Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

طريقة بيولوجية شبه آلية وقابلة للتكرار لتحديد ترسب الكالسيوم في المختبر

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/64029
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry, Cardiovascular Research Institute Maastricht (CARIM), Maastricht University, 2Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Biointerface Group, RWTH Aachen University, 3Institute of Experimental Medicine and Systems Biology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. يساهم تكلس الأوعية الدموية بشكل كبير في عبء المراضة والوفيات القلبية الوعائية. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لقياس ترسيب الكالسيوم بوساطة خلايا العضلات الملساء الوعائية في المختبر عن طريق التصوير الفلوري.

Abstract

يتضمن تكلس الأوعية الدموية سلسلة من الأمراض التنكسية ، بما في ذلك الالتهاب ، والتغيرات في النمط الظاهري الخلوي ، وموت الخلايا ، وغياب مثبطات التكلس ، والتي تؤدي في نفس الوقت إلى فقدان مرونة الأوعية ووظيفتها. يعد تكلس الأوعية الدموية مساهما مهما في المراضة والوفيات في العديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض الكلى المزمنة والسكري وتصلب الشرايين. نماذج البحث الحالية لدراسة تكلس الأوعية الدموية محدودة ولا يمكن تطبيقها إلا في المراحل المتأخرة من تطور التكلس في الجسم الحي. تستخدم الأدوات المختبرية لدراسة تكلس الأوعية الدموية قياسات نقطة النهاية ، مما يزيد من الطلب على المواد البيولوجية ويخاطر بإدخال التباين في الدراسات البحثية. نوضح تطبيق مسبار جديد يحمل علامة الفلورسنت يرتبط بتطور التكلس في المختبر على خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية ويحدد التطور في الوقت الفعلي للتكلس في المختبر . في هذا البروتوكول ، نصف تطبيق مقايسة التكلس المطورة حديثا ، وهي أداة جديدة في نمذجة الأمراض لها تطبيقات متعدية محتملة. نتصور أن يكون هذا الاختبار ذا صلة بمجموعة أوسع من أبحاث ترسب المعادن ، بما في ذلك التطبيقات في أبحاث العظام أو الغضاريف أو الأسنان.

Introduction

تكلس الأوعية الدموية (VC) هو عامل خطر مستقل لمراضة القلب والأوعية الدموية والوفيات1،2،3. تعتبر منذ فترة طويلة عملية كيميائية سلبية لترسب المعادن خارج الرحم ، ويبدو الآن استجابة قابلة للتعديل لشفاء الأنسجة تنطوي على المساهمة النشطة للخلايا المختلفة بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية المنشطة (hVSMC) كمحرك للمرض 4,5. في الجسم الحي يمكن قياس VC عن طريق التصوير المقطعي المحوسب متعدد الشرائح كتقييم لعبء تصلب الشرايين6،7،8. حاليا ، هناك نقلة نوعية جارية ، حيث أصبحت شدة VC معترف بها كعامل خطر في أمراض القلب والأوعية الدموية ، ومرض السكري من النوع الثاني ، وأمراض الكلى المزمنة ، والشيخوخة9،10،11،12،13،14،15.

hVSMCs هي أكثر أنواع الخلايا وفرة في نظام القلب والأوعية الدموية وفاعل رئيسي في تطوير VC. التكلس الناجم عن hVSMC في المختبر هو نموذج مرض يستخدم على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب والأوعية الدموية16,17. ومع ذلك ، فإن معظم بروتوكولات الكشف عن التكلس في المختبر تستخدم قياسات نقطة النهاية التي يمكن أن تحد من الحصول على البيانات ، وتتطلب استخداما أكبر للمواد الخلوية ، ويمكن أن تبطئ البحث. تشمل الطرق الشائعة للكشف عن تكلس hVSMC في المختبر مقايسة o-cresolphthalein ، والتي تقيس ترسب الكالسيوم المذاب مقابل البروتين الكلي وتتطلب تحلل الخلية18. أيضا ، يتم استخدام تلطيخ Alizarin الأحمر ، والذي يرتبط مباشرة برواسب الكالسيوم على الخلايا الثابتة أو الأنسجة19. لدراسة تكلس hVSMC بمرور الوقت مع o-cresolphthalein أو Alizarin Red يتطلب دفعات من النسخ المتماثلة لكل نقطة زمنية ، مما يزيد من الطلب على المواد البيولوجية ، وبالتالي يزيد من فرصة التباين.

في هذه الورقة ، نقوم بتفصيل طريقة تطبيق مقايسة جديدة تستخدم hVSMCs مع مسبار تصوير فلوري لتحديد تقدم VC في المختبر بالإضافة إلى العمل كاختبار تكلس فريد في المرحلة النهائية. لقد أثبتنا سابقا أن هذا الفحص يمكن مقارنته مباشرة بطريقتي o-cresolphthalein و Alizarin Red ويمكن استخدامه للتمييز بين ظروف الاستزراع المختلفة20. بالإضافة إلى القياسات في الوقت الفعلي ، يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد ميل عينات المصل أو البلازما كعلامة بديلة لتطوير VC السريري20. سيساعد هذا في تطبيق الاستراتيجيات البيولوجية لعلوم القلب والأوعية الدموية ونمذجة الأمراض. قد يكون التطبيق الآخر للمقايسة بمثابة نظام BioHybrid متعدي لتقييم شدة VC أو التقدم من مكونات الدم مثل المصل أو البلازما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بذر الخلايا وصيانتها وتحريض التكلس

  1. لزراعة الخلايا الأولية ، استخدم خزانة تدفق الهواء الصفحي والقفازات والمعدات المعقمة. تطهير اليدين ومساحة العمل قبل وبعد القيام بأي عمل. تعامل مع جميع الخلايا الأولية ووسائط المزرعة كخطر بيولوجي محتمل ، ما لم يثبت خلاف ذلك. يفضل الأوتوكلاف فائض الخلايا والوسائط قبل التخلص منها. لا تقم بتعطيل كيميائيا والأوتوكلاف لأن هذا سيحرر الأبخرة السامة.
  2. ثقافة hVSMC على لوحات زراعة الخلايا غير المطلية.
  3. الحفاظ بشكل روتيني على hVSMC في وسط نمو يتكون من وسط M199 مكمل بنسبة 10٪ -20٪ FBS و 1٪ Pen / Strep واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  4. تقسيم الخلايا عند التقاء 70٪ -90٪.
    1. للتقسيم ، اغسل hVSMCs 2x باستخدام PBS. يضاف التربسين ويحتضن لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق من انفصال الخلايا تحت المجهر.
    2. تثبيط تفاعل التربسين عن طريق إضافة وسط يحتوي على المصل. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 4 دقائق وأعد تعليق الحبيبات في وسط الصيانة. تتبع hVSMCs مخطط تقسيم 1: 2.
  5. لبدء تجربة التكلس ، قم بإعداد الخلايا باتباع التعليمات الخاصة بالانقسام (الخطوة 1.4.1). عند إعادة التعليق ، عد الخلايا والبذور في صفيحة من 48 بئرا بكثافة 10-15 × 103 خلايا / سم2. بذر الخلايا مع تجنب استخدام الآبار الخارجية ، على النحو الموصى به في الشكل التكميلي 1.
  6. دع الخلايا تلتصق وتتعافى لمدة 24 ساعة (بين عشية وضحاها) أثناء الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. اغسل الخلايا برفق 2x باستخدام PBS ، واستنشق بعناية جميع PBS المتبقيةبعد الغسيل الثاني .
  8. أضف وسط التكلس برفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. يجب أن يحتوي وسط التكلس على محفز تكلس ، المسمى بالفلورسنت fetuin-A (على سبيل المثال ، مع بروتين الفلورسنت الأحمر [RFP]) (1 ميكروغرام / مل) ، و HOECHST 33342 (0.1 ميكروغرام / مل) صبغة نووية أو صبغة نووية فلورية حية مماثلة. لا تستخدم DAPI ، لأن هذا غير منفذ.
  9. تحقق يوميا باستخدام المجهر الضوئي حتى يحدث التكلس.
    ملاحظة: للحصول على ملاحظات حول ثقافة الخلايا وصيانة hVMSCs ، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1.

2. كشف التكلس عن طريق التصوير

ملاحظة: يوفر البروتوكول التالي الخطوات العامة الواجب اتخاذها في الإعداد والتصوير وتحليل البيانات. يتم توفير لقطات شاشة تدعم التعليمات الخاصة بكل خطوة باستخدام منصة تصوير آلية وبرنامج تحليل الصور المقابل (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) في الملف التكميلي 2 والملف التكميلي 3. يمكن استخدام أدوات التصوير وأدوات معالجة الصور الأخرى لتطبيق هذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن التصوير المتكرر في نفس الموقع في كل بئر أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات ذات مغزى. يعد إنشاء بروتوكول لتكلس الصور وإعادة استخدامها في كل خطوة تصوير أمرا ضروريا للحصول على نتائج قابلة للتكرار. في المرة الأولى التي تطبق فيها الطريقة ، اتبع الخطوات أدناه للتحضير قبل التصوير.

  1. إعداد البروتوكول
    1. افتح البرنامج، ثم حدد البروتوكولات وإنشاء جديد.
    2. حدد الإجراء وانقر فوق ضبط درجة الحرارة. في النافذة المنبثقة، اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية والتدرج على 1 درجة مئوية، وانقر فوق موافق. حدد نوع اللوحة التي تختارها من القائمة المنسدلة. أضف خطوة التصوير بالنقر فوق صورة. حدد الصورة المعكوسة، وانقر موافق.
    3. أضف ثلاث قنوات تصوير واضبطها على DAPI (377 ، 447 نانومتر) ، RFP (531 ، 593 نانومتر) ، و brightfield. ضع علامة في مربع المونتاج وقم بتعيين الرقم المطلوب وموقع الصور. 2 × 2 للوحة 48 بئر هو خيار شائع. قم بتغيير التداخل لتمثيل تغطية أفضل لكل بئر. حدد الآبار التي سيتم تصويرها. سيتم فتح نافذة جديدة حيث يمكن اختيار الآبار ذات الأهمية.
    4. انقر فوق خيارات التركيز لتعيين وضع التركيز البؤري. سيتم فتح نافذة جديدة. قم بتعيين كل قناة على حدة. عادة ، يتم تركيز الآبار تلقائيا على قناة "DAPI". اضبط جميع القنوات الأخرى على ارتفاع بؤري ثابت من القناة الأولى وقم بتعيينها بالنقر فوق موافق. أغلق النافذة.
    5. ابدأ خطوات تقليل البيانات التي تم إعدادها مسبقا بالنقر فوق تقليل البيانات وحدد المعالجة المسبقة للصورة. يؤدي إعداد هذه الخطوة إلى تقليل خلفية التألق. اقبل الإعدادات الافتراضية عن طريق تحديد موافق. سيتم إنشاء مجموعة جديدة من الصور مع البادئة "TSF". سيتم الاحتفاظ بالصور الأصلية.
    6. قم بإعداد خطوة لحساب عدد الخلايا عن طريق تحديد التحليل الخلوي. حدد صور TSF DAPI من القائمة المنسدلة القناة . قم بتعيين مزيد من التفاصيل بعد إجراء التصوير. يمكن أيضا اعتبار هذه الخطوة تقليل البيانات ؛ تأكد دائما من الاحتفاظ بالصور الأصلية.
    7. قم بإعداد تحليل إشارة RFP (التكلس) عن طريق تحديد الإحصائيات. في النافذة المنبثقة ، قم بتسمية الخطوة وحدد TSF RFP كقناة الإدخال. ضع علامة في المربعين القيمة العليا والقيمة الأقل. ضع علامة في المربع الخاص بالمساحة الإجمالية في القائمة السفلية. حدد لا شيء في عمود تأثير اللون. في النافذة المنبثقة ، انقر فوق مخصص وحدد مربع الخلفية. سيؤدي هذا إلى ترميز النتائج من منخفض إلى مرتفع لسهولة التقييم. اضغط على موافق.
    8. للحصول على قراءة عادلة ، قم بتطبيع إشارة RFP لكل خلية. عند القيام بذلك ، يتم تقسيم المساحة الإجمالية لكل خلية. لإعداد هذه الخطوة، اضغط على النسبة على الجانب الأيسر. في النافذة المنبثقة، حدد لإدخال البيانات 1 تحديد كمية طلب تقديم العروض: المساحة الإجمالية من القائمة المنسدلة. حدد كذلك عدد الخلايا كإدخال بيانات 2.
    9. أخيرا ، حدد اسم مجموعة بيانات جديدة واضغط على موافق وموافق مرة أخرى. حدد تأثير اللون كما هو موضح سابقا. في الزاوية العلوية اليمنى، حدد ملف واحفظ الملف كبروتوكول (نوع ملف .prt).
  2. يوميا بعد حدوث التكلس الأول
    1. لكل نقطة زمنية ، كرر هذه الخطوات. في برنامج بدء التشغيل ، اضغط على القراءة الآن والبروتوكول الحالي .... حدد البروتوكول الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. سيطلب البرنامج حفظ التجربة. يمكن القيام بذلك في هذه الخطوة ولكن أيضا في أي خطوة لاحقة يدويا بالنقر فوق حفظ زر في الجزء العلوي الأيسر.
    2. ستطلب نافذة منبثقة الانتظار حتى يسخن النظام. قم بتشغيل وحدة التحكم في غاز CO2 واضبطها على 5٪.
    3. بمجرد وصول النظام إلى درجة الحرارة المحددة ، ستظهر مطالبة لإدخال لوحة وقراءتها. اضغط على إلغاء. هذا لأنه ، لكل نقطة زمنية ، يجب ضبط تعرض كل فلوروكروم بشكل فردي.
    4. نقل اللوحة من الحاضنة إلى جهاز التصوير في صندوق آمن يقاوم الكسر والانسكاب ويتماشى مع لوائح السلامة البيولوجية المحلية لنقل الخلايا الحية ، في حالة وقوع حادث. ضع اللوحة في قارئ اللوحة.
    5. بعد الإلغاء ، انقر فوق إجراء. في النافذة المنبثقة، حدد خطوة التصوير المضبوطة مسبقا. اضبط التركيز والتعرض على قناة DAPI أولا. ألغ تحديد مربع التعرض التلقائي في جميع القنوات. ثم ، انقر فوق رمز المجهر بجوار قناة DAPI . سيتم فتح نافذة جديدة.
    6. حدد البئر للتركيز عليه. استخدم بئرا ذات تكلس متوسط إلى مرتفع لهذه الخطوة. إذا كانت الإشارة مرئية بالفعل ، فانقر أولا فوق التركيز التلقائي ثم التعرض التلقائي. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم أولا بزيادة التعرض وكرر التركيز التلقائي والتعرض التلقائي. إذا رغبت في ذلك ، يمكن ضبط التعرض يدويا عن طريق تحديد القائمة المنسدلة للتعرض. تحقق من الإعدادات على آبار متعددة. بمجرد الرضا ، احفظ الإعدادات.
    7. اضبط التعرض بنفس الطريقة لجميع القنوات.
      تنبيه: لا تركز على القنوات الأخرى. اضبط التعرض فقط. يجب أن يكون التركيز العادي هو نفسه لجميع القنوات.
    8. أغلق نافذة الإجراء. حدد الزر الأخضر "اقرأ الآن " في شريط المهام العلوي. احفظ التجربة كما هو موضح في البرنامج.
      ملاحظة: سيقوم البرنامج الآن تلقائيا بقراءة جميع الآبار المحددة في الإعدادات المحددة.

3. تحليل البيانات

ملاحظة: للحصول على لقطات شاشة مفصلة حول كيفية إجراء تحليل البيانات باستخدام منصة تصوير آلية وبرنامج تحليل الصور المقابل (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 4. في حالة استخدام أدوات تصوير بديلة أو برنامج تحليل ، يجب تصدير الصور ومعالجتها على دفعات لضمان ضبط التعرض أو عتبة التألق أو الكثافة بالتساوي لجميع الصور في مجموعة بيانات مقارنة.

  1. بينما يقرأ النظام اللوحة ، تتم معالجة جميع الصور تلقائيا في الخلفية. اضبط إعدادات عدد الخلايا عن طريق تحديد صور TSF DAPI لعرضها. حدد البئر المفضل بالنقر المزدوج. ستظهر نافذة جديدة. حدد إحدى الصور.
  2. حدد علامة التبويب تحليل . في النافذة المنبثقة، حدد التحليل الخلوي: عدد الخلايا. انقر فوق موافق. قم بإلغاء تحديد قنوات RFP و brightfield. ضع علامة في المربع تمييز الكائنات .
  3. انقر فوق خيارات لفتح القائمة. اضبط عتبة الحجم والشدة لتشمل جميع النوى مع استبعاد الحطام. انقر فوق موافق. انقر فوق تطبيق التغييرات في أسفل اليسار لنقل الإعدادات أيضا إلى جميع الصور الأخرى.
  4. بطريقة مماثلة كما كان من قبل ، حدد بئرا وصورة بكمية متوسطة إلى عالية من التكلس لضبط نسبة الإشارة إلى الضوضاء بشكل أفضل ؛ انقر فوق علامة التبويب تحليل في قائمة المهام.
    1. هذه المرة حدد إحصائيات الصور. قم بإلغاء تحديد DAPI وقناة برايتفيلد. انقر فوق خيارات لفتح القائمة. ضع علامة في المربع القيم المتطرفة للعتبة. اضبط القيم العلوية والسفلية للعتبة. احسب الإشارة فقط إذا كانت فوق الخلفية واستبعد إذا كان هناك حطام / قطع أثرية.
    2. لتعيين قيمة عتبة غير ذاتية للإشارة فوق الخلفية ، حدد أداة الخط من شريط المهام. ستظهر نافذة. ارسم خطا عبر رقعة من الإشارة ، ولكن تأكد أيضا من تضمين منطقة من الخلفية.
      ملاحظة: سيظهر رسم بياني في النافذة المنبثقة، يعرض قمة تمثل الإشارة فوق خط الخلفية. تمثل قيمة ارتفاع الذروة 25٪ الحد الموصى به. يوصى أيضا بقياس تصحيحات إشارة متعددة لضمان اختيار العتبة الصحيحة. أثناء اختيار بقع الإشارة ، قد يؤدي تحديد المناطق ذات قوة الإشارة العالية جدا إلى عتبة تهمل الإشارات المتوسطة أو المنخفضة. لذلك ، يوصى بتحديد بقع ذات إشارة متوسطة إلى منخفضة فوق الخلفية. يتم عرض أمثلة على الحدود العالية جدا والمنخفضة جدا والدقيقة في الملف التكميلي 4.
    3. بمجرد الرضا ، انقر فوق " موافق " و " تطبيق التغييرات" لنقل الإعدادات إلى جميع الآبار الأخرى. تحقق مما إذا تم تحديد العتبة بدقة في الآبار الأخرى.
  5. بمجرد تعيين عدد الخلايا وعتبات طلب تقديم العروض ، قم بتصدير البيانات. حدد لوحة الاهتمام. في القائمة المنسدلة ، يمكن تحديد معلمات متعددة للتصدير. قد يكون عدد الخلايا ومنطقة RFP و "المنطقة / الخلية" ذات صلة بالمقياس المستخدم للمقارنة بين المجموعات. انقر فوق الزر Excel بجوار القائمة المنسدلة لتصدير البيانات مباشرة إلى جدول بيانات.
    ملاحظة: في القائمة المنسدلة ، يمكن الآن تحديد القيم المحسوبة لعدد الخلايا ، والمساحة الإجمالية لإشارة RFP (التي تعكس منطقة التكلس) ، بالإضافة إلى النسبة الطبيعية للمساحة الإجمالية لإشارة RFP لكل خلية بشكل فردي وتصديرها إلى جدول بيانات. اعرض النتائج كنسبة المساحة الإجمالية لإشارة RFP لكل خلية وتصورها (على سبيل المثال ، الرسوم البيانية الشريطية). قم بتطبيق اختبار t للطالب غير المزاوج لمقارنة مجموعتين أو ANOVA غير المزاوج لمقارنة مجموعات مختلفة في نفس النقطة الزمنية. قد تتطلب مقارنة نفس المجموعة في نقاط زمنية مختلفة تحليلا إحصائيا مزدوجا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تتضمن النتيجة صورا أصلية للنوى الملطخة ب HOECHST ، والتكلس المسمى RFP ، وصور برايتفيلد. يمكن الكشف عن مراحل مختلفة من التكلس تتراوح من منخفضة (الشكل 2) إلى عالية (الشكل 3) وتحليلها. يمكن عادة رصد التكلس على شكل بقع سوداء باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 2D والشكل 3B ، تشير الأسهم إلى التكلس) ، وهي مفيدة للتقييم الأولي وتحديد وقت بدء التصوير. لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، يجب تحليل صور RFP المعالجة لتحديد التكلس (الشكل 2F والشكل 3D ، تشير الأسهم إلى التكلس). أخيرا ، يمكن تقديم البيانات كرسم بياني شريطي يقارن بين شرطين أو أكثر في نقطة زمنية واحدة ، مصحوبة بصور تمثيلية (الشكل 4 أ ، ب ، ج). يجب عرض البيانات بشكل طبيعي مع عدد الخلايا (على سبيل المثال ، كمنطقة تكلس لكل خلية). يمكن أيضا عرض البيانات كبيانات سلاسل زمنية تظهر نفس الحالة في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 4D).

Figure 1
الشكل 1: ملخص مرئي يلخص خطوات الكشف عن التكلس شبه الآلي وتحليله. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مثال على التكلس في المرحلة المبكرة . (أ) يمكن عرض صورة التراكب وتحليلها ك (ب) DAPI منفصلة (نوى) ، (ج) RFP (تكلس) ، و (د) صور برايتفيلد. (ه) يتم تحديد النوى بواسطة البرنامج ويمكن تمييزها كدوائر صفراء لضبط الإعدادات. (و) لتحليل إشارة طلب تقديم العروض ، تتم معالجة الصور مسبقا لتقليل إشارة الخلفية ، و (G) بعد ذلك ، يمكن تعيين عتبة لقياس الإشارة. تشير الأسهم إلى التكلس في الحقل الساطع (D) وصور RFP المحولة (F &G). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: مثال على تكلس المرحلة اللاحقة. (أ) يمكن عرض صورة التراكب وتحليلها كصور منفصلة (ب) حقل ساطع ، (ج) RFP (تكلس) ، و (ه) DAPI (نوى). (د) لتحليل إشارة طلب تقديم العروض ، تتم معالجة الصور مسبقا لتقليل إشارة الخلفية. تشير الأسهم إلى التكلس في (B) برايتفيلد و (د) صور RFP المحولة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: مقارنة تمثيلية بين التكلس المنخفض والعالي ل hVSMC بعد 14 يوما في الثقافة مع وسط التكلس. بشكل عام ، قد يتم عرض البيانات كرسم بياني شريطي وتحليلها باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن. صور تمثيلية ل (أ) تكلس منخفض و (ب) تكلس عالي. تعكس الإشارة الحمراء (RFP) التكلس ، وتعرض الإشارة الزرقاء (HOECHST) النوى. (ج) التكلس المقدم كإشارة إيجابية للجنين A-RFP (المساحة الإجمالية) لكل خلية. د: مثال على مقايسة التكلس المقاسة بمرور الزمن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: مثال على مجموعة من الآبار المستخدمة في تجربة التكلس مع hVSMCs. لا يتم استخدام الحلقة الخارجية للآبار لتجربة التكلس ولكنها مملوءة بالسائل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: ملاحظات حول زراعة الخلايا وصيانة hVMSC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: بروتوكول التصوير الآلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: بروتوكول تحليل الصور. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: بروتوكول تحليل البيانات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المخطوطة ، نصف طريقة شبه آلية لتحديد التكلس في المختبر . لهذه الطريقة ، يجب تحسين ثلاث خطوات حاسمة لتكلس hVSMC. أولا ، الكثافة الخلوية أمر بالغ الأهمية لتطوير تكلس hVSMC. ستؤدي الكثافات المنخفضة ل hVSMCs إلى تكلس بطيء أو معدوم وموت الخلايا بسبب عدم وجود اتصال من خلية إلى خلية والإجهاد الناجم في ظل ظروف التكلس21. تؤدي الكثافة الخلوية العالية إلى الإفراط في الالتقاء ، وبعد ذلك تصبح الخلايا شيخوخة22 ويتوقف تطور التكلس. من الأهمية بمكان زرع ما يقرب من 70٪ من التقاء في لوحة البئر التي سيتم استخدامها لتطوير التكلس اللاحق ، مما يضمن القدرة التكاثرية والتوصيلات الخلوية ل hVSMCs.

ثانيا ، تتطلب وسائط زراعة الخلايا التي سيتم استخدامها لتحريض التكلس التحسين. ضمن أبحاث تكلس الأوعية الدموية ، تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الحالات وتركيبات الوسائط لتكلس hVSMCs23,24. نعتقد أن هذه الطريقة مناسبة للكشف عن جميع أنواع التكلس بوساطة المختبر ، وقد تم استخدامها للكشف عن رواسب الكالسيوم أو الفوسفات أو فوسفات الكالسيوم المحفزة. بغض النظر عن وضع تحريض التكلس ، فإن تحسين وسائط التكلس أمر محوري. في البروتوكول المقدم ، قمنا بتحسين تحريض التكلس باستخدام M199 بتركيز إجمالي للكالسيوم يبلغ 4.5 mM Ca2+ مع 2.5٪ FBS.

أخيرا ، لوحظت اختلافات محلية في الصفائح أثناء التكلس. من الأهمية بمكان تطبيق التحميل العشوائي للنسخ الفنية المكررة لمنع تحيز العينة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تجنب تحميل ممرات الآبار الخارجية لأن هذه الآبار تتكلس دائما بسرعة أكبر في إعداد 48 بئرا. من المحتمل أن يحدث هذا بسبب عدم تنظيم الرطوبة داخل الصفيحة ، حيث يساعد عدم استخدام الآبار الخارجية وتحميل هذه الآبار بكميات كبيرة من السائل في التحكم في ذلك.

في حين أن اختبار التكلس نفسه يمكن أن يتطلب خطوات تحسين متعددة لضمان قابلية التكرار مع إعداد معين ، بمجرد تشغيل هذا يصبح مباشرا. يمكن تشغيل فحوصات التكلس في وقت واحد وبشكل متكرر في ظل الظروف المحددة دون الحاجة إلى مزيد من التحسين. يمكن أن يكون التكلس بوساطة hVSMC أمرا صعبا ويتطلب التجريب قبل تحقيق قوة المقايسات. يجب أن يكون الباحث قادرا على تحديد التوقيت الأمثل قبل بدء التصوير المنتظم ، والذي قد يستغرق ما يصل إلى 1 أسبوع. يمكن وضع جدول تصوير ثابت من بداية التجربة ، على الرغم من أن هذا قد ينتج العديد من الصور بدون قراءات تفاضلية ، ويستخدم كمية كبيرة نسبيا من تخزين البيانات للصور ، ويستغرق وقتا طويلا في التحليل.

الإجراء الموضح في هذا البروتوكول هو إحدى الطرق لإجراء تحليل مقايسة التكلس. لأغراض أخرى ، ينبغي تعديل الإجراء وفقا لذلك. يضمن تحليلنا باستخدام منصة التصوير الآلي المشار إليها إمكانية التكاثر ، على الرغم من أنه يمكن إجراء التحليل باستخدام أي جهاز تصوير يتم التحكم فيه بالخلايا الحية ودرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون2. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين حزم البرامج التجارية المقابلة للفحص والتحليل الخلوي عالي المحتوى ، وهي مناسبة بشكل مثالي لقياس ميل التكلس بمرور الوقت. يمكن أن توفر حلول البرامج الأخرى ، مثل ImageJ المجانية ، تحليلا للصور وتحدد تطوير التكلس أيضا.

قد يكون تصوير لوحات التكلس في المرحلة المتأخرة صعبا بسبب مشكلات في التركيز البؤري التلقائي إذا واجهت الثقافة حطاما عائما ، مما يؤدي إلى تقليل عدد الصور الحادة والتكرارات. يجب تعديل تحليل الصور وفقا لذلك ، وقد تم تطوير بعض الحلول في البرنامج المستخدم في هذا البروتوكول لتحسين التحليل وتبسيطه.

يلعب عدم التجانس الخلوي دورا حاسما في القياس الكمي للتكلس في المختبر. في هذه المنصة ، نستخدم hVSMCs كمستشعرات حيوية لتطوير التكلس. تستمد hVSMCs الأولية من مختلف المانحين الذين يعانون من أمراض الأوعية الدموية الكامنة المختلفة. لذلك ، لا يزال هذا الفحص خاضعا لتقلبات عالية بسبب عدم تجانس دفعات VSMCs. الحل المحتمل هو استخدام خطوط الخلايا الخالدة أو استخدام hVSMCs المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات.

قيد آخر هو أن طريقة القياس الكمي لا تزال حساسة للذاتية. تنشأ الذاتية في مقايسات التكلس بسبب فحوصات نقطة النهاية ، والتي كانت متاحة فقط حتى وقت قريب. يجب على الباحثين أن يقرروا متى يوقفون التجربة ويقيسون التكلس ، مما يزيد من ذاتية الفحص. نعتقد أن الطريقة المقدمة في هذه المخطوطة متفوقة حيث نقيس بمرور الوقت ويمكننا مقارنة تطور التكلس في فترة معينة. مرتبطا بهذا ، يجب ضبط إعداد الإضاءة لكل نقطة زمنية على حدة بسبب انخفاض الإشارة بمرور الوقت. ونتيجة لذلك ، لا يزال مقدار الإشارة الممثلة في الصورة يتأثر برأي الفرد. من الأهمية بمكان أن يتم إجراء الإضاءة بأعلى نسب الإشارة إلى الضوضاء بحيث يمكن إجراء تحليل ما بعد الصورة بموضوعية قدر الإمكان.

على الرغم من أننا نرى ذاتية هذا الفحص كقيد ، إلا أننا نعتقد أنه متفوق على طرق التكلس الأخرى في المختبر . على عكس الطرق الحالية ، فإن اختبار التكلس شبه الآلي لدينا يتمتع بميزة أنه يمكن تحليل الصور بشكل مجهول ، وبالتالي توفير رأي أعمى مستقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحليل الصور في مرحلة لاحقة بنفس الإعدادات المحددة عبر مجموعة البيانات ، وبالتالي تقليل الذاتية.

تعتمد الطرق الحالية لتحديد التكلس على قياسات نقطة النهاية أو تفتقر إلى مكون الأوعية الدموية25،26،27. داخل العيادة ، تعتبر أدوات مثل التصوير المقطعي المحوسب والموجات فوق الصوتية داخل الأوعية والتصوير بالرنين المغناطيسي باهظة الثمن وتشكل عبئا على المرضى. أثبتت أبحاث العلامات الحيوية استخدامها ولكنها لا تعكس عبء التكلس للمرضى. نعتقد أن هذا الفحص شبه الآلي لا يستخدم علامة حيوية واحدة فحسب ، بل يستخدم مجموعة من المكونات المتداولة ، مما يعكس حالة القلب والأوعية الدموية للمريض. يمكن استخدام هذا لقياس استجابة التكلس كمستشعر حيوي. تشمل التطبيقات الإضافية المحتملة للطريقة الموصوفة فحص مصل المرضى لتطوير التكلس في المختبر كعلامة بديلة للتطوير الشخصي لتكلس الأوعية الدموية. أثبتت المنصة حساسيتها تجاه غسيل الكلى وعلاج فيتامين K ، بالإضافة إلى كل من الأمراض الأيضية وغير الأيضية المرتبطة بالمرضى الذين يعانون من ضعف حالة القلب والأوعية الدموية والتشخيص20. نظرا لأن مبدأ الفحص يعتمد على اكتشاف بلورات الكالسيوم ، فإننا نفترض أنه قد يكون ذا صلة أيضا في مجالات بحثية أخرى حيث قد يكون التمعدن ذا صلة ، مثل هشاشة العظام أو هشاشة العظام أو طب تجديد العظام أو أبحاث الأسنان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

حصل ليون شورجرز على منح مؤسسية من باير وبوهرنجر إنجلهايم وناتوفارما وآي دي إس. يمتلك ليون شورجرز أسهما في ملف التخثر. ويلي جانين-ديشينت هو مؤسس مشارك ومساهم في CALCISCON AG.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل برامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابعة للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوفسكا كوري رقم 722609 و 764474 ، NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). تم دعم هذا البحث من قبل BioSPX. تلقت WJ-D تمويلا من Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) TRR219-Project ID 322900939 ومعرف المشروع 403041552

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium chloride, 93%, anhydrous Thermo Fisher Scientific 349615000
Costar 6-well Clear TC-treated well plates Corning 3516
Cytation 3 System BioTek, Abcoude, The Netherlands
Fetal Bovine Serum Merck F7524-100ML
Fetuin-A-Alexa Fluor-546 Prepared in-house
Gen5 Software v3.10 BioTek
Gibco Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059
Hoechst 33342, Trihydrochloride Thermo Fisher Scientific H3570
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011044
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Fisher Scientific 25300062

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
  2. Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
  3. Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
  4. Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
  5. Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
  6. Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
  7. Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
  8. Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
  9. Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
  10. Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
  11. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
  12. Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
  13. Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
  14. Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
  15. Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
  16. Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
  17. Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
  18. Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
  19. Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
  20. Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
  21. Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
  22. Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
  23. Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
  24. Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
  25. Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
  26. Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
  27. Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 184 ،
طريقة بيولوجية شبه آلية وقابلة للتكرار لتحديد ترسب الكالسيوم <em>في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaminon, A. M. G., Rapp, N.,… More

Jaminon, A. M. G., Rapp, N., Akbulut, A. C., Dzhanaev, R., Reutelingsperger, C. P., Jahnen-Dechent, W., Schurgers, L. J. A Semi-Automated and Reproducible Biological-Based Method to Quantify Calcium Deposition In Vitro. J. Vis. Exp. (184), e64029, doi:10.3791/64029 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter