Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

Abstract

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא מערכת מודל לאינטראקציות בין פונדקאי למיקרוב ולמיקרוביום מארח-מיקרוביום. מחקרים רבים עד כה משתמשים בתקצירי אצווה ולא בדגימות תולעים בודדות כדי לכמת את עומס החיידקים באורגניזם זה. כאן נטען כי השונות הבין-אישית הגדולה הנראית בהתיישבות חיידקית במעי C. elegans היא אינפורמטיבית, וכי שיטות העיכול של האצווה משליכות מידע החשוב להשוואה מדויקת בין תנאים. מכיוון שתיאור השונות הטבועה בדגימות אלה דורש מספר רב של פרטים, נקבע פרוטוקול נוח של לוחות 96 בארות לשיבוש וציפוי מושבה של תולעים בודדות.

Introduction

הטרוגניות באסוציאציות בין חיידקים מארחים נצפית בכל מקום, ושונות בין פרטים מוכרת יותר ויותר כגורם תורם בתהליכים ברמת האוכלוסייה מתחרות ודו-קיום1 ועד העברת מחלות 2,3,4. ב- C. elegans, "הטרוגניות נסתרת" בתוך אוכלוסיות איזוגניות נצפתה שוב ושוב, כאשר תת-אוכלוסיות של פרטים הראו פנוטיפים שונים בתגובת הלם חום 5,6, הזדקנות ותוחלת חיים 7,8,9,10,11, והיבטים רבים אחרים של פיזיולוגיה ופיתוח12 . רוב הניתוחים המנסים לזהות מבנה תת-אוכלוסייה מספקים ראיות לשתי תת-אוכלוסיות באוכלוסיות ניסיוניות של תולעים איזוגניות ומסונכרנות 5,7,8, אם כי נתונים אחרים מצביעים על האפשרות של התפלגות בתוך האוכלוסייה של תכונות ולא קבוצות מובחנות 7,12,13 . רלוונטי כאן, הטרוגניות משמעותית באוכלוסיות מעיים נצפית אפילו בתוך אוכלוסיות איזוגניות של תולעים המיושבות ממקור משותף של מיקרובים 13,14,15,16, והטרוגניות זו יכולה להיות מוסתרת על ידי מדידות תקציר אצווה הנמצאות בשימוש נרחב 17,18,19,20 לכימות חיידקים בתולעת.

עבודה זו מציגה נתונים המצביעים על צורך בהסתמכות רבה יותר על מדידות של תולעים בודדות בקשר בין מיקרובים מארחים, כמו גם פרוטוקולים להגברת הדיוק והתפוקה בהפרעה לתולעת בודדת. פרוטוקולים אלה נועדו להקל על הפרעה מכנית של מספר גדול של C. elegans בודדים לכימות של עומס חיידקי בר-קיימא, תוך מתן יכולת חזרה טובה יותר ומאמץ נמוך יותר לכל דגימה מאשר הפרעה מבוססת מזיקים של תולעים בודדות. שלב מומלץ לטיהור המעיים, שבו תולעים מורשות להיזון מאי קולי מומת בחום לפני ההכנה לשיבוש, נכלל כדי למזער את התרומות של חיידקים ארעיים (שאינם דבקים) שנבלעו לאחרונה ואחרים (שאינם דבקים). פרוטוקולים אלה כוללים שיטת שיתוק קר לניקוי הציפורן עם טיפול באקונומיקה משטח בריכוז נמוך; הלבנת פני השטח יכולה לשמש כשלב הכנה בהפרעה לתולעת בודדת או כשיטה להכנת תולעים חיות, נטולות חיידקים מבחוץ. שיטת הלבנת פני השטח הזו מספיקה כדי להסיר מגוון רחב של חיידקים חיצוניים, וטיפול בקור מספק אלטרנטיבה לשיתוק קונבנציונלי מבוסס לבאמיזול; בעוד ש-levamisole יהיה מועדף לניסויים רגישים לקור, שיתוק קר ממזער את התרומות לזרמי פסולת מסוכנים ומאפשר חידוש מהיר של פעילות תקינה. בעוד שהפרוטוקול המלא מתאר ניסוי מעבדה שבו תולעים מתיישבות עם חיידקים ידועים, ההליכים לניקוי תולעים ושיבוש תולעים בודדות יכולים להיות מיושמים בקלות על תולעים שבודדו מדגימות בר או התיישבו בניסויי מיקרוקוסמוס. הפרוטוקולים המתוארים כאן מייצרים חיידקים חיים המופקים ממעי התולעת, המתאימים לציפוי ולכימות של יחידות יוצרות מושבה (CME) בתולעים בודדות; לצורך ניתוח קהילת המעיים המבוסס על ריצוף, יש להוסיף לפרוטוקולים אלה את שלבי התזה התאית ומיצוי חומצות הגרעין הבאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תולעים ששימשו בניסויים אלה התקבלו מהמרכז הגנטי Caenorhabditis , הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). בריסטול N2 הוא הסוג הפראי. המוטנטים DAF-2/IGF daf-16(mu86) I (CGC CF1038) ו-daf-2(e1370) III (CGC CB1370) משמשים להמחשת הבדלים בעומס חיידקי במעיים.

HT115(DE3) E. coli הנושא את וקטור RNAi pos-1 הוא מספריית אהרינגר21. אוסף MYb של חיידקי מעיים מקומיים מסוג C. elegans 22 התקבל במעבדת שולנבורג. סלמונלה אנטריקה LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR הוא ממעבדה זו23. Pseudomonas mosselii היה מבודד במעבדה זו. סטפילוקוקוס אאורוס MSSA Newman pTRKH3-mGFP התקבל ממעבדת LaRock באוניברסיטת אמורי.

כל מאגרי התולעים והמדיה מוכנים על פי ספרות24 שפורסמה בעבר עם שינויים קלים (ראו קובץ משלים 1).

1. הכנת C. elegans סטריליים מסונכרנים

הערה: בסעיף זה מתוארים נהלים שלב אחר שלב ליצירת אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים בוגרות סטריליות מבחינה רבייתית. האכלה על צלחות pos-1 RNAi משמשת כאן כדי למנוע ייצור של צאצאים כי הפרעה זו היא קטלנית עוברית; זחלי L1 שגדלו לבגרות ב-pos-1 RNAi מתפתחים להרמפרודיטים מטילים ביצים, אך ביצים אלה הןבלתי ניתנות לערעור 25. פרוטוקול ההזנה של RNAi הוא כמו בפרק "גנטיקה הפוכה" של Wormbook26.

  1. לפני סנכרון התולעים, ודא כי צלחות NGM + pos-1 RNAi טריות בגודל 10 ס"מ + pos-1 זמינות. ניתן להכין צלחות טריות מתרבית נוזלית מושרית מרוכזת (+Amp +IPTG) או לחסן אותן כמדשאות על NGM + 100 מיקרוגרם /מ"ל אמפיצילין + 1 mM IPTG ולאפשר להן לצמוח בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך במשך יוםאחד 27.
    הערה: קרבניצילין (25 מיקרוגרם/מ"ל) משמש לעתים קרובות במקום אמפיצילין על צלחות RNAi. אמפיצילין הוא פחות יקר אבל פחות יציב; אם משתמשים באמפיצילין, יש לזרוע צלחות מיד לאחר הייבוש ולהשתמש בהן בהקדם האפשרי (ניתן לאחסן במשך <שבוע ב-4 מעלות צלזיוס)27. הריכוז האנטיביוטי הגבוה המומלץ כאן יסייע להבטיח בחירה נאותה.
  2. התחילו עם מספר (בדרך כלל שתיים עד ארבע) לוחות NGM עם אוכלוסיות גדולות של הרמפרודיטים גרבידיים. בודדו ביצים באמצעות סנכרון אקונומיקה-NaOH24.
    1. לשטוף תולעים מצלחות אגר באמצעות 2 מ"ל של ddH2 O סטרילילכל צלחת. מפזרים את הנוזל באופן שווה לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל (צינור אחד לכל צלחת או הרמפרודיטים).
    2. סובבו כלפי מטה במשך כ-5 שניות במיני-סנטריפוגה (2,000 x גרם) כדי למשוך את המבוגרים לתחתית הצינורות. פיפטה מחוץ לסופרנטנט ולהשליך.
    3. לשטוף עם 1 מ"ל של ddHסטרילי 2O; סובבו למטה כמו קודם והשליכו את הסופרנאטנט.
    4. חזור על השלב הקודם כדי להפחית את פסולת החיידקים שנותרה.
    5. יש להחיות את התכולה של כל צינור ב-1 מ"ל של ddH2O. יש להוסיף לכל צינור 130 μL של אקונומיקה מסחרית (8.25% נתרן היפוכלוריט) ו-130 μL של 5 N נתרן הידרוקסיד (NaOH, ריכוז סופי 0.5 N).
    6. צינורות וורטקס נמרצים במשך 10-15 שניות לפחות כל 2 דקות עד שגופים בוגרים מתפרקים. אל תאפשרו לטיפול באקונומיקה-NaOH להימשך יותר מ-5 דקות כדי להימנע מהריגת ביצים.
    7. סובבו במיני-סנטריפוג' במשך 30-60 שניות ב-2,000 x גרם כדי להפיל את הביצים. פיפטה מחוץ לסופרנטנט ולהשליך. יכול להיות או לא יכול להיות כדור גלוי, זה נורמלי.
    8. הוסף 1 מ"ל של מאגר תולעת M9 וסובב במשך 30-60 שניות ב 2000 x g. השליכו את הסופרנאטנט.
    9. חזרו על שלב השטיפה (1.2.8) פי 5 כדי להסיר ביסודיות את תערובת האקונומיקה-NaOH, תוך הסרת חלק גדול ככל האפשר של חומר העל מבלי להפריע לכדור הביצה.
    10. מעבירים ביצים ל-10 מ"ל של חיץ תולעי M9 בצינור חרוטי של 50 מ"ל או בצינור תרבית של 30 מ"ל עם מכסה. אם אתם משתמשים בצינורות חרוטיים, השאירו את המכסה לא מעוגל מעט והשתמשו במעט נייר דבק כדי לשמור עליו מאובטח. דגירה עם רעידות למשך הלילה (16 שעות) ב-25 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד כדי לאפשר לזחלים לבקוע.
  3. העבר זחלי L1 מסונכרנים לצלחות RNAi כדי לגדול לבגרות.
    1. הוסף 2 מ"ל של חיץ M9 סטרילי + 0.01% Triton X-100 (מעתה M9TX-01) לכל צינור L1 והעבר את כל הנפח (12 מ"ל) לצינור חרוטי בורגי 15 מ"ל.
    2. הניחו צינורות של 15 מ"ל עם תולעי L1 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להאט את תנועת הזחל.
    3. סובב כלפי מטה צינורות חרוטיים של 15 מ"ל בצנטריפוגה שולחנית גדולה (1,500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; ההאצה וההאטה צריכות להיות לא יותר מ-80% מהמקסימום).
    4. פיפטה בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור L1. השליכו את הסופרנאטנט.
    5. הוסף 12 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור. חזור על הצנטריפוגה. בזהירות פיפטה להשליך את supernatant. כל צינור צריך להכיל כ-200 μL שנותרו.
    6. יש לשטוף קצה פיפטה של 200 μL ב-M9TX-01 כדי למנוע מהתולעים להידבק לפלסטיק, ולאחר מכן השתמשו בקצה זה כדי להחיות את גלולת התולעת. מעבירים את התולעים המחודשות לצלחות קופה-1 מוכנות על ידי צנרת טיפות של נוזל על מדשאת החיידקים.
    7. דגירה של הצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עד ליום הראשון לבגרות.
      הערה: אם מגדלים תולעים על צלחות RNAi pos-1 , התולעים חייבות להזין את ad libitum על חיידקי RNAi עד שהן עברו באופן מלא לבגרות כדי להבטיח חדירה גבוהה של הפנוטיפ העוברי-קטלני. בדוק את הצלחות ב 24 ו 48 שעות. אם הצלחות נראות מורעבות או כמעט מורעבות, יהיה צורך להעביר את התולעים לצלחות טריות כדי לסיים לגדול למבוגרים בגודל מלא. כדי למנוע הידלדלות של צלחות לפני גידול התולעים, שאפו להוסיף זחלי 250-500 L1 לכל צלחת RNAi בגודל 10 ס"מ.
  4. קוצרים מבוגרים ומנקים את ה-E. coli במעיים כדי ליצור תולעים נטולות חיידקים.
    1. יש לשטוף תולעים בוגרות מצלחות באמצעות 5 מ"ל של M9TX-01 לכל צלחת. מעבירים חיץ + תולעים לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומאפשרים למבוגרים להתיישב בתחתית הצינור.
    2. יש לשטוף את המבוגרים בשינויים של 10 מ"ל של מאגר M9TX-01 טרי עד שלא נותרה עכירות חיידקית נראית לעין (בדרך כלל פי 1-2). צינורות יכולים להיות צנטריפוגות ב 700 x g עבור 30 s כדי תולעים גלולה, או מבוגרים יכולים להיות מורשים להתיישב על ידי כוח הכבידה.
    3. בצע שטיפה אחת נוספת עם 10 מ"ל של M9TX-01 כדי להפחית את החיידקים החיצוניים.
    4. העברת תולעים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל או צינורות תרבית של 30 מ"ל המכילים 5 מ"ל S Medium + 2x E. coli OP50 מומת בחום (~5 x 109 תאים מומתים/מ"ל) + 200 מיקרוגרם/מ"ל של גנטמיצין + 50 מיקרוגרם/מ"ל של כלורמפניקול. אם אתם משתמשים בצינורות חרוטיים, השאירו את המכסה לא מעוגל מעט והשתמשו במעט נייר דבק כדי לשמור עליו מאובטח. השתמשו בפיפטות זכוכית או שטפו פיפטות פלסטיק ב-M9TX-01 כדי למנוע מהתולעים להידבק.
    5. הדגירו מבוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד למשך 24-48 שעות כדי לייצר מבוגרים ללא חיידקים.
      הערה: אם התולעים יישארו באנטיביוטיקה במשך >24 שעות, ייתכן שיהיה צורך להוסיף יותר OP50 מומת חום כדי להבטיח שלתולעים יש מקור מזון הולם. בדקו את הצינורות ב-24 שעות והוסיפו ל-OP50 מוכה חום אם העכירות מצטמצמת בעליל.
  5. סוכרוז לשטוף מבוגרים על פי פרוטוקולי Wormbook24 כדי להשיג מלאי נקי, סטרילי מבחינה רבייתית ומסונכרן למבוגרים בלבד להתיישבות חיידקים.
    1. ודא שנפחים קרים של 60% סוכרוז, מאגר תולעים M9 ו- M9TX-01 מוכנים לשימוש. לשם הפשטות, ניתן להשאיר אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בלילה הקודם.
    2. כדי שכל דגימה תישטף, צרו צינור חרוטי מסומן של 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של M9TX-01 והניחו בצד את הקרח. אלה יידרשו בשלב 1.5.10.
    3. הוסף 5 מ"ל של M9TX-01 לכל צינור 50 מ"ל המכיל זחלי L1. העבר את כל הנפח (כיום 10 מ"ל) לצינור חרוטי ראשון ריק של 15 מ"ל ואפשר למבוגרים להתיישב בתחתית הצינור.
    4. בזהירות לטפטף את supernatant להשליך.
    5. הוסף 10 מ"ל M9TX-01 לכל צינור והעביר צינורות לדלי קרח למשך 5-10 דקות.
      הערה: החל מנקודה זו, תולעים וכל המאגרים צריכים להישמר על קרח.
    6. השתמש בהגדרת "טמפ' מהירה" כדי לקרר צנטריפוגת שולחן גדולה ל-4 מעלות צלזיוס.
    7. הוסיפו 10 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור כדי לשטוף את כל הפסולת שנותרה. תנו לתולעים להתיישב על קרח; להסיר את supernatant ולהשליך.
    8. Sucrose לצוף: להוסיף 5 מ"ל של חיץ M9 קר ו 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קר 60% לכל צינור, ערבוב יסודי. לאחר מכן, צפו בזהירות 1 מ"ל של חיץ M9 קר על גבי תערובת סוכרוז-חיץ בכל צינור. אין לערבב לאחר הוספת המצוף.
      אזהרה: לנוע במהירות לקראת הצעדים הבאים - תולעים יכולות להתייבש אם הן נחשפות לריכוזים גבוהים של סוכרוז במשך זמן רב מדי!
    9. צנטריפוגה ב 1500 x g במשך 3 דקות ב 4 ° C. תולעים בוגרות חיות יהיו בממשק של M9 והסוכרוז, כ-1 מ"ל מראש הצינור.
    10. השתמש בפיפטה סרולוגית זכוכית 5 מ"ל כדי להעביר את שכבת התולעת לצינורות חרוטיים מוכנים של 15 מ"ל עם M9TX-01 קר (משלב 1.5.2). היזהרו מאוד לקבל את שכבת התולעים החיות מבלי לטפטף יותר מדי מהסוכרוז.
    11. במידת הצורך, הוסף M9TX-01 כדי לקבל נפחים שווים של 10-12 מ"ל / שפופרת. צנטריפוגה ב 1500 x g ב 4 ° C במשך 1 דקה, ולאחר מכן pipette את supernatant. ניתן להחזיר תולעים לטמפרטורת החדר בשלב זה.
    12. חזור על שלב הכביסה 1.5.11 פעמיים, והפחית את המהירות ל-700 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס ואת הזמן ל-30 שניות.

2. האכלת תולעים בחיידקים חיים בתרבית נוזלית

הערה: פרוטוקול זה משמש ליישוב תולעים עם חיידקים שגודלו במעבדה בתנאים מעורבים היטב בתרבית נוזלית (איור משלים 1). ניתן ליישב תולעים עם מבודדים בודדים מתרבית טהורה (למשל, פתוגנים כגון אנטרוקוקוס פקסיום28,29) או תערובות של מבודדים (למשל, קהילות מיקרוביום מינימליות14).

  1. התחילו עם תולעים בוגרות מסונכרנות של סוכרוז משלב הפרוטוקול 1.5 בצינור חרוטי של 15 מ"ל. לשטוף את התולעים פעם אחת ב 12 מ"ל של S buffer ולהשליך את supernatant.
  2. החייא את התולעים השטופות בנפח של מדיום S הדרוש לניסוי. קחו בחשבון את נפח תנאי הניסוי, את מספר התנאים שבהם יתפצלו התולעים ואת הריכוזים הסופיים של תולעים וחיידקים.
    הערה: האכלה בתולעים משתנה בהתאם לזמינות החיידקים30 ותולעים יכולות להיות לחוצות על ידי צפיפותשל 31. עבור קולוניזציה בתרבית נוזלית, מומלץ <1000 תולעים /מ"ל ו- >107 CFU / mL; 1011 CFU/mL נחשב לצפיפות האכלה "ad libitum" ב-E. coli32.
  3. סובבו את תרביות החיידקים. לשפוך את supernatant; ניתן להשתמש בשאיפה או בצנרת כדי להסיר את ה-supernatant עבור חיידקים שיוצרים כדורים רופפים.
    הערה: עבור תרביות >5 מ"ל, העבר לצינורות 15 מ"ל וסובב ב~ 2800 x g בצנטריפוגה שולחנית גדולה למשך 8-10 דקות. ניתן להעביר תרביות <5 מ"ל לצינורות 1.5 מ"ל ולצנטריפוגה ב-9000 x g למשך 1-2 דקות בצנטריפוגה שולחנית קטנה. ייתכן שיהיה צורך לצנן חיידקים תנועתיים מאוד (למשל, מינים רבים של Pseudomonas) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות כדי להקל על היווצרות כדור יציב, וייתכן שעדיף לצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. החייאת תרביות חיידקים בכרך אחד של חיץ S וצנטריפוגה שוב לכדור. הסר והשליכו את ה-supernatant כבעבר.
  5. בצעו החייאה בתרביות חיידקים במדיום S בצפיפות הרצויה לניסוי, בתוספת כל אנטיביוטיקה לבחירה. האנטיביוטיקה שתשמש, אם בכלל, תהיה תלויה בפרופיל העמידות של החיידקים המשמשים להתיישבות.
  6. באמצעות קצה פיפטה המצופה ב-M9TX-01, תולעי פיפטה עולות ויורדות בעדינות עד שהתולעים עוברות החייאה יסודית במדיום S, ואז מועברות לצינורות או לבארות צלחות להתיישבות חיידקית.
  7. הוסיפו תרחיף חיידקי לכל תרבית תולעים כדי להגיע לריכוז החיידקים הרצוי ולנפח הסופי הרצוי.
  8. אם אתם משתמשים בצלחת מרובת בארות להתיישבות, מכסים את הצלחת בקרום איטום סטרילי של 96 בארות חדירות לגז.
  9. דגירה עם רעידות ב-200 סל"ד כדי למנוע מחיידקים להתיישב במהלך הדגירה.

3. הפרעה מכנית של תולעים בודדות בפורמט של 96 בארות

הערה: סעיף זה מתאר פרוטוקול בפורמט של צלחת 96 בארות לשיבוש מכני של C. elegans בודדים המיושבים בחיידקים. הצעדים הראשונים בפרוטוקול (3.1-3.8) מתארים שיטה לטיהור חיידקים שאינם דבוקים ממעי התולעת ולנקות את החלק החיצוני של התולעים באמצעות שיתוק קר והלבנת פני השטח. שלבים אלה ייצרו תולעים בוגרות נקיות וחיות, שניתן לשבש אותן באופן מכני לצורך כימות תכולת החיידקים (3.8 קצוות) או להשתמש בהן לניסויים נוספים (איור משלים 1). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכימות חיידקים בתולעים המיושבות בתרבית נוזלית (סעיף 2), על צלחות אגר, או מאדמה טבעית או מיקרוקוסמוסית.

  1. מניחים אליקוט של M9TX-01 על קרח כדי לצנן (פי 4-5 ממספר הדגימות במ"ל).
  2. מכינים אליקוט של M9TX-01 + אקונומיקה (6% נתרן היפוכלוריט, 1:1000 או 1:2000 v/v, 1 מ"ל לדגימה + 1 מ"ל תוספת) ומניחים על קרח לקירור. ציטוט זה ישמש בשלב 3.8.
  3. הכינו צלחות של 96 בארות לדילול סדרתי של דגימות תולעים משובשות.
    1. להשיג לוחות סטריליים 300 μL קיבולת 96-well עם מכסים; פרוטוקול זה משתמש בצלחת דילול אחת לכל 12 תולעים שהתעכלו.
    2. השתמש בצינור רב-ערוצי בן 96 בארות כדי למלא שורות B-D של כל לוחית 96 באר (קיבולת של 300 μL) עם 180 μL של מאגר PBS 1x. השאר את השורה העליונה ריקה. שורות B-D יהפכו לדילולים סדרתיים פי 10 של תקצירי התולעת [0.1x, 0.01x, 0.01x].
    3. הניחו צלחות בצד. לוחות דילול ישמשו בשלב 3.13.
  4. בצעו החייאה של כל דגימת תולעת ב-1 מ"ל של M9TX-01 בצינור מיקרו-סנטריפוג' של 1.5 מ"ל.
  5. סובבו צינורות לזמן קצר (2-3 שניות) במיני-סנטריפוג' במהירות נמוכה (2,000 x גרם) ב-25 מעלות צלזיוס כדי להפיל מבוגרים. פיפטה את הסופרנטנט ולהשליך, להיות בטוח לא להפריע לכדור התולעת.
  6. באמצעות הגדרות הצנטריפוגה בשלב 3.5, יש לשטוף את התולעים פעמיים עם 1 מ"ל של M9TX-01, ולאחר מכן פעם אחת עם 1 מ"ל של מאגר תולעים M9, כדי להפחית את החיידקים החיצוניים.
  7. לטהר חיידקים שאינם דבקים ממעי התולעת.
    1. בצעו החייאה של כל דגימה של תולעים ב-1 מ"ל של S בינוני + 2x OP50 מומת חום בצינור תרבית.
    2. דגירה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לאפשר מעבר של חיידקים שאינם דבוקים מהמעיים.
      הערה: זה גם ינקה כל חלבון פלואורסצנטי חוץ-תאי מהלומן ויאפשר הדמיה ברורה יותר של חיידקים מסומנים שנדבקו לאפיתל המעיים, במיוחד כאשר נעשה שימוש בפלואורופורים מהירים בחומצה (למשל, mCherry, dsRed).
  8. פני השטח אקונומיקה תולעים כדי לנקות חיידקים חיצוניים.
    1. יש לשטוף את התולעים המטוהרות פעמיים עם 1 מ"ל של M9TX-01 קר ולהשליך את ה-supernatant.
    2. אפשרו לצינורות להתקרר במשך 10 דקות על קרח (מועדף) או ב-4 מעלות צלזיוס. זה ישתק את התולעים וימנע בליעה של אקונומיקה.
      הערה: פרוטוקולים אחרים משתמשים בחומר שיתוק כימי כגון levamisole; זוהי גישה מבוססת33 הדורשת תוספת של זרם פסולת מסוכן.
    3. הוסף 1 מ"ל של חיץ תולעת M9 קר כקרח + אקונומיקה ללא בישום (8.25% נתרן הידרוקסיד, 1:1000 או 1:2000 v/v) לכל צינור. אפשרו לצינורות לשבת על קרח (מועדף) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות כדי להרוג חיידקים חיצוניים.
      הערה: אין לחרוג מריכוז אקונומיקה של 1:1000. אפילו אצל תולעים משותקות, התמותה עלולה לגרום לכך.
    4. פיפטה מחוץ למאגר אקונומיקה ולהשליך; מחזירים צינורות לקרח כדי להבטיח שהתולעים לא יחזרו לשאוב עד לפינוי אקונומיקה.
    5. הוסף 1 מ"ל של M9TX-01 קר לכל צינור. ספין במשך כ-5 שניות במיני-סנטריפוג' (2,000 x גרם ב-25 מעלות צלזיוס); להחזיר צינורות לקרח. הסר את ה-supernatant והשליך.
    6. חזור על שלב שטיפה זה עם עוד 1 מ"ל של M9TX-01 קר, תוך השלכת כמה שיותר מהסופרנטנט.
      הערה: אם אתם משתמשים בתולעים לניסויים נוספים, דלגו על שלב ה-permeabilization (פרוטוקול 3.9) ובמקום זאת העבירו את הבוגרים הטריים שהלבינו את פני השטח למאגר קר כקרח בצלחת פטרי באורך 6 ס"מ והפרידו את התולעים לתנאי ניסוי כמו בפרוטוקול 3.10. שמור על התולעים קרות כדי למנוע את חידוש התנועתיות, אך עבוד במהירות - שמירה על תולעים במשך >30 דקות על קרח עלולה לגרום לחידוש <100% של הפעילות הרגילה34.
  9. חדירה כימית של קוטיקולה של תולעת עם נתרן דודציל סולפט ודיתיותריאטול (0.25% SDS + 300 mM DTT) (מבוסס על35)
    אזהרה: DTT הוא סוכן מפחית ומגרה. לבשו PPE ועבדו במכסה אדים כשאתם מטפלים במלאי או בפתרונות יבשים. נדרש זרם פסולת מסוכן.
    1. במכסה האדים, הכינו מספיק תמיסת SDS/DTT כדי לאפשר 100 μL לכל דגימה. עבור 1 מ"ל, עד 965 μL של מאגר תולעת M9 או M9TX-01 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 5 μL של 5% (w/v) SDS ו- 30 μL של 1M DTT.
      הערה: יש להכין תמיסת M DTT 1 (מימית) טרייה או לאחסן אותה באליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס כדי להבטיח עוצמה. יש להגדיל את גודלם של Aliquots כך שישמשו בשניים עד שלושה ניסויים כדי למנוע הפשרה מוגזמת של הקפאה.
    2. העבר צינורות microcentrifuge המכילים תולעים מולבנות על פני השטח אל מתלה צינורות בטמפרטורת החדר. כל צינור צריך להכיל תולעים בכ-20 μL של כ-20 μL של חיץ.
    3. הוסף 100 μL של תמיסת SDS/DTT לכל דגימת תולעת. השליכו כל פתרון SDS/DTT שנותר בזרם הפסולת המסוכנת המתאים.
    4. אפשרו לטיפול להמשיך עד 8 דקות על הספסל כדי לפרק חלקית את הציפורן העמידה של התולעים הבוגרות. תולעים ימותו וישקעו לתחתית הצינור בתקופה זו.
    5. לאחר שזמן ההחללה תם, פשטו בזהירות את הסופרנטנט SDS/DTT והשליכו אותו לזרם פסולת מסוכנת מתאים של SDS/DTT.
    6. הוסף 1 מ"ל של M9TX-01 לכל צינור. סובבו לזמן קצר בצנטריפוגה שולחנית כדי להדוף את התולעים או לאפשר לתולעים להתיישב בכוח הכבידה לתחתית הצינורות, ואז למשוך את הסופרנטנט ולהשליך לזרם פסולת מסוכנת SDS/DTT.
    7. תולעי החייאה ב-1 מ"ל M9 חיץ תולעים + 0.1% טריטון X-100 עד שהן מוכנות לשימוש.
  10. הפרד תולעים לתוך צלחת עמוקה של 96 בארות עם חצץ סיליקון קרביד לשיבוש מכני. הכינו את לוחית ההפרעה בת 96 הבאר כמו מתחת.
    1. השג צלחת 96 באר עמוקה סטרילית של 2 מ"ל וכיסוי צלחת סיליקון 96-באר תואם.
      הערה: חשוב להשתמש בצלחות התואמות את המתאמים של 96 בארות עבור משבש הרקמות. הבדלים זעירים בממדים החיצוניים עושים את ההבדל בין צלחת שניתן להסיר מהמתאמים לבין כזו שלא יכולה.
    2. באמצעות מרית סקופ סטרילית, מוסיפים כמות קטנה של סיליקון קרביד סטרילי 36-גרניט לכל באר של הצלחת שתקבל תולעת. השתמשו במספיק חצץ כדי לכסות בקושי את החלק התחתון של הבאר (כ-0.2 גרם לבאר). חומר מוגזם יקשה על קבלת קצה פיפטה לתחתית הבאר בעת אחזור התוכן.
    3. הוסף 180 μL של מאגר תולעת M9 לכל באר.
    4. סמן את העמודות או השורות כדי לציין לאן כל דגימה תלך, ולאחר מכן כיסה את הצלחת באופן רופף עם כיסוי לוחית הסיליקון 96-באר.
  11. מעבירים תולעים בודדות לצלחת של 96 בארות לשיבוש.
    1. העבירו את התולעים החודרות בזהירות לצלחת פטרי קטנה (35 או 60 מ"מ) המכילה מספיק M9TX-01 כדי למלא את המנה לעומק של כ-1 ס"מ.
      הערה: אם יש מספר רב של תולעים, ייתכן שלא ניתן יהיה להעביר את הדגימה כולה מכיוון שהנוזל יהפוך צפוף ויהיה קשה לטפטף תולעים בודדות.
    2. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח או מכשיר אחר בעל הגדלה נמוכה, פיפטה את התולעים הבודדות בנפחים של 20 μL, והעבירה את התולעים הללו לבארות בודדות של צלחת 96 הבארות.
      הערה: עדיף לקצור רק תולעים שזה עתה נהרגו. הימנעו מתולעים בעלות צורה ליניארית נוקשה, שכן ייתכן שהתולעים הללו מתות במשך זמן מה. נסו לקחת תולעים שהן מעוקלות או בצורת S, עם פיזיולוגיה גסה רגילה ומעיים שלמים.
    3. לאחר העברת כל כרך, ודא שהתולעת שנבחרה אכן נפלטה לתוך הבאר. כדי לעשות זאת, פיפט מעלה 20 μL של M9TX-01 מאזור ברור של צלחת פטרי ומשחרר את מלוא הנפח בחזרה לתוך המנה; זה בדרך כלל יפלוט את התולעת אם היא דבוקה לפיפטה. אם התולעת הייתה תקועה, הסר 20 μL מהבאר ונסה שוב את ההעברה.
    4. לאחר שכל התולעים הועברו, כסו את הצלחת בת 96 הבארות בגיליון של סרט איטום גמיש מגובה נייר זמין מסחרית (2 x 2 ריבועים), וודאו שהצד המגובה בנייר של סרט האיטום פונה כלפי מטה אל בארות הדגימה. היזהרו לא למתוח את סרט האיטום דק מדי, אחרת יהיה קשה מאוד להסיר אותו מאוחר יותר.
    5. מניחים את משטח איטום הסיליקון בקלילות על גבי סרט האיטום הגמיש; אל תלחץ את הכיסוי לתוך הבארות בשלב זה.
    6. הזז את הצלחת ל 4 מעלות צלזיוס כדי לצנן במשך 30-60 דקות. זה ימנע חימום יתר במהלך הפרעה, מה שעלול לפגוע בדגימות.
      הערה: זוהי נקודת שבירה בפרוטוקול. ברוב המקרים, ניתן להשאיר את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שעות לפני הטחינה. אל תשאירו את התולעים בן לילה, שכן זה ישנה את ספירת החיידקים.
  12. העמיסו צלחות של 96 בארות על משבש רקמות כדי לפרק רקמות תולעים ולשחרר חיידקי מעיים.
    הערה: (אופציונלי) אם משתמשים במספר אי-זוגי של לוחות 96-well לעיכולים, יש צורך להכין משקל נגד לפני שתמשיך. השתמשו בצלחת ריקה של 96 בארות ומלאו בארות במים עד שהיא שוקלת כמו הצלחת הראשונה.
    1. לחצו את משטח איטום הסיליקון בחוזקה לתוך הבארות כדי ליצור אטימה, וודאו שהמכסה שטוח על פני כל פני השטח של הצלחת.
      הערה: אם סרט האיטום הגמיש עבה מדי לאחר המתיחה, יהיה קשה לאבטח את מכסה הסיליקון כך שהוא שוכב שטוח בכל הבארות. התוצאה תהיה איטום לא מספיק וזיהום עד טוב במהלך הרעידות.
    2. אבטחו צלחות במשבש הרקמות באמצעות מתאמי לוחות 96 הבאר. יש לנער צלחות למשך דקה אחת ב-30 הרץ, ואז לסובב צלחות ב-180° ולנער שוב למשך דקה אחת. זה יעזור להבטיח אפילו הפרעה בכל בארות של הצלחת.
    3. הקש על לוחות בחוזקה על הספסל פעמיים או שלוש כדי לעקור כל חצץ מסרט האיטום הגמיש.
    4. באמצעות צנטריפוגה גדולה עם שני מתאמי לוחות של 96 בארות, סובבו את הלוחות כלפי מטה ב-2400 x g למשך 2 דקות כדי לאסוף את כל החומר לתחתית הבארות.
    5. הסר את מכסה הסיליקון ומשך בזהירות את סרט האיטום הגמיש.
      הערה: אם סרט האיטום הגמיש נדבק לאחת הבארות, השתמש בקצה פיפטה של 200 μL כדי להסיר אותו. זה נפוץ כאשר סרט האיטום הגמיש נמתח דק מדי.
  13. דילול סדרתי של דגימות עיכול תולעים ב-300 μL בלוחות של 96 בארות.
    1. באמצעות פיפטטור מרובה בארות המוגדר ל-200 μL, פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים לאט ובזהירות כדי לערבב מחדש את תכולת הבארות, ולאחר מכן למשוך כמה שיותר מהנוזל. העבירו את הנוזל הזה לשורות העליונות של לוחות 96 הבאר שהוכנו בשלב 3.3.
    2. באמצעות פיפטטור של 96 בארות המוגדר ל-20 μL, הסר נפח זה של נוזל מהשורה העליונה וחלוק לשורה B. פיפטה למעלה ולמטה 8-10x כדי לערבב. השליכו טיפים.
    3. חזור על שלב 3.13.2, החל מדגימות 0.1x בשורה B כדי ליצור דגימות דילול של 0.01x בשורה C.
    4. חזור שוב על שלב 3.13.2, ועבר משורה C לשורה D.
    5. צלחת על אגר מוצק לכימות חיידקי. עבור תולעים חד-מושביות, זה בדרך כלל מספיק כדי לצלוח טיפות 10-20 μL של כל דילול [1x-0.001x] על צלחות אגר. עבור קולוניזציה מרובת מינים, צלחת כל דילול בנפרד על ידי צנרת 100 μL על צלחת אגר 10 ס"מ; להתפשט מיד באמצעות חרוזי ציפוי זכוכית.

4. ניקוי חצץ סיליקון קרביד לשימוש חוזר

הערה: הליך זה משמש לניקוי ועיקור חומר הטחינה, חצץ סיליקון קרביד, לשימוש חוזר לאחר ניסויים. יש לעקוב אחר פרוטוקול זה בשלמותו לפני השימוש הראשון, שכן חצץ סיליקון קרביד הוא מוצר תעשייתי ואינו מגיע מעוקר מראש. חצץ Si-carbide (3.2 גרם/סמ"ק) הוא חומר צפוף בעל קצוות מחוספסים הפועל ביעילות כדי לשבש דגימות קשות. עם זאת, החלקיקים יכולים להתבלות על פני שימוש חוזר ויש להחליפם כאשר מתגלה בלאי. למרבה המזל, החומר זול, והגדלים שנמכרים בדרך כלל (כ-1 ליברות) מספיקים לניסויים רבים.

  1. לאחר הסרת דגימות לציפוי, הוסיפו תמיסת אקונומיקה של 10% לכל הבארות של צלחת 96 הקידוחים ותנו לשבת לפחות 10 דקות.
  2. הסר את עיקר החצץ על-ידי היפוך מהיר של לוחית 96 הבארות מעל מגש קטן בעל צד גבוה או מיכל קצה פיפטה ריק P1000 גדול מספיק כדי לתפוס את כל התכולה. החצץ ישקע מיד לתחתית המגש. שפכו את תמיסת האקונומיקה לכיור.
  3. מלאו מחדש את צלחת 96 הבאר במי ברז והפכו לאותו מגש כדי לשטוף את החצץ שנותר. שפכו את המים לכיור.
  4. חוזרים על הפעולה עוד פעם עד שלוש פעמים עם מי ברז עד שהצלחת נקייה לחלוטין מחצץ.
  5. יש לשטוף את החצץ פי 2 במי ברז ולמלא את המגש בכל פעם.
    הערה: ניתן לשטוף את צלחת הבאר העמוקה בת 96 הבאר במדיח כלים במעבדה, לכסות אותה היטב בנייר כסף, ולעטוף אותה בפלסטיק רב-פעמי אחר. אין צורך לשטוף את הנחרצות באופן מיידי וניתן להניח אותה בצד בשלב זה. חצץ משומש נצבר בדרך כלל מניסויים מרובים לפני שטיפה ואוטוקלבינג.
  6. לשטוף חצץ בתמיסה של חומר ניקוי מעבדה במשך 30 דקות, תוך תסיסה מדי פעם על ידי מערבולת או ערבוב עם מרית מתכת.
  7. יש לשטוף את כל עקבות חומרי הניקוי במספר שינויים (8-10) במי ברז, ולאחר מכן לשטוף פי 2 במים מזוקקים.
  8. מורחים חצץ במגש פתוח, כגון מגש אוטוקלאב פוליפרופילן רדוד, ומייבשים בטמפרטורה של 40-70 מעלות צלזיוס במשך מספר שעות.
    הערה: אם החצץ גושני כאשר הוא יבש, הוא לא נוקה או נשטף מספיק. חזרו על פרוטוקול הניקוי החל משלב 4.6, והוסיפו שטיפות נוספות בשלב 4.7.
  9. מחלקים חצץ נקי ויבש לבקבוקי זכוכית אוטומטיים בעלי ברגים בעומק מרבי של 5-6 ס"מ. יש לבצע אוטוקלאציה במחזור הקדם-ואקום למשך 30 דקות לצורך עיקור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עיקור אקונומיקה של תולעים חיות
תולעים מולבנות על פני השטח נקיות למעשה מחיידקים חיצוניים עד שהתנועתיות חוזרת וההפרשה מתחדשת. בתנאים המשמשים כאן, נצפית הכחדה מהירה של חיידקים במאגר (איור 1A-C, איור משלים 2, וידאו 1) מבלי להפריע לחיידקים הקשורים למעיים בתולעים משותקות קרות (איור 1D-F, וידאו 2). נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש בהלבנת פני השטח ביעילות כדי לטהר את התולעים באופן חיצוני מבלי להתפשר על תוכן המעיים (השוואות של ספירת CFU הקשורה להלבנת פני השטח לעומת ספירת CFU הקשורה לתולעים ללא אקונומיקה אינן משמעותיות, מבחן סכום הדירוג של Wilcoxon p > 0.05).

וריאציות על הפרעה מכנית מרובת דגימות
טכניקת 96 הקידוחים לשיבוש מכני של התולעים חזקה על החומרים הספציפיים שבהם נעשה שימוש, ושיקולים מעשיים מכתיבים את בחירת חומר הטחינה. בדומה לדו"ח הקודםמס' 33, שיבוש ידני (איור 2A) הביא להטרוגניות רבה יותר מאשר הפרוטוקול הסטנדרטי של 96 קידוחים (חצץ סיליקון קרביד, איור 2B) (var(log10CFU) = 0.499) בכל תנאי החיץ, בהשוואה ל-0.229 עבור Si-carbide, 0.243 עבור חרוזי זכוכית גדולים (איור 2C) ו-0.227 עבור חרוזי זכוכית קטנים (איור 2D ). עם זאת, רוב ההבדלים בהתפלגויות CFU/תולעים לא היו משמעותיים (Kruskal-Wallace, p = 0.017 עם df = 3; בדיקות משמעותיות של Wilcoxon לאחר הוק עבור חרוזים גדולים לעומת חרוזים קטנים, p = 0.021, וחרוזים גדולים לעומת חצץ סיליקון קרביד, p = 0.02). השימוש ב-Triton X-100 כחומר פעילי שטח לא היה קשור להבדל משמעותי כלשהו בתפוקה כאשר הוא נחשב כגורם אינדיבידואלי (Kruskal-Wallace, p = 0.94, df = 3), אם כי קיימת עלייה ניכרת בתפוקה בדגימות שאינן מכילות טריטון לעומת טריטון כאשר נעשה שימוש בחרוזים גדולים (2.7 מ"מ) (איור 2C), שניתן אולי לייחס אותה ל"קצף" המופרז שנצפה בבארות אלה כאשר טריטון היה נוכח. תוצאות אלה מצביעות על כך שחרוזי זכוכית גדולים, אף שהם אידיאליים לשימוש בצינורות הומוגניזציה33, אינם מתאימים לטכניקת 96 הבארות. בעוד שחרוזי זכוכית קטנים הניבו תוצאות סבירות (איור 2D), הם סתמו באופן עקבי 200 μL קצוות פיפטה במהלך ערבוב וציפוי. החומר הסטנדרטי במבחן זה, חצץ סיליקון קרביד, הוא זול, גדול מכדי לסתום קצוות סטנדרטיים, וכמו חרוזי זכוכית ניתן לשטוף ולעשות בהם שימוש חוזר לאחר אוטוקלאב. החצץ אכן משחרר כמות קטנה של "אבק" לתוך המאגר, שאינו מפריע לציפוי אלא צריך לסנן אותו אם יש להשתמש בתוצרי ההפרעה לציטומטריית זרימה.

הטרוגניות בהתיישבות חיידקית בתולעים בוגרות
שיבוש מוצלח של תולעים בודדות חושף הטרוגניות בהתיישבות חיידקים. פרטים מאוכלוסיות מסונכרנות איזוגניות של תולעים, המתיישבות בו זמנית על אותה מאגר של חיידקים, מראים באופן עקבי טווח של פי 100 או יותר בעומס החיידקי במעיים. זה נצפה עבור מתיישבי חיידקים שונים (איור 3A) ובמהלך התיישבות בקהילות חיידקים מרובות מינים (איור 3B). הטרוגניות זו ניכרת גם במדידות פלואורסצנטיות של תולעים בודדות כאשר תולעים מתיישבות עם חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי (GFP) (איור 3C-D). התכונות של הפונדקאי ממלאות תפקיד בעיצוב ההטרוגניות הזו, כפי שניתן לראות על ידי השוואת קולוניזציה של תולעי בריסטול N2 מסוג בר להתיישבות על ידי אותם חיידקים במוטציות DAF-2/IGF; מוטציה זו של daf-16 תומכת באוכלוסיות גדולות יותר של חיידקים רבים בהשוואה ל-N2, בעוד ש-daf-2 עמיד בפני התיישבות על-ידי מגוון חיידקים36 (איור 3B,D). הטרוגניות זו אופיינית, ומראה שונות בין צירופים שונים של פונדקאי ומתיישב(ים), תוך שמירה על מבנה עקבי לאורך ריצות שונות של אותו ניסוי (איור 3E-F).

חשיבות ההטרוגניות האינדיבידואלית להשוואה מדויקת של קבוצות
ניתן לראות בקלות את החשיבות של הטרוגניות אינדיבידואלית על ידי התחשבות באופן שבו תקצירי אצווה יכולים לשנות את התפלגויות הנתונים. התיישבות על ידי חיידקי מיקרוביום מקומיים MYb53 (רודוקוקוס אריתרופוליס) ו- MYb120 (Chryseobacteria spp.) (איור 3A, 4A) אצל מבוגרים ב-N2 משמשים כדוגמאות. נתוני התולעת הבודדים דומים בבירור בהתפלגותם (מבחן t דו-זנב, p = 0.9, סכום דרגת וילקוקסון, p = 0.59). בעת דגימה מחדש של נתונים אלה כדי לדמות את ההשפעות של תקצירי אצווה, ה-CFU/תולעת האקסטרפולציה של האצווה מושכת לכיוון הקוונטילים העליונים של הנתונים בשל ההטיה החיובית בהתפלגויות אלה (ממוצע > חציון). מכיוון שממוצע האצווה הוא למעשה על פני הפרטים בתוך אצווה, CFU/תולעת שעברו אקסטרפולציה של אצווה יתמקדו סביב הממוצע האריתמטי של הנתונים הבודדים, עם ירידה במרחק לממוצע זה ככל שהאצוות הופכות לגדולות בהתאם למשפט הגבול המרכזי (איור 4B-D). לפיכך, אות מהשונות הביולוגית הולך לאיבוד במהירות; מדידות CFU/תולעים המוסקות באצווה מתכנסות לכיוון הממוצע, מה שאינו מדד מייצג של נתונים אלה המופצים בקנה מידה של יומן. הבדלים בהתיישבות מוסקת על ידי MYb53 לעומת MYb120 הופכים במהירות למשמעותיים בתקצירי אצווה מדומים (t-test batch 5, p = 0.049; אצווה 10, p = 2.27e-4; אצווה 20, p = 1.19e-15; וילקוקסון דרגה סכום מבחן אצווה 5, p = 2.27e-4; אצווה 10, p = 2.70e-06; אצווה 20, p = 1.80e-09) כאשר האות המקורי מוסתר.

השפעות של הטרוגניות אינדיבידואלית על העברה מיקרוביאלית
מכיוון שתולעים בודדות מראות הטרוגניות משמעותית בהתיישבות חיידקים, סביר לשאול אם להטרוגניות זו יש השפעות במורד הזרם. לדוגמה, סביר לצפות כי העברה עשויה להיות פונקציה של עומס חיידקי במעיים. על ידי העברת תולעים בודדות מולבנות על פני השטח לסביבה נקייה, ניתן לצפות בחיסון הסביבה עם חיידקים חיים מופרשים. בניסויים אלה, בוגרים שהולבנו לפני המתיישבים על פני השטח, שנשאו אוכלוסיות משמעותיות בדרך כלל (103-10 5 CFU/תולעת, איור 5) של Ochrobactrum MYb14-GFP קומנסאלי או S. aureus-GFP פתוגניים, הורשו לשוטט על מדשאות OP50 מומתות בחום על אגר NGM במשך 1.5 שעות. כאשר תולעים אלה נקטפות מחדש מצלחות הפרשה ומופרעות לצורך כימות חיידקים, אין קשר משמעותי בין עומס חיידקי לשיעור הפרשה של חיידקים חיים (קורלציות פירסון בין מושבות/שעות שעברו שינוי לוגים לבין CFU/תולעת: MYb14 rho = 0.19, p = 0.45; S. aureus rho = 0.02, p = 0.9) (איור 5). כמו כן, אין קשר משמעותי בין נוכחות/היעדר מושבות על צלחת לבין עומס חיידקי במעיים (רגרסיה לוגיסטית בינומית עם CFU/תולעת שעברה שינוי יומן כגורם: p = 0.15 עם df = 53). חלק ניכר מהלוחות נותרו ללא צמיחה חדשה (לוחות 9/18 עבור MYb14, 10/36 לוחות עבור S. aureus), מה שמעיד על שיעורי הפרשה כוללים נמוכים.

כאשר תולעים מורשות להפריש על צלחות אגר, המספר האמיתי של חיידקים מופרשים חיים לכל תולעת מבלבל על ידי "חקלאות", שבה תולעים עוברות במושבות ויוצרות שבילים של צמיחה חדשה (איור 6)37. צלחת עם n מושבות מייצגת לפחות אירוע אחד, ולכל היותר n, שבו הופרשו חיידקים חיים היוצרים מושבה. מתצפית זו, לא ניתן לדעת כמה אירועי הפרשה ב-(1,n) התרחשו בפועל, וגם לא ניתן לדעת כמה חיידקים הופרשו בכל אירוע. לכן לא ניתן להעריך במדויק את שיעורי ההפרשה של חיידקים חיים מהמעיים באמצעות נתונים אלה. עם זאת, ניתן להסיק כמה גבולות. למרות שמספר המושבות לכל צלחת אינו אינפורמטיבי במיוחד, ניתן להשתמש בנתוני נוכחות / היעדרות להסקה גסה של שיעורי ההפרשה. למען הפשטות, אם מניחים ששיעור ההפרשה של חיידקים חיים אינו פונקציה של עומס חיידקים ושהפרשה היא תהליך פואסון, יש סיכוי של כ-50% לצפות לפחות בתשעה אירועים ב-18 ניסויים כאשר λ ≈ 0.33 תולעת-1 hr-1 ב-MYb14 . עבור S. aureus, מתקבלים שיעורים סבירים דומים של λ ≈ 0.2 תולעת-1 שעה-1 מתקבלים. בעוד שחישובים גסים אלה מצביעים על שיעורים נמוכים של הפרשה של חיידקים חיים, יהיה צורך בכימות מדויק יותר של תהליך זה על פני מספר גדול יותר של תולעים בודדות כדי לקבל הערכות מהימנות.

זמינות נתונים:
הנתונים המוצגים כאן זמינים ב-Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
איור 1. טיפול בהלבנת פני השטח בריכוז נמוך הורג במהירות חיידקים במאגר, אך אינו מפריע לקהילות מעיים בתולעים משותקות קרות. (א-ג) CFU/mL חיידקי במאגר תולעים M9 במהלך הלבנת פני השטח בשלושה ריכוזים שונים (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; בקרה לא מולבנת לצורך השוואה), מיקוד (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2, או (C) E. coli OP50. הדגימות נלקחו בנקודות זמן שצוינו עד 20 דקות לאחר החשיפה ונשטפו פעמיים עם חיץ סטרילי כדי למנוע אקונומיקה להרוג מושבות על צלחות. הנתונים עבור מצב 1:1000 מתקזזים מעט כך שנתונים אלה גלויים בחלקה. (ד-ו) חיידקי מעיים בתולעי N2 בודדות (n = 24 תולעים לכל ניסוי, שתיים או שלוש ריצות עצמאיות בימים נפרדים). כל ההשוואות של ספירת CFU הקשורה לתולעים שאינן מולבנות על פני השטח ושל תולעים ללא אקונומיקה אינן משמעותיות (מבחן סכום הדירוג של וילקוקסון p > 0.05). קווים אופקיים אפורים מייצגים את סף הגילוי, המוגדר כצפיפות (40 CFU/תולעת) שבה ההסתברות לתצפית על מושבה אחת לפחות היא כ-60% בעת ציפוי 10 μL aliquots מנפחים של 200 μL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. פרוטוקול השיבוש בן 96 הקידוחים מפיק תוצאות עקביות ועמיד בפני בחירת החומרים. N2 תולעים בוגרות שיושבו עם מין חיידקי יחיד במשך 48 שעות (P. mosselii) הולבנו על פני השטח וחלחלו על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ואז תולעים בודדות (n = 24 לכל מצב) שובשו מכנית לציפוי CFU באמצעות (A) הפרעה ידנית בצינורות 0.5 מ"ל בודדים, באמצעות הדברה ממונעת או (B-D ) וריאציות על פרוטוקול ההפרעה של 96 בארות המתוארות בפירוט בפרוטוקול. השיבוש בוצע במאגר תולעים M9 המכיל ריכוזים משתנים של טריטון X-100 (ציר x, 0-0.1%, v/v) ואחד מחרוזי זכוכית (B) סיליקון קרביד 36-חצץ, (C) חרוזי זכוכית קטנים (425-600 מיקרומטר), או (D) חרוזי זכוכית גדולים (2.7 מ"מ). עבור כל החלקות, הנתונים המוצגים הם יומן10 (CFU/תולעת), וכל נקודה היא תולעת אחת בודדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. התיישבות חיידקית הטרוגנית של המעי C. elegans. (A) קולוניזציה של מין יחיד של הרמפרודיטים בוגרים N2 שהוכנו כמו בשיטות. חיידקים הם ארבעה מינים מאוסף המיקרוביום המקומי של תולעים MYb (Dirksen et al. 2016) (n = 24 תולעים, ניסוי אחד כל אחד) ושני פתוגנים, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) וסלמונלה אנטריקה LT2 (SE) (n = 96-144 תולעים על פני שניים/שלושה ניסויים עצמאיים). התיישבות על ידי מיני מיקרוביום מקומיים הוערכה לאחר דגירה של 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במדיום S נוזלי + 108 CFU/mL חיידקים; קולוניזציה על ידי פתוגנים הוערכה לאחר דגירה על מדשאות על אגר תולעת NGM במשך 24 (SA) או 48 (SE) שעה ב 25 מעלות צלזיוס. (בשעה 48 שעות, תולעים על S. aureus מתו ברובן.) (B) סך כל ה-CFU/תולעת ב-N2, daf-16(mu86), ו-daf-2(e1370) בוגרים שיושבו במשך 4 ימים במדיה נוזלית על מיקרוביום מקומי מינימלי של שמונה מינים (נתונים של Taylor and Vega, 2021)14. (ג-ד) פלואורסצנציה ירוקה בתולעים בודדות המתיישבות בחיידקים המבטאים GFP, הנצפות על ידי ציטומטריה של זרימת אובייקטים גדולים. ב-(C), אוכלוסיות מסונכרנות של בוגרי N2 התיישבו עם OP50 (לא פלואורסצנטי, n = 1908 תולעים בוגרות בודדות), S. aureus (GFP, n = 968), או S. enterica (GFP, n = 1153) כמתואר ב-(A); בקרת OP50 מציינת רמות אופייניות של פלואורסצנציה אוטומטית בערוץ ירוק בתולעי N2 בוגרות ביום 3. ב-(D), אוכלוסיות מסונכרנות של N2 (n = 1165), daf-16(mu86) (n = 1180) ו- daf-2(e1370) (n = 2267) הבוגרים הושבו עם Ochrobactrum MYb14-GFP למשך יומיים על לוחות כמתואר ב- (A). (ה-ו-ו) שונות יומיומית בקולוניזציה על ידי S. aureus (E) ו- S. enterica (F) (אותם נתונים כמו בלוח A ואיור 1, n = 48 תולעים לכל ניסוי). ציר ה-x מציין את יום הדגימה. קווים אופקיים אפורים מייצגים את סף הגילוי, המוגדר כצפיפות שבה ההסתברות לתצפית על מושבה אחת לפחות היא כ-60% (40 CFU/תולעת עבור קולוניזציה של מין יחיד וארבעה CFU/תולעת עבור התיישבות מרובת מינים, בשל נפחי ציפוי שונים של 10 μL ו-100 μL בהתאמה מתוך 200 μL). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
תרשים 4. אצווה מוחקת שונות ביולוגית בנתונים מוטים בקנה מידה של יומן. נתוני CFU/תולעת מאיור 3 נדגמו מחדש עם החלפה כדי ליצור n = 25 ערכות שכפול של נתונים מדומים עבור כל גודל אצווה, כאשר הגודל הוא מספר התולעים הבודדות לכל אצווה. CFU/תולעת היא סך כל ה-CFU בכל אצווה מדומה המחולקת על פני מספר התולעים בכל אצווה. בנתונים הגולמיים (לוח A), ממוצע ה-CFU/תולעת עבור MYb53 הוא 4450.8 (103.6), ועבור MYb120, 1398.3 (103.1); המספרים המוסקים באצווה מתכנסים לערכים אלה ככל שגודל האצווה גדל (B, חמש תולעים/אצווה; C, 10 תולעים/אצווה; D, 20 תולעים/אצווה), בהתאם לציפיות ממשפט הגבול המרכזי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5. הפרשה של חיידקים חיים אינה מתואמת היטב עם עומס CFU במעי של תולעים בודדות. כאן, בוגרי N2 התיישבו על ידי האכלה במשך יום או יומיים בהתאמה על מדשאות של S. aureus-GFP או MYb14-GFP. תולעים עם פלואורסצנציה של GFP הניתנת לזיהוי (סך הכל GFP > 1.8 לוגים על ציטומטר זרימת אובייקטים גדולים) מוינו מאוכלוסיית התפזורת, מולבנו את פני השטח כמתואר בשיטות, והועברו בנפרד ללוחות NGM + OP50 מומתים בחום. המתאמים של פירסון בין מושבות/h שעברו טרנספורמציית לוגים לבין CFU/תולעת אינם משמעותיים (MYb14 rho = 0.19, p = 0.45; S. aureus rho = 0.02, p = 0.9). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6. "חקלאות" חיידקית מטשטשת את מספר אירועי ההפרשה על צלחות אגר. הנה שתי צלחות עם מושבות MYb14-GFP מהפרשת תולעים. בלוח הראשון (A) יש עדויות ברורות ל"חקלאות" לאורך נתיבי תולעים ונראה שהוא מייצג לפחות שני אירועי הפרשה נפרדים המבוססים על הבדלים בביטוי GFP (הנראים כפיגמנטציה צהבהבה) על פני מושבות. בעוד שהלוח השני (B) מעורפל יותר, לא ניתן לשלול חקלאות על סמך מיקומי המושבות. בניסויים אלה, תולעים בוגרות N2 התיישבו מראש במשך 48 שעות על ידי האכלה על צלחות אגר המכילות מדשאות של MYb14-GFP. לאחר ההתיישבות, הוכנו תולעים והלבינו את פני השטח על פי שיטות, ולאחר מכן הועברו ב-5 μL aliquots של חיץ תולעת M9 + 0.1% Triton X-100 עד 6 ס"מ NGM + לוחות OP50 מומתים בחום (שהוכנו על ידי מתן אפשרות ל-50 נקודות μL של 5x OP50 מרוכזות שהומתו בחום להתייבש על פני השטח). תולעים הורשו לשוטט במשך 1.5 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, לאחר מכן נקטפו מלוחות והופרעו לציפוי CFU/תולעת (הפרעה ידנית ב-20 μL buffer בצינורות בודדים של 0.5 מ"ל, באמצעות הדברה ממונעת). הצלחות הודגמו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני הספירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון 1. הדמיה של תולעי N2 המיושבות עם GFP פלואורסצנטי S. aureus ללא הלבנת פני השטח. מספר קטן של תאים פלואורסצנטיים על הציפורן נעים לתוך המיקוד ומחוצה לו כאשר התמונה עוברת דרך גוף התולעת, והתיישבות הטרוגנית מרחבית של המעיים הופכת לגלויה כאשר שדה הראייה נע מפני השטח של הגוף אל תוך המעי. תמונת Z-stack צולמה בהגדלה של פי 20 במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. תמונות פלואורסצנטיות מסוננות בשדה בהיר וב-GFP היו מכוסות בשכבת-על, ותמונות על פני מחסנית Z נתפרו יחד, באמצעות תוכנת הספק. התמונה היא מאותה שקופית כמו באיור משלים 2A. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 2. הדמיה של תולעת N2 המתיישבת עם GFP פלואורסצנטי S. aureus עם הלבנת פני השטח (1:1000 v/v במשך 20 דקות). קולוניזציה מרחבית-הטרוגנית על ידי חיידקים פלואורסצנטיים נראית במעי של אדם זה, וחיידקים חדרו לרקמות הגוף, מה שמעיד על זיהום מתקדם. אין חיידקים נראים על הציפורן. תמונת Z-stack צולמה בהגדלה של פי 20 במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. תמונות פלואורסצנטיות מסוננות בשדה בהיר וב-GFP היו מכוסות בשכבת-על, ותמונות על פני מחסנית Z נתפרו יחד, באמצעות תוכנת הספק. התמונה היא מאותה שקופית כמו באיור משלים 2B. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

איור משלים 1. סקירה כללית של הפרוטוקול. כאן, תולעים בוגרות מסונכרנות מתמקמות בחיידקים אדומים, מולבנות על פני השטח וחודרות לפני הפרעה מכנית של תולעים בודדות בפורמט של 96 בארות. חיידקים המשתחררים מהמעי מצופים דילול בסדרות פי 10 לצורך כימות CFU/תולעת; הלוחות המוצגים אופייניים להטרוגניות הנצפית. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2. הדמיה של תולעי N2 המתיישבות עם GFP פלואורסצנטי S. aureus עם ובלי הלבנת פני השטח (1:1000 v/v למשך 20 דקות). (A) בדגימה הלא מולבנת, חיידקים חיצוניים נראים בהגדלה נמוכה כאזורים של פלואורסצנציה ירוקה שאינם קשורים לתולעים או לשברי גוף של תולעים. (B) בדגימה מולבנת פני השטח, הפלואורסצנציה של GFP מוגבלת לפנים של גופי התולעים (שבר גוף תולעת אחד נראה באמצע התמונה). כל התמונות צולמו בהגדלה של פי 4 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. תמונות פלורסנטיות מסוננות בשדה בהיר וב-GFP היו מכוסות בשכבה, ותמונות משדות ראייה סמוכים נתפרו יחד, באמצעות תוכנת הספק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: מתכוני מאגר ותמיסה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן מוצגים נתונים על היתרונות של כימות תולעת בודדת של עומס חיידקים ב- C. elegans, יחד עם פרוטוקול שיבוש של 96 בארות כדי לאפשר רכישה מהירה ועקבית של מערכי נתונים גדולים מסוג זה. בהשוואה לשיטות הקיימות33, פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה בתפוקה גבוהה יותר של קהילות מיקרוביאליות במעיים בתולעת.

לגישה זו יש ציפוי כצעד מגביל קצב ואינה באמת "תפוקה גבוהה". ציטומטריה של זרימה של עצמים גדולים (איור 3C,D) היא שיטה שימושית בעלת תפוקה גבוהה לכימות חיידקים בעלי תווית פלואורסצנטית בתולעיםבודדות 16, אם כי מספר הפלואורופורים הסימולטניים הוא מגבלה בקהילות מרובות מינים. קישור בין הפרעה לצלחת מרובת בארות לבין ריצוף קהילתי הוא דרך נוספת להגדיל את התפוקה; עם זאת, הליך השיבוש של 96 בארות שתואר כאן הותאם במיוחד כדי להשאיר את תאי החיידקים ללא פגע. ניתוח מבוסס ריצוף, שבו רצוי ליזה יסודית של תאים, ידרוש תוספת של שלב מיצוי חומצת גרעין או שינוי של פרוטוקול הכאה (פרוטוקול 3.10-3.11) כדי לחלץ את תוכן התא במקום חיידקים חיים. פרוטוקולים לשיבוש תולעים בודדות ולמיצוי חומצות גרעין פורסמו במקומות אחרים38,39.

השפע הכולל של החיידקים במעי התולעת הוא הטרוגני, והנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך שמדידה מבוססת אצווה יכולה להניב תוצאות שגויות בהשוואות בין קבוצות. עם זאת, מדדים אחרים של קהילות חיידקים בתולעת עשויים להיות פחות רגישים להשפעות של אצוות. יש לציין כי נראה כי השפע היחסי בקהילות הקשורות לתולעים משתנה מעט מאוד אם בכלל עם גודל אוכלוסיית המעיים הכולל, ללא קשר לשאלה אם האינטראקציות בין מיקרובים הן ניטרליות40 או לא14. סביר להניח כי בהשוואה לנתוני הספירה, מדדי השפע היחסי יהיו פחות רגישים לסוגיית שיעור החיוביות המוטעות המתוארת. לפיכך, ניתוח קהילתי מבוסס ריצוף, שמייצר נתוני שפע יחסיים להרכב הקהילה, לא ידרוש אפוא מדידה של תולעים בודדות. יש צורך בחקירה נוספת בנקודה זו.

כאן, אנו משתמשים בטיפול קר כדי לשתק תולעים להלבנת פני השטח. עבודות אחרות מצאו כי תולעים חוזרות לפעילות רגילה במהירות (<15 דקות) אם הזמן על הקרח נשמר פחות מ-30 דקות, מה שמאפשר שימוש מיידי בבדיקות נוספות, בניגוד לחומרי שיתוק כימיים שיכולים לדרוש תקופות ממושכות לפני התאוששות מלאה34. אם יש לשבש את התולעים באופן מיידי לצורך כימות חיידקי, תכונה זו ניתנת לחלוקה, והיתרון העיקרי של צינון לעומת שיתוק כימי הוא הימנעות מהצורך בזרם פסולת מבוקר. יש להשתמש בזהירות בטיפול ממושך בקור בעת חקירת תגובות עקה, במיוחד אם ידוע על קשר לטמפרטורה. פרוטוקולי שיתוק הקור המתוארים כאן כוללים חשיפה קצרה יותר לקור חריף מאשר בניסויים ללחץ קר (20-30 דקות לעומת 2+ שעות בטמפרטורה של 2-4 מעלות צלזיוס)41,42,43, והלם קר של שעה אחת אינו מייצר פנוטיפ נראה לעין בתולעים מסוג בר43. דגירה לטווח קצר (90 דקות) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס גורמת לשינויים בביטוי גנים בלחץ קר (הנמדד על ידי ביטוי של כתב TMEM-135::GFP), אך הביטוי חוזר לרמות לא מתוחות תוך דקות לאחר שהתולעים מוחזרות לטמפרטורת החדר34. עם זאת, ההשפעות על גנוטיפים של תולעים רגישות ללחץ עשויות להיות חמורות יותר מאשר בסוג בר. יש לאמת הליך זה בתנאי הניסוי שיש להשתמש בהם.

פרוטוקול הלבנת פני השטח המתואר כאן יכול לשמש כדרך להגביל או למנוע מעבר של מיקרובים חיצוניים בניסויים. שיטה זו שימשה גם לפינוי מזהמים פטרייתיים על ידי הלבנת פני השטח והעברת זחלי L1/L2 בלבד לצלחות טריות (העברת בוגרים מולבנים על פני השטח גרמה לכישלון בפינוי המזהם, ככל הנראה בשל הובלה במעיים של בעלי החיים הגדולים יותר). חשוב מאוד להבטיח שריכוז האקונומיקה לא יעלה על 1:1000 v/v, שכן הנזק לתולעים ולתמותה יגרום לכך. הליך זה עשוי להיות שימושי באבולוציה ניסיונית של חיידק-מארח ובאינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן. לדוגמה, שיעור ההפרשה הנמוך של חיידקים חיים שנצפה כאן יכול לעזור להסביר את השיעורים המשתנים מאוד שנצפו להעברת חיידקים מהרמפרודיטים לצאצאים15. חוסר המתאם בין עומס חיידקי במעיים לבין קצב הפרשות שנצפה כאן הוא מעניין אך דורש חקירה נוספת; יהיה צורך במספר גדול יותר של נקודות נתונים על פני מגוון תנאים כדי לקבוע היכן (או אם) תצפית זו תחזיק מעמד.

זה לא תמיד יכול להיות נחוץ כדי לנקות תולעים במידה המסופקת על ידי הלבנת פני השטח. סביר להניח ששטיפות מרובות במאגר סטרילי מספיקות כאשר תולעים מתיישבות באופן פנימי עם מיקרוב יחיד אם ה-CFU/תולעת המינימליים הצפויים גבוהים בהרבה (פי 10-100) מריכוז החיידקים בסופרנט חיץ, שכן נשיאה זו תשפיע באופן מינימלי על הספירות (ראו איור 1). בנוסף, אם המיקרובים המעניינים בעיקר מתיישבים(ים) את הציפורן, ברור שיש להימנע מהלבנת פני השטח. ניקוי יסודי חשוב יותר כדי להבטיח דיוק כאשר מתמודדים עם קהילות מיקרוביאליות מעורבות (כדי להבטיח שכל המושבות/קריאות בדגימה הן מחיידקים הקשורים לתולעים ולא מהסביבה), כאשר חיידקים שדבקו בציפורן מפריעים לקריאת האוכלוסייה המופנמת, כאשר הצפוי מינימום CFU/תולעת נמוך וכו'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות ל-H. Schulenberg ול-C. LaRock על השיתוף הנדיב שלהם בזני חיידקים ששימשו בניסויים אלה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מאוניברסיטת אמורי ו- NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 185 Caenorhabditis elegans מיקרוביום הטרוגניות מיקרוב מארח חיידקים העברה
שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות <em>של Caenorhabditis elegans-Bacterial</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter