生物叢相互作用のモデル系である。これまでの多くの研究では、個々のワームサンプルではなくバッチ消化を使用して、この生物の細菌負荷を定量化しています。ここでは、 C. elegans 腸の細菌コロニー形成に見られる大きな個人間変動が有益であり、バッチ消化法は条件間の正確な比較に重要な情報を破棄すると主張している。これらのサンプルに固有の変動を記述するにつれて、多数の個体を必要とし、個々のワームの破壊およびコロニーメッキのための便利な96ウェルプレートプロトコルが確立される。
Introduction
宿主と微生物の関連における不均一性は遍在的に観察され、個体間の変動は、競争と共存1から疾患伝染2、3、4までの集団レベルのプロセスに寄与する要因としてますます認識されている。 C. elegansでは、アイソジェニック集団内の「隠れた不均一性」が繰り返し観察されており、個体のサブ集団はヒートショック応答5,6、老化、寿命7,8,9,10,11、および生理学および発達の他の多くの側面において明確な表現型を示している12.亜集団構造を同定しようとするほとんどの解析は、同種異系の同期ワーム5,7,8の実験集団における2つの亜集団の証拠を提供するが、他のデータは、別個のグループではなく集団内の形質分布の可能性を示唆している7,12,13.ここでの関連性は、微生物の共有供給源からコロニー化されたワームの同種性集団内においても腸集団における実質的な不均一性が観察され13、14、15、16であり、この不均一性は、ワームにおける細菌定量のために広く使用されているバッチ消化測定17、18、19、20によって隠蔽することができる。
この研究は、宿主と微生物の関連における単一ワーム測定への依存度を高める必要性を示唆するデータと、単一ワームの中断における精度とスループットを向上させるためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、個々のワームの乳棒ベースの破壊よりも優れた再現性とサンプルあたりの労力を提供しながら、生存可能な細菌負荷の定量化のために多数の 個々のC. elegans の機械的破壊を容易にするように設計されています。破壊の準備の前にワームが熱死した 大腸菌 を食べることが許可されている推奨される腸内パージステップは、最近摂取された他の一過性(非付着)細菌からの寄与を最小限に抑えるために含まれています。これらのプロトコルには、低濃度の表面漂白剤処理でキューティクルを洗浄するための冷麻痺法が含まれる。表面漂白は、単一ワーム破壊の準備ステップとして、または生きた外部無菌ワームを調製するための方法として使用することができる。この表面漂白方法は、広範囲の外部微生物を除去するのに十分であり、低温処理は、従来のレバミゾールベースの麻痺に代わるものを提供する。レバミゾールは寒さに敏感な実験に好まれるが、冷たい麻痺は有害な廃棄物の流れへの寄与を最小限に抑え、正常な活動の迅速な再開を可能にする。完全なプロトコルは、ワームが既知の細菌にコロニー形成される実験室実験を説明しているが、ワームの洗浄および単一ワーム破壊の手順は、野生のサンプルから単離されたワームまたは小宇宙実験でコロニー化されたワームに容易に適用することができる。ここで説明するプロトコルは、ワームの腸から抽出された生細菌を産生し、個々のワームのコロニー形成単位(CFU)のメッキおよび定量化に適しています。シーケンシングベースの腸群集分析では、その後の細胞溶解および核酸抽出ステップをこれらのプロトコルに追加する必要があります。
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Protocol
これらの実験で使用されたワームは、NIH研究インフラプログラム局(P40 OD010440)が資金提供している Caenorhabditis 遺伝子センターから入手した。ブリストルN2はワイルドタイプです。DAF-2/IGF変異体 daf-16(mu86)I( CGC CF1038)および daf-2(e1370)III(CGC CB1370) は、腸内細菌負荷の違いを説明するために使用される。
pos-1 RNAiベクターを搭載したHT115(DE3)大腸菌は、アーリンガーライブラリー21からのものである。C. elegans天然腸内細菌22のMYbコレクションを、シューレンブルク研究所から入手した。サルモネラ・エンテリカ LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR は、このラボ23 からのものです。シュードモナス・モッセリイはこの研究室で単離された。黄色 ブドウ 球菌 MSSA Newman pTRKH3-mGFPは、エモリー大学のLaRock Labから入手した。
すべてのワームバッファーおよび培地は、以前に公開された文献24 に従って、若干の変更を加えて調製されています( 補足ファイル1を参照)。
1. 同期滅菌C.エレガンスの調製
注: このセクションでは、生殖的に滅菌された成虫の同期集団を生成するためのステップバイステップの手順について説明します。 pos-1 RNAiプレートへの摂食は、この干渉が胚性致死的であるため、子孫の産生を防ぐためにここで使用されます。 pos-1 RNAiで成虫期に育てられたL1幼虫は産卵雌雄同体に発達するが、これらの卵は生存不能である25。RNAi給餌プロトコルは、ワームブック26の「逆遺伝学」の章のとおりです。
- ワームを同期させる前に、新鮮な10 cm NGM + pos-1 RNAiプレートが利用可能であることを確認してください。プレートは、濃縮誘導液体培養物(+Amp + IPTG)から新鮮に調製するか、NGM + 100 μg/mLアンピシリン+ 1 mM IPTG上に芝生として接種し、暗所で25°Cで1日間増殖させた27。
注:カルベニシリン(25μg/mL)は、RNAiプレート上でアンピシリンの代わりによく使用されます。アンピシリンは安価ですが、安定性は低くなります。アンピシリンを使用する場合は、乾燥したらすぐにプレートを播種し、できるだけ早く使用する必要があります(4°Cで<1週間保存することができます)27。ここで推奨される高い抗生物質濃度は、適切な選択を確実にするのに役立ちます。 - いくつかの(典型的には2〜4つの)NGMプレートから始め、重力雌雄同体の集団が多い。漂白剤-NaOH同期24を用いて卵を単離する。
- プレートあたり2 mLの滅菌ddH2 Oを使用して寒天プレートからワームを洗い流します。液体を1.5 mLの微量遠心チューブ(プレートまたは雌雄同体ごとに1本のチューブ)に均等に分配します。
- ベンチトップのミニ遠心分離機(2,000 x g)で約5秒間スピンダウンして、大人をチューブの底に引っ張ります。上清をピペットで取り除き、廃棄する。
- 1mLの滅菌ddH2Oで洗浄する。前と同じようにスピンダウンし、上清を捨てる。
- 前の手順を繰り返して、残りの細菌の破片を減らします。
- 各チューブの内容物を滅菌ddH2Oの1mLに再懸濁し、各チューブに市販の漂白剤(8.25%次亜塩素酸ナトリウム)130μLおよび5N水酸化ナトリウム(NaOH、最終濃度0.5N)130μLを加える。
- ボルテックスチューブは、成人の体が壊れるまで、少なくとも2分ごとに少なくとも10〜15秒間激しくチューブを流します。卵を殺さないように、漂白剤-NaOH処理を5分より長くしないでください。
- ミニ遠心分離機で2,000 x g で30〜60秒間回転させて卵をペレット化します。上清をピペットで取り除き、廃棄する。目に見えるペレットがあるかもしれませんし、ないかもしれません、これは正常です。
- 1 mL の M9 ワームバッファーを加え、2000 x g で 30 ~ 60 秒回転 させます。上清を捨てる。
- すすぎ工程(1.2.8)を5倍繰り返して漂白剤-NaOH混合物を完全に除去し、卵ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を除去する。
- 卵を10 mLのM9ワームバッファーに50 mLの円錐形チューブまたはキャップ付き30 mL培養チューブに移します。円錐形のチューブを使用している場合は、蓋を少し緩めたままにしておき、テープを少し使用して固定してください。幼虫が孵化できるように、25°Cおよび200RPMで一晩(16時間)振とうしながらインキュベートする。
- 同期したL1幼虫をRNAiプレートに移し、成虫期まで成長させる。
- 滅菌 M9 バッファー 2 mL + 0.01% Triton X-100 (以下 M9TX-01) を各 L1 チューブに加え、全容量 (12 mL) を 15 mL スクリュートップ円錐形チューブに移します。
- L1ワームを含む15mLチューブを4°Cで10分間置き、幼虫の動きを遅くする。
- 15 mL の円錐形チューブを大型卓上遠心分離機でスピンダウンします (1,500 x g で 4 °C で 3 分間、加減速は最大値の 80% 以下)。
- L1ペレットを乱すことなく上清を慎重にピペットで取り除きます。上清を捨てる。
- 12mLの冷たいM9TX-01を各チューブに加える。遠心分離を繰り返す。慎重にピペットオフし、上清を捨てる。各チューブには〜200μLが残っているはずです。
- M9TX-01 の 200 μL ピペットチップをすすぎ、ワームがプラスチックに付着しないようにしてから、このチップを使用してワームペレットを再懸濁します。再懸濁ワームを、細菌芝生上に液体の滴をピペッティングすることによって、調製した pos-1 プレートに移す。
- 成虫期の最初の日までプレートを25°Cでインキュベートする。
注: pos-1 RNAiプレート上でワームを増殖させる場合、ワームは、胚致死的表現型の高い浸透性を確保するために、成体期に完全に移行するまでRNAi細菌に 自由 摂取しなければならない(MUST)。プレートを24時間と48時間に確認します。プレートが飢えているか、ほとんど飢えているように見える場合、ワームはフルサイズの大人に成長するために新鮮なプレートに移動する必要があります。ワームが増殖する前にプレートが枯渇しないように、各10 cm RNAiプレートに250〜500匹のL1幼虫を追加することを目指してください。
- 成虫を収穫し、腸内 大腸菌 をクリアして無菌ワームを作ります。
- プレートあたり5mLのM9TX-01を使用して、プレートから成虫をすすいでください。バッファー+ワームを15mLの円錐形チューブに移し、大人がチューブの底に落ち着くようにします。
- 10 mLの新鮮なM9TX-01バッファーの変化で、目に見える細菌の濁りが残らなくなるまで成人をすすいでください(通常1-2倍)。チューブを700 x g で30秒間遠心分離してワームをペレットにするか、大人を重力で沈降させることができます。
- 10mLのM9TX-01でさらに1回洗浄を行い、外部細菌を減らします。
- ワームを、5 mL S 培地 + 2 x 熱死 大腸菌 OP50 (~5 x109 死滅細胞/mL) + 200 μg/mL のゲンタマイシン + 50 μg/mL のクロラムフェニコールを含む 50 mL 円錐形チューブまたは 30 mL 培養チューブに移します。円錐形のチューブを使用している場合は、蓋を少し緩めたままにしておき、テープを少し使用して固定してください。M9TX-01のガラスピペットを使用するか、プラスチックピペットをすすぎ、ワームがくっつかないようにします。
- 成人を25°Cで200RPMで24〜48時間振とうしながらインキュベートし、無菌成体を産生する。
注:ワームが抗生物質に>24時間留まる場合は、ワームが十分な食料源を持っていることを確認するために、より多くの熱死滅OP50を追加する必要があります。24時間でチューブをチェックし、濁りが目に見えて減少している場合は、ヒートキルドOP50を補充してください。
- スクロースは、Wormbookプロトコル24 に従って成人を洗浄し、細菌コロニー形成のための清潔で生殖的に無菌の同期成人専用ストックを得る。
- 60% スクロース、M9 ワームバッファー、および M9TX-01 のコールドボリュームが使用可能であることを確認します。簡単にするために、これらは前夜に4°Cで放置することができます。
- 洗浄する各サンプルについて、8 mLのM9TX-01を含む標識付き15 mL円錐管を作成し、氷上に脇に置いておきます。これらはステップ 1.5.10 で必要になります。
- 5 mLのM9TX-01をL1幼虫を含む各50 mLチューブに加える。全容量(現在は10 mL)を空の15 mLスクリュートップ円錐形チューブに移し、大人がチューブの底に落ち着くようにします。
- 上清を慎重にピペットで取り除き、廃棄する。
- 各チューブに10mLのM9TX-01を加え、チューブをアイスバケットに5〜10分間移動させます。
メモ: この時点で、ワームとすべてのバッファは氷上に保管する必要があります。 - 「高速温度」設定を使用して、大型卓上遠心分離機を4°Cに冷却します。
- 各チューブに10mLの冷たいM9TX-01を加えて、残っている破片を洗い流します。ワームを氷の上に落ち着かせてください。上清を取り除き、廃棄する。
- スクロースフロート:5 mLの冷M9緩衝液および5 mLの冷60%スクロース溶液を各チューブに加え、十分に混合する。次いで、各チューブ内のスクロース - 緩衝液混合物の上に1mLの冷たいM9緩衝液を注意深く浮かべる。float を追加した後は混ぜないでください。
注意:次の数ステップのために素早く移動してください - ワームは高濃度のスクロースにあまりにも長い間さらされると乾燥する可能性があります! - 1500 x g で4°Cで3分間遠心分離する。 生きた成虫の虫は、M9とスクロースの界面にあり、チューブの上部から約1mLです。
- ガラス製5mL血清学的ピペットを使用して、ウォーム層を冷M9TX-01(ステップ1.5.2から)で調製した15mL円錐管に移す。スクロースをあまりピペッティングせずに生きた虫の層を得るように非常に注意してください。
- 必要に応じて、M9TX-01 を加えて、等量の 10-12 mL/チューブを取得します。4°Cで1500 x g で1分間遠心分離し、次いで上清をピペットオフする。ワームはこの時点で室温に戻すことができます。
- 洗浄ステップ1.5.11を2回繰り返し、速度を4°Cで700 x g に下げ、時間を30秒に下げます。
2. 液体培養中の生きた細菌にワームを給餌する
注:このプロトコルは、液体培養でよく混合された条件下で実験室で増殖した細菌とワームをコロニー形成するために使用されます(補足図1)。ワームは、純粋培養物からの個々の分離株(例えば、エンテロコッカス・フェシウム28、29などの病原体)または分離株の混合物(例えば、最小マイクロバイオームコミュニティ14)でコロニー形成することができる。
- スクロース洗浄した同期成虫をプロトコルステップ1.5から15mL円錐管で開始する。ワームを12mLのSバッファーで1回洗い、上清を捨てる。
- 洗浄したワームを実験に必要なS培地の容量に再懸濁する。実験条件の量、ワームが分割される条件の数、およびワームと細菌の最終濃度を検討してください。
注:ワームの摂食は細菌の可用性30によって異なり、ワームは混雑31によってストレスを受ける可能性があります。液体培養におけるコロニー形成には、<1000ワーム/ mLおよび>107CFU / mLが推奨される。1011 CFU/mLは、大腸菌32の「自由摂取」摂食密度とみなされる。 - 細菌培養物をスピンダウンします。上清を注ぎます;吸引またはピペッティングを使用して、緩いペレットを形成する細菌の上清を除去することができる。
注: 培養物 >5 mL の場合は、15 mL チューブに移し、大型卓上遠心分離機で約 2800 x g で 8 ~ 10 分間回転させます。培養物<5 mLを1.5 mLチューブに移し、小さな卓上遠心分離機で9000 x g で1〜2分間遠心分離することができます。運動性の高い細菌(例えば、多くの種の シュードモナス)は、安定したペレットの形成を容易にするために4°Cで10〜15分間冷却する必要があるかもしれません、そしてそれは4°Cで遠心分離する方が良いかもしれません。 - 細菌培養物を1容量のS緩衝液に再懸濁し、ペレットに再度遠心分離する。先ほどと同様に上清を取り除いて捨てます。
- 実験のための所望の密度でS培地に細菌培養物を再懸濁し、選択のために任意の抗生物質を加えた。使用される抗生物質は、もしあれば、コロニー形成に使用される細菌の耐性プロファイルに依存するであろう。
- M9TX-01でコーティングされたピペットチップを使用して、ワームがS培地に完全に再懸濁されるまでピペットワームを穏やかに上下に動かし、次いで細菌コロニー形成のためにチューブまたはプレートウェルに移す。
- 各ワーム培養物に細菌懸濁液を加えて、所望の細菌濃度および最終体積に達する。
- コロニー形成にマルチウェルプレートを使用する場合は、プレートを滅菌96ウェルガス透過性封孔膜で覆う。
- インキュベーション中に細菌が沈降するのを防ぐために、200 RPMで振とうしながらインキュベートします。
3. 96ウェルフォーマットでの個々のワームの機械的破壊
注:このセクションでは、個々の細菌にコロニー形成された C. elegansの機械的破壊のための96ウェルプレートフォーマットプロトコルについて説明します。プロトコル(3.1-3.8)の最初のステップは、ワーム腸から非付着細菌を除去し、冷たい麻痺および表面漂白を使用してワームの外側を洗浄する方法を記載している。これらのステップは、細菌内容物の定量化のために機械的に破壊されるか(3.8末端)、またはさらなる実験(補足図1)に使用することができる、清潔で生きた成虫ワームを生成する。このプロトコルは、液体培養(セクション2)、寒天プレート上、または天然または小宇宙土壌からコロニー化されたワームの細菌を定量化するために適合させることができる。
- M9TX-01のアリコートを氷の上に置き、冷やします(サンプル数の4〜5倍(mL単位)。
- M9TX-01+漂白剤(6%次亜塩素酸ナトリウム、1:1000または1:2000 v/v、サンプルあたり1 mL + 1 mL余分に)のアリコートを調製し、氷の上に置き、冷やします。このアリコートは、ステップ 3.8 で使用されます。
- 破壊されたワームサンプルの段階希釈のために96ウェルプレートを調製する。
- 蓋付きの滅菌300 μL容量96ウェルプレートを入手します。このプロトコルは、消化された12匹のワームごとに1つの希釈プレートを使用する。
- 96ウェルマルチチャンネルピペッターを使用して、各96ウェルプレート(300 μL容量)の列B-Dを180 μLの1x PBSバッファーで満たします。一番上の行は空のままにします。行B〜Dは、ワームダイジェストの10倍の連続希釈[0.1x、0.01x、0.01x]になります。
- 皿は脇に置いておきます。希釈プレートはステップ3.13で使用されます。
- 各ワームサンプルを1 mLのM9TX-01に1.5 mLの微量遠心チューブに再懸濁します。
- チューブを25°Cの低速ミニ遠心分離機(2,000 x g)で短時間(2〜3秒)スピンして、成人をペレット化する。上清をピペットで取り除き、ワームペレットを乱さないようにして廃棄する。
- ステップ3.5の遠心分離設定を使用して、ワームを1mLのM9TX-01で2回、次いで1mLのM9ワームバッファーで1回すすぎ、外細菌を減少させた。
- ワーム腸から付着していない細菌をパージします。
- ワームの各サンプルを培養管内の1mLのS培地+2x加熱死滅OP50に再懸濁する。
- 25°Cで20〜30分間インキュベートし、腸からの非付着細菌の通過を可能にする。
注:これにより、内腔から細胞外蛍光タンパク質がパージされ、特に抗酸蛍光色素(mCherry、dsRedなど)が使用されている場合、腸上皮に付着した標識細菌をより明確に視覚化できます。
- 表面漂白剤ワームは、外部細菌を除去します。
- パージしたワームを1mLの冷たいM9TX-01で2回すすぎ、上清を捨てる。
- チューブを氷上(望ましい)または4°Cで10分間冷やすことができます。 これはワームを麻痺させ、漂白剤の摂取を防ぎます。
注:他のプロトコルは、レバミゾールなどの化学麻痺剤を使用する。これは、有害廃棄物ストリームの追加を必要とする確立されたアプローチ33 である。 - 氷冷したM9ワームバッファー1mL+無香料漂白剤(8.25%水酸化ナトリウム、1:1000または1:2000 v/v)を各チューブに加えます。チューブを氷の上(好ましい)または4°Cで少なくとも10分間座らせて、外部細菌を殺す。
注:漂白剤の濃度は1:1000を超えないでください。麻痺したワームでさえ、死亡率が生じる可能性があります。 - 漂白剤バッファーをピペットオフし、廃棄;漂白剤が取り除かれるまでワームがポンピングを再開しないようにするために、チューブを氷に戻します。
- 各チューブに1mLの冷たいM9TX-01を加える。ミニ遠心分離機(25°Cで2,000 x g )で〜5秒間スピンする。チューブを氷に戻す。上清を取り除き、廃棄する。
- 別の1mLの冷たいM9TX-01でこのすすぎ工程を繰り返し、できるだけ多くの上清を捨てる。
注:さらなる実験にワームを使用する場合は、透過処理ステップ(プロトコル3.9)をスキップし、代わりに表面漂白したばかりの成虫を6cmのペトリ皿の氷冷バッファーに移し、プロトコル3.10のようにワームを実験条件に分けてください。運動性が再開するのを防ぐためにワームを冷たく保ちますが、すぐに機能します - 氷上でワームを>30分間保持すると、通常の活動が<100%再開される可能性があります34。
- ドデシル硫酸ナトリウムおよびジチオトリエトール(0.25% SDS + 300 mM DTT)によるワームキューティクルの化学的透過(35に基づく)
警告: DTT は還元剤であり、刺激性です。PPEを着用し、乾燥したストックや溶液を扱うときはヒュームフードで作業してください。有害廃棄物の流れが必要です。- ヒュームフード内で、各サンプルに100 μLを許容するのに十分なSDS/DTT溶液を準備します。1 mL の場合、1.5 mL の微量遠心チューブ内の M9 ワームバッファーまたは M9TX-01 965 μL に、5 μL の 5% (w/v) SDS および 30 μL の 1M DTT を追加します。
注:1 M DTT溶液(水性)は、効力を確保するために、新鮮に調製するか、-20°Cのアリコートに保存する必要があります。アリコートは、過度の凍結融解サイクルを避けるために、2 ~ 3 回の実験で使用するようにサイズ変更する必要があります。 - 表面漂白されたワームを含む微量遠心チューブを室温のチューブラックに移動します。各チューブには、約20μLのバッファーにワームが含まれている必要があります。
- 各ワームサンプルに 100 μL の SDS/DTT 溶液を追加します。残りのSDS/DTTソリューションは、適切な有害廃棄物ストリームに廃棄してください。
- 治療をベンチで最大8分間進行させて、成虫の耐性キューティクルを部分的に分解する。ワームは死に、この間にチューブの底に落ち着きます。
- 透過処理時間が経過したら、SDS/DTT上清を慎重にピペットで取り除き、適切なSDS/DTT有害廃棄物ストリームに廃棄します。
- 各チューブに1mLのM9TX-01を加える。卓上遠心分離機で短時間回転させてワームをペレット化するか、ワームが重力によってチューブの底に沈降し、上清を引き出してSDS/DTT有害廃棄物流に処分します。
- ワームを 1 mL の M9 ワームバッファー + 0.1% Triton X-100 に再懸濁して、使用できる状態になるまで再懸濁します。
- ヒュームフード内で、各サンプルに100 μLを許容するのに十分なSDS/DTT溶液を準備します。1 mL の場合、1.5 mL の微量遠心チューブ内の M9 ワームバッファーまたは M9TX-01 965 μL に、5 μL の 5% (w/v) SDS および 30 μL の 1M DTT を追加します。
- ワームを深い96ウェルプレートに分離し、炭化ケイ素グリットで機械的に破壊します。96ウェル破壊プレートを以下のように準備する。
- 滅菌した2 mLのディープウェル96ウェルプレートと、一致するシリコン96ウェルプレートカバーを入手します。
注: 組織ディスラプターには、96 ウェルアダプターと互換性のあるプレートを使用することが重要です。外形寸法のわずかな違いが、アダプターから取り外すことができるプレートとできないプレートの違いを生みます。 - 滅菌スクープヘラを使用して、少量の滅菌36グリット炭化ケイ素を、ワームを受け取るプレートの各ウェルに加える。井戸の底をかろうじて覆うのに十分なグリットを使用してください(井戸あたり約0.2g)。過剰な材料は、内容物を取り出すときに井戸の底にピペットチップを得ることを困難にします。
- 180 μL の M9 ワームバッファーを各ウェルに加えます。
- 各サンプルがどこに行くかを示すために列または行にラベルを付け、シリコン96ウェルプレートカバーでプレートをゆるやかに覆います。
- 滅菌した2 mLのディープウェル96ウェルプレートと、一致するシリコン96ウェルプレートカバーを入手します。
- 個々のワームを96ウェルプレートに移して中断させます。
- 透過処理したワームを、ディッシュを〜1cmの深さまで満たすのに十分なM9TX-01を含む小さな(35または60mm)ペトリ皿に慎重に移動させる。
注:多数のワームが存在する場合、液体が混雑し、個々のワームをピペットすることが困難になるため、サンプル全体を転送することは現実的ではない場合があります。 - 解剖顕微鏡または他の低倍率装置を用いて、個々のワームを20μL容量でピペットオフし、これらのワームを96ウェルプレートの個々のウェルに移す。
注:殺されたばかりのワームだけを収穫するのが最善です。これらのワームはしばらくの間死んでいた可能性があるため、硬い直線形状のワームは避けてください。湾曲した、またはS字型のワームを服用し、正常な肉眼的な生理機能と無傷の腸を服用してみてください。 - 各ボリュームを転送した後、選択したワームが実際にウェルに排出されたことを確認します。これを行うには、ペトリ皿の透明な領域からM9TX-01の20μLをピペットで送り出し、全容量を皿に戻します。これは通常、ワームがピペットにくっついている場合にワームを排出します。ワームが詰まっていた場合は、ウェルから20 μLを取り出し、移入を再試行してください。
- すべてのワームを移したら、96ウェルプレートを市販の柔軟な紙裏面封止フィルム(2 x 2マス)で覆い、封止フィルムの紙裏面がサンプルウェルに下を向いていることを確認します。シールフィルムが薄すぎたり、後から外すのが非常に難しくなったりしないように注意してください。
- シリコンシーリングマットをフレキシブルシーリングフィルムの上に軽く置きます。この時点では、カバーを井戸に押し込まないでください。
- プレートを4°Cに動かして30〜60分間冷やします。これにより、サンプルを損傷する可能性のある破壊中の過熱を防ぐことができます。
メモ: これはプロトコルのブレークポイントです。ほとんどの場合、プレートは研削前に最大4時間4°Cに放置することができます。これは細菌の数を変えるので、一晩ワームを離れないでください。
- 透過処理したワームを、ディッシュを〜1cmの深さまで満たすのに十分なM9TX-01を含む小さな(35または60mm)ペトリ皿に慎重に移動させる。
- 96ウェルプレートを組織破壊器に負荷をかけ、ワーム組織を分解し、腸内細菌を放出します。
注:(オプション)消化に奇数の96ウェルプレートを使用する場合は、先に進む前にカウンターウェイトを準備する必要があります。空の深い96ウェルプレートを使用し、最初のプレートと同じ重さになるまでウェルを水で満たします。- シリコンシーリングマットをウェルにしっかりと押し込んでシールを作成し、蓋がプレートの表面全体に平らに収まっていることを確認します。
注:延伸後にフレキシブルシーリングフィルムが厚すぎると、シリコン蓋をすべてのウェルに平らに横たわるように固定することが困難になります。これにより、シールが不十分になり、振盪中にウェルツーウェル汚染が発生します。 - 96ウェルプレートアダプターを使用して、組織ディスラプターにプレートを固定します。プレートを30Hzで1分間振った後、プレートを180°回転させてから、再度1分間振ってください。これは、プレートのすべてのウェルで均一な混乱を確実にするのに役立ちます。
- ベンチにプレートを2〜3回しっかりとタップして、柔軟なシーリングフィルムからグリットを取り除きます。
- 2 つの 96 ウェルプレートアダプターを備えた大型遠心分離機を使用して、プレートを 2400 x g で 2 分間回転させ、すべての材料をウェルの底に集めます。
- シリコンの蓋を取り外し、フレキシブルシーリングフィルムを慎重に引き抜きます。
メモ: フレキシブルシーリングフィルムがウェルのいずれかに付着している場合は、200 μL のピペットチップを使用して取り外します。これは、可撓性封止フィルムが薄すぎて延伸された場合に一般的である。
- シリコンシーリングマットをウェルにしっかりと押し込んでシールを作成し、蓋がプレートの表面全体に平らに収まっていることを確認します。
- ワーム消化サンプルを96ウェルプレートで300 μLで連続希釈します。
- 200 μLに設定したマルチウェルピペッターを使用して、ピペットを数回ゆっくりと慎重に上下させてウェルの内容物を再混合し、できるだけ多くの液体を引き出します。この液体を、ステップ3.3で調製した96ウェルプレートの最上段に移す。
- 20 μLに設定した96ウェルピペッターを使用して、この量の液体を一番上の列から取り出し、B列に分配します。ヒントを捨てる。
- ステップ 3.13.2 を繰り返し、行 B の 0.1x サンプルから始めて、行 C の 0.01x 希釈サンプルを作成します。
- 手順 3.13.2 をもう一度繰り返し、行 C から行 D に移動します。
- 細菌定量のために固体寒天上にプレートする。単コロニー化したワームの場合、一般に、寒天プレート上に各希釈液[1x-0.001x]の10〜20μL滴をプレート化すれば十分である。多種コロニー形成のために、100 μLを10 cm寒天プレートにピペッティングすることによって各希釈液を別々にプレート化する。ガラスメッキビーズを使用してすぐに広げます。
4. 再利用のための炭化ケイ素グリットの洗浄
注:この手順は、実験後に再利用するために、研削材料である炭化ケイ素グリットを洗浄および滅菌するために使用されます。炭化ケイ素グリットは工業製品であり、事前に滅菌されていないため、このプロトコルは最初の使用前に完全に従う必要があります。Siカーバイドグリット(3.2g / cc)は、緻密で粗いエッジの材料で、タフなサンプルを破壊するために効率的に機能します。ただし、粒子は繰り返し使用すると摩耗する可能性があるため、摩耗が明らかになったら交換する必要があります。幸いなことに、材料は安価であり、一般的に販売されているサイズ(〜1ポンド)は多くの実験に十分です。
- めっき用のサンプルを除去した後、96ウェルプレートのすべてのウェルに10%漂白剤溶液を加え、少なくとも10分間放置する。
- すべての内容物をキャッチするのに十分な大きさの小さなハイサイドトレイまたは空のP1000ピペットチップ容器の上に96ウェルプレートを素早く反転させて、グリットの大部分を取り除きます。グリットはすぐにトレイの底に沈みます。漂白剤溶液をシンクに注ぎます。
- 96ウェルプレートに水道水を入れ直し、同じトレイにひっくり返して、残った砂を洗い流します。シンクに水を注ぎます。
- プレートが完全に汚れなくなるまで、水道水でさらに1〜3回繰り返します。
- 水道水でグリット2xをすすぎ、毎回トレイに充填します。
注:96ウェルディープウェルプレートは、実験室の食器洗い機で洗浄し、ホイルでしっかりと覆い、他の再利用可能なプラスチックでオートクレーブすることができます。グリットはすぐに洗う必要はなく、この時点で脇に置いておくことができます。使用済みのグリットは、通常、洗浄およびオートクレーブの前に複数の実験から蓄積される。 - 実験用洗剤の溶液でグリットを30分間洗浄し、時折渦巻くか金属ヘラと混合して攪拌する。
- 水道水のいくつか(8-10)交換で洗剤の痕跡をすべて洗い流し、蒸留水で2倍すすいでください。
- 浅いポリプロピレン製オートクレーブトレイなどの開いたトレイにグリットを広げ、40~70°Cで数時間乾燥させる。
メモ:乾燥時にグリットがごつごつしている場合は、十分に洗浄またはすすぎませんでした。手順4.6から洗浄プロトコルを繰り返し、手順4.7でリンスを追加します。 - 清潔で乾燥したグリットをスクリュートップのオートクレーブ可能なガラス瓶に最大5〜6cmの深さまで分配します。オートクレーブを予備真空サイクルで30分間滅菌します。
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Representative Results
生きた虫の漂白剤滅菌
表面漂白されたワームは、運動性が戻り、排泄が再開するまで、外部細菌を効果的に含まない。ここで使用した条件下では、低温麻痺したワームの腸内関連細菌を乱すことなく(図1A-C、補足図2、ビデオ1)、緩衝液中の細菌の急速な絶滅が観察される(図1D-F、ビデオ2)。これらのデータは、表面漂白が腸内容物を損なうことなくワームを外部から消毒するために効果的に使用できることを示している(表面漂白されたワームに関連するCFU数と漂白剤を含まないWCU数の比較は有意ではなく、Wilcoxonランクサム検定p >0.05)。
マルチサンプルの機械的破壊のバリエーション
ワームを機械的に破壊するための96ウェル技術は、使用される特定の材料に対して堅牢であり、実用的な考慮事項が研削材料の選択を決定します。以前のレポート33と同様に、手動破壊(図2A)は、Si-carbideの0.229、大きなガラスビーズの0.243(図2C)、および小さなガラスビーズの0.227(図2D)と比較して、すべてのバッファ条件にわたって標準の96ウェルプロトコル(炭化ケイ素グリット、図2B)(var(log10CFU)= 0.499)よりも異質性が高かった(図2D).それにもかかわらず、CFU/ワーム分布のほとんどの違いは有意ではなかった(Kruskal-Wallace、p = 0.017、df = 3、大きなビーズ対小さなビーズの有意なポストホックウィルコクソン検定、p = 0.021、および大きなビーズ対炭化ケイ素グリット、p = 0.02)。界面活性剤としてのTriton X-100の使用は、個々の因子(Kruskal-Wallace、p = 0.94、df = 3)として考慮した場合、収率の有意な差とは関連していなかったが、大きなビーズ(2.7mm)を使用した場合のトリトン含有サンプルとトリトン含有サンプルの収率の明らかな増加があり(図2C)、おそらくトリトンが存在していたときにこれらのウェルで観察された過剰な「発泡」に起因する可能性がある。これらの結果は、大きなガラスビーズが、均質化チューブ33での使用には理想的であるが、96ウェル技術には適していないことを示している。小さなガラスビーズは妥当な結果をもたらしましたが(図2D)、混合およびめっき中に200μLのピペットチップが一貫して詰まりました。このアッセイにおける標準材料である炭化ケイ素グリットは、安価であり、標準チップを詰まらせるには大きすぎ、ガラスビーズなどはオートクレーブ後に洗浄して再利用することができる。グリットはバッファーに少量の「ほこり」を放出しますが、これはめっきを妨げませんが、破壊生成物をフローサイトメトリーに使用する場合はろ過する必要があります。
成虫の細菌コロニー形成における不均一性
個々のワームの破壊に成功すると、細菌のコロニー形成における不均一性が明らかになる。同じ細菌プール上に同時にコロニー形成された、同種性同期ワーム集団からの個体は、腸内細菌負荷において一貫して100倍以上の範囲を示す。これは、異なる細菌コロニー(図3A)および多種細菌群集(図3B)でのコロニー形成中に観察される。この不均一性は、ワームが蛍光タンパク質(GFP)を発現する細菌にコロニー形成されている場合の蛍光の個体-ワーム測定においても明らかである(図3C-D)。野生型ブリストルN2ワームのコロニー形成をDAF-2/IGF変異体の同じ細菌によるコロニー形成と比較することによってわかるように、宿主の特性は、この不均一性の形成に役割を果たしている。このdaf-16変異体は、N2と比較して多くの細菌のより大きな集団をサポートし、daf-2は細菌36の範囲によるコロニー形成に耐性である(図3B、D)。この異質性は特徴的であり、宿主と入植者の異なる組み合わせ間で変動を示しながら、同じ実験の異なる実行にわたって一貫した構造を維持している(図3E-F)。
グループの正確な比較のための個々の不均一性の重要性
個々の異質性の重要性は、バッチダイジェストがデータの分布をどのように変更するかを検討することで簡単に確認できます。天然型マイクロバイオーム細菌MYb53(ロドコッカス・エリスロポリス)およびMYb120(クリソバクテリア属)によるコロニー形成N2成人(図3A、4A)が例として用いられている。個々のワームデータは分布が明らかに類似しています(両側t検定、p = 0.9、ウィルコクソンランク合計、p = 0.59)。バッチダイジェストの効果をシミュレートするためにこれらのデータを再サンプリングすると、バッチ外挿CFU/ワームは、これらの分布の正のスキュー(平均>中央値)のためにデータの上位分位数に向かって引っ張ります。バッチ処理はバッチ内の個人に対して効果的に平均化されるため、バッチ外挿CFU/ワームは個々のデータの算術平均を中心にし、中心極限定理に従ってバッチが大きくなるにつれてこの平均までの距離が短くなります(図4B-D)。したがって、生物学的変異からのシグナルは迅速に失われる。バッチで推定されたCFU/ワーム測定値は、これらの対数スケール分布データの代表メトリックではない平均に向かって収束します。MYb53とMYb120による推定コロニー形成の差異は、シミュレートされたバッチダイジェスト(t検定バッチ5、p = 0.049;バッチ10、p = 2.27e-4;バッチ20、p = 1.19e-15;ウィルコクソン順位和検定バッチ5、p = 2.27e-4;バッチ10、p = 2.70e-06;バッチ20、p = 1.80e-09)として、元の信号が不明瞭になる。
微生物伝播に対する個々の不均一性の影響
個々のワームは細菌のコロニー形成において実質的な不均一性を示すので、この不均一性が下流効果を有するかどうかを尋ねることは合理的である。例えば、伝播が腸内細菌負荷の関数であるかもしれないと予想することは合理的である。表面漂白された個々のワームを清潔な環境に移すことにより、排泄された生細菌による環境の接種を観察することができる。これらの実験では、共生性オクロバクトルムMYb14-GFPまたは病原性黄色ブドウ球菌-GFPの一般的に実質的な集団(10 3-105 CFU/ワーム、図5)を担持した表面漂白済みのコロニー形成済み成虫を、NGM寒天上の加熱殺されたOP50芝生上で1.5時間ローミングさせた。これらのワームを排泄プレートから再採取し、細菌定量のために破壊する場合、細菌負荷と生細菌の排泄速度との間に有意な関係はない(対数形質転換コロニー/hrとCFU/ワームの間のピアソン相関:MYb14 rho = 0.19、p = 0.45;黄色ブドウ球菌 rho = 0.02, p = 0.9) (図 5).また、プレート上のコロニーの有無と腸内細菌負荷との間には有意な関係もない(対数変換CFU/ワームを因子とする二項ロジスティック回帰:p = 0.15、df = 53)。プレートのかなりの部分が新しい成長(MYb14の9/18プレート、黄色ブドウ球菌の10/36プレート)がなく、全体的な排泄率が低いことを示している。
ワームが寒天プレートに排泄されるとき、ワームあたりの生きた排泄細菌の実際の数は、ワームがコロニーを通過して新しい成長の痕跡を作り出す「農業」によって混乱します(図6)37。 n個の コロニーを有するプレートは、生きたコロニー形成細菌が排泄された少なくとも1つの事象、最大で n個の事象を表す。この観察から、(1,n)内の排泄事象が実際に何個発生したかを知ることはできず、また、各事象において何個の細菌が排泄されたかを知ることもできない。したがって、これらのデータを用いて腸内からの生菌の排泄率を正確に推定することは不可能である。しかし、いくつかの境界を推測することは可能です。プレートあたりのコロニー数はあまり有益ではありませんが、存在/不在データは排泄率の大まかな推論に使用できます。簡単にするために、生細菌の排泄速度が細菌負荷の関数ではなく、排泄がポアソンプロセスであると仮定すると、λがMYb14で0.33ワーム-1時間- 1のとき、18 回の試行で少なくとも9つの事象を観察する可能性≈〜50%である。 黄色ブドウ球菌の場合、0.2ワーム-1 時間-1 のλ≈同様のもっともらしい率が得られる。これらの大まかな計算は、生細菌の排泄率が低いことを示唆しているが、信頼性の高い推定値を得るためには、より多くの個々のワームに対するこのプロセスのより正確な定量化が必要となる。
データの可用性:
ここに示されているデータはDryad(https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2)で利用可能です。
図1.低濃度の表面漂白処理は、緩衝液中の細菌を迅速に殺しますが、寒冷麻痺したワームの腸内コミュニティを乱すことはありません。(A-C)表面漂白中のM9ワームバッファー中の細菌CFU/mLを3つの異なる濃度(1:1000、1:2000、1:5000 v/v;比較のために未漂白対照)で行い、(A)黄色ブドウ球菌ニューマン、(B)エンテリカ菌LT2、または(C)大腸菌OP50を標的とする。サンプルは、曝露後20分までの指示された時点で採取し、漂白剤がプレート上のコロニーを死滅させるのを防ぐために滅菌緩衝液で2回洗浄した。1:1000条件のデータは、これらのデータがプロットに表示されるようにわずかにオフセットされます。(D-F)個々のN2ワームにおける腸内細菌(n = 実験あたり24匹のワーム、別々の日に2つまたは3つの独立した実行)。表面漂白ワーム関連CFU数と無漂白ワーム関連CFU数のすべての比較は有意ではない(ウィルコクソンランクサム検定p > 0.05)。灰色の水平線は検出の閾値を表し、200 μL容量から10 μLアリコートをメッキした場合に少なくとも1つのコロニーを観察する確率が〜60%である密度(40 CFU /ワーム)として定義されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.96ウェル破壊プロトコルは、一貫した結果を生み出し、材料の選択に堅牢です。単一の細菌種で48時間コロニー形成したN2成虫ワーム(P. mosselii)を標準プロトコールに従って表面漂白および透過処理し、次いで個々のワーム(条件あたりn = 24)を用いてCFUめっきのために機械的に破壊した(A)電動乳棒または(B-D)を用いて個々の0.5mLチューブ中での手動破壊または(B-D)プロトコルに詳述されている96ウェル破壊プロトコルのバリエーション。破砕は、様々な濃度のTriton X-100(x軸、0-0.1%、v/v)および(B)36グリット炭化ケイ素、(C)小型(425-600μm)ガラスビーズ、または(D)大型(2.7mm)ガラスビーズのいずれかを含むM9ワームバッファー中で行った。すべてのプロットについて、示されているデータはログ10(CFU /ワーム)であり、各ポイントは1つの個別のワームです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.C.エレガンス腸の不均一な細菌コロニー形成。(a)方法のように調製されたN2成体雌雄同体の一種コロニー形成。細菌は、MYb在来ワームマイクロバイオームコレクション(Dirksen et al. 2016)からの4種(n = 24ワーム、それぞれ1つの実験)および2つの病原体、黄色ブドウ球菌MSSA Newman(SA)およびサルモネラ・エンテリカLT2(SE)(n = 2/3の独立した実験にわたる96〜144のワーム)である。天然のマイクロバイオーム種によるコロニー形成は、液体S培地+ 108CFU/mL細菌中で25°Cで48時間インキュベートした後に評価された。病原体によるコロニー形成は、NGMワーム寒天の芝生上で25°Cで24(SA)または48(SE)時間インキュベートした後に評価した。 (48時間で、黄色ブドウ球菌のワームはほとんど死にました。(B) N2、daf-16(mu86)およびdaf-2(e1370)成虫の総CFU/ワームを、8種の最小天然微生物叢上の液体培地中で4日間コロニー形成した(Taylor and Vega、2021からのデータ)14。(C-D)緑色蛍光は、GFP発現細菌にコロニー形成した個々のワームにおいて、大目的フローサイトメトリーによって観察される。(C)において、N2成虫の同期集団を、(A)に記載されるようにOP50(非蛍光性、n=1908個体成虫虫)、黄色ブドウ球菌(GFP、n=968)、またはエンテリカ菌(GFP、n=1153)でコロニー形成した;OP50対照は、成体N2ワームの3日目における緑色チャネル自己蛍光の典型的なレベルを示す。(D)において、N2(n=1165)、daf−16(mu86)(n=1180)、およびdaf−2(e1370)(n=2267)成体の同期集団を、(A)に記載されるようにプレート上で共生オクロバクトルムMYb14−GFPで2日間コロニー形成した。(E-F)黄色ブドウ球菌(E)およびエンテリカ菌(F)によるコロニー形成の日々の変動(パネルAおよび図1と同じデータ、n=実験あたり48匹のワーム)。X 軸はサンプリングの日を示します。灰色の水平線は検出の閾値を表し、少なくとも1つのコロニーを観察する確率が〜60%である密度として定義される(単一種コロニー形成の場合は40 CFU /ワーム、多種コロニー形成の場合は4 CFU /ワーム、200 μLのうちそれぞれ10 μLと100 μLのめっき量が異なるため)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.バッチ処理では、歪んだ対数スケール データの生物学的変動が消去されます。図 3 の CFU/worm データを置換して再サンプリングし、バッチ サイズごとにシミュレートされたデータの n = 25 レプリケート セットを作成しました (サイズはバッチあたりの個々のワームの数)。CFU/worm は、シミュレートされた各バッチの合計 CFU を、バッチあたりのワーム数で割ったものです。生データ(パネルA)では、MYb53の平均CFU/ワームは4450.8(10 3.6)、MYb120の平均CFU/ワームは1398.3(103.1)です。バッチ推定された数値は、バッチサイズが増加するにつれてこれらの値に収束します(B、5つのワーム/バッチ;C、10ワーム/バッチ;D, 20 ワーム/バッチ), 中心極限定理からの期待と一致する.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5.生細菌の排泄は、個々のワームの腸内のCFU負荷とはあまり相関していない。 ここで、N2成虫は 、黄色ブドウ球菌-GFPまたはMYb14-GFPの芝生にそれぞれ1または2日間給餌することによりコロニー形成した。検出可能なGFP蛍光(大型物体フローサイトメーター上の総GFP>1.8ログ)を有するワームをバルク集団から選別し、方法に記載されるように表面漂白し、NGM+加熱死滅OP50プレートに個々に移した。対数変換されたコロニー/hとCFU/ワームの間のピアソン相関は有意ではない(MYb14 rho = 0.19, p = 0.45; 黄色ブドウ球菌 rho = 0.02, p = 0.9). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6.細菌の「農業」は、寒天プレート上の排泄事象の数を不明瞭にする。 ここにワーム排泄物からのMYb14-GFPコロニーを有する2つのプレートがある。最初のプレート(A)は、ワーム経路に沿った「農業」の明確な証拠を有し、コロニー間のGFP発現(黄色がかった色素沈着として見える)の違いに基づいて、少なくとも2つの別々の排泄事象を表すようである。第2プレート(B)はより曖昧であるが、農業は植民地の位置に基づいて除外することはできない。これらの実験では、N2成虫を、MYb14-GFPの芝生を含む寒天プレートに給餌することによって48時間予めコロニー形成した。コロニー形成後、ワームを調製し、方法に従って表面漂白し、次いで、M9ワーム緩衝液+0.1%Triton X-100の5μLアリコートに6cm NGM+加熱死傷OP50プレート(5x濃縮熱死剤OP50の50μLスポットを表面に乾燥させることによって調製)に移した。ワームは25°Cで1.5時間ローミングし、プレートからピックアップし、CFU/ワームメッキのために破砕しました(電動乳棒を使用して、個々の0.5mLチューブ内の20μLバッファーで手動で破砕)。プレートを計数する前に25°Cで2日間インキュベートしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1.表面漂白を伴わないGFP蛍光 黄色ブドウ球菌 でコロニー形成したN2ワームの可視化。 キューティクル上の少数の蛍光細胞は、画像がワームの体内を通過するにつれて焦点の合わない動きをし、視野が体表面から腸に移動するにつれて、腸の空間的に不均一なコロニー形成が見えるようになる。Zスタック画像は、倒立蛍光顕微鏡上で倍率20倍で撮影した。明視野およびGFPフィルタリングされた蛍光画像を重ね合わせ、Zスタック全体の画像をベンダーソフトウェアを使用してステッチしました。画像は、 補足図2Aと同じスライドからのものです。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ 2.GFP蛍光黄色 ブドウ球菌 をコロニー形成したN2ワームを表面漂白(1:1000 v/v、20分間)で可視化。 蛍光細菌による空間的に不均一なコロニー形成は、この個体の腸内で見え、細菌が身体組織に浸潤し、感染の進行を示している。キューティクルには細菌は見えません。Zスタック画像は、倒立蛍光顕微鏡上で倍率20倍で撮影した。明視野およびGFPフィルタリングされた蛍光画像を重ね合わせ、Zスタック全体の画像をベンダーソフトウェアを使用してステッチしました。画像は、 補足図2Bと同じスライドからのものです。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1.プロトコルの概要。 ここでは、同期成虫は、96ウェルフォーマットで個々のワームを機械的に破壊する前に、赤色細菌でモノコロニー化され、表面漂白され、透過処理される。腸から放出された細菌は、CFU /ワーム定量のために10xシリーズで希釈メッキされます。示されているプレートは、観察された不均一性について典型的である。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2.GFP蛍光黄色 ブドウ球菌 にコロニー形成したN2ワームの可視化(表面漂白の有無にかかわらず)(1:1000 v/v、20分間)。 (A)漂白されていないサンプルでは、外部細菌は、ワームまたはワーム体断片に関連しない緑色蛍光の領域として低倍率で見える。(b)表面漂白試料において、GFP蛍光は、ワーム体の内部に制限されている(1つのワーム体断片が画像の中央に見える)。全ての画像は、倒立蛍光顕微鏡上で倍率4倍で撮影した。明視野およびGFPフィルタリングされた蛍光画像を重ね合わせ、隣接する視野からの画像をベンダーソフトウェアを使用して縫い合わせた。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:バッファとソリューションのレシピ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、 C. elegansにおける細菌負荷の単一ワーム定量化の利点と、このタイプの大規模なデータセットの迅速かつ一貫した取得を可能にする96ウェル破壊プロトコルに関するデータが提示されています。既存の方法33と比較して、これらのプロトコルは、ワーム内の腸内微生物群集のより高いスループット測定を可能にする。
このアプローチは、レート制限ステップとしてメッキがあり、真に「ハイスループット」ではありません。大目的フローサイトメトリー(図3C、D)は、個々のワーム16の蛍光標識細菌を定量するための有用なハイスループット法ですが、同時蛍光色素の数は多種群集では制限されています。マルチウェルプレートの破壊をコミュニティシーケンシングと結びつけることは、スループットを向上させるもう1つの方法です。しかし、ここで説明する96ウェル破壊手順は、細菌細胞をそのまま残すために特別に最適化されました。細胞の徹底的な溶解が望ましいシーケンシングベースの解析では、生細菌の代わりに細胞内容物を抽出するために、核酸抽出ステップの追加または拍動プロトコル(プロトコル3.10-3.11)の変更が必要になります。単一ワームの破壊および核酸の抽出のためのプロトコールは、他の場所で公開されている38,39.
ワーム腸内の細菌の総存在量は不均一であり、ここに示すデータは、バッチベースの測定がグループ間の比較において誤った結果を生み出す可能性があることを示唆している。しかし、ワーム内の細菌群集の他の尺度は、バッチ処理の影響に対して感受性が低い可能性がある。注目すべきは、ワーム関連群集における相対的存在量は、微生物間の相互作用が中性40 であろうと14であろうと、腸内総集団サイズと全く変化しないように見える。カウントデータと比較して、相対存在量の測定値は、説明されている偽陽性率の問題の影響を受けにくいことはもっともらしいです。したがって、コミュニティ構成の相対的存在量データを生成するシーケンシングベースのコミュニティ分析は、単一のワームの測定を必要としない可能性がある。この点については、さらなる調査が必要である。
ここでは、表面漂白のためにワームを麻痺させるために低温処理を使用します。他の研究では、氷上の時間が30分未満に保たれると、ワームは急速に正常な活動を再開し(<15分)、完全な回復までに長期間を必要とする化学麻痺剤とは対照的に、さらなるアッセイで即時に使用できることが分かっている34。細菌の定量のためにワームを直ちに破壊する場合、この機能は不可欠であり、冷却と化学麻痺の主な利点は、制御された廃棄物の流れの必要性を回避することです。拡張低温処理は、特に温度との既知の関連がある場合、ストレス応答を調査する際には注意して使用する必要があります。ここで説明する寒冷麻痺プロトコルは、寒冷ストレス(2-4°Cで20-30分対2+時間)の実験で使用されたよりも短い急性寒冷曝露を伴い、41,42,43、および1時間の寒冷ショックは野生型ワームに明らかな表現型を生じない43。4°Cでの短期(90分)インキュベーションは、コールドストレス遺伝子発現(TMEM-135::GFPレポーターの発現によって測定)の変化を誘導するが、ワームが室温に戻ると、発現は数分以内にストレスのないレベルに戻る34。しかし、ストレス感受性ワームの遺伝子型への影響は、野生型よりも深刻である可能性があります。この手順は、使用する実験条件下で検証する必要があります。
ここで説明する表面漂白プロトコルは、実験における外部微生物の継代を制限または排除する方法として使用できます。この方法は、表面漂白およびL1/L2幼虫のみを新鮮なプレートに移すことによって真菌汚染物質を除去するためにさらに使用されている(表面漂白された成虫の移送は、おそらく大型動物の腸内での輸送のために、汚染物質を除去するのに失敗した)。漂白剤濃度が1:1000 v/vを超えないようにすることは、ワームの損傷と死亡率が生じるため、非常に重要です。この手順は、実験的な宿主-微生物の進化および宿主-病原体相互作用において有用であり得る。例えば、ここで観察された生細菌の排泄率が低いことは、雌雄同体から子孫への細菌の伝達について観察された非常に可変的な速度を説明するのに役立つ15。ここで観察された腸内細菌負荷と排泄速度との間の相関の欠如は興味深いが、さらなる調査が必要である。このオブザベーションがどこで保持されるか(または保持されるかどうか)を決定するには、さまざまな条件にわたってより多くのデータポイントが必要になります。
表面漂白によって提供される程度にワームをきれいにすることは必ずしも必要ではないかもしれません。このキャリーオーバーはカウントに最小限しか影響しないため、予想されるCFU/ワームがバッファー上清中の細菌の濃度よりもはるかに高い(10〜100倍)場合、ワームが単一の微生物で内部的にコロニー形成されている場合、滅菌バッファーでの複数回の洗浄で十分である可能性が高い( 図1参照)。さらに、関心のある微生物が主にキューティクルに定着する場合、表面の漂白は明らかに避けるべきです。混合微生物群集を扱うとき(サンプル中のすべてのコロニー/読み取りが環境からではなくワーム関連細菌からのものであることを確認するため)、キューティクルに付着した細菌が内在化された集団の読み取りを妨げる場合、予想される最小CFU /ワームが低い場合など、徹底的な洗浄がより重要です。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、H. SchulenbergとC. LaRockがこれらの実験で使用した細菌株を寛大に共有したことを認めたいと考えている。この研究は、エモリー大学とNSF(PHY2014173)からの資金提供によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
References
- Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
- Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
- VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
- Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
- Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
- Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
- Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
- Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
- Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
- Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
- Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
- Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
- Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
- Stiernagle, T.
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
- Ahringer, J.
- Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
- Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
- Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
- Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
- Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
- Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
- Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
- Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
- Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
- Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
- Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
- Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).
