Summary
Kardiyovasküler hastalık dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. Vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler morbidite ve mortalite yüküne önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, floresan görüntüleme ile vasküler düz kas hücresi aracılı kalsiyum çökelmesini in vitro olarak ölçmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Vasküler kalsifikasyon, inflamasyon, hücresel fenotipteki değişiklikler, hücre ölümü ve kalsifikasyon inhibitörlerinin yokluğu da dahil olmak üzere bir dizi dejeneratif patolojiyi içerir ve bu da eşzamanlı olarak damar elastikiyeti ve fonksiyon kaybına yol açar. Vasküler kalsifikasyon, kronik böbrek hastalığı, diabetes mellitus ve ateroskleroz gibi birçok patolojide morbidite ve mortaliteye önemli bir katkıda bulunmaktadır. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için mevcut araştırma modelleri sınırlıdır ve sadece kalsifikasyon gelişiminin in vivo geç aşamalarında uygulanabilir. Vasküler kalsifikasyonu incelemek için in vitro araçlar, son nokta ölçümlerini kullanır, biyolojik materyal üzerindeki talepleri arttırır ve araştırma çalışmalarına değişkenliğin getirilmesini riske atar. İnsan vasküler düz kas hücreleri üzerinde in vitro kalsifikasyon gelişimine bağlanan ve in vitro kalsifikasyonun gerçek zamanlı gelişimini belirleyen yeni bir floresan etiketli probun uygulanmasını gösteriyoruz. Bu protokolde, potansiyel translasyonel uygulamaları olan hastalık modellemesinde yeni bir araç olan yeni geliştirilen kalsifikasyon testimizin uygulanmasını açıklıyoruz. Bu tahlilin, kemik, kıkırdak veya diş araştırmalarındaki uygulamalar da dahil olmak üzere daha geniş bir mineral biriktirme araştırması yelpazesinde alakalı olmasını öngörüyoruz.
Introduction
Vasküler kalsifikasyon (VC) kardiyovasküler morbidite ve mortalite için bağımsız bir risk faktörüdür 1,2,3. Uzun zamandır ektopik mineral birikiminin pasif bir kimyasal süreci olarak kabul edilirken, şimdi hastalığın itici gücü olarak aktif vasküler düz kas hücreleri (hVSMC) dahil olmak üzere çeşitli hücrelerin aktif katkısını içeren değiştirilebilir bir doku iyileşme yanıtı ortaya çıkmaktadır 4,5. İn vivo VC, aterosklerotik yükündeğerlendirilmesi olarak çok kesitli BT taramaları ile ölçülebilir 6,7,8. Şu anda, VC şiddetinin kardiyovasküler hastalık, tip II diyabet, kronik böbrek hastalığı ve yaşlanma 9,10,11,12,13,14,15'te bir risk faktörü olarak kabul edildiği bir paradigma değişimi devam etmektedir.
hVSMC'ler kardiyovasküler sistemde en bol bulunan hücre tipidir ve VC gelişiminde başlıca aktördür. İn vitro hVSMC kaynaklı kalsifikasyon, kardiyovasküler hastalıkları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir hastalık modelidir16,17. Bununla birlikte, in vitro kalsifikasyonun tespiti için çoğu protokol, veri toplamayı sınırlayabilen, hücresel materyalin daha fazla kullanılmasını gerektiren ve araştırmayı yavaşlatabilen son nokta ölçümlerini kullanır. İn vitro hVSMC kalsifikasyonunun tespiti için yaygın yöntemler, toplam proteine karşı çözünür kalsiyum birikimini ölçen ve hücre lizisi18 gerektiren o-cresolphthalein testini içerir. Ayrıca, sabit hücreler veya doku19 üzerindeki kalsiyum birikintilerine doğrudan bağlanan Alizarin Kırmızı boyama kullanılır. Zaman içinde hVSMC kalsifikasyonunu o-kresolftalin veya Alizarin Kırmızısı ile incelemek için, zaman noktası başına replika partileri gerekir, bu da biyolojik materyale olan talebi arttırır ve sırayla değişkenlik şansını arttırır.
Bu yazıda, in vitro VC progresyonunu belirlemek ve tekil bir son aşama kalsifikasyon testi olarak işlev görmek için floresan görüntüleme probu ile hVSMC'leri kullanan yeni bir tahlilin uygulama yöntemini detaylandırıyoruz. Daha önce bu tahlilin o-cresolphthalein ve Alizarin Red yöntemleriyle doğrudan karşılaştırılabilir olduğunu ve değişen kültür koşullarını ayırt etmek için kullanılabileceğini göstermiştik20. Gerçek zamanlı ölçümlere ek olarak, bu tahlil, klinik VC gelişimi için vekil bir belirteç olarak serum veya plazma örneklerinin eğilimini belirlemek için kullanılabilir20. Bu, kardiyovasküler bilimlerin biyolojik stratejilerinin ve hastalık modellemesinin uygulanmasına yardımcı olacaktır. Tahlilin başka bir uygulaması, VC şiddetini veya serum veya plazma gibi kan bileşenlerinden ilerlemeyi değerlendirmek için translasyonel bir BioHybrid sistemi olarak olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre tohumlama, bakım ve kalsifikasyon indüksiyonu
- Birincil hücreleri kültürlemek için laminer hava akış dolabı, eldivenler ve steril ekipman kullanın. Herhangi bir işi yapmadan önce ve sonra ellerinizi ve çalışma alanını dezenfekte edin. Aksi kanıtlanmadıkça, tüm birincil hücrelere ve kültür ortamına potansiyel bir biyolojik tehlike olarak davranın. Tercihen imha edilmeden önce fazla hücreleri ve ortamları otoklav eder. Kimyasal olarak inaktive etmeyin ve otoklav yapmayın, çünkü bu toksik dumanları serbest bırakacaktır.
- Kaplamasız hücre kültürü plakaları üzerinde kültür hVSMC.
- hVSMC'yi% 10-20 FBS ve% 1 Pen / Strep ile desteklenmiş M199 ortamından oluşan büyüme ortamında rutin olarak koruyun ve 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Hücreleri% 70 -% 90 oranında kesin.
- Bölmek için hVSMC'leri 2 kat PBS ile yıkayın. Tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 2-5 dakika kuluçkaya yatırın. Mikroskop altında hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.
- Serum içeren bir ortam ekleyerek tripsin reaksiyonunu inhibe edin. Hücreleri 4 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj edin ve peleti bakım ortamında yeniden askıya alın. hVSMC'ler 1:2 bölme şemasını izler.
- Kalsifikasyon deneyini başlatmak için, hücreleri bölünme talimatlarını izleyerek hazırlayın (Adım 1.4.1). Yeniden süspansiyon üzerine, hücreleri ve tohumu 10-15 x 103 hücre /cm2 yoğunlukta 48 delikli bir plakaya sayın. Ek Şekil 1'de önerildiği gibi, dış kuyucukların kullanımından kaçınarak hücreleri tohumlayın.
- Hücrelerin 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübe ederken24 saat (gecede) yapışmasına ve iyileşmesine izin verin.
- Hücreleri PBS ile 2 kat nazikçe yıkayın, 2. yıkamadan sonra kalan tüm PBS'yi dikkatliceaspire edin.
- Yavaşça kireçlenme ortamı ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO 2'de daha fazla inkübeedin. Kalsifikasyon ortamı, floresan olarak etiketlenmiş fetuin-A (örneğin, kırmızı floresan protein [RFP]) (1 μg / mL) ve HOECHST 33342 (0.1 μg / mL) nükleer lekesi veya benzeri canlı floresan nükleer boyası içeren bir kalsifikasyon uyaranı içermelidir. Geçirgen olmadığından DAPI kullanmayın.
- Kalsifikasyon meydana gelene kadar her gün bir ışık mikroskobu ile kontrol edin.
NOT: hVMSC'lerin hücre kültürü ve bakımı hakkında notlar için lütfen Ek Dosya 1'e bakın.
2. Görüntüleme yoluyla kireçlenme tespiti
NOT: Aşağıdaki protokol, hazırlama, görüntüleme ve veri analizinde atılacak genel adımları sağlar. Otomatik bir görüntüleme platformu ve ilgili görüntü analiz yazılımı (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın) kullanılarak her adımın talimatlarını destekleyen ekran görüntüleri Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3'te verilmiştir. Bu protokolü uygulamak için diğer görüntüleme araçları ve görüntü işleme araçları kullanılabilir. Bununla birlikte, her kuyuda aynı yerde tekrarlanan görüntüleme, anlamlı veri toplama için çok önemlidir. Görüntü kalsifikasyonu ve her görüntüleme adımında yeniden kullanım için bir protokol oluşturmak, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Yöntemi ilk kez uygularken, görüntülemeden önce hazırlanmak için aşağıdaki adımları izleyin.
- Protokol kurulumu
- Yazılımı açın ve ardından Protokoller ve Yeni Oluştur'u seçin.
- Prosedür'ü seçin ve Sıcaklığı Ayarla'ya tıklayın. Açılır pencerede, sıcaklığı 37 °C'ye ve gradyanı 1 °C'ye ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Açılır menüden tercih ettiğiniz plaka türünü seçin. Görüntü'yü tıklatarak görüntüleme adımını ekleyin. Ters çevrilmiş görüntüleyiciyi seçin ve Tamam'ı tıklatın.
- Üç görüntüleme kanalı ekleyin ve bunları DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) ve parlak alan olarak ayarlayın. Montaj kutusunu işaretleyin ve görüntülerin istediğiniz sayısını ve konumunu ayarlayın. 48 kuyulu bir plaka için 2 x 2 ortak bir seçimdir. Her bir kuyucuğun daha iyi bir kapsamını temsil etmek için örtüşmeyi değiştirin. Hangi kuyucukların görüntüleneceğini seçin. İlgilenilen kuyuların seçilebileceği yeni bir pencere açılacaktır.
- Netleme modunu ayarlamak için Netleme Seçenekleri'ni tıklatın. Yeni bir pencere açılacaktır. Her kanalı ayrı ayrı ayarlayın. Genellikle, kuyular "DAPI" kanalına otomatik olarak odaklanır. Diğer tüm kanalları İlk Kanaldan Sabit Odak Yüksekliği olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatarak ayarlayın. Pencereyi kapatın.
- Veri Azaltma'yı tıklayıp Görüntü Ön İşleme'yi seçerek ön ayar veri azaltma adımlarını başlatın. Bu adımın ayarlanması floresan arka planını azaltır. Tamam'ı seçerek varsayılan ayarları kabul edin. "TSF" önekiyle yeni bir görüntü kümesi oluşturulacaktır. Orijinal görüntüler korunacaktır.
- Hücresel Analiz'i seçerek hücreleri saymak için bir adım ayarlayın. Kanal açılır menüsünden TSF DAPI görüntüleri'ni seçin. Görüntüleme yapıldıktan sonra daha fazla ayrıntı ayarlayın. Bu adım aynı zamanda veri azaltma olarak da düşünülebilir; her zaman orijinal görüntüleri sakladığınızdan emin olun.
- İstatistikler'i seçerek RFP (kireçlenme) sinyalinin analizini hazırlayın. Açılır pencerede, Adım'ı etiketleyin ve giriş kanalı olarak TSF RFP'yi seçin. Üst Değer ve Düşük Değer kutularını işaretleyin. Alt listedeki Toplam Alan kutusunu işaretleyin. Color Effect sütununda Hiçbiri'ni seçin. Açılır pencerede, Özel'i tıklayın ve Arka Plan kutusunu işaretleyin. Bu, kolay değerlendirme için sonuçları düşük-yüksek renklerle kodlayacaktır. Tamam'a basın.
- Adil bir okuma için, hücre başına RFP sinyalini normalleştirin. Bunu yaparken, toplam alan hücre başına bölünür. Bu adımı ayarlamak için sol taraftaki Oran düğmesine basın. Açılır pencerede, açılır menüden veri girişi 1 RFP Ölçümü: Toplam Alan'ı seçin. Ayrıca veri girişi olarak Hücre Sayısı 2'yi seçin.
- Son olarak, Yeni Veri Kümesi Adı seçin ve OK ve OK tuşlarına tekrar basın. Daha önce açıklandığı gibi Renk Efekti'ni seçin. Sol üst köşede Dosya'yı seçin ve dosyayı protokol (.prt dosya türü) olarak kaydedin.
- İlk kireçlenme gerçekleştikten sonra günlük
- Her zaman noktası için bu adımları yineleyin. Başlangıç yazılımında, Şimdi Oku ve Mevcut Protokol...'e basın. Önceki adımda oluşturulan protokolü seçin. Program denemeyi kaydetmeyi isteyecektir. Bu, bu adımda değil, daha sonraki herhangi bir adımda sol üstteki Kaydet düğmesine tıklayarak manuel olarak da yapılabilir.
- Bir açılır pencere, sistemin ısınmasını beklemenizi isteyecektir. CO2 gaz kontrolörünü açın ve% 5'e ayarlayın.
- Sistem ayarlanan sıcaklığa ulaştığında, bir plaka takmak ve okumak için bir istem görünecektir. İptal'e basın. Bunun nedeni, her zaman noktası için, her florokromun maruz kalmasının ayrı ayrı ayarlanması gerektiğidir.
- Plakayı inkübatörden görüntüleyiciye, kırılmaya ve dökülmeye karşı dayanıklı ve bir kaza durumunda canlı hücrelerin taşınması için yerel biyogüvenlik yönetmeliklerine uygun güvenli bir kutuda taşıyın. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
- İptal ettikten sonra, Prosedür'e tıklayın. Açılır pencerede, Önceden Ayarlanmış Görüntüleme Adımı'nı seçin. Odağı ve pozlamayı önce DAPI kanalında ayarlayın. Tüm kanallarda Otomatik Pozlama kutusunun işaretini kaldırın. Ardından, DAPI kanalının yanındaki Mikroskop simgesine tıklayın. Yeni bir pencere açılacaktır.
- Odaklanılacak kuyuyu seçin. Bu adım için orta ila yüksek kireçlenmeye sahip bir kuyu kullanın. Bir sinyal zaten görünüyorsa, önce Otomatik Netleme'yi ve ardından Otomatik pozlamayı tıklatın. Değilse, önce pozlamayı artırın ve Otomatik Netleme ve Otomatik pozlamayı tekrarlayın. İstenirse, pozlama açılır menüsü seçilerek pozlama manuel olarak ayarlanabilir. Birden fazla kuyudaki ayarları kontrol edin. Memnun kaldıktan sonra ayarları kaydedin.
- Pozlamayı tüm kanallar için aynı şekilde ayarlayın.
DİKKAT: Diğer kanallara odaklanmayın; sadece pozlamayı ayarlayın. Netleme düzlüğü tüm kanallar için aynı olmalıdır. - Yordam penceresini kapatın. Üst görev çubuğundaki yeşil Şimdi Oku düğmesini seçin. Denemeyi yazılım tarafından belirtildiği şekilde kaydedin.
NOT: Yazılım artık seçilen ayarlarda seçilen tüm kuyucukları otomatik olarak okuyacaktır.
3. Veri analizi
NOT: Otomatik bir görüntüleme platformu ve ilgili görüntü analiz yazılımı kullanılarak veri analizinin nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin ayrıntılı ekran görüntüleri için lütfen Ek Dosya 4'e bakın. Alternatif görüntüleme cihazları veya analiz yazılımı kullanılıyorsa, görüntüler dışa aktarılmalı ve pozlamanın, floresan eşiğinin veya yoğunluğun karşılaştırmalı bir veri kümesindeki tüm görüntüler için eşit olarak ayarlanmasını sağlamak için toplu olarak işlenmelidir.
- Sistem plakayı okurken, tüm görüntüler arka planda otomatik olarak işlenir. Görüntülenecek TSF DAPI görüntüleri'ni seçerek hücre sayısı ayarlarını yapın. Çift tıklayarak istediğiniz kuyuyu seçin. Yeni bir pencere açılacaktır. Görüntülerden birini seçin.
- Analiz sekmesini seçin. Açılır pencerede Hücresel Analiz: Hücre Sayısı'nı seçin. Tamam'ı tıklatın. RFP ve parlak alan kanallarının seçimini kaldırın. Nesneleri Vurgula kutusunu işaretleyin.
- Menüyü açmak için Seçenekler'i tıklatın. Boyut ve yoğunluk eşiğini tüm çekirdekleri içerecek ancak kalıntıları hariç tutacak şekilde ayarlayın. Tamam'ı tıklatın. Ayarları diğer tüm resimlere de aktarmak için sol alttaki Değişiklikleri uygula'yı tıklayın.
- Daha önce olduğu gibi benzer şekilde, sinyal-gürültü oranını en iyi şekilde ayarlamak için orta ila yüksek miktarda kireçlenme içeren bir kuyu ve görüntü seçin; Görev menüsündeki Analiz sekmesini tıklatın.
- Bu sefer Görüntü İstatistikleri'ni seçin. DAPI ve parlak alan kanalının seçimini kaldırın. Menüyü açmak için Seçenekler'i tıklatın. Eşik Aykırı Değerleri kutusunu işaretleyin. Eşiğin üst ve alt değerlerini ayarlayın. Sinyali yalnızca arka planın üzerindeyse sayın ve enkaz / artefakt varsa hariç tutun.
- Arka planın üzerindeki sinyal için öznel olmayan bir eşik değeri ayarlamak üzere, görev çubuğundan çizgi aracını seçin. Bir pencere açılacaktır. Bir sinyal yaması boyunca bir çizgi çizin, ancak bir arka plan alanı da eklediğinizden emin olun.
NOT: Açılır pencerede, arka plan çizgisinin üzerindeki sinyali temsil eden bir tepe noktasını gösteren bir grafik görünecektir. %25 tepe yüksekliği değeri, önerilen eşiği temsil eder. Doğru eşiğin seçilmesini sağlamak için birden fazla sinyal yamasının ölçülmesi de önerilir. Sinyal yamalarını seçerken, çok yüksek sinyal gücüne sahip bölgelerin seçilmesi, orta ve/veya daha düşük sinyalleri ihmal eden bir eşikle sonuçlanabilir. Bu nedenle, arka planın üzerinde orta ila düşük sinyalli yamaların seçilmesi önerilir. Çok yüksek, çok düşük ve doğru eşiklerin örnekleri Ek Dosya 4'te gösterilmiştir. - Memnun kaldıktan sonra, tıklayın OK ve Değişiklikleri Uygula ayarları diğer tüm kuyucuklara aktarmak için. Eşiğin diğer kuyularda doğru seçilip seçilmediğini kontrol edin.
- Hücre sayısı ve RFP eşikleri ayarlandıktan sonra verileri dışarı aktarın. İlgilendiğiniz plakayı seçin. Açılır menüde, dışa aktarma için birden fazla parametre seçilebilir. İlgili olan, hücre sayısı, RFP alanı ve gruplar arasında karşılaştırma için kullanılan metrik olan "alan / hücre" olabilir. Verileri doğrudan bir elektronik tabloya dışa aktarmak için açılır menünün yanındaki Excel düğmesini tıklatın.
NOT: Açılır menüde, hücre sayısı için hesaplanan değerler, RFP sinyalinin toplam alanı (kireçlenme alanını yansıtan) ve hücre başına toplam RFP sinyali alanının normalleştirilmiş oranı artık ayrı ayrı seçilebilir ve bir elektronik tabloya aktarılabilir. Sonuçları, hücre başına toplam RFP sinyali alanının oranı olarak görüntüleyin ve görselleştirin (örneğin, çubuk grafikler). İki grubu karşılaştırmak için eşlenmemiş bir Öğrencinin t-testini veya farklı grupları aynı zaman noktasında karşılaştırmak için eşlenmemiş bir ANOVA uygulayın. Aynı grubu farklı zaman noktalarında karşılaştırmak, eşleştirilmiş istatistiksel analiz gerektirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuç, HOECHST boyalı çekirdeklerin orijinal görüntülerini, RFP etiketli kalsifikasyonu ve parlak alan görüntülerini içerir. Kalsifikasyonun düşükten (Şekil 2) yükseğe (Şekil 3) kadar değişen farklı aşamaları tespit edilebilir ve analiz edilebilir. Kalsifikasyon genellikle ışık mikroskobu kullanılarak siyah lekeler olarak tespit edilebilir (Şekil 2D ve Şekil 3B, oklar kalsifikasyonu gösterir), bu da birincil değerlendirme için ve görüntülemeye ne zaman başlanacağını belirlemek için yararlıdır. Gelişmiş sinyal-gürültü oranı için, işlenmiş RFP görüntüleri kalsifikasyonu ölçmek için analiz edilmelidir (Şekil 2F ve Şekil 3D, oklar kalsifikasyonu gösterir). Son olarak, veriler temsili görüntülerle birlikte bir zaman noktasında iki veya daha fazla koşulu karşılaştıran bir çubuk grafik olarak sunulabilir (Şekil 4A, B, C). Veriler hücre sayısına normalleştirilmiş olarak gösterilmelidir (örneğin, hücre başına kireçlenme alanı olarak). Veriler, çeşitli zaman noktalarında aynı durumu gösteren zaman serisi verileri olarak da görüntülenebilir (Şekil 4D).
Şekil 1: Yarı otomatik kireçlenme tespiti ve analizi için adımları özetleyen görsel özet. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Erken evre kireçlenme örneği. (A)Bindirme görüntüsü (B) ayrı DAPI (çekirdekler), (C) RFP (kireçlenme) ve (D) parlak alan görüntüleri olarak görüntülenebilir ve analiz edilebilir. (E) Çekirdekler yazılım tarafından tanımlanır ve ayarları yapmak için sarı daireler olarak vurgulanabilir. (F) RFP sinyalinin analizi için, arka plan sinyalini azaltmak için görüntüler önceden işlenir ve (G) daha sonra sinyali ölçmek için bir eşik ayarlanabilir. Oklar, (D) parlak alanındaki kalsifikasyonu ve (F & G) dönüştürülmüş RFP görüntülerini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Daha sonraki aşamadaki kireçlenme örneği. (A) Bindirme görüntüsü ayrı (B) parlak alan, (C) RFP (kireçlenme) ve (E) DAPI (çekirdek) görüntüleri olarak görüntülenebilir ve analiz edilebilir. (D) RFP sinyalinin analizi için, görüntüler arka plan sinyalini azaltmak için önceden işlenir. Oklar, (B) parlak alan ve (D) dönüştürülmüş RFP görüntülerindeki kireçlenmeyi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kültürde 14 gün sonra hVSMC'nin düşük ve yüksek kalsifikasyonu ile kalsifikasyon ortamı arasında temsili karşılaştırma. Genellikle, veriler bir çubuk grafik olarak görüntülenebilir ve eşleştirilmemiş Öğrencinin t-testi kullanılarak analiz edilebilir. (A) düşük kalsifikasyon ve (B) yüksek kalsifikasyonun temsili görüntüleri. Kırmızı sinyal (RFP) kireçlenmeyi yansıtır ve mavi sinyal (HOECHST) çekirdekleri görüntüler. (C) Hücre başına fetuin A-RFP pozitif sinyali (toplam alan) olarak sunulan kalsifikasyon. (D) Zaman içinde ölçülen bir kireçlenme testi örneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: hVSMC'lerle yapılan bir kireçlenme deneyi için kullanılan bir dizi kuyucuk örneği. Kuyuların dış halkası kireçlenme deneyi için kullanılmaz, sıvı ile doldurulur. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 1: hVMSC'nin hücre kültürü ve bakımı hakkında notlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2: Otomatik görüntüleme protokolü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 3: Görüntü analizi protokolü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 4: Veri analizi protokolü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, in vitro kalsifikasyon tayini için yarı otomatik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem için, hVSMC kalsifikasyonunun üç kritik adımı optimize edilmelidir. İlk olarak, hücresel yoğunluk hVSMC kalsifikasyon gelişimi için kritik öneme sahiptir. Düşük hVSMC yoğunlukları, hücreden hücreye temasın olmaması ve kalsifikasyon koşulları altında indüklenen stres nedeniyle yavaş veya hiç kalsifikasyon ve hücre ölümü ile sonuçlanacaktır21. Yüksek hücresel yoğunluklar aşırı akıcılığa neden olur, bundan sonra hücreleryaşlanan 22 olur ve kalsifikasyon gelişimi durur. Daha sonraki kireçlenme gelişimi için kullanılacak kuyu plakasında kabaca% 70 akıcılık tohumlamak, hVSMC'lerin proliferatif kapasitesini ve hücresel bağlantılarını sağlamak çok önemlidir.
İkincisi, kalsifikasyon indüksiyonu için kullanılacak hücre kültürü ortamı optimizasyon gerektirir. Vasküler kalsifikasyon araştırmalarında, çeşitli koşullar ve ortam bileşimlerinin hVSMC'leri23,24 kalsifiye ettiği bildirilmiştir. Yöntemin her türlü in vitro aracılı kalsifikasyonu tespit etmek için uygun olduğuna inanıyoruz ve kalsiyum, fosfat veya kalsiyum-fosfat uyarılmış birikintileri tespit etmek için kullanılmıştır. Kalsifikasyon indüksiyonu modu ne olursa olsun, kalsifikasyon ortamının optimizasyonu çok önemlidir. Sunulan protokolde, toplam kalsiyum konsantrasyonu 4.5 mM Ca2+ olan M199'u %2.5 FBS ile kullanarak kalsifikasyon indüksiyonunu optimize ettik.
Son olarak, kireçlenme sırasında plakalarda lokal farklılıklar gözlenmiştir. Örnek yanlılığını önlemek için teknik çoğaltmaların rastgele yüklenmesi çok önemlidir. Ek olarak, dış kuyu şeritlerinin yüklenmesinden kaçınılmalıdır, çünkü bu kuyular 48 kuyulu ayarda her zaman daha hızlı kireçlenir. Bu potansiyel olarak plaka içi nemin düzensizliğinden kaynaklanır, burada en dıştaki kuyucukları kullanmamak ve bu kuyucukları büyük miktarlarda sıvı ile yüklemek bunun kontrolüne yardımcı olur.
Kalsifikasyon testinin kendisi, belirli bir kurulumla tekrarlanabilirliği sağlamak için birden fazla optimizasyon adımı gerektirebilirken, bir kez kurulduktan ve çalıştırıldıktan sonra bu basit hale gelir. Kalsifikasyon testleri, daha fazla optimizasyona gerek kalmadan belirlenmiş koşullar altında aynı anda ve tekrar tekrar çalıştırılabilir. hVSMC aracılı kalsifikasyon zor olabilir ve tahlillerin sağlamlığı elde edilmeden önce deney yapılmasını gerektirebilir. Bir araştırmacı, 1 haftaya kadar sürebilen düzenli görüntülemeye başlamadan önce en uygun zamanlamayı belirleyebilmelidir. Deneyin başlangıcından itibaren sabit bir görüntüleme programı oluşturulabilir, ancak bu, diferansiyel okumalar olmadan birçok görüntü üretebilir, görüntüler için nispeten büyük miktarda veri depolama alanı kullanabilir ve analizde zaman alıcı olabilir.
Bu protokolde açıklanan prosedür, kalsifikasyon testinin analizini gerçekleştirmenin bir yoludur. Diğer amaçlar için, prosedür buna göre ayarlanmalıdır. Referans verilen otomatik görüntüleme platformunu kullanarak yaptığımız analiz, tekrarlanabilirliği sağlar, ancak analiz herhangi bir canlı hücre ve sıcaklık ve CO2 kontrollü görüntüleme cihazı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ek olarak, ilgili ticari yazılım paketleri, zaman içinde kireçlenme eğilimini ölçmek için ideal olan yüksek içerikli hücresel tarama ve analiz için optimize edilmiştir. Ücretsiz ImageJ gibi diğer yazılım çözümleri de görüntü analizi sağlayabilir ve kireçlenme gelişimini ölçebilir.
Geç evre kireçlenme plakalarının görüntülenmesi, kültürün yüzen döküntülerle karşılaşması durumunda otomatik odaklama ile ilgili sorunlar nedeniyle zor olabilir, bu da keskin görüntü ve replikasyon sayısının azalmasına neden olur. Görüntü analizi buna göre ayarlanmalıdır ve analizi iyileştirmek ve basitleştirmek için bu protokolde kullanılan yazılımda bazı çözümler geliştirilmiştir.
Hücresel heterojenite, in vitro kalsifikasyonun nicelleştirilmesinde çok önemli bir rol oynar. Bu platformda, kalsifikasyonun geliştirilmesi için biyosensör olarak hVSMC'leri kullanıyoruz. Primer hVSMC'ler, altta yatan farklı vasküler patolojilere sahip çeşitli donörlerden türetilir; bu nedenle, bu tahlil VSMC partilerinin heterojenliği nedeniyle hala yüksek değişkenliğe tabidir. Olası bir çözüm, ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının kullanılması veya pluripotent kök hücrelerden türetilen hVSMC'lerin kullanılmasıdır.
Diğer bir sınırlama, niceleme yönteminin hala öznelliğe duyarlı olmasıdır. Kalsifikasyon tahlillerindeki öznellik, sadece yakın zamana kadar mevcut olan son nokta tahlilleri nedeniyle ortaya çıkar. Araştırmacılar, deneyi ne zaman durduracaklarına ve kalsifikasyonu ölçeceklerine karar vermeli ve tahlilin öznelliğini arttırmalıdır. Bu yazıda tanıtılan yöntemin zaman içinde ölçtüğümüz ve belirli bir dönemdeki kireçlenme gelişimini karşılaştırabildiğimiz için üstün olduğuna inanıyoruz. Buna bağlı olarak, aydınlatma ayarının zaman içinde sinyaldeki azalma nedeniyle her zaman noktası için ayrı ayrı ayarlanması gerekir. Bu nedenle, bir resimde temsil edilen sinyal miktarı hala bir bireyin görüşü tarafından sallanır. Görüntü sonrası analizin mümkün olduğunca objektif bir şekilde yapılabilmesi için aydınlatmanın en yüksek sinyal-gürültü oranlarıyla gerçekleştirilmesi çok önemlidir.
Bu tahlilin öznelliğini bir sınırlama olarak görsek de, diğer in vitro kalsifikasyon yöntemlerinden daha üstün olduğuna inanıyoruz. Mevcut yöntemlerden farklı olarak, yarı otomatik kalsifikasyon tahlilimiz, görüntülerin anonim olarak analiz edilebilmesi avantajına sahiptir ve böylece bağımsız bir kör görüş sağlar. Ek olarak, görüntüler daha sonraki bir aşamada, bir veri kümesi boyunca aynı tanımlanmış ayarlarla analiz edilebilir, böylece öznellik azaltılabilir.
Mevcut kalsifikasyon belirleme yöntemleri son nokta ölçümlerine dayanır veya vasküler bileşen25,26,27'den yoksundur. Klinikte bilgisayarlı tomografi, intravasküler ultrasonografi, manyetik rezonans görüntüleme gibi araçlar pahalıdır ve hastalar için bir yüktür. Biyobelirteç araştırmaları kullanımını kanıtlamıştır, ancak hastaların kalsifikasyon yükünü yansıtmamaktadır. Bu yarı otomatik tahlilin sadece tek bir biyobelirteç değil, hastanın kardiyovasküler durumunu yansıtan dolaşımdaki bileşenlerin bir koleksiyonunu kullandığına inanıyoruz. Bu, bir biyosensör olarak bir kalsifikasyon tepkisini ölçmek için kullanılabilir. Tarif edilen yöntemin potansiyel diğer uygulamaları, vasküler kalsifikasyonun kişiselleştirilmiş gelişimi için vekil bir belirteç olarak hastaların in vitro kalsifikasyon gelişimi için serum taramasını içerir. Platform, diyaliz ve K vitamini tedavisine karşı duyarlılığını, ayrıca kardiyovasküler durumu ve prognozu kötü olan hastalarla bağlantılı hem metabolik hem de metabolik olmayan hastalıklara karşı hassasiyetini göstermiştir20. Tahlilin prensibi kalsiyum kristallerinin tespitine dayandığından, osteoartrit, osteoporoz, kemik rejeneratif tıbbı veya diş araştırması gibi mineralizasyonun ilgili olabileceği diğer araştırma alanlarında da geçerli olabileceğini varsayıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Leon Schurgers, Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma ve IDS'den kurumsal hibeler aldı. Leon Schurgers, Coagulation Profile'da hisselere sahiptir. Willi Jahnen-Dechent, CALCISCON AG'nin kurucu ortağı ve hissedarıdır.
Acknowledgments
Bu araştırma, Avrupa Birliği'nin Marie Sklodowska-Curie hibe anlaşması No 722609 ve 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007) kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programları tarafından finanse edilmiştir. Bu araştırma BioSPX tarafından desteklenmiştir. WJ-D, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) TRR219 proje kimliği 322900939 ve proje kimliği 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
