Summary
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. La calcification vasculaire contribue considérablement au fardeau de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. Ce protocole décrit une méthode simple pour quantifier la précipitation du calcium médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires in vitro par imagerie fluorescente.
Abstract
La calcification vasculaire implique une série de pathologies dégénératives, y compris l’inflammation, les modifications du phénotype cellulaire, la mort cellulaire et l’absence d’inhibiteurs de la calcification, qui entraînent simultanément une perte d’élasticité et de fonction des vaisseaux. La calcification vasculaire est un contributeur important à la morbidité et à la mortalité dans de nombreuses pathologies, y compris la maladie rénale chronique, le diabète sucré et l’athérosclérose. Les modèles de recherche actuels pour étudier la calcification vasculaire sont limités et ne sont viables qu’aux derniers stades du développement de la calcification in vivo. Les outils in vitro pour étudier la calcification vasculaire utilisent des mesures de point final, ce qui augmente les exigences en matière de matériel biologique et risque d’introduire de la variabilité dans les études de recherche. Nous démontrons l’application d’une nouvelle sonde marquée par fluorescence qui se lie au développement de la calcification in vitro sur les cellules musculaires lisses vasculaires humaines et détermine le développement en temps réel de la calcification in vitro . Dans ce protocole, nous décrivons l’application de notre nouveau test de calcification, un nouvel outil de modélisation des maladies qui a des applications translationnelles potentielles. Nous envisageons que ce test soit pertinent dans un spectre plus large de la recherche sur les dépôts minéraux, y compris les applications dans la recherche sur les os, le cartilage ou les dents.
Introduction
La calcification vasculaire (CV) est un facteur de risque indépendant de morbidité et de mortalité cardiovasculaires 1,2,3. Longtemps considéré comme un processus chimique passif de dépôt de minéraux ectopiques, il apparaît aujourd’hui comme une réponse de cicatrisation tissulaire modifiable impliquant la contribution active de diverses cellules, y compris les cellules musculaires lisses vasculaires activées (hVSMC) comme moteur de la maladie 4,5. In vivo La CV peut être mesurée par tomodensitométrie multicoupes comme évaluation de la charge athéroscléreuse 6,7,8. Actuellement, un changement de paradigme est en cours, dans lequel la gravité de la CV est de plus en plus reconnue comme un facteur de risque de maladie cardiovasculaire, de diabète de type II, de maladie rénale chronique et de vieillissement 9,10,11,12,13,14,15.
Les hVSMC sont le type cellulaire le plus abondant dans le système cardiovasculaire et un acteur principal dans le développement de la CV. La calcification in vitro induite par hVSMC est un modèle de maladie largement utilisé pour étudier les maladies cardiovasculaires16,17. Cependant, la plupart des protocoles de détection de la calcification in vitro utilisent des mesures de point final qui peuvent limiter l’acquisition de données, nécessitent une plus grande utilisation de matériel cellulaire et peuvent ralentir la recherche. Les méthodes courantes de détection de la calcification hVSMC in vitro comprennent le test o-crésolphtaléine, qui mesure le dépôt de calcium solubilisé par rapport aux protéines totales et nécessite une lyse cellulaire18. En outre, la coloration Alizarin Red est utilisée, qui se lie directement aux dépôts de calcium sur les cellules fixes ou les tissus19. Pour étudier la calcification de l’hVSMC au fil du temps avec l’o-crésolphtaléine ou le rouge d’Alizarine, il faut des lots de répétitions par point temporel, ce qui augmente la demande de matériel biologique et, par conséquent, augmente le risque de variabilité.
Dans cet article, nous détaillons la méthode d’application d’un nouveau test qui utilise des hVSMC avec une sonde d’imagerie fluorescente pour déterminer la progression in vitro de la CV ainsi que la fonction d’un test de calcification en phase terminale unique. Nous avons précédemment démontré que ce test est directement comparable aux méthodes o-crésolphtaléine et Alizarin Red et peut être utilisé pour distinguer différentes conditions de culture20. En plus des mesures en temps réel, ce test peut être utilisé pour déterminer la propension des échantillons de sérum ou de plasma comme marqueur de substitution pour le développement clinique de CV20. Cela facilitera l’application des stratégies biologiques des sciences cardiovasculaires et de la modélisation des maladies. Une autre application du test peut être en tant que système biohybride translationnel pour évaluer la gravité ou la progression de la CV à partir de constituants sanguins tels que le sérum ou le plasma.
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Protocol
1. Ensemencement cellulaire, entretien et induction de calcification
- Pour la culture des cellules primaires, utilisez une armoire à flux d’air laminaire, des gants et du matériel stérile. Désinfectez les mains et l’espace de travail avant et après tout travail. Traiter toutes les cellules primaires et tous les milieux de culture comme présentant un risque biologique potentiel, sauf preuve contraire. De préférence, autoclaver les cellules et les milieux excédentaires avant l’élimination. Ne pas inactiver chimiquement et autoclaver car cela libérerait des fumées toxiques.
- Culture hVSMC sur des plaques de culture cellulaire non enrobées.
- Maintenir systématiquement hVSMC dans un milieu de croissance composé de milieu M199 complété par 10%-20% FBS et 1% Pen/Streptocoque et incuber à 37 °C et 5% CO2.
- Divisez les cellules sur une confluence de 70% à 90%.
- Pour fractionner, lavez les hVSMC 2x avec du PBS. Ajouter la trypsine et incuber pendant 2-5 min à 37 °C. Vérifiez le détachement des cellules au microscope.
- Inhiber la réaction de trypsine en ajoutant un milieu contenant du sérum. Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 4 min et remettre la pastille en suspension dans un milieu d’entretien. Les hVSMC suivent un schéma de fractionnement 1:2.
- Pour démarrer l’expérience de calcification, préparez les cellules en suivant les instructions pour une scission (étape 1.4.1). Lors de la remise en suspension, compter les cellules et les graines dans une plaque de 48 puits à une densité de 10-15 x 103 cellules/cm2. Ensemencer les cellules en évitant d’utiliser les puits extérieurs, comme recommandé dans la figure supplémentaire 1.
- Laisser les cellules adhérer et récupérer pendant 24 h (toute la nuit) tout en incubant à 37 °C et 5% de CO2.
- Lavez doucement les cellules 2x avec du PBS, en aspirant soigneusement tout le PBS restant après le 2ème lavage.
- Ajouter délicatement le milieu de calcification et incuber à 37 °C et 5% de CO2. Le milieu de calcification doit contenir un stimulus de calcification, une fœtuine-A marquée par fluorescence (p. ex. avec une protéine fluorescente rouge [RFP]) (1 μg/mL) et une coloration nucléaire HOECHST 33342 (0,1 μg/mL) ou une coloration nucléaire fluorescente vivante similaire. N’utilisez pas de DAPI, car il n’est pas perméable.
- Vérifiez quotidiennement avec un microscope optique jusqu’à ce que la calcification se produise.
REMARQUE : Pour obtenir des notes sur la culture cellulaire et l’entretien des CSSGh, veuillez consulter le dossier supplémentaire 1.
2. Détection de calcification par imagerie
Remarque : Le protocole suivant fournit les étapes générales à suivre dans la préparation, l’imagerie et l’analyse des données. Des captures d’écran à l’appui des instructions pour chaque étape à l’aide d’une plateforme d’imagerie automatisée et du logiciel d’analyse d’images correspondant (voir le tableau des matériaux pour plus de détails) sont fournies dans le dossier supplémentaire 2 et le dossier supplémentaire 3. D’autres instruments d’imagerie et outils de traitement d’images peuvent être utilisés pour appliquer ce protocole. Cependant, l’imagerie répétée au même endroit dans chaque puits est cruciale pour l’acquisition de données significatives. La création d’un protocole de calcification et de réutilisation des images à chaque étape de l’imagerie est nécessaire pour obtenir des résultats reproductibles. La première fois que vous appliquez la méthode, suivez les étapes ci-dessous pour vous préparer avant l’imagerie.
- Configuration du protocole
- Ouvrez le logiciel, puis sélectionnez Protocoles et créer nouveau.
- Sélectionnez Procédure et cliquez sur Définir la température. Dans la fenêtre contextuelle, réglez la température sur 37 °C et le dégradé sur 1 °C, puis cliquez sur OK. Sélectionnez le type d’assiette de votre choix dans le menu déroulant. Ajoutez l’étape d’imagerie en cliquant sur Image. Sélectionnez l’imageur inversé, puis cliquez sur OK.
- Ajoutez trois canaux d’imagerie et réglez-les sur DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) et fond clair. Cochez la case Montage et définissez le nombre et l’emplacement souhaités des images. 2 x 2 pour une plaque de 48 puits est un choix courant. Modifier le chevauchement pour représenter une meilleure couverture de chaque puits. Sélectionnez les puits à imager. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira où les puits d’intérêt pourront être sélectionnés.
- Cliquez sur Options de mise au point pour définir le mode de mise au point . Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Définissez chaque canal individuellement. Généralement, les puits sont autofocalisés sur le canal « DAPI ». Réglez tous les autres canaux sur Hauteur focale fixe à partir du premier canal et définissez en cliquant sur OK. Fermez la fenêtre.
- Démarrez les étapes de préréglage de la réduction des données en cliquant sur Réduction des données et sélectionnez Prétraitement d’image. La configuration de cette étape réduit le fond de fluorescence. Acceptez les paramètres par défaut en sélectionnant OK. Un nouvel ensemble d’images sera créé avec le préfixe « TSF ». Les images originales seront conservées.
- Configurez une étape pour compter les cellules en sélectionnant Analyse cellulaire. Sélectionnez les images DAPI TSF dans le menu déroulant Channel . Définissez d’autres détails après l’exécution de l’imagerie. Cette étape peut également être considérée comme une réduction des données; Assurez-vous toujours de conserver les images originales.
- Préparez l’analyse du signal RFP (calcification) en sélectionnant Statistiques. Dans la fenêtre contextuelle, étiquetez Étape et sélectionnez TSF RFP comme canal d’entrée. Cochez les cases Valeur supérieure et Valeur inférieure. Cochez la case Surface totale dans la liste inférieure. Sélectionnez Aucun dans la colonne Effet de couleur. Dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Personnalisé et cochez la case Arrière-plan. Cela permettra de coder par couleur les résultats de faible à haut pour une évaluation facile. Appuyez sur OK.
- Pour une lecture équitable, normalisez le signal RFP par cellule. Ce faisant, une surface totale est divisée par cellule. Pour configurer cette étape, appuyez sur Ratio sur le côté gauche. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez pour la saisie de données 1 Quantification de l’appel d’offres : Superficie totale dans le menu déroulant. Sélectionnez ensuite Nombre de cellules comme entrée de données 2.
- Enfin, sélectionnez un nouveau nom d’ensemble de données et appuyez à nouveau sur OK et OK . Sélectionnez Effet de couleur comme décrit précédemment. Dans le coin supérieur gauche, sélectionnez Fichier et enregistrez le fichier en tant que protocole (type de fichier .prt).
- Tous les jours après la première calcification
- Pour chaque point temporel, répétez ces étapes. Dans le logiciel de démarrage, appuyez sur Lire maintenant et Protocole existant.... Sélectionnez le protocole qui a été créé à l’étape précédente. Le programme demandera de sauvegarder l’expérience. Cela peut être fait à cette étape, mais aussi à n’importe quelle étape ultérieure manuellement en cliquant sur le bouton Enregistrer en haut à gauche.
- Une fenêtre contextuelle vous demandera d’attendre que le système chauffe. Allumez le contrôleur de gaz CO2 et réglez-le sur 5%.
- Une fois que le système a atteint la température réglée, une invite apparaîtra pour insérer une plaque et lire. Appuyez sur Annuler. En effet, pour chaque point temporel, l’exposition de chaque fluorochrome doit être ajustée individuellement.
- Transportez la plaque de l’incubateur à l’imageur dans une boîte sûre qui résiste à la rupture et au déversement et qui est conforme aux réglementations locales en matière de biosécurité pour le transport de cellules vivantes, en cas d’accident. Placez la plaque dans le lecteur de plaques.
- Après l’annulation, cliquez sur Procédure. Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Étape d’imagerie prédéfinie. Ajustez d’abord la mise au point et l’exposition sur le canal DAPI . Décochez la case Exposition automatique sur tous les canaux. Cliquez ensuite sur l’icône Microscope en regard du canal DAPI . Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
- Sélectionnez le puits sur lequel vous souhaitez vous concentrer. Utilisez un puits avec une calcification moyenne à élevée pour cette étape. Si un signal est déjà visible, cliquez d’abord sur Autofocus , puis sur Autoexposure. Si ce n’est pas le cas, augmentez d’abord l’exposition et répétez l’autofocus et l’exposition automatique. Si vous le souhaitez, l’exposition peut être ajustée manuellement en sélectionnant le menu déroulant d’exposition. Vérifiez les paramètres sur plusieurs puits. Une fois satisfait, enregistrez les paramètres.
- Ajustez l’exposition de la même manière pour tous les canaux.
ATTENTION : Ne vous concentrez pas sur d’autres canaux; Ajustez seulement l’exposition. La mise au point doit être la même pour tous les canaux. - Fermez la fenêtre de procédure. Sélectionnez le bouton vert Lire maintenant dans la barre des tâches supérieure. Enregistrez l’expérience comme indiqué par le logiciel.
REMARQUE: Le logiciel va maintenant lire automatiquement tous les puits sélectionnés dans les paramètres sélectionnés.
3. Analyse des données
REMARQUE : Pour des captures d’écran détaillées sur la façon d’effectuer l’analyse des données à l’aide d’une plate-forme d’imagerie automatisée et du logiciel d’analyse d’images correspondant (voir le tableau des matériaux pour plus de détails), veuillez consulter le dossier supplémentaire 4. Si vous utilisez d’autres instruments d’imagerie ou logiciels d’analyse, les images doivent être exportées et traitées par lots en veillant à ce que l’exposition, le seuil de fluorescence ou l’intensité soient ajustés de manière égale pour toutes les images d’un ensemble de données comparatives.
- Pendant que le système lit la plaque, toutes les images sont automatiquement traitées en arrière-plan. Ajustez les paramètres du nombre de cellules en sélectionnant les images TSF DAPI à afficher. Sélectionnez le puits de votre choix en double-cliquant. Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Sélectionnez l’une des images.
- Sélectionnez l’onglet Analyse . Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Analyse cellulaire : Nombre de cellules. Cliquez sur OK. Désélectionnez l’appel d’offres et les canaux en fond clair. Cochez la case Mettre en surbrillance les objets .
- Cliquez sur Options pour ouvrir le menu. Ajustez le seuil de taille et d’intensité pour inclure tous les noyaux, mais exclure les débris. Cliquez sur OK. Cliquez sur Appliquer les modifications en bas à gauche pour transférer également les paramètres vers toutes les autres images.
- De la même manière que précédemment, sélectionnez un puits et une image avec une calcification moyenne à élevée pour ajuster au mieux le rapport signal sur bruit; cliquez sur l’onglet Analyse dans le menu des tâches.
- Cette fois, sélectionnez Statistiques d’image. Désélectionnez le DAPI et le canal de fond clair. Cliquez sur Options pour ouvrir le menu. Cochez la case Valeurs aberrantes de seuil. Ajustez les valeurs supérieures et inférieures du seuil. Ne comptez le signal que s’il est au-dessus de l’arrière-plan et excluez s’il y a des débris / artefacts.
- Pour définir une valeur de seuil non subjective pour le signal au-dessus de l’arrière-plan, sélectionnez l’outil Ligne dans la barre des tâches. Une fenêtre apparaîtra. Tracez une ligne à travers une parcelle de signal, mais assurez-vous d’inclure également une zone d’arrière-plan.
REMARQUE: Un graphique apparaîtra dans la fenêtre contextuelle, montrant un pic représentant le signal au-dessus de la ligne d’arrière-plan. La valeur de la hauteur maximale de 25 % représente le seuil recommandé. Il est également recommandé de mesurer plusieurs patchs de signal pour s’assurer de la sélection du bon seuil. Lors de la sélection de patchs de signal, la sélection de régions avec une intensité de signal très élevée peut entraîner un seuil qui néglige les signaux moyens et/ou inférieurs. Il est donc recommandé de sélectionner des patchs de signal moyen à faible au-dessus de l’arrière-plan. Des exemples de seuils trop élevés, trop bas et précis sont présentés dans le dossier supplémentaire 4. - Une fois satisfait, cliquez sur OK et appliquer les modifications pour transférer les paramètres vers tous les autres puits. Vérifiez si le seuil est sélectionné avec précision dans les autres puits.
- Une fois le nombre de cellules et les seuils d’appel d’offres définis, exportez les données. Sélectionnez la plaque qui vous intéresse. Dans le menu déroulant, plusieurs paramètres peuvent être sélectionnés pour l’exportation. Le nombre de cellules, la zone de DP et la « zone/cellule », qui est la mesure utilisée pour la comparaison entre les groupes, pourraient être pertinents. Cliquez sur le bouton Excel en regard du menu déroulant pour exporter les données directement dans une feuille de calcul.
REMARQUE: Dans le menu déroulant, les valeurs calculées pour le nombre de cellules, la surface totale du signal RFP (reflétant la zone de calcification), ainsi que le rapport normalisé de la surface totale du signal RFP par cellule peuvent maintenant être sélectionnés individuellement et exportés vers une feuille de calcul. Affichez les résultats sous forme de rapport entre la surface totale du signal RFP par cellule et visualisez (p. ex., graphiques à barres). Appliquez un test t de Student non apparié pour comparer deux groupes ou une ANOVA non appariée pour comparer différents groupes au même moment. La comparaison du même groupe à différents moments peut nécessiter une analyse statistique par paires.
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Representative Results
Le résultat comprend des images originales de noyaux colorés par HOECHST, une calcification marquée par RFP et des images en fond clair. Différents stades de calcification allant de faible (Figure 2) à élevé (Figure 3) peuvent être détectés et analysés. La calcification peut généralement être repérée sous forme de taches noires à l’aide de la microscopie optique (Figure 2D et Figure 3B, les flèches indiquent la calcification), qui sont utiles pour l’évaluation primaire et pour déterminer quand commencer l’imagerie. Pour améliorer le rapport signal/bruit, les images de DP traitées doivent être analysées pour quantifier la calcification (figure 2F et figure 3D, les flèches indiquent la calcification). Enfin, les données peuvent être présentées sous forme de diagramme à barres comparant deux conditions ou plus à un moment donné, accompagné d’images représentatives (figure 4A, B, C). Les données doivent être affichées normalisées en fonction du nombre de cellules (p. ex., sous forme de zone de calcification par cellule). Les données peuvent également être affichées sous forme de données de séries chronologiques montrant la même condition à différents points temporels (Figure 4D).
Figure 1 : Résumé visuel résumant les étapes de détection et d’analyse de calcification semi-automatisées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemple de calcification à un stade précoce. (A) L’image superposée peut être affichée et analysée sous forme (B) d’images DAPI (noyaux), (C) RFP (calcification) et (D) de fond clair. (E) Les noyaux sont identifiés par le logiciel et peuvent être mis en évidence par des cercles jaunes pour ajuster les paramètres. (F) Pour l’analyse du signal RFP, les images sont prétraitées pour réduire le signal de fond et, (G) par la suite, un seuil peut être défini pour mesurer le signal. Les flèches indiquent la calcification dans les images RFP (D) en fond clair et (F & G) transformées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Exemple de calcification à un stade avancé. (A) L’image superposée peut être affichée et analysée sous forme d’images séparées (B) en fond clair, (C) RFP (calcification) et (E) DAPI (noyaux). (D) Pour l’analyse du signal RFP, les images sont prétraitées pour réduire le signal de fond. Les flèches indiquent la calcification dans les images RFP (B) en fond clair et (D) transformées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Comparaison représentative entre une calcification faible et élevée de l’hVSMC après 14 jours en culture avec milieu de calcification. Généralement, les données peuvent être affichées sous forme de graphique à barres et analysées à l’aide du test t de Student non apparié. Images représentatives de (A) faible calcification et (B) calcification élevée. Le signal rouge (RFP) reflète la calcification et le signal bleu (HOECHST) affiche les noyaux. (C) Calcification présentée sous forme de signal positif A-RFP fœtuin (surface totale) par cellule. (D) Exemple d’essai de calcification mesuré dans le temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Exemple d’une gamme de puits utilisés pour une expérience de calcification avec des hVSMC. L’anneau extérieur des puits n’est pas utilisé pour l’expérience de calcification mais rempli de liquide. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 1 : Notes sur la culture cellulaire et le maintien de l’hVMSC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : Protocole d’imagerie automatisé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 3 : Protocole d’analyse d’images. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 4 : Protocole d’analyse des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode semi-automatisée pour la détermination de la calcification in vitro . Pour cette méthode, trois étapes critiques de la calcification hVSMC doivent être optimisées. Premièrement, la densité cellulaire est essentielle au développement de la calcification hVSMC. De faibles densités de VSMC hmc entraîneront une calcification lente ou nulle et la mort cellulaire en raison de l’absence de contact de cellule à cellule et du stress induit dans des conditions de calcification21. Des densités cellulaires élevées entraînent une confluence excessive, après quoi les cellules deviennent sénescentes22 et le développement de la calcification s’arrête. Il est essentiel d’ensemencer environ 70% de confluence dans la plaque de puits qui sera utilisée pour le développement ultérieur de la calcification, assurant ainsi la capacité de prolifération et les connexions cellulaires des hVSMC.
Deuxièmement, le milieu de culture cellulaire qui sera utilisé pour l’induction de la calcification nécessite une optimisation. Dans le cadre de la recherche sur la calcification vasculaire, une variété de conditions et de compositions de milieux ont été signalées pour calcifier les hVSMC23,24. Nous pensons que la méthode est appropriée pour détecter toutes sortes de calcification in vitro, et elle a été utilisée pour détecter le calcium, le phosphate ou les dépôts stimulés par le phosphate de calcium. Quel que soit le mode d’induction de calcification, l’optimisation du milieu calcifiant est essentielle. Dans le protocole présenté, nous avons optimisé l’induction de la calcification en utilisant M199 avec une concentration totale de calcium de 4,5 mM Ca2+ avec 2,5% FBS.
Enfin, des différences locales dans les plaques lors de la calcification ont été observées. Il est essentiel d’appliquer le chargement aléatoire des répétitions techniques pour éviter le biais de l’échantillon. De plus, il faut éviter de charger les voies de forage extérieures, car ces puits se calcifient toujours plus rapidement dans le cadre de 48 puits. Ceci est potentiellement causé par la dérégulation de l’humidité intraplaque, dans laquelle le fait de ne pas utiliser les puits les plus extérieurs et de charger ces puits avec de grands volumes de liquide aide à contrôler cela.
Bien que le test de calcification lui-même puisse nécessiter plusieurs étapes d’optimisation pour assurer la reproductibilité avec une configuration particulière, une fois opérationnel, cela devient simple. Les tests de calcification peuvent être exécutés simultanément et à plusieurs reprises dans des conditions établies sans nécessiter d’optimisation supplémentaire. La calcification médiée par hVSMC peut être difficile et nécessiter une expérimentation avant que la robustesse des tests n’ait été atteinte. Un chercheur devrait être en mesure de déterminer le moment optimal avant de commencer l’imagerie régulière, ce qui peut prendre jusqu’à 1 semaine. Un calendrier d’imagerie fixe peut être établi dès le début de l’expérience, bien que cela puisse produire de nombreuses images sans lectures différentielles, utiliser une quantité relativement importante de stockage de données pour les images et prendre beaucoup de temps dans l’analyse.
La procédure décrite dans ce protocole est une façon d’effectuer l’analyse du test de calcification. À d’autres fins, la procédure devrait être adaptée en conséquence. Notre analyse à l’aide de la plate-forme d’imagerie automatisée référencée garantit la reproductibilité, bien que l’analyse puisse être effectuée à l’aide de n’importe quelle cellule vivante et dispositif d’imagerie contrôlé en température et CO2. De plus, les progiciels commerciaux correspondants sont optimisés pour le criblage et l’analyse cellulaires à haut contenu, parfaitement adaptés à la mesure de la propension à la calcification au fil du temps. D’autres solutions logicielles, telles que le logiciel gratuit ImageJ, peuvent également fournir une analyse d’image et quantifier le développement de la calcification.
L’imagerie des plaques de calcification à un stade avancé peut être difficile en raison de problèmes de mise au point automatique si la culture rencontre des débris flottants, ce qui réduit le nombre d’images nettes et de répétitions. L’analyse des images doit être ajustée en conséquence, et certaines solutions ont été développées dans le logiciel utilisé dans ce protocole pour améliorer et simplifier l’analyse.
L’hétérogénéité cellulaire joue un rôle crucial dans la quantification de la calcification in vitro. Dans cette plateforme, nous utilisons des hVSMC comme biocapteurs pour le développement de la calcification. Les VSMC primaires proviennent de divers donneurs présentant différentes pathologies vasculaires sous-jacentes; par conséquent, ce test est toujours sujet à une grande variabilité en raison de l’hétérogénéité des lots de VSMC. Une solution possible est l’utilisation de lignées cellulaires immortalisées ou l’utilisation de hVSMC dérivés de cellules souches pluripotentes.
Une autre limite est que la méthode de quantification est encore sensible à la subjectivité. La subjectivité dans les tests de calcification découle des tests de point final, qui n’étaient disponibles que récemment. Les chercheurs doivent décider quand arrêter l’expérience et mesurer la calcification, ce qui augmente la subjectivité du test. Nous pensons que la méthode introduite dans ce manuscrit est supérieure car nous mesurons au fil du temps et pouvons comparer le développement de la calcification dans une certaine période. Lié à cela, le réglage de l’éclairage doit être ajusté pour chaque point temporel séparément en raison de la diminution du signal au fil du temps. Pour cette raison, la quantité de signal représentée dans une image est toujours influencée par l’opinion d’un individu. Il est crucial que l’éclairage soit effectué avec les rapports signal/bruit les plus élevés afin que l’analyse post-image puisse être effectuée aussi objectivement que possible.
Bien que nous considérions la subjectivité de ce test comme une limitation, nous pensons qu’il est supérieur aux autres méthodes de calcification in vitro . Contrairement aux méthodes existantes, notre test de calcification semi-automatisé présente l’avantage de pouvoir analyser les images de manière anonyme, fournissant ainsi une opinion indépendante en aveugle. De plus, les images peuvent être analysées ultérieurement avec les mêmes paramètres définis dans un ensemble de données, réduisant ainsi la subjectivité.
Les méthodes actuelles de détermination de la calcification reposent sur des mesures du point final ou manquent de la composante vasculaire25,26,27. Au sein de la clinique, des outils tels que la tomodensitométrie, l’échographie intravasculaire et l’imagerie par résonance magnétique sont coûteux et constituent un fardeau pour les patients. La recherche sur les biomarqueurs a prouvé son utilisation, mais ne reflète pas le fardeau de la calcification des patients. Nous pensons que ce test semi-automatisé utilise non seulement un seul biomarqueur, mais une collection de composants circulants, reflétant l’état cardiovasculaire d’un patient. Cela peut être utilisé pour mesurer une réponse de calcification en tant que biocapteur. D’autres applications potentielles de la méthode décrite comprennent le dépistage sérique des patients pour le développement de la calcification in vitro en tant que marqueur de substitution pour le développement personnalisé de la calcification vasculaire. La plateforme a démontré sa sensibilité à la dialyse et au traitement à la vitamine K, en plus des maladies métaboliques et non métaboliques liées aux patients ayant un statut cardiovasculaire et un pronosticmédiocres 20. Puisque le principe du test est basé sur la détection de cristaux de calcium, nous émettons l’hypothèse qu’il pourrait également être pertinent dans d’autres domaines de recherche où la minéralisation peut être pertinente, tels que l’arthrose, l’ostéoporose, la médecine régénérative osseuse ou la recherche dentaire.
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Disclosures
Leon Schurgers a reçu des subventions institutionnelles de Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma et IDS. Leon Schurgers détient des actions de Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent est cofondateur et actionnaire de CALCISCON AG.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par les programmes de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Sklodowska-Curie n ° 722609 et 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Cette recherche a été soutenue par BioSPX. WJ-D a reçu un financement de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) TRR219-projet ID 322900939 et projet ID 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
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