Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

يصف هذا البروتوكول اضطرابا في 96 بئرا من Caenorhabditis elegans المستعمر بكتيريا فرديا بعد الشلل البارد وتبييض السطح لإزالة البكتيريا الخارجية. يتم طلاء التعليق الناتج على ألواح أجار للسماح بتحديد كمي دقيق ومتوسط الإنتاجية للحمل البكتيري في أعداد كبيرة من الديدان الفردية.

Abstract

الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هو نظام نموذجي للتفاعلات بين الميكروب المضيف والميكروبيوم المضيف. تستخدم العديد من الدراسات حتى الآن هضمات الدفعات بدلا من عينات الدودة الفردية لتحديد الحمل البكتيري في هذا الكائن الحي. هنا يقال إن التباين الكبير بين الأفراد الذي شوهد في الاستعمار البكتيري لأمعاء C. elegans مفيد ، وأن طرق هضم الدفعات تتجاهل المعلومات المهمة للمقارنة الدقيقة عبر الظروف. نظرا لأن وصف التباين المتأصل في هذه العينات يتطلب أعدادا كبيرة من الأفراد ، فقد تم إنشاء بروتوكول مناسب للوحة 96 بئرا للتعطيل وطلاء المستعمرة للديدان الفردية.

Introduction

ويلاحظ عدم التجانس في ارتباطات الميكروبات المضيفة في كل مكان، ويتزايد الاعتراف بالتباين بين الأفراد كعامل مساهم في العمليات على مستوى السكان من المنافسة والتعايش1 إلى انتقال الأمراض2،3،4. في C. elegans ، لوحظ "عدم التجانس الخفي" داخل المجموعات السكانية متساوية المنشأ مرارا وتكرارا ، حيث أظهرت المجموعات الفرعية للأفراد أنماطا ظاهرية متميزة في استجابة الصدمة الحرارية5,6 ، والشيخوخة ، والعمر 7,8,9,10,11 ، والعديد من الجوانب الأخرى لعلم وظائف الأعضاء والتنمية 12 . توفر معظم التحليلات التي تحاول تحديد بنية السكان الفرعية أدلة على مجموعتين فرعيتين في المجموعات التجريبية للديدان المتزامنة متساوية المنشأ 5,7,8 ، على الرغم من أن البيانات الأخرى تشير إلى إمكانية توزيع السمات داخل السكان بدلا من المجموعات المتميزة 7,12,13 . ومما له أهمية هنا ، لوحظ عدم تجانس كبير في المجموعات المعوية حتى داخل مجموعات متساوية المنشأ من الديدان المستعمرة من مصدر مشترك للميكروبات 13،14،15،16 ، ويمكن إخفاء هذا عدم التجانس من خلال قياسات هضم الدفعات التي تستخدم على نطاق واسع17،18،19،20 للقياس الكمي البكتيري في الدودة.

يقدم هذا العمل بيانات تشير إلى الحاجة إلى مزيد من الاعتماد على قياسات الدودة الواحدة في ارتباط الميكروب المضيف ، بالإضافة إلى بروتوكولات لزيادة الدقة والإنتاجية في اضطراب الدودة الواحدة. تم تصميم هذه البروتوكولات لتسهيل التعطيل الميكانيكي لأعداد كبيرة من C. elegans الفردية لتحديد كمية الحمل البكتيري القابل للحياة ، مع توفير قابلية تكرار أفضل وجهد أقل لكل عينة من التعطيل القائم على المدقة للديدان الفردية. يتم تضمين خطوة تطهير الأمعاء الموصى بها ، حيث يسمح للديدان بالتغذية على الإشريكية القولونية المقتولة بالحرارة قبل التحضير للاضطراب ، لتقليل المساهمات من البكتيريا التي تم تناولها مؤخرا وغيرها من البكتيريا العابرة (غير الملتزمة). وتشمل هذه البروتوكولات طريقة الشلل البارد لتنظيف البشرة باستخدام معالجة التبييض السطحي منخفض التركيز. يمكن استخدام التبييض السطحي كخطوة تحضيرية في اضطراب الدودة الواحدة أو كوسيلة لإعداد الديدان الحية الخالية من الجراثيم خارجيا. طريقة تبييض السطح هذه كافية لإزالة مجموعة واسعة من الميكروبات الخارجية ، وتوفر المعالجة الباردة بديلا للشلل التقليدي القائم على الليفاميزول. في حين أن الليفاميزول سيكون مفضلا للتجارب الحساسة للبرد ، فإن الشلل البارد يقلل من المساهمات في تيارات النفايات الخطرة ويسمح بالاستئناف السريع للنشاط الطبيعي. في حين أن البروتوكول الكامل يصف تجربة معملية حيث يتم استعمار الديدان بالبكتيريا المعروفة ، يمكن بسهولة تطبيق إجراءات تنظيف الديدان واضطراب الدودة الواحدة على الديدان المعزولة من العينات البرية أو المستعمرة في تجارب العالم المصغر. تنتج البروتوكولات الموصوفة هنا بكتيريا حية مستخرجة من أمعاء الدودة ، مناسبة للطلاء والقياس الكمي لوحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) في الديدان الفردية ؛ لتحليل المجتمع المعوي القائم على التسلسل ، يجب إضافة خطوات تحلل الخلايا اللاحقة واستخراج الحمض النووي إلى هذه البروتوكولات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الديدان المستخدمة في هذه التجارب من مركز Caenorhabditis الوراثي ، الذي يموله مكتب برامج البنية التحتية البحثية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P40 OD010440). بريستول N2 هو النوع البري. تستخدم طفرات DAF-2 / IGF daf-16 (mu86) I (CGC CF1038) و daf-2 (e1370) III (CGC CB1370) لتوضيح الاختلافات في الحمل البكتيري المعوي.

HT115 (DE3) E. coli التي تحمل متجه POS-1 RNAi من مكتبة Ahringer21. تم الحصول على مجموعة MYb من بكتيريا الأمعاء الأصلية C. elegans 22 من مختبر Schulenburg. السالمونيلا المعوية LT2 (ATCC 700720) attB: GFP-KmR من هذا المختبر23. تم عزل Pseudomonas mosselii في هذا المختبر. المكورات العنقودية الذهبية تم الحصول على MSSA Newman pTRKH3-mGFP من مختبر LaRock في جامعة إيموري.

يتم إعداد جميع المخازن المؤقتة للديدان والوسائط وفقا للأدبيات المنشورة سابقا24 مع تعديلات طفيفة (انظر الملف التكميلي 1).

1. إعداد C. elegans المعقمة المتزامنة

ملاحظة: في هذا القسم، يتم وصف الإجراءات خطوة بخطوة لتوليد مجموعة متزامنة من الديدان البالغة المعقمة تكاثريا. يتم استخدام التغذية على ألواح الحمض النووي الريبي POS-1 هنا لمنع إنتاج النسل لأن هذا التداخل قاتل جنيني. تتطور يرقات L1 التي يتم رفعها إلى مرحلة البلوغ على POS-1 RNAi إلى خنثى وضع البيض ، ولكن هذه البيض غير قابلة للحياة25. بروتوكول تغذية RNAi هو كما هو الحال في فصل "علم الوراثة العكسي" من Wormbook26.

  1. قبل مزامنة الديدان ، تأكد من توفر لوحات NGM + pos-1 RNAi الطازجة مقاس 10 سم. يمكن تحضير الألواح طازجة من المستنبتة السائلة المركزة المستحثة (+Amp + IPTG) أو تلقيحها كمروج على NGM + 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين + 1 mM IPTG ويسمح لها بالنمو عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة يوم واحد27.
    ملاحظة: غالبا ما يستخدم الكاربينيسيلين (25 ميكروغرام / مل) بدلا من الأمبيسلين على ألواح RNAi. الأمبيسلين أقل تكلفة ولكنه أقل استقرارا. إذا كنت تستخدم الأمبيسلين ، فيجب أن تزرع الألواح على الفور بمجرد أن تجف وتستخدم في أقرب وقت ممكن (يمكن تخزينها لمدة <1 أسبوع عند 4 درجات مئوية)27. سيساعد تركيز المضادات الحيوية العالي الموصى به هنا على ضمان الاختيار الكافي.
  2. ابدأ بالعديد من لوحات NGM (عادة ما تكون من اثنين إلى أربعة) مع مجموعات كبيرة من الخنثى الود. عزل البيض باستخدام مزامنة التبييض-NaOH24.
    1. اغسل الديدان من ألواح الأجار باستخدام 2 مل من DDH2O المعقم لكل لوحة. قم بتوزيع السائل بالتساوي في أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل (أنبوب واحد لكل صفيحة أو خنثى).
    2. قم بالدوران لأسفل لمدة 5 ثوان تقريبا في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2000 × جم) لسحب البالغين إلى أسفل الأنابيب. ماصة قبالة supernatant والتخلص منها.
    3. يغسل مع 1 مل من DDH2O المعقمة ؛ تدور لأسفل كما كان من قبل وتجاهل supernatant.
    4. كرر الخطوة السابقة لتقليل الحطام البكتيري المتبقي.
    5. أعد تعليق محتويات كل أنبوب في 1 مل من DDH2O. أضف إلى كل أنبوب 130 ميكرولتر من المبيض التجاري (8.25٪ هيبوكلوريت الصوديوم) و 130 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 5 N (NaOH ، التركيز النهائي 0.5 N).
    6. دوامة الأنابيب بقوة لمدة لا تقل عن 10-15 ثانية كل دقيقتين حتى تتفكك أجسام البالغين. لا تسمح لعلاج التبييض-NaOH أن يستمر لفترة أطول من 5 دقائق لتجنب قتل البيض.
    7. تدور في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30-60 ثانية عند 2000 × غرام لتكوير البيض. ماصة قبالة supernatant والتخلص منها. قد يكون هناك أو لا يكون هناك حبيبات مرئية ، وهذا أمر طبيعي.
    8. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 وقم بالدوران لمدة 30-60 ثانية عند 2000 × جم. تخلص من السوبرناتانت.
    9. كرر خطوة الشطف (1.2.8) 5x لإزالة خليط التبييض-NaOH تماما ، وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج حبيبات البيض.
    10. انقل البيض إلى 10 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 في أنبوب مخروطي 50 مل أو أنبوب زراعة 30 مل مع غطاء. إذا كنت تستخدم أنابيب مخروطية ، فاترك الغطاء غير مشدود قليلا واستخدم القليل من الشريط للحفاظ على أمانه. احتضان مع الاهتزاز بين عشية وضحاها (16 ساعة) عند 25 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة للسماح لليرقات بالفقس.
  3. انقل يرقات L1 المتزامنة إلى ألواح RNAi لتنمو إلى مرحلة البلوغ.
    1. أضف 2 مل من المخزن المؤقت M9 المعقم + 0.01٪ Triton X-100 (من الآن فصاعدا M9TX-01) إلى كل أنبوب L1 وانقل الحجم بالكامل (12 مل) إلى أنبوب مخروطي لولبي 15 مل.
    2. ضع أنابيب 15 مل مع ديدان L1 عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإبطاء حركة اليرقات.
    3. قم بتدوير أنابيب مخروطية سعة 15 مل في جهاز طرد مركزي كبير على الطاولة (1500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ؛ يجب ألا يزيد التسارع والتباطؤ عن 80٪ من الحد الأقصى).
    4. ماصة بعناية قبالة supernatant دون إزعاج بيليه L1. تخلص من السوبرناتانت.
    5. أضف 12 مل من M9TX-01 البارد إلى كل أنبوب. كرر الطرد المركزي. ماصة بعناية قبالة والتخلص من supernatant. يجب أن يكون لكل أنبوب ~ 200 ميكرولتر متبقية.
    6. اشطف طرف ماصة 200 ميكرولتر في M9TX-01 لمنع الديدان من الالتصاق بالبلاستيك ، ثم استخدم هذا الطرف لإعادة تعليق حبيبات الدودة. انقل الديدان المعاد تعليقها إلى ألواح pos-1 المحضرة عن طريق سحب قطرات من السائل على العشب البكتيري.
    7. احتضن الألواح عند 25 درجة مئوية حتى اليوم الأول من مرحلة البلوغ.
      ملاحظة: إذا كانت الديدان تنمو على ألواح الحمض النووي الريبي POS-1 ، فيجب على الديدان أن تتغذى على بكتيريا الحمض النووي الريبي حتى تنتقل بالكامل إلى مرحلة البلوغ لضمان اختراق عال للنمط الظاهري الجنيني القاتل. تحقق من اللوحات في 24 و 48 ساعة. إذا بدت الصفائح جائعة أو شبه جائعة ، فستحتاج الديدان إلى نقلها إلى أطباق جديدة لإنهاء النمو إلى بالغين كاملي الحجم. لتجنب استنزاف الألواح قبل زراعة الديدان ، تهدف إلى إضافة 250-500 يرقات L1 إلى كل لوحة RNAi 10 سم.
  4. حصاد البالغين ومسح الإشريكية القولونية المعوية لإنشاء ديدان خالية من الجراثيم.
    1. شطف الديدان البالغة من الألواح باستخدام 5 مل من M9TX-01 لكل لوحة. انقل المخزن المؤقت + الديدان إلى أنبوب مخروطي 15 مل واسمح للبالغين بالاستقرار في قاع الأنبوب.
    2. شطف البالغين في تغييرات من 10 مل من المخزن المؤقت M9TX-01 الطازج حتى لا يبقى أي تعكر بكتيري مرئي (عادة 1-2x). يمكن طرد الأنابيب مركزيا بسرعة 700 × جم لمدة 30 ثانية إلى ديدان الكريات ، أو يمكن السماح للبالغين بالاستقرار عن طريق الجاذبية.
    3. قم بإجراء غسل إضافي واحد مع 10 مل من M9TX-01 لتقليل البكتيريا الخارجية.
    4. نقل الديدان إلى أنابيب مخروطية 50 مل أو أنابيب زراعة 30 مل تحتوي على 5 مل S متوسطة + 2x E. coli OP50 (~ 5 × 109 خلايا مقتولة / مل) + 200 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين + 50 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول. إذا كنت تستخدم أنابيب مخروطية ، فاترك الغطاء غير مشدود قليلا واستخدم القليل من الشريط للحفاظ على أمانه. استخدم الماصات الزجاجية أو اشطف الماصات البلاستيكية في M9TX-01 لمنع الديدان من الالتصاق.
    5. احتضان البالغين عند 25 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 24-48 ساعة لإنتاج بالغين خاليين من الجراثيم.
      ملاحظة: إذا كان للديدان أن تبقى في المضادات الحيوية لمدة >24 ساعة، فقد يلزم إضافة المزيد من OP50 المقتول بالحرارة للتأكد من أن الديدان لديها مصدر غذائي كاف. تحقق من الأنابيب في 24 ساعة واستكملها ب OP50 المقتول بالحرارة إذا تم تقليل التعكر بشكل واضح.
  5. يغسل السكروز البالغين وفقا لبروتوكولات Wormbook24 للحصول على مخزون نظيف ومعقم ومتزامن للبالغين فقط للاستعمار البكتيري.
    1. تأكد من أن الأحجام الباردة من السكروز بنسبة 60٪ ، والمخزن المؤقت للدودة M9 ، و M9TX-01 جاهزة للاستخدام. للبساطة ، يمكن تركها عند 4 درجات مئوية في الليلة السابقة.
    2. لغسل كل عينة ، قم بإنشاء أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 8 مل من M9TX-01 ووضعه جانبا على الجليد. ستكون هناك حاجة إليها في الخطوة 1.5.10.
    3. أضف 5 مل من M9TX-01 إلى كل أنبوب 50 مل يحتوي على يرقات L1. انقل الحجم بالكامل (الآن 10 مل) إلى أنبوب مخروطي فارغ بطول 15 مل واسمح للبالغين بالاستقرار في قاع الأنبوب.
    4. ماصة بعناية قبالة supernatant والتخلص منها.
    5. أضف 10 مل M9TX-01 إلى كل أنبوب وانقل الأنابيب إلى دلو ثلج لمدة 5-10 دقائق.
      ملاحظة: بدءا من هذه المرحلة ، يجب أن تبقى الديدان وجميع المخازن المؤقتة على الجليد.
    6. استخدم إعداد "درجة الحرارة السريعة" لتبريد جهاز طرد مركزي كبير على الطاولة إلى 4 درجات مئوية.
    7. أضف 10 مل من M9TX-01 البارد إلى كل أنبوب لشطف أي حطام متبقي. دع الديدان تستقر على الجليد ؛ إزالة supernatant والتخلص منها.
    8. تعويم السكروز: أضف 5 مل من المخزن المؤقت M9 البارد و 5 مل من محلول السكروز البارد بنسبة 60٪ إلى كل أنبوب ، واخلطه جيدا. ثم ، قم بتعويم 1 مل من المخزن المؤقت M9 البارد بعناية فوق خليط السكروز العازل في كل أنبوب. لا تخلط بعد إضافة العوامة.
      تحذير: تحرك بسرعة للخطوات القليلة التالية - يمكن للديدان أن تجف إذا تعرضت لتركيزات عالية من السكروز لفترة طويلة جدا!
    9. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. ستكون الديدان البالغة الحية في واجهة M9 والسكروز ، على بعد حوالي 1 مل من أعلى الأنبوب.
    10. استخدم ماصة مصلية زجاجية سعة 5 مل لنقل طبقة الدودة إلى أنابيب مخروطية مخروطية سعة 15 مل مع M9TX-01 باردة (من الخطوة 1.5.2). كن حريصا جدا على الحصول على طبقة من الديدان الحية دون سحب الكثير من السكروز.
    11. إذا لزم الأمر ، أضف M9TX-01 للحصول على أحجام متساوية من 10-12 مل / أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة ، ثم ماصة قبالة supernatant. يمكن إرجاع الديدان إلى درجة حرارة الغرفة في هذه المرحلة.
    12. كرر خطوة الغسيل 1.5.11 مرتين ، مما يقلل من السرعة إلى 700 × g عند 4 درجات مئوية والوقت إلى 30 ثانية.

2. تغذية الديدان على البكتيريا الحية في الثقافة السائلة

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لاستعمار الديدان بالبكتيريا المزروعة في المختبر في ظروف مختلطة جيدا في المستنبتة السائلة (الشكل التكميلي 1). يمكن استعمار الديدان بعزلات فردية من الثقافة النقية (على سبيل المثال ، مسببات الأمراض مثل Enterococcus faecium28,29) أو مخاليط من العزلات (على سبيل المثال ، الحد الأدنى من مجتمعات الميكروبيوم14).

  1. ابدأ بالديدان البالغة المتزامنة المغسولة بالسكروز من خطوة البروتوكول 1.5 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل الديدان مرة واحدة في 12 مل من المخزن المؤقت S وتخلص من السوبرناتانت.
  2. أعد تعليق الديدان المغسولة في حجم الوسط S اللازم للتجربة. ضع في اعتبارك حجم الظروف التجريبية ، وعدد الظروف التي سيتم تقسيم الديدان عليها ، والتركيزات النهائية للديدان والبكتيريا.
    ملاحظة: تختلف التغذية في الديدان باختلاف توافر البكتيريا30 ويمكن التأكيد على الديدان عن طريق الازدحام31. بالنسبة للاستعمار في الثقافة السائلة ، يوصى <1000 ديدان / مل و >107 CFU / mL ؛ 1011 تعتبر CFU/mL كثافة تغذية "ad libitum" على الإشريكية القولونية32.
  3. قم بتدوير الثقافات البكتيرية. صب قبالة supernatant. يمكن استخدام الشفط أو السحب لإزالة supernatant للبكتيريا التي تشكل كريات فضفاضة.
    ملاحظة: بالنسبة للثقافات >5 مل ، انقل إلى أنابيب 15 مل وقم بالدوران عند ~ 2800 × g في جهاز طرد مركزي كبير على الطاولة لمدة 8-10 دقائق. يمكن نقل الثقافات <5 مل إلى أنابيب 1.5 مل والطرد المركزي عند 9000 × g لمدة 1-2 دقيقة في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. قد تحتاج البكتيريا شديدة الحركة (على سبيل المثال ، العديد من أنواع Pseudomonas) إلى التبريد عند 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة لتسهيل تكوين حبيبات مستقرة ، وقد يكون من الأفضل جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية.
  4. أعد تعليق المزارع البكتيرية في حجم واحد من المخزن المؤقت S وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى إلى الكريات. قم بإزالة وتجاهل supernatant كما كان من قبل.
  5. أعد تعليق المزارع البكتيرية في وسط S بالكثافة المطلوبة للتجربة ، بالإضافة إلى أي مضادات حيوية للاختيار. تعتمد المضادات الحيوية التي سيتم استخدامها ، إن وجدت ، على ملف تعريف مقاومة البكتيريا المستخدمة في الاستعمار.
  6. باستخدام طرف ماصة مطلي ب M9TX-01 ، تقوم ديدان الماصة بلطف لأعلى ولأسفل حتى يتم إعادة تعليق الديدان تماما في وسط S ، ثم نقلها إلى أنابيب أو آبار صفيحة للاستعمار البكتيري.
  7. أضف التعليق البكتيري إلى كل مزرعة دودة للوصول إلى التركيز البكتيري المطلوب والحجم النهائي.
  8. في حالة استخدام صفيحة متعددة الآبار للاستعمار ، قم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب من الغاز معقم يبلغ 96 بئرا.
  9. احتضان مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمنع البكتيريا من الاستقرار أثناء الحضانة.

3. الاضطراب الميكانيكي للديدان الفردية في شكل 96 بئرا

ملاحظة: يصف هذا القسم بروتوكول تنسيق لوحة 96 بئرا للتعطيل الميكانيكي ل C. elegans المستعمرة بكتيريا. تصف الخطوات الأولى في البروتوكول (3.1-3.8) طريقة لتطهير البكتيريا غير الملتصقة من أمعاء الدودة وتنظيف الجزء الخارجي من الديدان باستخدام الشلل البارد وتبييض السطح. ستنتج هذه الخطوات ديدان بالغة نظيفة وحية يمكن تعطيلها ميكانيكيا لتحديد كمية المحتويات البكتيرية (3.8 نهاية) أو استخدامها لإجراء المزيد من التجارب (الشكل التكميلي 1). يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحديد كمية البكتيريا في الديدان المستعمرة في الثقافة السائلة (القسم 2) ، أو على ألواح الأجار ، أو من التربة الطبيعية أو المصغرة.

  1. ضع أليكوت من M9TX-01 على الجليد لتبرد (4-5 أضعاف عدد العينات بالمل).
  2. تحضير أليكوت من M9TX-01 + التبييض (6 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم ، 1: 1000 أو 1: 2000 v / v ، 1 مل لكل عينة + 1 مل إضافي) ووضعها على الجليد لتبرد. سيتم استخدام هذا aliquot في الخطوة 3.8.
  3. قم بإعداد لوحات 96 بئرا للتخفيف التسلسلي لعينات الدودة المعطلة.
    1. الحصول على لوحات معقمة بسعة 300 ميكرولتر بسعة 96 بئرا مع أغطية ؛ يستخدم هذا البروتوكول لوحة تخفيف واحدة لكل 12 دودة مهضومة.
    2. استخدم ماصة متعددة القنوات بسعة 96 بئرا لملء الصفوف B-D لكل لوحة بئر 96 (سعة 300 ميكرولتر) مع 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1x PBS. اترك الصف العلوي فارغا. ستصبح الصفوف B-D 10x تخفيفا تسلسليا لهضمات الدودة [0.1x ، 0.01x ، 0.01x].
    3. ضع الأطباق جانبا. سيتم استخدام لوحات التخفيف في الخطوة 3.13.
  4. أعد تعليق كل عينة دودة في 1 مل من M9TX-01 في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
  5. تدور الأنابيب لفترة وجيزة (2-3 ثانية) في جهاز طرد مركزي صغير منخفض السرعة (2000 × جم) عند 25 درجة مئوية للبالغين الكريات. ماصة قبالة supernatant والتخلص منها ، والتأكد من عدم إزعاج بيليه الدودة.
  6. باستخدام إعدادات الطرد المركزي في الخطوة 3.5 ، اشطف الديدان مرتين باستخدام 1 مل من M9TX-01 ، ثم مرة واحدة باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 ، لتقليل البكتيريا الخارجية.
  7. تطهير البكتيريا غير الملتصقة من الأمعاء الدودة.
    1. أعد تعليق كل عينة من الديدان في 1 مل من S متوسطة + 2x OP50 المقتولة بالحرارة في أنبوب استزراع.
    2. تحضن في 25 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح بمرور أي بكتيريا غير ملتصقة من الأمعاء.
      ملاحظة: سيؤدي ذلك أيضا إلى تطهير أي بروتين فلورسنت خارج الخلية من التجويف ويسمح بتصور أوضح للبكتيريا الملصقة الملتصقة بالظهارة المعوية ، خاصة عند استخدام الفلوروفورات سريعة الحمض (على سبيل المثال ، mCherry ، dsRed).
  8. ديدان التبييض السطحية لإزالة البكتيريا الخارجية.
    1. شطف الديدان المطهرة مرتين مع 1 مل من M9TX-01 الباردة والتخلص من supernatant.
    2. اترك الأنابيب لتبرد لمدة 10 دقائق على الجليد (المفضل) أو عند 4 درجات مئوية. هذا سوف يشل الديدان ويمنع ابتلاع التبييض.
      ملاحظة: تستخدم بروتوكولات أخرى عامل شلل كيميائي مثل الليفاميزول. هذا هو النهج الراسخ33 الذي يتطلب إضافة تيار النفايات الخطرة.
    3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 الباردة + المبيض غير المعطر (8.25٪ هيدروكسيد الصوديوم ، 1: 1000 أو 1: 2000 v / v) إلى كل أنبوب. اسمح للأنابيب بالجلوس على الجليد (المفضل) أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل لقتل البكتيريا الخارجية.
      ملاحظة: لا تتجاوز تركيز التبييض 1:1000. حتى في الديدان المشلولة ، يمكن أن ينتج عن الوفيات.
    4. ماصة قبالة المخزن المؤقت المبيض والتخلص منها. أعد الأنابيب إلى الجليد لضمان عدم استئناف الديدان للضخ حتى يتم إزالة المبيض.
    5. أضف 1 مل من M9TX-01 البارد إلى كل أنبوب. تدور لمدة ~ 5 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير (2000 × جم عند 25 درجة مئوية) ؛ إعادة الأنابيب إلى الجليد. قم بإزالة supernatant وتخلص منه.
    6. كرر خطوة الشطف هذه مع 1 مل آخر من M9TX-01 البارد ، مع التخلص من أكبر قدر ممكن من supernatant.
      ملاحظة: في حالة استخدام الديدان لإجراء مزيد من التجارب، تخطى خطوة النفاذية (البروتوكول 3.9) وبدلا من ذلك انقل البالغين المبيضين حديثا إلى المخزن المؤقت المثلج في طبق بتري بطول 6 سم وافصل الديدان إلى ظروف تجريبية كما هو الحال في البروتوكول 3.10. حافظ على برودة الديدان لمنع الحركة من الاستئناف ولكن العمل بسرعة - يمكن أن يؤدي الاحتفاظ بالديدان لمدة >30 دقيقة على الجليد إلى استئناف النشاط الطبيعي بنسبة <100٪34.
  9. النفاذية الكيميائية لبشرة الدودة مع كبريتات دوديسيل الصوديوم وثنائي ثيوثريتول (0.25٪ SDS + 300 mM DTT) (على أساس35)
    تنبيه: DTT هو عامل اختزال ومهيج. ارتد معدات الوقاية الشخصية واعمل في غطاء دخان عند التعامل مع المخزون الجاف أو المحاليل. مطلوب تيار النفايات الخطرة.
    1. في غطاء الدخان ، قم بإعداد ما يكفي من محلول SDS / DTT للسماح ب 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى 1 مل ، إلى 965 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدودة M9 أو M9TX-01 في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، أضف 5 ميكرولتر من 5٪ (ث / v) SDS و 30 ميكرولتر من 1M DTT.
      ملاحظة: يجب تحضير محلول DTT 1 M (مائي) طازجا أو تخزينه في الأليكوتات عند -20 درجة مئوية لضمان الفعالية. يجب أن يكون حجم Aliquots ليتم استخدامه في تجربتين إلى ثلاث تجارب لتجنب الإفراط في ركوب الدراجات في التجمد والذوبان.
    2. انقل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على ديدان مبيضة على السطح إلى رف أنبوب بدرجة حرارة الغرفة. يجب أن يحتوي كل أنبوب على ديدان في ~ 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول SDS/DTT إلى كل عينة دودة. تخلص من أي حل متبقي من حلول SDS/DTT في تيار النفايات الخطرة المناسب.
    4. اسمح للعلاج بالمضي قدما لمدة تصل إلى 8 دقائق على المقعد لتحطيم البشرة المقاومة للديدان البالغة جزئيا. سوف تموت الديدان وتستقر في قاع الأنبوب خلال هذا الوقت.
    5. بعد انتهاء وقت النفاذية ، قم بسحب الماصة بعناية من السوبرناتانت SDS / DTT والتخلص منها في تيار نفايات خطرة SDS / DTT مناسب.
    6. أضف 1 مل من M9TX-01 إلى كل أنبوب. تدور لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي على الطاولة لتكسير الديدان أو السماح للديدان بالاستقرار عن طريق الجاذبية إلى أسفل الأنابيب ، ثم سحب supernatant والتخلص منها في تيار النفايات الخطرة SDS / DTT.
    7. أعد تعليق الديدان في مخزن مؤقت للديدان M9 سعة 1 مل + 0.1٪ Triton X-100 حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
  10. افصل الديدان في صفيحة عميقة من 96 بئرا مع حصى كربيد السيليكون للتعطيل الميكانيكي. قم بإعداد لوحة التعطيل المكونة من 96 بئرا على النحو التالي.
    1. احصل على صفيحة معقمة بعمق 2 مل بعمق 96 بئرا وغطاء لوحة سيليكون مطابق من 96 بئرا.
      ملاحظة: من المهم استخدام لوحات متوافقة مع محولات 96 بئرا لتعطيل الأنسجة. الاختلافات الصغيرة في الأبعاد الخارجية تحدث فرقا بين لوحة يمكن إزالتها من المحولات وأخرى لا يمكن إزالتها.
    2. باستخدام ملعقة مغرفة معقمة ، أضف كمية صغيرة من كربيد السيليكون المعقم 36 حصى إلى كل بئر من الطبق الذي سيتلقى دودة. استخدم ما يكفي من الحصى لتغطية قاع البئر بالكاد (حوالي 0.2 جم لكل بئر). المواد الزائدة ستجعل من الصعب الحصول على طرف ماصة إلى أسفل البئر عند استرداد المحتويات.
    3. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدودة M9 إلى كل بئر.
    4. قم بتسمية الأعمدة أو الصفوف للإشارة إلى المكان الذي ستذهب إليه كل عينة ، ثم قم بتغطية اللوحة بشكل فضفاض بغطاء لوحة السيليكون المكون من 96 بئرا.
  11. نقل الديدان الفردية إلى لوحة 96 بئر للتعطيل.
    1. انقل الديدان المتخلل بعناية إلى طبق بتري صغير (35 أو 60 مم) يحتوي على ما يكفي من M9TX-01 لملء الطبق على عمق ~ 1 سم.
      ملاحظة: في حالة وجود عدد كبير من الديدان ، فقد لا يكون من الممكن نقل العينة بأكملها لأن السائل سيصبح مزدحما وسيكون من الصعب ماصة الديدان الفردية.
    2. باستخدام مجهر تشريح أو أي جهاز آخر منخفض التكبير ، قم بإخراج الديدان الفردية في أحجام 20 ميكرولتر ، ونقل هذه الديدان إلى آبار فردية من صفيحة 96 بئرا.
      ملاحظة: من الأفضل حصاد الديدان المقتولة حديثا فقط. تجنب الديدان ذات الشكل الخطي الصلب ، لأن هذه الديدان قد تكون ميتة لبعض الوقت. حاول أن تأخذ الديدان المنحنية أو على شكل حرف S ، مع فسيولوجيا إجمالية طبيعية وأمعاء سليمة.
    3. بعد نقل كل وحدة تخزين ، تأكد من أن الدودة المحددة قد تم إخراجها بالفعل إلى البئر. للقيام بذلك ، ماصة تصل إلى 20 ميكرولتر من M9TX-01 من منطقة واضحة من طبق بتري وإطلاق الحجم الكامل مرة أخرى في الطبق ؛ سيؤدي ذلك عادة إلى إخراج الدودة إذا كانت عالقة في الماصة. إذا كانت الدودة عالقة ، فقم بإزالة 20 ميكرولتر من البئر وحاول النقل مرة أخرى.
    4. بمجرد نقل جميع الديدان ، قم بتغطية لوحة البئر 96 بورقة من فيلم الختم المرن المدعوم بالورق (2 × 2 مربع) ، مع التأكد من أن الجانب المدعوم بالورق من فيلم الختم مواجه لأسفل على آبار العينة. احرص على عدم تمديد فيلم الختم الرقيق جدا ، أو سيكون من الصعب جدا إزالته لاحقا.
    5. ضع حصيرة ختم السيليكون برفق فوق فيلم الختم المرن ؛ لا تضغط على الغطاء لأسفل في الآبار في هذا الوقت.
    6. حرك اللوحة إلى 4 درجات مئوية لتبرد لمدة 30-60 دقيقة. هذا سيمنع ارتفاع درجة الحرارة أثناء الاضطراب ، مما قد يؤدي إلى تلف العينات.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف في البروتوكول. في معظم الحالات ، يمكن ترك اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 ساعات قبل الطحن. لا تترك الديدان بين عشية وضحاها ، لأن هذا سيغير عدد البكتيريا.
  12. قم بتحميل لوحات 96 بئرا على جهاز تعطيل الأنسجة لتفتيت أنسجة الدودة وإطلاق البكتيريا المعوية.
    ملاحظة: (اختياري) في حالة استخدام عدد فردي من لوحات 96-well للهضم، فمن الضروري إعداد ثقل موازنة قبل المتابعة. استخدم صفيحة فارغة عميقة من 96 بئرا واملأ الآبار بالماء حتى يزن نفس وزن اللوحة الأولى.
    1. اضغط على حصيرة ختم السيليكون لأسفل بقوة في الآبار لإنشاء ختم ، مع التأكد من أن الغطاء يقع مسطحا عبر سطح اللوحة بالكامل.
      ملاحظة: إذا كان فيلم الختم المرن سميكا جدا بعد التمدد ، فسيكون من الصعب تأمين غطاء السيليكون بحيث يكون مستلقيا بشكل مسطح في جميع الآبار. سيؤدي ذلك إلى عدم كفاية الختم والتلوث من البئر إلى البئر أثناء الاهتزاز.
    2. قم بتأمين الألواح في معطل الأنسجة باستخدام محولات الألواح ذات ال 96 بئرا. رج الألواح لمدة 1 دقيقة عند 30 هرتز، ثم قم بتدوير الألواح 180 درجة ورجها مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة. هذا سوف يساعد على ضمان حتى الاضطراب في جميع آبار اللوحة.
    3. اضغط على الألواح بإحكام على المقعد مرتين أو ثلاث مرات لإزاحة أي حصى من فيلم الختم المرن.
    4. باستخدام جهاز طرد مركزي كبير مع اثنين من محولات لوحة 96 بئرا ، قم بتدوير الألواح لأسفل عند 2400 × g لمدة 2 دقيقة لجمع جميع المواد في قاع الآبار.
    5. قم بإزالة غطاء السيليكون واسحب بعناية فيلم الختم المرن.
      ملاحظة: إذا التزم فيلم الختم المرن في أي من الآبار ، فاستخدم طرف ماصة 200 ميكرولتر لإزالته. هذا أمر شائع عندما تم تمديد فيلم الختم المرن رقيقة جدا.
  13. عينات هضم الدودة المخففة بشكل متسلسل في 300 ميكرولتر في لوحات 96 بئرا.
    1. باستخدام ماصة متعددة الآبار مضبوطة على 200 ميكرولتر ، قم بماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ببطء وبعناية لإعادة خلط محتويات الآبار ، ثم اسحب أكبر قدر ممكن من السائل. انقل هذا السائل إلى الصفوف العليا من ألواح البئر 96 المعدة في الخطوة 3.3.
    2. باستخدام ماصة 96 بئر مضبوطة على 20 ميكرولتر ، قم بإزالة هذا الحجم من السائل من الصف العلوي وقم بتوزيعه في الصف B. ماصة لأعلى ولأسفل 8-10x للخلط. تجاهل النصائح.
    3. كرر الخطوة 3.13.2، بدءا من عينات 0.1x في الصف B لإنشاء عينات تخفيف 0.01x في الصف C.
    4. كرر الخطوة 3.13.2 مرة أخرى، الانتقال من الصف C إلى الصف D.
    5. طبق على أجار صلب لتحديد كمية البكتيريا. بالنسبة للديدان أحادية الاستعمار ، يكفي عموما وضع قطرات 10-20 ميكرولتر من كل تخفيف [1x-0.001x] على ألواح أجار. بالنسبة للاستعمار متعدد الأنواع ، قم بلوحة كل تخفيف على حدة عن طريق سحب 100 ميكرولتر على صفيحة أجار 10 سم ؛ ينتشر على الفور باستخدام خرز طلاء الزجاج.

4. تنظيف الحصى كربيد السيليكون لإعادة استخدامها

ملاحظة: يستخدم هذا الإجراء لتنظيف وتعقيم مواد الطحن ، حصى كربيد السيليكون ، لإعادة استخدامها بعد التجارب. يجب اتباع هذا البروتوكول بالكامل قبل الاستخدام الأول ، حيث أن حصى كربيد السيليكون هو منتج صناعي ولا يأتي معقما مسبقا. حصى Si-carbide (3.2 جم / سم مكعب) هي مادة كثيفة ذات حواف خشنة تعمل بكفاءة لتعطيل العينات الصعبة. ومع ذلك ، يمكن أن تتآكل الجسيمات على الاستخدام المتكرر ويجب استبدالها عندما يصبح التآكل واضحا. لحسن الحظ ، فإن المادة غير مكلفة ، والأحجام التي تباع عادة (~ 1 رطل) كافية للعديد من التجارب.

  1. بعد إزالة العينات للطلاء ، أضف محلول تبييض بنسبة 10٪ إلى جميع آبار اللوحة المكونة من 96 بئرا واتركها لمدة 10 دقائق على الأقل.
  2. قم بإزالة الجزء الأكبر من الحصى عن طريق عكس اللوحة المكونة من 96 بئرا بسرعة فوق صينية صغيرة عالية الجانب أو حاوية طرف ماصة P1000 فارغة كبيرة بما يكفي لالتقاط جميع المحتويات. سوف تغرق الحصى على الفور في الجزء السفلي من الدرج. صب محلول التبييض في الحوض.
  3. أعد ملء الصفيحة المكونة من 96 بئرا بماء الصنبور وانقلبها في نفس الدرج لشطف الحصى المتبقي. صب الماء في الحوض.
  4. كرر مرة إلى ثلاث مرات أخرى مع ماء الصنبور حتى يصبح الطبق خاليا تماما من الحصى.
  5. شطف الحصى 2x في ماء الصنبور ، وملء الدرج في كل مرة.
    ملاحظة: يمكن غسل لوحة البئر العميقة المكونة من 96 بئرا في غسالة الصحون المختبرية ، وتغطيتها بشكل آمن بورق القصدير ، وتعقيمها بمواد بلاستيكية أخرى قابلة لإعادة الاستخدام. لا تحتاج الحصى إلى غسلها على الفور ويمكن وضعها جانبا في هذه المرحلة. عادة ما تتراكم الحصى المستخدمة من تجارب متعددة قبل الغسيل والتعقيم.
  6. اغسل الحصى في محلول من المنظفات المختبرية لمدة 30 دقيقة ، مع الإثارة من حين لآخر عن طريق الدوران أو الخلط مع ملعقة معدنية.
  7. شطف جميع آثار المنظفات في عدة تغييرات (8-10) من ماء الصنبور ، ثم شطف 2x بالماء المقطر.
  8. انشر الحصى في صينية مفتوحة ، مثل صينية الأوتوكلاف الضحلة المصنوعة من البولي بروبيلين ، وجففها عند 40-70 درجة مئوية لعدة ساعات.
    ملاحظة: إذا كانت الحصى متكتلة عندما تجف ، فلم يتم تنظيفها أو شطفها بشكل كاف. كرر بروتوكول التنظيف بدءا من الخطوة 4.6 ، مع إضافة شطف إضافي في الخطوة 4.7.
  9. قم بتوزيع الحصى النظيف والجاف في زجاجات زجاجية قابلة للتعقيم على سطح لولبي على عمق أقصى يتراوح بين 5 و 6 سم. الأوتوكلاف في دورة ما قبل الفراغ لمدة 30 دقيقة للتعقيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تعقيم التبييض للديدان الحية
الديدان المبيضة على السطح خالية بشكل فعال من البكتيريا الخارجية حتى تعود الحركة وتستأنف الإفراز. في ظل الظروف المستخدمة هنا ، لوحظ الانقراض السريع للبكتيريا في المخزن المؤقت (الشكل 1A-C ، الشكل التكميلي 2 ، الفيديو 1) دون إزعاج البكتيريا المرتبطة بالأمعاء في الديدان المشلولة بالبرد (الشكل 1D-F ، الفيديو 2). تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام التبييض السطحي بفعالية لتعقيم الديدان خارجيا دون المساس بمحتويات الأمعاء (المقارنات بين التبييض السطحي مقابل عدد CFU المرتبط بالديدان غير المهمة ، اختبار Wilcoxon rank sum p > 0.05).

الاختلافات في الاضطراب الميكانيكي متعدد العينات
تقنية 96-well للتعطيل الميكانيكي للديدان قوية للمواد المحددة المستخدمة ، والاعتبارات العملية تملي اختيار مواد الطحن. وعلى غرار تقرير سابقرقم 33، أدى التعطيل اليدوي (الشكل 2 ألف) إلى عدم تجانس أكبر من بروتوكول 96 بئرا القياسي (حصى كربيد السيليكون، الشكل 2 ب) (var(log10CFU) = 0.499) في جميع ظروف التخزين المؤقت، مقارنة ب 0.229 لكربيد Si، و 0.243 للخرز الزجاجي الكبير (الشكل 2C)، و 0.227 للخرز الزجاجي الصغير (الشكل 2D). ). ومع ذلك ، فإن معظم الاختلافات في توزيعات CFU / الدودة لم تكن كبيرة (Kruskal-Wallace ، p = 0.017 مع df = 3 ؛ اختبارات Wilcoxon المهمة بعد المخصصة للخرز الكبير مقابل الخرز الصغير ، p = 0.021 ، والخرز الكبير مقابل حصى كربيد السيليكون ، p = 0.02). لم يكن استخدام Triton X-100 كخافض للتوتر السطحي مرتبطا بأي فرق كبير في الغلة عند اعتباره عاملا فرديا (Kruskal-Wallace ، p = 0.94 ، df = 3) ، على الرغم من وجود زيادة واضحة في الغلة في العينات التي لا تحتوي على Triton مقابل Triton عند استخدام الخرز الكبير (2.7 مم) (الشكل 2C) ، وربما يعزى ذلك إلى "الرغوة" المفرطة التي لوحظت في هذه الآبار عندما كان Triton موجودا. تشير هذه النتائج إلى أن الخرز الزجاجي الكبير ، في حين أنه مثالي للاستخدام في أنابيب التجانس33 ، إلا أنه غير مناسب لتقنية 96 بئرا. في حين أن الخرز الزجاجي الصغير أنتج نتائج معقولة (الشكل 2D) ، إلا أنه كان يسد باستمرار أطراف ماصة 200 ميكرولتر أثناء الخلط والطلاء. المواد القياسية في هذا الفحص ، حصى كربيد السيليكون ، غير مكلفة ، كبيرة جدا لسد النصائح القياسية ، ومثل الخرز الزجاجي يمكن غسلها وإعادة استخدامها بعد التعقيم. تطلق الحصى كمية صغيرة من "الغبار" في المخزن المؤقت ، والذي لا يتداخل مع الطلاء ولكن يجب تصفيته إذا كان سيتم استخدام منتجات الاضطراب لقياس التدفق الخلوي.

عدم التجانس في الاستعمار البكتيري في الديدان البالغة
يكشف التعطيل الناجح للديدان الفردية عن عدم التجانس في الاستعمار البكتيري. الأفراد من مجموعات متزامنة متساوية المنشأ من الديدان ، المستعمرة في نفس الوقت على نفس المجموعة من البكتيريا ، تظهر باستمرار 100 ضعف أو أكبر في الحمل البكتيري المعوي. ويلاحظ ذلك بالنسبة للمستعمرين البكتيريين المختلفين (الشكل 3 أ) وأثناء الاستعمار على المجتمعات البكتيرية متعددة الأنواع (الشكل 3 ب). ويتضح هذا التباين أيضا في قياسات الدودة الفردية للتألق عندما تستعمر الديدان ببكتيريا تعبر عن بروتين فلورسنت (GFP) (الشكل 3C-D). تلعب خصائص المضيف دورا في تشكيل هذا التباين ، كما يتضح من خلال مقارنة استعمار ديدان بريستول N2 البرية بالاستعمار بواسطة نفس البكتيريا في طفرات DAF-2 / IGF ؛ يدعم هذا المتحور daf-16 مجموعات أكبر من العديد من البكتيريا مقارنة ب N2 ، في حين أن daf-2 مقاوم للاستعمار بواسطة مجموعة من البكتيريا 36 (الشكل 3B ، D). هذا التباين هو سمة مميزة ، تظهر التباين عبر مجموعات مختلفة من المضيف والمستعمر (المستعمرين) ، مع الاحتفاظ ببنية متسقة على مسارات مختلفة من نفس التجربة (الشكل 3E-F).

أهمية عدم التجانس الفردي للمقارنة الدقيقة بين المجموعات
يمكن رؤية أهمية عدم التجانس الفردي بسهولة من خلال النظر في كيفية قيام هضم الدفعات بتغيير توزيعات البيانات. الاستعمار بواسطة بكتيريا الميكروبيوم الأصلية MYb53 (Rhodococcus erythropolis) و MYb120 (Chryseobacteria spp.) (الشكل 3A ، 4A) في N2 البالغين تستخدم كأمثلة. من الواضح أن بيانات الدودة الفردية متشابهة في التوزيع (اختبار t ثنائي الذيل ، p = 0.9 ، مجموع رتبة Wilcoxon ، p = 0.59). عند إعادة تشكيل هذه البيانات لمحاكاة تأثيرات هضمات الدفعات ، فإن الدفعة المستنبطة CFU / worm تسحب نحو الكميات العليا من البيانات بسبب الانحراف الإيجابي في هذه التوزيعات (متوسط > الوسيط). نظرا لأن الخلط يفوق متوسطات فعالة على الأفراد داخل الدفعة، فإن CFU/worm المستنبطة بالدفعة سوف تتمحور حول المتوسط الحسابي للبيانات الفردية، مع تناقص المسافة إلى هذا المتوسط حيث تصبح الدفعات كبيرة وفقا لنظرية الحد المركزي (الشكل 4B-D). وفقا لذلك ، يتم فقدان الإشارة من التباين البيولوجي بسرعة ؛ تتقارب قياسات CFU / الدودة المستنبطة دفعة نحو المتوسط ، وهو ليس مقياسا تمثيليا لهذه البيانات الموزعة على مقياس السجل. وسرعان ما تصبح الاختلافات في الاستعمار المستنبط بواسطة MYb53 مقابل MYb120 كبيرة في ملخصات الدفعات المحاكية (دفعة اختبار t 5 ، p = 0.049 ؛ الدفعة 10 ، p = 2.27e-4 ؛ الدفعة 20 ، p = 1.19e-15 ؛ ويلكوكسون رتبة مجموع اختبار دفعة 5 ، p = 2.27e-4 ؛ الدفعة 10 ، p = 2.70e-06 ؛ الدفعة 20 ، p = 1.80e-09) حيث يتم حجب الإشارة الأصلية.

آثار عدم التجانس الفردي على انتقال الميكروبات
نظرا لأن الديدان الفردية تظهر عدم تجانس كبير في الاستعمار البكتيري ، فمن المعقول أن نسأل ما إذا كان هذا التباين له آثار في المصب. على سبيل المثال ، من المعقول أن نتوقع أن يكون الانتقال دالة على الحمل البكتيري المعوي. عن طريق نقل الديدان الفردية المبيضة على السطح إلى بيئة نظيفة ، من الممكن ملاحظة تلقيح البيئة بالبكتيريا الحية التي تفرز . وفي هذه التجارب، سمح للبالغين المبيضين سطحيا قبل الاستعمار، الذين يحملون أعدادا كبيرة عموما (10 3-10 5 CFU/worm، الشكل 5) من Ochrobactrum MYb14-GFP أو S. aureus-GFP المسببة للأمراض، بالتجول في مروج OP50 المقتولة بالحرارة على أجار NGM لمدة1.5 ساعة. عندما يتم إعادة حصاد هذه الديدان من ألواح الإفراز وتعطيلها من أجل تحديد كمية البكتيريا ، لا توجد علاقة كبيرة بين الحمل البكتيري ومعدل إفراز البكتيريا الحية (علاقات بيرسون بين المستعمرات / ساعة المحولة بالسجل و CFU / الدودة: MYb14 rho = 0.19 ، p = 0.45; S. aureus rho = 0.02 ، p = 0.9) (الشكل 5). كما لا توجد علاقة كبيرة بين وجود / عدم وجود مستعمرات على صفيحة والحمل البكتيري المعوي (الانحدار اللوجستي ذو الحدين مع CFU / الدودة المحولة بالسجل كعامل: p = 0.15 مع df = 53). وظل جزء كبير من الصفائح خاليا من النمو الجديد (9/18 لوحة ل MYb14 ، 10/36 لوحة ل S. aureus) ، مما يشير إلى انخفاض معدلات الإفراز الإجمالية.

عندما يسمح للديدان بالإفراز على صفائح أجار ، فإن العدد الفعلي للبكتيريا الحية التي تفرز لكل دودة يتم إرباكه بسبب "الزراعة" ، حيث تمر الديدان عبر المستعمرات وتخلق مسارات نمو جديدة (الشكل 6)37. تمثل الصفيحة ذات المستعمرات n حدثا واحدا على الأقل ، وعلى الأكثر n ، حيث تم إفراز البكتيريا الحية المكونة للمستعمرة. من هذه الملاحظة ، لا يمكن معرفة عدد أحداث الإفراز في (1,n) التي حدثت بالفعل ، ولا يمكن معرفة عدد البكتيريا التي تم إفرازها في كل حدث. لذلك لا يمكن تقدير معدلات إفراز البكتيريا الحية من الأمعاء بدقة باستخدام هذه البيانات. ومع ذلك ، من الممكن استنتاج بعض الحدود. على الرغم من أن عدد المستعمرات لكل لوحة ليس مفيدا للغاية ، إلا أنه يمكن استخدام بيانات الوجود / الغياب للاستدلال التقريبي على معدلات الإفراز. من أجل البساطة ، إذا افترضنا أن معدل إفراز البكتيريا الحية ليس دالة للحمل البكتيري وأن الإفراز هو عملية بواسون ، فهناك فرصة بنسبة 50٪ تقريبا لمراقبة تسعة أحداث على الأقل في 18 تجربة عندما ≈ 0.33 دودة -1 ساعة - 1 في MYb14. بالنسبة ل S. aureus ، يتم الحصول على معدلات معقولة مماثلة من λ ≈ 0.2 worm-1 hr-1. في حين أن هذه الحسابات التقريبية تشير إلى انخفاض معدلات إفراز البكتيريا الحية ، فإن تحديد كمية أكثر دقة لهذه العملية على أعداد أكبر من الديدان الفردية سيكون ضروريا للحصول على تقديرات موثوقة.

توافر البيانات:
البيانات المعروضة هنا متاحة على Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
الشكل 1. إن علاج تبييض السطح منخفض التركيز يقتل البكتيريا بسرعة في المخزن المؤقت ولكنه لا يزعج المجتمعات المعوية في الديدان المشلولة الباردة. (أ-ج) CFU البكتيرية / مل في المخزن المؤقت للدودة M9 أثناء التبييض السطحي بثلاثة تركيزات مختلفة (1: 1000 ، 1: 2000 ، 1: 5000 v / v ؛ التحكم غير المبيض للمقارنة) ، مستهدفة (A) S. aureus Newman ، (B) S. enterica LT2 ، أو (C) E. coli OP50. تم أخذ العينات في نقاط زمنية محددة تصل إلى 20 دقيقة بعد التعرض وغسلها مرتين باستخدام عازل معقم لمنع المبيض من قتل المستعمرات على الأطباق. يتم إزاحة بيانات الشرط 1:1000 قليلا بحيث تكون هذه البيانات مرئية على المؤامرة. (مد إلى واو) البكتيريا المعوية في الديدان الفردية N2 (n = 24 دودة لكل تجربة ، واثنين أو ثلاثة أشواط مستقلة في أيام منفصلة). جميع المقارنات بين تعداد CFU المرتبط بالديدان المبيضة السطحية وغير المبيضة غير مهمة (اختبار Wilcoxon rank sum p > 0.05). تمثل الخطوط الأفقية الرمادية عتبة الكشف ، والتي تعرف بأنها الكثافة (40 CFU / worm) التي يكون فيها احتمال مراقبة مستعمرة واحدة على الأقل ~ 60٪ عند طلاء 10 ميكرولتر من أحجام 200 ميكرولتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. ينتج عن بروتوكول التعطيل المكون من 96 بئرا نتائج متسقة وقوي في اختيار المواد. تم تبييض الديدان البالغة N2 المستعمرة بنوع بكتيري واحد لمدة 48 ساعة (P. mosselii) على السطح وتغلغلت وفقا للبروتوكولات القياسية ، ثم تعطلت الديدان الفردية (n = 24 لكل حالة) ميكانيكيا لطلاء CFU باستخدام (A) التعطيل اليدوي في أنابيب 0.5 مل الفردية ، باستخدام مدقة آلية أو (B-D) ) الاختلافات في بروتوكول تعطيل 96 بئرا الموصوف بالتفصيل في البروتوكول. تم إجراء الاضطراب في المخزن المؤقت للدودة M9 الذي يحتوي على تركيزات متفاوتة من Triton X-100 (المحور x ، 0-0.1٪ ، v / v) وواحد من (B) كربيد السيليكون 36-grit ، (C) خرز زجاجي صغير (425-600 ميكرومتر) ، أو (D) خرز زجاجي كبير (2.7 مم). بالنسبة لجميع المؤامرات ، فإن البيانات المعروضة هي السجل10 (CFU / worm) ، وكل نقطة هي دودة فردية واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. الاستعمار البكتيري غير المتجانس للأمعاء C. elegans. (أ) استعمار نوع واحد من الخنثى البالغ N2 المحضر كما هو الحال في الأساليب. البكتيريا هي أربعة أنواع من مجموعة ميكروبيوم الدودة الأصلية MYb (Dirksen et al. 2016) (n = 24 دودة ، تجربة واحدة لكل منهما) واثنين من مسببات الأمراض ، المكورات العنقودية الذهبية MSSA Newman (SA) والسالمونيلا المعوية LT2 (SE) (n = 96-144 الديدان على تجربتين مستقلتين أو ثلاث تجارب). تم تقييم الاستعمار من قبل أنواع الميكروبيوم المحلية بعد حضانة 48 ساعة عند 25 درجة مئوية في السائل S المتوسطة + 108 CFU / mL البكتيريا. تم تقييم الاستعمار بواسطة مسببات الأمراض بعد الحضانة على المروج على أجار دودة NGM لمدة 24 (SA) أو 48 (SE) h عند 25 درجة مئوية. (في الساعة 48 ، ماتت الديدان على S. aureus في الغالب.) (ب) إجمالي CFU / دودة في N2 و daf-16 (mu86) و daf-2 (e1370) البالغين المستعمرين لمدة 4 أيام في الوسائط السائلة على ميكروبيوم محلي من ثمانية أنواع (بيانات من Taylor and Vega ، 2021)14. (C-D) التألق الأخضر في الديدان الفردية المستعمرة بالبكتيريا المعبرة عن GFP ، والتي لوحظت من خلال قياس تدفق الخلايا الكبيرة. وفي الفقرة (ج)، استعمرت مجموعات متزامنة من البالغين N2 مع OP50 (غير الفلورسنت، n = 1908 الديدان البالغة الفردية)، S. aureus (GFP، n = 968)، أو S. enterica (GFP، n = 1153) كما هو موضح في (A)؛ يشير التحكم OP50 إلى المستويات النموذجية للتألق الذاتي للقناة الخضراء في ديدان N2 البالغة في اليوم 3. في (D) ، تم استعمار مجموعات متزامنة من N2 (n = 1165) ، daf-16 (mu86) (n = 1180) ، و daf-2 (e1370) (n = 2267) بالغين مع Ochrobactrum MYb14-GFP لمدة يومين على لوحات كما هو موضح في (A). (E-F) التباين اليومي في الاستعمار بواسطة S. aureus (E) و S. enterica (F) (نفس البيانات كما في اللوحة A والشكل 1 ، n = 48 دودة لكل تجربة). يشير المحور x إلى يوم أخذ العينات. تمثل الخطوط الأفقية الرمادية عتبة الكشف، التي تعرف بأنها الكثافة التي يكون فيها احتمال مراقبة مستعمرة واحدة على الأقل ~ 60٪ (40 CFU/worm لاستعمار نوع واحد وأربعة CFU/worm للاستعمار متعدد الأنواع، بسبب أحجام الطلاء المختلفة من 10 ميكرولتر و 100 ميكرولتر على التوالي من أصل 200 ميكرولتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. الخلط يمحو التباين البيولوجي في بيانات مقياس السجل المنحرفة. تم إعادة تشكيل بيانات CFU / worm من الشكل 3 مع استبدالها لإنشاء n = 25 مجموعة مكررة من البيانات المحاكية لكل حجم دفعة ، حيث يكون الحجم هو عدد الديدان الفردية لكل دفعة. CFU / worm هو إجمالي CFU في كل دفعة محاكاة مقسوما على عدد الديدان لكل دفعة. وفي البيانات الأولية (اللوحة ألف)، يبلغ متوسط CFU/worm ل MYb53 4450.8 (10 3.6)، وبالنسبة ل MYb120، 1398.3 (103.1)؛ تتقارب الأرقام المستنبطة بالدفعة مع هذه القيم مع زيادة حجم الدفعة (B ، خمس ديدان / دفعة ؛ C ، 10 ديدان / دفعة ؛ D، 20 ديدان/دفعة)، بما يتفق مع التوقعات من نظرية الحد المركزي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. يرتبط إفراز البكتيريا الحية ارتباطا سيئا بحمل CFU في أمعاء الديدان الفردية. هنا ، تم استعمار البالغين N2 عن طريق التغذية لمدة 1 أو يومين على التوالي على مروج S. aureus-GFP أو MYb14-GFP. تم فرز الديدان ذات التألق GFP القابل للكشف (إجمالي GFP > 1.8 سجل على مقياس تدفق الخلايا الكائنية الكبيرة) من السكان السائبين ، وتبييض السطح كما هو موضح في الطرق ، ونقلها بشكل فردي إلى NGM + لوحات OP50 المقتولة حراريا. ارتباطات بيرسون بين المستعمرات / h المحولة بالسجل و CFU / الدودة غير مهمة (MYb14 rho = 0.19 ، p = 0.45 ؛ S. aureus rho = 0.02 ، p = 0.9). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6. "الزراعة" البكتيرية تحجب عدد أحداث الإفراز على ألواح الأجار. فيما يلي لوحتان مع مستعمرات MYb14-GFP من إفرازات الدودة. تحتوي الصفيحة الأولى (A) على دليل واضح على "الزراعة" على طول مسارات الديدان ويبدو أنها تمثل حدثين منفصلين على الأقل من أحداث الإفراز بناء على الاختلافات في تعبير GFP (المرئي على شكل تصبغ مصفر) عبر المستعمرات. في حين أن اللوحة الثانية (B) أكثر غموضا ، لا يمكن استبعاد الزراعة بناء على مواقع المستعمرات. في هذه التجارب ، تم استعمار الديدان البالغة N2 قبل الاستعمار لمدة 48 ساعة عن طريق التغذية على ألواح أجار تحتوي على مروج MYb14-GFP. بعد الاستعمار ، تم تحضير الديدان وتبييضها على السطح وفقا للطرق ، ثم نقلها في 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدودة M9 + 0.1٪ Triton X-100 إلى 6 cm NGM + لوحات OP50 المقتولة بالحرارة (تم إعدادها عن طريق السماح لبقع 50 ميكرولتر من OP50 المركزة المركزة بالحرارة لتجف على السطح). وسمح للديدان بالتجول لمدة 1.5 ساعة عند 25 درجة مئوية، ثم تم التقاطها من الألواح وتعطيلها لطلاء CFU/worm (التعطيل اليدوي في مخزن مؤقت سعة 20 ميكرولتر في أنابيب فردية سعة 0.5 مل، باستخدام مدقة آلية). تم تحضين اللوحات عند 25 درجة مئوية لمدة يومين قبل العد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1. تصور ديدان N2 المستعمرة مع GFP الفلورسنت S. aureus دون تبييض السطح. يتحرك عدد صغير من الخلايا الفلورية على البشرة داخل وخارج التركيز البؤري أثناء مرور الصورة عبر جسم الدودة ، ويصبح الاستعمار غير المتجانس مكانيا للأمعاء مرئيا مع انتقال مجال الرؤية من سطح الجسم إلى الأمعاء. تم التقاط صورة Z-stack عند تكبير 20x على مجهر فلورسنت مقلوب. تم وضع صور الفلورسنت المصفاة ذات المجال الساطع و GFP ، وتم خياطة الصور عبر مكدس Z معا ، باستخدام برنامج المورد. الصورة من نفس الشريحة كما في الشكل التكميلي 2A. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2. تصور دودة N2 المستعمرة مع GFP الفلورسنت S. aureus مع تبييض السطح (1: 1000 v / v لمدة 20 دقيقة). الاستعمار غير المتجانس مكانيا بواسطة البكتيريا الفلورية مرئي في أمعاء هذا الفرد ، وقد تسللت البكتيريا إلى أنسجة الجسم ، مما يشير إلى الإصابة المتقدمة. لا توجد بكتيريا مرئية على البشرة. تم التقاط صورة Z-stack عند تكبير 20x على مجهر فلورسنت مقلوب. تم وضع صور الفلورسنت المصفاة ذات المجال الساطع و GFP ، وتم خياطة الصور عبر مكدس Z معا ، باستخدام برنامج المورد. الصورة من نفس الشريحة كما في الشكل التكميلي 2B. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الشكل التكميلي 1. نظرة عامة على البروتوكول. هنا ، يتم استعمار الديدان البالغة المتزامنة بشكل أحادي مع البكتيريا الحمراء ، وتبييضها على السطح ، وتتخلل قبل التعطيل الميكانيكي للديدان الفردية في شكل 96 بئرا. البكتيريا المنبعثة من الأمعاء مطلية بالتخفيف في سلسلة 10x لتحديد كمية CFU / الدودة. اللوحات المعروضة نموذجية لعدم التجانس الملحوظ. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2. تصور ديدان N2 المستعمرة باستخدام GFP fluorescent S. aureus مع وبدون تبييض السطح (1:1000 v/v لمدة 20 دقيقة). (أ) في العينة غير المبيضة ، تكون البكتيريا الخارجية مرئية عند تكبير منخفض كمناطق من التألق الأخضر غير مرتبطة بالديدان أو شظايا جسم الدودة. (ب) في العينة المبيضة السطحية، يقتصر تألق GFP على الجزء الداخلي من أجسام الدودة (جزء واحد من جسم الدودة مرئي في منتصف الصورة). تم التقاط جميع الصور بتكبير 4x على مجهر فلورسنت مقلوب. تم وضع صور الفلورسنت المصفاة ذات المجال الساطع و GFP ، وتم خياطة الصور من حقول الرؤية المجاورة معا ، باستخدام برنامج البائع. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: وصفات المخزن المؤقت والحل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا يتم تقديم البيانات حول مزايا القياس الكمي للدودة المفردة للحمل البكتيري في C. elegans ، إلى جانب بروتوكول تعطيل 96 بئرا للسماح بالحصول السريع والمتسق على مجموعات البيانات الكبيرة من هذا النوع. بالمقارنة مع الطرق الحالية33 ، تسمح هذه البروتوكولات بقياس إنتاجية أعلى للمجتمعات الميكروبية المعوية في الدودة.

هذا النهج لديه الطلاء كخطوة للحد من معدل الفائدة وليس حقا "الإنتاجية العالية". يعد قياس التدفق الخلوي للأجسام الكبيرة (الشكل 3C ، D) طريقة مفيدة عالية الإنتاجية لقياس البكتيريا المصنفة بالفلورسنت في الديدان الفردية16 ، على الرغم من أن عدد الفلوروفورات المتزامنة يمثل قيدا في المجتمعات متعددة الأنواع. ويعد ربط تعطل الصفائح متعددة الآبار بتسلسل المجتمع طريقة أخرى لزيادة الإنتاجية؛ ومع ذلك ، تم تحسين إجراء تعطيل 96 بئرا الموصوف هنا خصيصا لترك الخلايا البكتيرية سليمة. سيتطلب التحليل القائم على التسلسل ، حيث يكون التحلل الشامل للخلايا مرغوبا فيه ، إضافة خطوة استخراج الحمض النووي أو تعديل بروتوكول الضرب (البروتوكول 3.10-3.11) لاستخراج محتويات الخلايا بدلا من البكتيريا الحية. تم نشر بروتوكولات لتعطيل الدودة المفردة واستخراج الأحماض النووية في مكان آخر38,39.

الوفرة الكلية للبكتيريا في الأمعاء الدودية غير متجانسة ، وتشير البيانات الموضحة هنا إلى أن القياس القائم على الدفعات يمكن أن يؤدي إلى نتائج خاطئة في المقارنات بين المجموعات. ومع ذلك ، قد تكون التدابير الأخرى للمجتمعات البكتيرية في الدودة أقل حساسية لآثار الدفع. وتجدر الإشارة إلى أن الوفرة النسبية في المجتمعات المرتبطة بالديدان تبدو ضئيلة جدا إن وجدت مع الحجم الإجمالي للسكان المعويين، بغض النظر عما إذا كانت التفاعلات بين الميكروبات محايدة40 أم لا14. ومن المعقول، مقارنة ببيانات العد، أن تكون مقاييس الوفرة النسبية أقل عرضة لمسألة المعدل الإيجابي الكاذب الموصوفة. وبالتالي فإن التحليل المجتمعي القائم على التسلسل، الذي يولد بيانات وفيرة نسبيا لتكوين المجتمع، قد لا يتطلب قياس الديدان المفردة. وهناك حاجة إلى مزيد من التحقيق بشأن هذه النقطة.

هنا ، نستخدم العلاج البارد لشل الديدان لتبييض السطح. وقد وجدت أبحاث أخرى أن الديدان تستأنف نشاطها الطبيعي بسرعة (<15 دقيقة) إذا تم الاحتفاظ بالوقت على الجليد أقل من 30 دقيقة، مما يسمح بالاستخدام الفوري في المزيد من المقاييس، على عكس عوامل الشلل الكيميائي التي يمكن أن تتطلب فترات طويلة قبل الشفاء التام34. إذا تم تعطيل الديدان على الفور لتحديد كمية البكتيريا ، فإن هذه الميزة يمكن الاستغناء عنها ، والميزة الرئيسية للتبريد مقابل الشلل الكيميائي هي تجنب الحاجة إلى تيار نفايات خاضع للرقابة. يجب استخدام العلاج البارد الممتد بحذر عند التحقيق في استجابات الإجهاد ، خاصة إذا كان هناك اتصال معروف بدرجة الحرارة. تستلزم بروتوكولات الشلل البارد الموصوفة هنا تعرضا أقصر للبرد الحاد مما هو مستخدم في تجارب الإجهاد البارد (20-30 دقيقة مقابل 2 + ساعة عند 2-4 درجة مئوية) 41،42،43 ، ولا تنتج صدمة باردة لمدة 1 ساعة أي نمط ظاهري واضح في الديدان البرية 43. الحضانة قصيرة الأجل (90 دقيقة) عند 4 درجات مئوية تحفز التغيرات في التعبير الجيني للإجهاد البارد (تقاس بتعبير مراسل TMEM-135::GFP)، ولكن التعبير يعود إلى مستويات غير مجهدة في غضون دقائق بمجرد عودة الديدان إلى درجة حرارة الغرفة34. ومع ذلك ، قد تكون التأثيرات على الأنماط الجينية للديدان الحساسة للإجهاد أكثر حدة مما هي عليه في النوع البري. يجب التحقق من صحة هذا الإجراء في ظل الظروف التجريبية التي سيتم استخدامها.

يمكن استخدام بروتوكول تبييض السطح الموصوف هنا كوسيلة للحد من أو القضاء على مرور الميكروبات الخارجية في التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه الطريقة لإزالة الملوثات الفطرية عن طريق التبييض السطحي ونقل يرقات L1 / L2 فقط إلى ألواح جديدة (أدى نقل البالغين المبيضين على السطح إلى الفشل في إزالة الملوث ، على الأرجح بسبب النقل في أمعاء الحيوانات الكبيرة). من المهم للغاية التأكد من أن تركيز التبييض لا يتجاوز 1: 1000 v / v ، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الديدان والوفيات. قد يكون هذا الإجراء مفيدا في التطور التجريبي بين المضيف والميكروبات والتفاعلات بين المضيف والممرض. على سبيل المثال ، يمكن أن يساعد معدل إفراز البكتيريا الحية المنخفض الذي لوحظ هنا في تفسير المعدلات المتغيرة للغاية التي لوحظت للانتقال البكتيري من الخنثى إلى النسل15. إن عدم وجود علاقة بين الحمل البكتيري المعوي ومعدل الإفراز الذي لوحظ هنا أمر مثير للاهتمام ولكنه يتطلب مزيدا من التحقيق. ستكون هناك حاجة إلى عدد أكبر من نقاط البيانات عبر مجموعة من الظروف لتحديد أين (أو ما إذا كان) ستبقى هذه الملاحظة.

قد لا يكون من الضروري دائما تنظيف الديدان إلى الحد الذي يوفره التبييض السطحي. من المحتمل أن تكون عمليات الغسل المتعددة في المخزن المؤقت المعقم كافية عندما تكون الديدان مستعمرة داخليا بميكروب واحد إذا كان الحد الأدنى المتوقع من CFU / الدودة أعلى بكثير (10-100 ضعف) من تركيز البكتيريا في السوبرناتانت العازلة ، لأن هذا الترحيل سيؤثر على الحد الأدنى من الأعداد (انظر الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان الميكروب (الميكروبات) ذات الأهمية يستعمر (الميكروبات) في المقام الأول البشرة ، فيجب تجنب التبييض السطحي بوضوح. التنظيف الشامل هو أكثر أهمية لضمان الدقة عند التعامل مع المجتمعات الميكروبية المختلطة (للتأكد من أن جميع المستعمرات / القراءات في عينة هي من البكتيريا المرتبطة بالديدان وليس من البيئة) ، عندما تتداخل البكتيريا الملتصقة بالبشرة مع قراءة السكان الداخليين ، عندما يكون الحد الأدنى المتوقع من CFU / الدودة منخفضا ، إلخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم ل H. Schulenberg و C. LaRock لمشاركتهم السخية للسلالات البكتيرية المستخدمة في هذه التجارب. تم دعم هذا العمل بتمويل من جامعة إيموري و NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

علم الأحياء ، العدد 185 ، Caenorhabditis elegans ، الميكروبيوم ، عدم التجانس ، الميكروب المضيف ، البكتيريا ، الانتقال
استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter