Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bruke single-worm data for å kvantifisere heterogenitet i Caenorhabditis elegans-bakterielle interaksjoner

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Denne protokollen beskriver en 96-brønns forstyrrelse av individuelle bakteriell koloniserte Caenorhabditis elegans etter kald lammelse og overflatebleking for å fjerne eksterne bakterier. Den resulterende suspensjonen er belagt på agarplater for å muliggjøre nøyaktig kvantifisering av bakteriebelastning i et stort antall individuelle ormer.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans er et modellsystem for vert-mikrobe- og vertsmikrobiom-interaksjoner. Mange studier til dags dato bruker batchfordøyelser i stedet for individuelle ormprøver for å kvantifisere bakteriell belastning i denne organismen. Her argumenteres det for at den store interindividuelle variabiliteten sett i bakteriell kolonisering av C. elegans tarmen er informativ, og at batchfordøyelsesmetoder forkaster informasjon som er viktig for nøyaktig sammenligning på tvers av forhold. Som å beskrive variasjonen som ligger i disse prøvene krever et stort antall individer, etableres en praktisk 96-brønns plateprotokoll for forstyrrelse og kolonibelegg av individuelle ormer.

Introduction

Heterogenitet i vertsmikrobeforeninger observeres allestedsnærværende, og variasjon mellom individer blir i økende grad anerkjent som en medvirkende faktor i prosesser på populasjonsnivå fra konkurranse og sameksistens1 til sykdomsoverføring 2,3,4. I C. elegans har "skjult heterogenitet" innen isogene populasjoner blitt observert gjentatte ganger, med underpopulasjoner av individer som viser forskjellige fenotyper i varmesjokkrespons 5,6, aldring og levetid 7,8,9,10,11, og mange andre aspekter av fysiologi og utvikling12 . De fleste analyser som forsøker å identifisere subpopulasjonsstruktur gir bevis for to underpopulasjoner i eksperimentelle populasjoner av isogene, synkroniserte ormer 5,7,8, selv om andre data antyder muligheten for innenfor populasjonsfordeling av egenskaper i stedet for forskjellige grupper 7,12,13 . Av relevans her observeres betydelig heterogenitet i tarmpopulasjoner selv innenfor isogene populasjoner av ormer kolonisert fra en delt kilde til mikrober 13,14,15,16, og denne heterogeniteten kan skjules av batchfordøyelsesmålingene som er mye brukt 17,18,19,20 for bakteriell kvantifisering i ormen.

Dette arbeidet presenterer data som tyder på et behov for større avhengighet av enkeltormmålinger i vertsmikrobeforening, samt protokoller for å øke nøyaktigheten og gjennomstrømningen i enkeltormforstyrrelser. Disse protokollene er utformet for å lette mekanisk forstyrrelse av et stort antall individuelle C. elegans for kvantifisering av levedyktig bakteriebelastning, samtidig som det gir bedre repeterbarhet og lavere innsats per prøve enn pestlebasert forstyrrelse av individuelle ormer. Et anbefalt tarmrensende trinn, hvor ormer får lov til å mate på varmedrept E. coli før preparatet for forstyrrelse, er inkludert for å minimere bidrag fra nylig inntatt og andre forbigående (ikke-adhered) bakterier. Disse protokollene inkluderer en kaldlammelsesmetode for rengjøring av neglebåndet med en overflateblekemiddelbehandling med lav konsentrasjon; overflatebleking kan brukes som et forberedende trinn i enkeltormforstyrrelser eller som en metode for å forberede levende, eksternt bakteriefrie ormer. Denne overflateblekingsmetoden er tilstrekkelig til å fjerne et bredt spekter av eksterne mikrober, og kald behandling gir et alternativ til konvensjonell levamisolbasert lammelse; mens levamisol vil bli foretrukket for kaldfølsomme eksperimenter, minimerer kald lammelse bidrag til farlige avfallsstrømmer og tillater rask gjenopptakelse av normal aktivitet. Mens den fullstendige protokollen beskriver et laboratorieeksperiment der ormer koloniseres med kjente bakterier, kan prosedyrene for rengjøring av ormer og enkeltormforstyrrelser lett brukes på ormer isolert fra ville prøver eller kolonisert i mikrokosmoseksperimenter. Protokollene beskrevet her produserer levende bakterier ekstrahert fra ormtarmen, egnet for plating og kvantifisering av kolonidannende enheter (CFU) i individuelle ormer; for sekvenseringsbasert intestinal samfunnsanalyse, bør påfølgende cellelyse og nukleinsyreekstraksjonstrinn legges til disse protokollene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ormer som ble brukt i disse forsøkene ble hentet fra Caenorhabditis Genetic Center, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 er villtypen. DAF-2/IGF mutantene daf-16(mu86) I (CGC CF1038) og daf-2(e1370) III (CGC CB1370) brukes for å illustrere forskjeller i intestinal bakteriebelastning.

HT115 (DE3) E. coli som bærer pos-1 RNAi-vektoren er fra Ahringer-biblioteket21. MYb-samlingen av C. elegans innfødte tarmbakterier22 ble hentet fra Schulenburg-laboratoriet. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR er fra dette laboratoriet23. Pseudomonas mosselii ble isolert i dette laboratoriet. Stafylokokker aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP ble hentet fra LaRock-laboratoriet ved Emory University.

Alle ormbuffere og medier er utarbeidet i henhold til tidligere publisert litteratur24 med mindre modifikasjoner (se tilleggsfil 1).

1. Fremstilling av synkroniserte sterile C. elegans

MERK: I denne delen beskrives trinnvise prosedyrer for å generere en synkronisert populasjon av reproduktivt sterile voksne ormer. Fôring på pos-1 RNAi-plater brukes her for å forhindre produksjon av avkom fordi denne forstyrrelsen er embryonal dødelig; L1 larver oppdratt til voksen alder på pos-1 RNAi utvikler seg til eggleggende hermafroditter, men disse eggene er misunnelsesverdige25. RNAi-fôringsprotokollen er som i kapittelet "Omvendt genetikk" i Wormbook26.

  1. Før du synkroniserer ormer, må du sørge for at friske 10 cm NGM + pos-1 RNAi-plater er tilgjengelige. Plater kan tilberedes ferske fra konsentrert indusert væskekultur (+Amp +IPTG) eller inokuleres som plener på NGM + 100 μg/ml ampicillin + 1 mM IPTG og tillates å vokse ved 25 °C i mørket i 1 dag27.
    MERK: Carbenicillin (25 μg / ml) brukes ofte i stedet for ampicillin på RNAi-plater. Ampicillin er billigere, men mindre stabil; Ved bruk av ampicillin skal platene sås umiddelbart når de er tørre og brukes så snart som mulig (kan oppbevares i <1 uke ved 4 °C)27. Den høye antibiotikakonsentrasjonen som anbefales her, vil bidra til å sikre tilstrekkelig seleksjon.
  2. Start med flere (vanligvis to til fire) NGM-plater med store populasjoner av gravide hermafroditter. Isoler egg ved hjelp av blekemiddel-NaOH-synkronisering24.
    1. Vask ormer av agarplater med 2 ml steril ddH2O per plate. Fordel væsken jevnt i 1,5 ml mikrosentrifugerrør (ett rør per plate eller hermafroditter).
    2. Spinn ned for ~ 5 s i en stasjonær minicentrifuge (2000 x g) for å trekke voksne til bunnen av rørene. Pipetter av supernatanten og kast.
    3. Vask med 1 ml steril ddH2O; spinn ned som før og kast supernatanten.
    4. Gjenta forrige trinn for å redusere gjenværende bakterieavfall.
    5. Resuspender innholdet i hvert rør i 1 ml steril ddH2O. Tilsett til hvert rør 130 μL kommersielt blekemiddel (8,25% natriumhypokloritt) og 130 μL 5 N natriumhydroksyd (NaOH, endelig konsentrasjon 0,5 N).
    6. Vortex rør kraftig i minst 10-15 s hvert 2. minutt til voksne kropper har brutt opp. Ikke la blekemiddel-NaOH-behandling gå lenger enn 5 minutter for å unngå å drepe egg.
    7. Spinn i en minicentrifuge i 30-60 s ved 2000 x g for å pelletere eggene. Pipetter av supernatanten og kast. Det kan eller ikke være en synlig pellet, dette er normalt.
    8. Tilsett 1 ml M9 ormbuffer og spinn i 30-60 s ved 2000 x g. Kast supernatanten.
    9. Gjenta skylletrinnet (1.2.8) 5x for å fjerne blekemiddel-NaOH-blandingen grundig, og fjern så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre eggpelleten.
    10. Overfør egg til 10 ml M9 ormbuffer i et 50 ml konisk rør eller 30 ml kulturrør med hette. Hvis du bruker koniske rør, la lokket skrus litt ut og bruk litt tape for å holde det sikkert. Inkuber med risting over natten (16 timer) ved 25 °C og 200 RPM for å la larvene klekkes.
  3. Overfør synkroniserte L1-larver til RNAi-plater for å vokse til voksen alder.
    1. Tilsett 2 ml steril M9 buffer + 0,01% Triton X-100 (heretter M9TX-01) til hvert L1 rør og overfør hele volumet (12 ml) til et 15 ml skrue-topp konisk rør.
    2. Plasser 15 ml rør med L1-ormer ved 4 °C i 10 minutter for å bremse larvebevegelsen.
    3. Spinn ned 15 ml koniske rør i en stor bordcenrifuge (1 500 x g ved 4 °C i 3 minutter, akselerasjon og retardasjon bør ikke være høyere enn maksimalt 80 %).
    4. Skyll forsiktig av supernatanten uten å forstyrre L1-pelleten. Kast supernatanten.
    5. Tilsett 12 ml kald M9TX-01 til hvert rør. Gjenta sentrifugering. Pipetter forsiktig av og kast supernatanten. Hvert rør skal ha ~ 200 μL igjen.
    6. Skyll en 200 μL pipettespiss i M9TX-01 for å forhindre at ormer fester seg til plasten, og bruk deretter dette tipset til å resuspendere ormpelleten. Overfør resuspenderte ormer til tilberedte pos-1-plater ved å pipettere væskedråper på bakterieplenen.
    7. Rug platene ved 25 °C til første dag i voksen alder.
      MERK: Hvis voksende ormer på pos-1 RNAi-plater, må ormer mate ad libitum på RNAi-bakteriene til de har gått helt over til voksen alder for å sikre høy penetrans av den embryonale dødelige fenotypen. Kontroller platene ved 24 og 48 timer. Hvis platene virker utsultet eller nesten sultet, må ormene flyttes til ferske tallerkener for å fullføre veksten til voksne i full størrelse. For å unngå å tømme plater før ormer dyrkes, sikte på å legge til 250-500 L1 larver til hver 10 cm RNAi-plate.
  4. Høst voksne og klare intestinal E. coli for å skape bakteriefrie ormer.
    1. Skyll voksne ormer fra plater med 5 ml M9TX-01 per plate. Overfør buffer + ormer til et 15 ml konisk rør og la voksne slå seg ned til bunnen av røret.
    2. Skyll voksne i endringer på 10 ml fersk M9TX-01 buffer til ingen synlig bakteriell turbiditet gjenstår (vanligvis 1-2x). Rør kan sentrifugeres ved 700 x g i 30 s til pelletsormer, eller voksne kan få lov til å bosette seg ved tyngdekraften.
    3. Utfør en ekstra vask med 10 ml M9TX-01 for å redusere eksterne bakterier.
    4. Overfør ormer til 50 ml koniske rør eller 30 ml kulturrør som inneholder 5 ml S Medium + 2x varmedrept E. coli OP50 (~ 5 x 109 drepte celler / ml) + 200 μg / ml gentamycin + 50 μg / ml kloramfenikol. Hvis du bruker koniske rør, la lokket skrus litt ut og bruk litt tape for å holde det sikkert. Bruk glasspipetter eller skyll plastpipetter i M9TX-01 for å hindre at ormene fester seg.
    5. Inkuber voksne ved 25 °C med risting ved 200 RPM i 24-48 timer for å produsere bakteriefrie voksne.
      MERK: Hvis ormene skal forbli i antibiotika i >24 timer, kan det hende at mer varmedrept OP50 må tilsettes for å sikre at ormene har tilstrekkelig matkilde. Kontroller rørene ved 24 timer og suppler med varmedrept OP50 hvis turbiditeten er synlig redusert.
  5. Sukrose vaske voksne i henhold til Wormbook protokoller24 for å oppnå rene, reproduktivt sterile, synkronisert voksen-bare aksjer for bakteriell kolonisering.
    1. Sørg for at kalde volumer på 60 % sukrose, M9-ormbuffer og M9TX-01 er klare til bruk. For enkelhets skyld kan disse stå på 4 °C kvelden før.
    2. For hver prøve som skal vaskes, lag en merket 15 ml konisk slange som inneholder 8 ml M9TX-01 og sett til side på is. Disse vil være nødvendige i trinn 1.5.10.
    3. Tilsett 5 ml M9TX-01 til hvert 50 ml rør som inneholder L1 larver. Overfør hele volumet (nå 10 ml) til et tomt 15 ml skruetopp konisk rør og la voksne sette seg til bunnen av røret.
    4. Pipetter forsiktig av supernatanten og kast den.
    5. Tilsett 10 ml M9TX-01 i hvert rør og flytt rørene til en isbøtte i 5-10 minutter.
      MERK: Fra og med dette tidspunktet bør ormer og alle buffere holdes på is.
    6. Bruk innstillingen "fast temp" til å kjøle ned en stor bordsentrifuge til 4 °C.
    7. Tilsett 10 ml kald M9TX-01 i hvert rør for å skylle av eventuelt restavfall. La ormer slå seg ned på is; fjern supernatanten og kast den.
    8. Sukrose float: Tilsett 5 ml kald M9-buffer og 5 ml kald 60% sukroseoppløsning til hvert rør, bland godt. Deretter flyter forsiktig 1 ml kald M9-buffer på toppen av sukrose-bufferblandingen i hvert rør. Ikke bland etter at flottøren er tilsatt.
      FORSIKTIG: Beveg deg raskt for de neste trinnene- ormer kan tørke ut hvis de utsettes for høye konsentrasjoner av sukrose for lenge!
    9. Sentrifuge ved 1500 x g i 3 min ved 4 °C. Levende voksne ormer vil være i grensesnittet til M9 og sukrose, omtrent 1 ml fra toppen av røret.
    10. Bruk en glass 5 ml serologisk pipette til å overføre ormelaget til tilberedte 15 ml koniske rør med kald M9TX-01 (fra trinn 1.5.2). Vær veldig forsiktig med å få laget av levende ormer uten å pipettere opp for mye av sukrose.
    11. Legg om nødvendig til M9TX-01 for å få like store volumer på 10-12 ml/rør. Sentrifuger ved 1500 x g ved 4 °C i 1 min, og pipetter deretter av supernatanten. Ormer kan returneres til romtemperatur på dette punktet.
    12. Gjenta vasketrinnet 1.5.11 to ganger, og reduser hastigheten til 700 x g ved 4 °C og tiden til 30 s.

2. Fôring av ormer på levende bakterier i flytende kultur

MERK: Denne protokollen brukes til å kolonisere ormer med laboratoriedyrkede bakterier i godt blandede forhold i flytende kultur (supplerende figur 1). Ormer kan koloniseres med individuelle isolater fra ren kultur (f.eks. Patogener som Enterococcus faecium28,29) eller blandinger av isolater (f.eks. Minimale mikrobiomsamfunn14).

  1. Start med sukrose vasket synkroniserte voksne ormer fra protokollen trinn 1,5 i et 15 ml konisk rør. Vask ormene en gang i 12 ml S-buffer og kast supernatanten.
  2. Resuspender de vasket ormene i volumet av S-medium som trengs for forsøket. Vurder volumet av eksperimentelle forhold, antall forhold over hvilke ormer vil bli delt, og de endelige konsentrasjonene av ormer og bakterier.
    MERK: Fôring i ormer varierer med bakteriell tilgjengelighet30 og ormer kan stresses ved trengsel31. For kolonisering i flytende kultur anbefales < 1000 ormer/ml og >107 CFU/ml; 1011 CFU/ml regnes som "ad libitum" fôringstetthet på E. coli32.
  3. Spinn ned bakteriekulturer. Hell av supernatanten; aspirasjon eller pipettering kan brukes til å fjerne supernatanten for bakterier som danner løse pellets.
    MERK: For kulturer >5 ml, overfør til 15 ml rør og spinn ved ~ 2800 x g i en stor bordsentrifuge i 8-10 minutter. Kulturer <5 ml kan overføres til 1,5 ml rør og sentrifugeres ved 9000 x g i 1-2 minutter i en liten bordcentrifuge. Svært bevegelige bakterier (f.eks. mange arter av Pseudomonas) må kanskje kjøles ned ved 4 °C i 10-15 minutter for å lette dannelsen av en stabil pellet, og det kan være bedre å sentrifugere ved 4 °C.
  4. Resuspender bakteriekulturer i ett volum S-buffer og sentrifuge igjen til pellets. Fjern og kast supernatanten som før.
  5. Resuspend bakteriekulturer i S medium ved ønsket tetthet for forsøket, pluss eventuelle antibiotika for seleksjon. Antibiotika som skal brukes, hvis noen, vil avhenge av resistensprofilen til bakteriene som brukes til kolonisering.
  6. Ved hjelp av en pipettespiss belagt i M9TX-01, pipette ormer forsiktig opp og ned til ormer er grundig resuspendert i S medium, og overfør deretter til rør eller platebrønner for bakteriell kolonisering.
  7. Tilsett bakteriesuspensjon til hver ormkultur for å oppnå ønsket bakteriekonsentrasjon og sluttvolum.
  8. Hvis du bruker en flerbrønnsplate for kolonisering, dekk platen med en steril 96-brønn gassgjennomtrengelig tetningsmembran.
  9. Inkuber med risting ved 200 RPM for å forhindre at bakterier setter seg under inkubasjon.

3. Mekanisk forstyrrelse av individuelle ormer i et 96-brønns format

MERK: Denne delen beskriver en 96-brønns plateformatprotokoll for mekanisk forstyrrelse av individuelle bakterielt koloniserte C. elegans. De første trinnene i protokollen (3.1-3.8) beskriver en metode for å rense ikke-festede bakterier fra ormens tarm og rense utsiden av ormene ved hjelp av kald lammelse og overflatebleking. Disse trinnene vil produsere rene, levende voksne ormer som kan forstyrres mekanisk for kvantifisering av bakterieinnhold (3.8-end) eller brukes til videre eksperimenter (supplerende figur 1). Denne protokollen kan tilpasses for å kvantifisere bakterier i ormer kolonisert i flytende kultur (seksjon 2), på agarplater eller fra naturlig eller mikrokosmosjord.

  1. Plasser en aliquot av M9TX-01 på is for å kjøle seg ned (4-5 ganger antall prøver i ml).
  2. Forbered en aliquot av M9TX-01 + blekemiddel (6% natriumhypokloritt, 1:1000 eller 1:2000 v / v, 1 ml per prøve + 1 ml ekstra) og legg på is for å kjøle seg ned. Denne aliquot vil bli brukt i trinn 3.8.
  3. Forbered 96-brønns plater for seriell fortynning av forstyrrede ormprøver.
    1. Oppnå sterile 300 μL kapasitet 96-brønns plater med lokk; denne protokollen bruker en fortynningsplate per 12 ormer fordøyd.
    2. Bruk en 96-brønns flerkanals pipettor til å fylle rader B-D av hver 96 brønnplate (300 μL kapasitet) med 180 μL av 1x PBS buffer. La den øverste raden stå tom. Rader B-D vil bli 10x serielle fortynninger av ormen fordøyer [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Sett plater til side. Fortynningsplater vil bli brukt i trinn 3.13.
  4. Resuspender hver ormprøve i 1 ml M9TX-01 i et mikrosentrifugerør på 1,5 ml.
  5. Spinnrør kort (2-3 s) i en lavhastighets minicentrifuge (2000 x g) ved 25 ° C til pellets voksne. Pipetter av supernatanten og kast, pass på at du ikke forstyrrer ormpelleten.
  6. Bruk sentrifugeringsinnstillingene i trinn 3.5, skyll ormer to ganger med 1 ml M9TX-01, deretter en gang med 1 ml M9 ormbuffer, for å redusere eksterne bakterier.
  7. Rens ikke-festede bakterier fra ormtarmen.
    1. Resuspender hver prøve av ormer i 1 ml S medium + 2x varmedrept OP50 i et kulturrør.
    2. Inkuber ved 25 °C i 20-30 minutter for å tillate passasje av eventuelle ikke-klebne bakterier fra tarmen.
      MERK: Dette vil også rense ethvert ekstracellulært fluorescerende protein fra lumen og tillate klarere visualisering av merkede bakterier festet til tarmepitelet, spesielt når syrefaste fluoroforer (f.eks. mCherry, dsRed) brukes.
  8. Overflate blekemiddel ormer for å fjerne eksterne bakterier.
    1. Skyll rensede ormer to ganger med 1 ml kald M9TX-01 og kast supernatanten.
    2. La rørene avkjøles i 10 minutter på is (foretrukket) eller ved 4 °C. Dette vil lamme ormer og forhindre inntak av blekemiddel.
      MERK: Andre protokoller bruker et kjemisk lammelsesmiddel som levamisol; dette er en etablert tilnærming33 som krever tillegg av en farlig avfallsstrøm.
    3. Tilsett 1 ml iskald M9 ormbuffer + uparfymert blekemiddel (8,25 % natriumhydroksid, 1:1000 eller 1:2000 v/v) til hvert rør. La rørene sitte på is (foretrukket) eller ved 4 °C i minst 10 minutter for å drepe eksterne bakterier.
      MERK: Ikke overskrid 1:1000 konsentrasjon av blekemiddel. Selv i lammede ormer kan dødelighet resultere.
    4. Pipette av blekemiddelbuffer og kast bort; returner rør til is for å sikre at ormer ikke fortsetter å pumpe før blekemiddelet er ryddet.
    5. Tilsett 1 ml kald M9TX-01 til hvert rør. Spinn for ~ 5 s i en minicentrifuge (2000 x g ved 25 ° C); returner rør til is. Fjern supernatanten og kast den.
    6. Gjenta dette skylletrinnet med ytterligere 1 ml kald M9TX-01, og kast så mye av supernatanten som mulig.
      MERK: Hvis du bruker ormer til ytterligere eksperimenter, hopp over permeabiliseringstrinnet (protokoll 3.9) og overfør i stedet ny overflateblekede voksne til iskald buffer i en 6 cm petriskål og skill ormer til eksperimentelle forhold som i protokoll 3.10. Hold ormer kalde for å forhindre at motiliteten gjenopptas, men arbeid raskt - å holde ormer i >30 minutter på is kan potensielt føre til <100% gjenopptakelse av normal aktivitet34.
  9. Kjemisk permeabilisering av orm kutikula med natriumdodecylsulfat og dithiothrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (basert på35)
    FORSIKTIG: DTT er et reduksjonsmiddel og irriterende. Bruk personlig verneutstyr og arbeid i avtrekksvifte ved håndtering av tørre lagre eller løsninger. En farlig avfallsstrøm er nødvendig.
    1. I avtrekksviften klargjør du nok SDS/DTT-løsning til å tillate 100 μL for hver prøve. For 1 ml, til 965 μL M9 ormbuffer eller M9TX-01 i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, tilsett 5 μL med 5 % (w/v) SDS og 30 μL 1M DTT.
      MERK: 1 M DTT-oppløsning (vandig) skal tilberedes fersk eller oppbevares i aliquot ved -20 °C for å sikre potens. Aliquots bør dimensjoneres for å brukes opp i to til tre eksperimenter for å unngå overdreven fryse-tine sykling.
    2. Flytt mikrosentrifugerør som inneholder overflateblekede ormer til et romtemperert rørstativ. Hvert rør skal inneholde ormer i ~ 20 μL buffer.
    3. Tilsett 100 μL SDS / DTT-løsning til hver ormprøve. Kast eventuell gjenværende SDS/DTT-løsning i riktig strøm av farlig avfall.
    4. La behandlingen fortsette i opptil 8 minutter på benken for delvis å bryte ned den motstandsdyktige neglebåndet til de voksne ormene. Ormer vil dø og bosette seg til bunnen av røret i løpet av denne tiden.
    5. Etter at permeabiliseringstiden er ute, pipetter forsiktig av SDS / DTT-supernatanten og kast den i en passende SDS / DTT farlig avfallsstrøm.
    6. Tilsett 1 ml M9TX-01 i hvert rør. Spinn kort i en bord-topp sentrifuge for å pellet ormene eller la ormer bosette seg ved tyngdekraften til bunnen av rørene, deretter trekke av supernatanten og kaste i en SDS / DTT farlig avfallsstrøm.
    7. Resuspend ormer i 1 ml M9 ormbuffer + 0,1% Triton X-100 til klar til bruk.
  10. Skill ormer i en dyp 96-brønns plate med silisiumkarbidkorn for mekanisk forstyrrelse. Klargjør 96-brønns avbruddsplaten som under.
    1. Få en steril 2 ml dypbrønns 96-brønns plate og et matchende silisium 96-brønns platedeksel.
      MERK: Det er viktig å bruke plater som er kompatible med 96-brønnsadapterne for vevsforstyrreren. Små forskjeller i ytre dimensjoner utgjør forskjellen mellom en plate som kan fjernes fra adapterne og en som ikke kan.
    2. Bruk en steril scoop spatel, tilsett en liten mengde steril 36-grit silisiumkarbid til hver brønn på platen som vil motta en orm. Bruk nok grus til å knapt dekke bunnen av brønnen (ca. 0,2 g per brønn). Overdreven materiale vil gjøre det vanskelig å få en pipettespiss til bunnen av brønnen når du henter innholdet.
    3. Tilsett 180 μL M9 ormbuffer til hver brønn.
    4. Merk kolonnene eller radene for å indikere hvor hver prøve skal gå, og dekk deretter platen løst med det silisium 96-brønns platedekselet.
  11. Overfør individuelle ormer til 96-brønnplaten for forstyrrelse.
    1. Flytt permeabiliserte ormer forsiktig til en liten (35 eller 60 mm) petriskål som inneholder tilstrekkelig M9TX-01 til å fylle parabolen til en dybde på ~ 1 cm.
      MERK: Hvis et stort antall ormer er til stede, kan det ikke være mulig å overføre hele prøven, da væsken blir overfylt og det vil være vanskelig å pipette individuelle ormer.
    2. Ved hjelp av et dissekeringsmikroskop eller annen lavforstørrelsesanordning, pipette av individuelle ormer i 20 μL volumer, og overfør disse ormene til individuelle brønner på 96-brønnplaten.
      MERK: Det er best å høste bare ferskt drepte ormer. Unngå ormer med stiv lineær form, da disse ormene kan ha vært døde i noen tid. Prøv å ta ormer som er buede eller S-formede, med normal bruttofysiologi og en intakt tarm.
    3. Etter å ha overført hvert volum, må du kontrollere at den valgte ormen faktisk ble kastet ut i brønnen. For å gjøre dette, pipette opp 20 μL M9TX-01 fra et klart område av petriskålen og slipp hele volumet tilbake i parabolen; Dette vil normalt kaste ut ormen hvis den sitter fast i pipetten. Hvis ormen satt fast, fjern 20 μL fra brønnen og prøv overføringen igjen.
    4. Når alle ormer er overført, dekker du 96-brønnplaten med et ark med kommersielt tilgjengelig fleksibel papirstøttet tetningsfilm (2 x 2 firkanter), og sørg for at papirsiden av tetningsfilmen vender ned på prøvebrønnene. Vær forsiktig så du ikke strekker tetningsfilmen for tynn, ellers vil det være veldig vanskelig å fjerne senere.
    5. Plasser silikonforseglingsmatten lett på toppen av den fleksible tetningsfilmen; Ikke trykk dekselet ned i brønnene på dette tidspunktet.
    6. Flytt platen til 4 °C for å avkjøles i 30-60 min. Dette vil forhindre overoppvarming under avbrudd, noe som kan skade prøvene.
      MERK: Dette er et bruddpunkt i protokollen. I de fleste tilfeller kan platen stå ved 4 °C i opptil 4 timer før sliping. Ikke la ormene stå over natten, da dette vil endre bakterietallene.
  12. Last 96-brønns plater på en vevsforstyrrende for å bryte opp ormvev og frigjøre tarmbakterier.
    MERK: (Valgfritt) Hvis du bruker et oddetall på 96-brønns plater for fordøyelser, er det nødvendig å forberede en motvekt før du fortsetter. Bruk en tom dyp plate med 96 brønner og fyll brønner med vann til den veier det samme som den første platen.
    1. Trykk silikonforseglingsmatten godt ned i brønnene for å lage en tetning, og sørg for at lokket ligger flatt over hele overflaten av platen.
      MERK: Hvis den fleksible tetningsfilmen er for tykk etter strekking, vil det være vanskelig å feste silisiumlokket slik at det ligger flatt i alle brønner. Dette vil resultere i utilstrekkelig forsegling og forurensning av brønnen under risting.
    2. Sikre plater i vevsforstyrreren ved hjelp av 96-brønns plateadaptere. Rist platene i 1 min ved 30 Hz, roter deretter platene 180° og rist igjen i 1 min. Dette vil bidra til å sikre jevn forstyrrelse i alle brønnene på platen.
    3. Trykk platene godt på benken to eller tre ganger for å løsne grus fra den fleksible tetningsfilmen.
    4. Bruk en stor sentrifuge med to 96-brønns plateadaptere, og spinn platene ned ved 2400 x g i 2 minutter for å samle alt materiale til bunnen av brønnene.
    5. Fjern silikonlokket og trekk forsiktig av den fleksible tetningsfilmen.
      MERK: Hvis den fleksible tetningsfilmen fester seg i noen av brønnene, bruk en pipettespiss på 200 μL for å fjerne den. Dette er vanlig når den fleksible tetningsfilmen ble strukket for tynn.
  13. Serielt fortynnede ormfordøyelsesprøver i 300 μL i 96-brønns plater.
    1. Ved hjelp av en multibrønnpipettor satt til 200 μL, pipette opp og ned flere ganger sakte og forsiktig for å blande innholdet i brønnene på nytt, og trekk deretter av så mye av væsken som mulig. Overfør denne væsken til de øverste radene på platene med 96 brønner fremstilt i trinn 3.3.
    2. Bruk en 96-brønns pipettor satt til 20 μL, fjern dette volumet av væske fra den øverste raden og dispenser inn i rad B. Pipette opp og ned 8-10x for å blande. Kast tips.
    3. Gjenta trinn 3.13.2, og start fra 0,1x-prøvene i rad B for å opprette 0,01x fortynningsprøver i rad C.
    4. Gjenta trinn 3.13.2 igjen, og gå fra rad C til rad D.
    5. Plate på fast agar for bakteriell kvantifisering. For monokoloniserte ormer er det vanligvis tilstrekkelig å plate 10-20 μL dråper av hver fortynning [1x-0,001x] på agarplater. For kolonisering av flere arter, plate hver fortynning separat ved pipettering 100 μL på en 10 cm agarplate; spres umiddelbart ved hjelp av glassbeleggperler.

4. Rengjøring av silisiumkarbidkorn for gjenbruk

MERK: Denne prosedyren brukes til å rengjøre og sterilisere slipematerialet, silisiumkarbidkorn, for gjenbruk etter eksperimenter. Denne protokollen bør følges i sin helhet før første gangs bruk, da silisiumkarbidkorn er et industriprodukt og ikke kommer pre-sterilisert. Si-karbidkorn (3,2 g / cc) er et tett, grovkantet materiale som fungerer effektivt for å forstyrre tøffe prøver. Partiklene kan imidlertid slites ned ved gjentatt bruk og bør byttes ut når slitasje blir tydelig. Heldigvis er materialet billig, og størrelsene som vanligvis selges (~ 1 lb) er tilstrekkelig for mange eksperimenter.

  1. Etter å ha fjernet prøver for plating, tilsett 10% blekemiddelløsning til alle brønnene på 96-brønnplaten og la den sitte i minst 10 minutter.
  2. Fjern mesteparten av kornet ved raskt å invertere 96-brønnsplaten over et lite høysidig brett eller en tom P1000 pipettespissbeholder som er stor nok til å fange opp alt innholdet. Kornet synker umiddelbart til bunnen av brettet. Hell av blekemiddeloppløsningen i en vask.
  3. Fyll 96-brønnplaten på nytt med vann fra springen og vend inn i samme brett for å skylle ut gjenværende grus. Hell vannet av i vasken.
  4. Gjenta en til tre ganger til med vann fra springen til platen er helt fri for grus.
  5. Skyll grus 2x i vann fra springen, fyll brettet hver gang.
    MERK: 96-brønns dypbrønnsplaten kan vaskes i en laboratorieoppvask, dekkes sikkert med folie og autoklaveres med annen gjenbrukbar plast. Grit trenger ikke å vaskes umiddelbart og kan settes til side på dette tidspunktet. Brukt grus akkumuleres vanligvis fra flere eksperimenter før vask og autoklavering.
  6. Vask grus i en løsning av laboratorievaskemiddel i 30 minutter, og omrør av og til ved å virvle eller blande med en metallspatel.
  7. Skyll bort alle spor av vaskemiddel i flere (8-10) endringer av vann fra springen, skyll deretter 2x med destillert vann.
  8. Spred grus i et åpent brett, for eksempel et grunt polypropylen autoklavbrett, og tørk ved 40-70 °C i flere timer.
    MERK: Hvis grusen er klumpete når den er tørr, ble den ikke rengjort eller skyllet tilstrekkelig. Gjenta rengjøringsprotokollen fra trinn 4.6, og legg til flere skyllinger i trinn 4.7.
  9. Fordel rent, tørt korn i autoklaverbare glassflasker til en maksimal dybde på 5-6 cm. Autoklav på pre-vakuum syklus i 30 minutter for å sterilisere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Blekemiddelsterilisering av levende ormer
Overflateblekede ormer er effektivt fri for eksterne bakterier til motiliteten kommer tilbake og utskillelsen gjenopptas. Under de forhold som er brukt her, observeres rask utryddelse av bakterier i buffer (Figur 1A-C, Supplerende figur 2, Video 1) uten å forstyrre tarmassosierte bakterier i kaldparalyserte ormer (Figur 1D-F, Video 2). Disse dataene indikerer at overflatebleking kan brukes effektivt til å rense ormer eksternt uten å kompromittere tarminnholdet (sammenligninger av overflateblekede vs. ikke-blekemiddelormassosierte CFU-teller er ikke-signifikante, Wilcoxon rank-sum test p > 0,05).

Variasjoner på multi-sample mekanisk forstyrrelse
96-brønnsteknikken for mekanisk forstyrrelse av ormer er robust for de spesifikke materialene som brukes, og praktiske hensyn tilsier valget av slipemateriale. I likhet med en tidligere rapport33 resulterte manuell forstyrrelse (figur 2A) i mer heterogenitet enn standard 96-brønnsprotokoll (silisiumkarbidkorn, figur 2B) (var (logg10CFU) = 0,499) på tvers av alle bufferforhold, sammenlignet med 0,229 for Si-karbid, 0,243 for store glassperler (figur 2C) og 0,227 for små glassperler (figur 2D ). De fleste forskjellene i CFU/ormfordeling var likevel ikke signifikante (Kruskal-Wallace, p = 0,017 med df = 3; signifikante posthocson-Wilcoxon-tester for store perler vs. små perler, p = 0,021, og store perler vs. silisiumkarbidkorn, p = 0,02). Bruken av Triton X-100 som overflateaktivt middel var ikke forbundet med noen signifikant forskjell i utbytte når det betraktes som en individuell faktor (Kruskal-Wallace, p = 0,94, df = 3), selv om det er en tilsynelatende økning i utbyttet i prøver som ikke er Triton vs. Triton når store perler (2,7 mm) ble brukt (figur 2C), muligens på grunn av overdreven "skumdannelse" observert i disse brønnene da Triton var tilstede. Disse resultatene indikerer at store glassperler, mens de er ideelle for bruk i homogeniseringsrør33, ikke er egnet for 96-brønnsteknikken. Mens små glassperler ga rimelige resultater (figur 2D), tettet de konsekvent 200 μL pipettespisser under blanding og plating. Standardmaterialet i denne analysen, silisiumkarbidkorn, er billig, for stort til å tette standardspisser, og som glassperler kan vaskes og gjenbrukes etter autoklavering. Grusen frigjør en liten mengde "støv" i bufferen, som ikke forstyrrer plating, men må filtreres av hvis forstyrrelsesproduktene skal brukes til flowcytometri.

Heterogenitet i bakteriell kolonisering i voksne ormer
Vellykket forstyrrelse av individuelle ormer avslører heterogenitet i bakteriell kolonisering. Personer fra isogene synkroniserte populasjoner av ormer, kolonisert samtidig på samme basseng av bakterier, viser konsekvent 100 ganger eller større rekkevidde i intestinal bakteriell belastning. Dette observeres for ulike bakteriekolonister (figur 3A) og under kolonisering på bakteriesamfunn med flere arter (figur 3B). Denne heterogeniteten er også tydelig i individuelle ormmålinger av fluorescens når ormer koloniseres med bakterier som uttrykker et fluorescerende protein (GFP) (figur 3C-D). Egenskapene til verten spiller en rolle i å forme denne heterogeniteten, som kan sees ved å sammenligne kolonisering av villtype Bristol N2-ormer med kolonisering av de samme bakteriene i DAF-2 / IGF-mutanter; denne daf-16 mutanten støtter større populasjoner av mange bakterier sammenlignet med N2, mens DAF-2 er motstandsdyktig mot kolonisering av en rekke bakterier36 (figur 3B, D). Denne heterogeniteten er karakteristisk, og viser variasjon på tvers av forskjellige kombinasjoner av vert og kolonist (er), samtidig som den beholder en konsistent struktur over forskjellige løp av samme eksperiment (figur 3E-F).

Betydningen av individuell heterogenitet for nøyaktig sammenligning av grupper
Betydningen av individuell heterogenitet kan lett ses ved å vurdere hvordan batchfordøyelser kan endre fordelingen av data. Kolonisering av innfødte mikrobiombakterier MYb53 (Rhodococcus erythropolis) og MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Figur 3A, 4A) hos N2 voksne brukes som eksempler. De individuelle ormdataene er klart like i fordeling (tosidig t-test, p = 0,9, Wilcoxon rang sum, p = 0,59). Ved resampling av disse dataene for å simulere effekten av batchfordøyelser, trekker batch ekstrapolert CFU / orm mot de øvre kvantilene av dataene på grunn av den positive skjevheten i disse distribusjonene (gjennomsnittlig > median). Ettersom batching effektivt gjennomsnitt over individene i en batch, vil batch-ekstrapolert CFU / orm sentrere rundt det aritmetiske gjennomsnittet av de enkelte dataene, med avtagende avstand til dette gjennomsnittet ettersom batchene blir store i henhold til sentralgrenseteoremet (figur 4B-D). Følgelig går signal fra biologisk variasjon raskt tapt; batch-utledet CFU / orm målinger konvergerer mot gjennomsnittet, som ikke er en representativ beregning av disse log-skala-distribuerte data. Forskjeller i antatt kolonisering av MYb53 vs. MYb120 blir raskt signifikante i simulerte batchfordøyelser (t-testbatch 5, p = 0,049; batch 10, p = 2,27e-4; batch 20, p = 1,19e-15; Wilcoxon rang sum test batch 5, p = 2,27e-4; batch 10, p = 2, 70e-06; batch 20, p = 1.80e-09) som det opprinnelige signalet er skjult.

Effekter av individuell heterogenitet på mikrobiell overføring
Ettersom individuelle ormer viser betydelig heterogenitet i bakteriell kolonisering, er det rimelig å spørre om denne heterogeniteten har nedstrømseffekter. For eksempel er det rimelig å forvente at overføring kan være en funksjon av intestinal bakteriell belastning. Ved å overføre individuelle overflateblekede ormer til et rent miljø, er det mulig å observere inokulering av miljøet med utskilte levende bakterier. I disse forsøkene fikk overflateblekede prekoloniserte voksne, som bærer generelt betydelige populasjoner (103-10 5 CFU / orm, figur 5) av kommensale Ochrobactrum MYb14-GFP eller patogen S. aureus-GFP, lov til å streife på varmedrepte OP50-plener på NGM-agar i 1,5 timer. Når disse ormene høstes på nytt fra utskillelsesplater og forstyrres for bakteriell kvantifisering, er det ingen signifikant sammenheng mellom bakteriebelastning og utskillelseshastighet av levende bakterier (Pearson-korrelasjoner mellom logtransformerte kolonier/hr og CFU/orm: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (figur 5). Det er heller ingen signifikant sammenheng mellom tilstedeværelse/fravær av kolonier på plate og intestinal bakteriebelastning (binomisk logistisk regresjon med logtransformert CFU/orm som faktor: p = 0,15 med df = 53). En betydelig del av platene forble fri for ny vekst (9/18 plater for MYb14, 10/36 plater for S. aureus), noe som indikerer lave totale utskillelseshastigheter.

Når ormer får lov til å skille ut på agarplater, blir det faktiske antallet levende utskilte bakterier per orm forvirret av "oppdrett", der ormer passerer gjennom kolonier og skaper spor av ny vekst (figur 6) 37. En plate med n kolonier representerer minst en, og høyst n, hendelser der levende kolonidannende bakterier ble utskilt. Fra denne observasjonen er det ikke mulig å vite hvor mange utskillelseshendelser i (1,n) som faktisk skjedde, og det er heller ikke mulig å vite hvor mange bakterier som ble utskilt i hver hendelse. Det er derfor ikke mulig å nøyaktig estimere utskillelseshastigheter av levende bakterier fra tarmen ved hjelp av disse dataene. Det er imidlertid mulig å utlede noen grenser. Selv om antall kolonier per plate ikke er veldig informativt, kan tilstedeværelses- / fraværsdata brukes til grov slutning av utskillelseshastigheter. For enkelhets skyld, hvis det antas at utskillelseshastighet av levende bakterier ikke er en funksjon av bakteriell belastning og at utskillelse er en Poisson-prosess, er det ~ 50% sjanse for å observere minst ni hendelser i 18 forsøk når λ ≈ 0,33 orm-1 t-1 i MYb14. For S. aureus oppnås tilsvarende plausible hastigheter av λ ≈ 0,2 orm-1 t-1 . Selv om disse grove beregningene antyder lave utskillelseshastigheter av levende bakterier, vil mer presis kvantifisering av denne prosessen over større antall individuelle ormer være nødvendig for å oppnå pålitelige estimater.

Data tilgjengelighet:
Data vist her er tilgjengelig på Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Figur 1. Overflateblekingsbehandling med lav konsentrasjon dreper raskt bakterier i buffer, men forstyrrer ikke tarmsamfunn i kaldslammede ormer. (A-C) Bakteriell CFU/ml i M9 ormbuffer under overflatebleking i tre forskjellige konsentrasjoner (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; ubleket kontroll for sammenligning), rettet mot (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2, eller (C) E. coli OP50. Prøver ble tatt på angitte tidspunkter opptil 20 minutter etter eksponering og vasket to ganger med steril buffer for å forhindre at blekemiddel dreper kolonier på plater. Data for 1:1000-tilstanden forskyves litt slik at disse dataene er synlige på plottet. (D-F) Tarmbakterier i individuelle N2 ormer (n = 24 ormer per eksperiment, to eller tre uavhengige løp på separate dager). Alle sammenligninger av overflateblekede og ikke-blekemiddelormassosierte CFU-tellinger er ikke-signifikante (Wilcoxon rank-sum test p > 0,05). Grå horisontale linjer representerer deteksjonsterskel, definert som tettheten (40 CFU/orm) der sannsynligheten for å observere minst én koloni er ~60 % ved plating av 10 μL aliquots fra 200 μL volumer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Avbruddsprotokollen med 96 brønner gir konsistente resultater og er robust for materialvalg. N2 voksne ormer kolonisert med en enkelt bakterieart i 48 timer (P. mosselii) ble overflatebleket og permeabilisert i henhold til standardprotokoller, deretter ble individuelle ormer (n = 24 per tilstand) mekanisk forstyrret for CFU-plating ved bruk av (A) manuell forstyrrelse i individuelle 0,5 ml rør, ved bruk av en motorisert pestle eller (B-D ) variasjoner over 96-brønns avbruddsprotokollen beskrevet i detalj i protokollen. Forstyrrelse ble utført i M9 ormbuffer som inneholdt varierende konsentrasjoner av Triton X-100 (x-akse, 0-0,1%, v / v) og en av (B) 36-korn silisiumkarbid, (C) små (425-600 μm) glassperler, eller (D) store (2,7 mm) glassperler. For alle plottene er data som vises log10(CFU/orm), og hvert punkt er én individuell orm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Heterogen bakteriell kolonisering av C. elegans tarm. (A) Kolonisering av enkeltarter av N2 voksne hermafroditter fremstilt som i metoder. Bakterier er fire arter fra MYbs opprinnelige ormmikrobiomsamling (Dirksen et al. 2016) (n = 24 ormer, ett eksperiment hver) og to patogener, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) og Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 ormer over to/tre uavhengige eksperimenter). Kolonisering av innfødte mikrobiomarter ble vurdert etter en 48 timers inkubasjon ved 25 ° C i flytende S medium + 108 CFU / ml bakterier; kolonisering av patogener ble vurdert etter inkubasjon på plener på NGM orme agar for 24 (SA) eller 48 (SE) h ved 25 ° C. (Ved 48 timer har ormer på S. aureus for det meste dødd.) (B) Total CFU/orm i N2, daf-16(mu86), og daf-2(e1370) voksne kolonisert i 4 dager i flytende medier på et åtte arter minimalt innfødt mikrobiom (data fra Taylor og Vega, 2021)14. (C-D) Grønn fluorescens i individuelle ormer kolonisert med GFP-uttrykkende bakterier, observert ved stor objektstrømcytometri. I (C) ble synkroniserte populasjoner av N2 voksne kolonisert med OP50 (ikke-fluorescerende, n = 1908 individuelle voksne ormer), S. aureus (GFP, n = 968) eller S. enterica (GFP, n = 1153) som beskrevet i (A); OP50-kontrollen indikerer typiske nivåer av grønnkanals autofluorescens i dag-3 voksne N2-ormer. I (D) ble synkroniserte populasjoner av N2 (n = 1165), daf-16(mu86) (n = 1180) og daf-2(e1370) (n = 2267) voksne kolonisert med commensal Ochrobactrum MYb14-GFP i 2 dager på plater som beskrevet i (A). (E-F) Daglig variasjon i kolonisering av S. aureus (E) og S. enterica (F) (samme data som i panel A og figur 1, n = 48 ormer per eksperiment). X-aksen angir prøvetakingsdagen. Grå horisontale linjer representerer deteksjonsterskel, definert som tettheten der sannsynligheten for å observere minst en koloni er ~ 60% (40 CFU / orm for kolonisering av enkeltarter og fire CFU / orm for kolonisering av flere arter, på grunn av forskjellige platingvolumer på henholdsvis 10 μL og 100 μL av 200 μL). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Batching sletter biologisk variasjon i skjeve loggskaladata. CFU/ormdata fra figur 3 ble omsamplet med erstatning for å lage n = 25 replikasjonssett med simulerte data for hver batchstørrelse, der størrelsen er antall individuelle ormer per batch. CFU/orm er den totale CFU i hver simulerte batch delt på antall ormer per batch. I rådata (panel A) er gjennomsnittlig CFU/orm for MYb53 4450,8 (103,6), og for MYb120, 1398,3 (103,1); de batch-utledede tallene konvergerer til disse verdiene etter hvert som batchstørrelsen øker (B, fem ormer / batch; C, 10 ormer/batch; D, 20 ormer/batch), i samsvar med forventningene fra sentralgrenseteoremet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Utskillelse av levende bakterier er dårlig korrelert med CFU-belastning i tarmen til individuelle ormer. Her ble N2 voksne kolonisert ved å mate i henholdsvis 1 eller 2 dager på plener av S. aureus-GFP eller MYb14-GFP. Ormer med påviselig GFP-fluorescens (total GFP > 1,8 logger på stort objektstrømcytometer) ble sortert fra bulkpopulasjonen, overflatebleket som beskrevet i Metoder, og overført individuelt til NGM + varmedrepte OP50-plater. Pearson-korrelasjoner mellom logtransformerte kolonier/h og CFU/orm er ikke-signifikante (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0, 02, p = 0, 9). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Bakteriell "oppdrett" skjuler antall utskillelseshendelser på agarplater. Her er to plater med MYb14-GFP kolonier fra ormekskreta. Den første platen (A) har klare bevis på "oppdrett" langs ormbaner og ser ut til å representere minst to separate utskillelseshendelser basert på forskjeller i GFP-uttrykk (synlig som gulaktig pigmentering) over kolonier. Mens den andre platen (B) er mer tvetydig, kan oppdrett ikke utelukkes basert på kolonienes posisjoner. I disse forsøkene ble N2 voksne ormer prekolonisert i 48 timer ved å mate på agarplater som inneholder plener av MYb14-GFP. Etter kolonisering ble ormer forberedt og overflatebleket i henhold til metoder, deretter overført i 5 μL aliquots av M9 ormbuffer + 0,1% Triton X-100 til 6 cm NGM + varmedrepte OP50-plater (fremstilt ved å la 50 μL flekker av 5x konsentrert varmedrept OP50 tørke på overflaten). Ormer fikk lov til å streife rundt i 1,5 timer ved 25 °C, deretter plukket fra plater og forstyrret for CFU/ormbelegg (manuell forstyrrelse i 20 μL buffer i individuelle 0,5 ml rør, ved hjelp av en motorisert pestle). Platene ble ruget ved 25 °C i 2 dager før telling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1. Visualisering av N2 ormer kolonisert med GFP fluorescerende S. aureus uten overflatebleking. Et lite antall fluorescerende celler på neglebåndet beveger seg inn og ut av fokus når bildet passerer gjennom ormens kropp, og romlig heterogen kolonisering av tarmen blir synlig når synsfeltet beveger seg fra kroppsoverflaten inn i tarmen. Z-stack-bildet ble tatt med 20x forstørrelse på et omvendt fluorescerende mikroskop. Lysfelt- og GFP-filtrerte fluorescerende bilder ble lagt over, og bilder over Z-stakken sydd sammen ved hjelp av leverandørens programvare. Bildet er fra samme lysbilde som i Tillegg figur 2A. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2. Visualisering av en N2-orm kolonisert med GFP fluorescerende S. aureus med overflatebleking (1:1000 v/v i 20 min). Romlig heterogen kolonisering av fluorescerende bakterier er synlig i tarmen til denne personen, og bakterier har infiltrert kroppens vev, noe som indikerer avansert infeksjon. Ingen bakterier er synlige på neglebåndet. Z-stack-bildet ble tatt med 20x forstørrelse på et omvendt fluorescerende mikroskop. Lysfelt- og GFP-filtrerte fluorescerende bilder ble lagt over, og bilder over Z-stakken sydd sammen ved hjelp av leverandørens programvare. Bildet er fra samme lysbilde som i Tillegg figur 2B. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende figur 1. Oversikt over protokollen. Her blir synkroniserte voksne ormer monokolonisert med røde bakterier, overflatebleket og permeabilisert før mekanisk forstyrrelse av individuelle ormer i et 96-brønns format. Bakterier frigjort fra tarmen er fortynning belagt i 10x serie for CFU / orm kvantifisering; plater vist er typiske for observert heterogenitet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Visualisering av N2-ormer kolonisert med GFP fluorescerende S. aureus med og uten overflatebleking (1:1000 v/v i 20 min). (A) I den ublekede prøven er eksterne bakterier synlige ved lav forstørrelse som områder med grønn fluorescens som ikke er forbundet med ormer eller ormkroppsfragmenter. (B) I den overflateblekede prøven er GFP-fluorescens begrenset til det indre av ormelegemer (ett ormlegemefragment er synlig midt i bildet). Alle bildene ble tatt med 4x forstørrelse på et omvendt fluorescerende mikroskop. Lysfelt- og GFP-filtrerte fluorescerende bilder ble lagt over, og bilder fra tilstøtende synsfelt sydd sammen ved hjelp av leverandørprogramvaren. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Buffer- og løsningsoppskrifter. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenteres data om fordelene med enkeltormskvantifisering av bakteriell belastning i C. elegans, sammen med en 96-brønns forstyrrelsesprotokoll for å muliggjøre rask og konsistent innsamling av store datasett av denne typen. Sammenlignet med eksisterende metoder33 tillater disse protokollene høyere gjennomstrømningsmåling av intestinale mikrobielle samfunn i ormen.

Denne tilnærmingen har plating som et hastighetsbegrensende trinn og er ikke virkelig "høy gjennomstrømning". Storobjekt flowcytometri (figur 3C, D) er en nyttig høy gjennomstrømningsmetode for å kvantifisere fluorescerende merkede bakterier i individuelle ormer16, selv om antall samtidige fluoroforer er en begrensning i flerartssamfunn. Kobling av flerbrønnsplateforstyrrelser med samfunnssekvensering er en annen måte å øke gjennomstrømningen på; Imidlertid ble 96-brønns forstyrrelsesprosedyren beskrevet her optimalisert spesielt for å la bakterieceller være intakte. Sekvenseringsbasert analyse, hvor grundig lysis av celler er ønskelig, vil kreve tilsetning av et nukleinsyreekstraksjonstrinn eller modifisering av slagprotokollen (protokoll 3.10-3.11) for å trekke ut celleinnhold i stedet for levende bakterier. Protokoller for enkeltormforstyrrelser og ekstraksjon av nukleinsyrer er publisert andre steder38,39.

Bakteriell total overflod i ormtarmen er heterogen, og dataene vist her tyder på at batchbasert måling kan gi feilaktige resultater i sammenligninger mellom grupper. Imidlertid kan andre tiltak av bakteriesamfunn i ormen være mindre følsomme for effekten av batching. Det er verdt å merke seg at relative mengder i ormeassosierte samfunn synes å variere svært lite om i det hele tatt med total tarmpopulasjonsstørrelse, uavhengig av om interaksjoner mellom mikrober er nøytrale40 eller ikke14. Det er plausibelt at sammenlignet med telledata, vil relative overflodsmål være mindre utsatt for det falske positive renteproblemet som er beskrevet. Sekvenseringsbasert samfunnsanalyse, som genererer relative overflodsdata for samfunnssammensetning, kan derfor ikke kreve måling av enkeltormer. Ytterligere undersøkelser er nødvendig på dette punktet.

Her bruker vi kald behandling for å lamme ormer for overflatebleking. Annet arbeid har funnet at ormer gjenopptar normal aktivitet raskt (<15 min) hvis tiden på is holdes under 30 minutter, noe som tillater umiddelbar bruk i ytterligere analyser, i motsetning til kjemiske lammelsesmidler som kan kreve lengre perioder før full gjenoppretting34. Hvis ormer skal forstyrres umiddelbart for bakteriell kvantifisering, er denne funksjonen dispenserbar, og den største fordelen med kjøling vs. kjemisk lammelse er å unngå behovet for en kontrollert avfallsstrøm. Utvidet kuldebehandling bør brukes med forsiktighet ved undersøkelse av stressresponser, spesielt hvis det er en kjent sammenheng med temperatur. Kuldelammelsesprotokollene beskrevet her medfører kortere akutt kuldeeksponering enn det som brukes i eksperimenter for kaldt stress (20-30 min vs 2 + t ved 2-4 ° C) 41,42,43, og et 1 timers kaldt sjokk gir ingen tilsynelatende fenotype i villtype ormer 43. Kortsiktig (90 min) inkubasjon ved 4 ° C induserer endringer i kaldt stress genuttrykk (målt ved ekspresjon av en TMEM-135: : GFP reporter), men uttrykket vender tilbake til ubelastede nivåer i løpet av minutter når ormer er returnert til romtemperatur34. Effektene på stressfølsomme ormgenotyper kan imidlertid være mer alvorlige enn i villtype. Denne prosedyren bør valideres under de eksperimentelle forholdene som skal brukes.

Overflateblekingsprotokollen beskrevet her kan brukes som en måte å begrense eller eliminere passasje av eksterne mikrober i eksperimenter. Denne metoden har i tillegg blitt brukt til å fjerne soppforurensninger ved overflatebleking og overføring av bare L1/L2-larver til ferske plater (overføring av overflateblekede voksne resulterte i manglende fjerning av forurensningen, antagelig på grunn av transport i tarmene til de større dyrene). Det er kritisk viktig å sikre at konsentrasjonen av blekemiddel ikke overstiger 1:1000 v/v, da det vil oppstå skade på ormene og dødeligheten. Denne prosedyren kan være nyttig i eksperimentell vert-mikrobe evolusjon og vert-patogen interaksjoner. For eksempel kan den lave utskillelseshastigheten av levende bakterier observert her bidra til å forklare de svært variable frekvensene som observeres for bakteriell overføring fra hermafroditter til avkom15. Mangelen på korrelasjon mellom intestinal bakteriell belastning og utskillelseshastighet observert her er interessant, men krever ytterligere undersøkelser; et større antall datapunkter over en rekke forhold vil være nødvendig for å bestemme hvor (eller om) denne observasjonen vil holde.

Det kan ikke alltid være nødvendig å rengjøre ormer i den grad det er gitt av overflatebleking. Flere vasker i steril buffer er sannsynligvis tilstrekkelig når ormer er internt kolonisert med en enkelt mikrobe hvis minimum forventet CFU / orm er mye høyere (10-100 ganger) enn konsentrasjonen av bakterier i buffer supernatant, da denne overføringen vil minimalt påvirke teller (se figur 1). I tillegg, hvis mikroben (e) av interesse primært koloniserer neglebåndet, bør overflatebleking klart unngås. Grundig rengjøring er viktigere for å sikre nøyaktighet når det gjelder blandede mikrobielle samfunn (for å sikre at alle kolonier / avlesninger i en prøve er fra ormeassosierte bakterier og ikke fra miljøet), når bakterier festet til neglebåndet forstyrrer lesingen av den internaliserte populasjonen, når forventet minimum CFU / orm er lav, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne H. Schulenberg og C. LaRock for deres sjenerøse deling av bakteriestammer som brukes i disse forsøkene. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Emory University og NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Biologi Utgave 185 Caenorhabditis elegans mikrobiom heterogenitet vertsmikrobe bakterier overføring
Bruke single-worm data for å kvantifisere heterogenitet i <em>Caenorhabditis elegans-bakterielle</em> interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter