Summary
Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste dødsårsag på verdensplan. Vaskulær forkalkning bidrager væsentligt til byrden af kardiovaskulær sygelighed og dødelighed. Denne protokol beskriver en simpel metode til kvantificering af vaskulær glat muskelcellemedieret calciumudfældning in vitro ved fluorescerende billeddannelse.
Abstract
Vaskulær forkalkning involverer en række degenerative patologier, herunder inflammation, ændringer i cellulær fænotype, celledød og fravær af forkalkningshæmmere, der samtidig fører til tab af karelasticitet og funktion. Vaskulær forkalkning er en vigtig bidragyder til sygelighed og dødelighed i mange patologier, herunder kronisk nyresygdom, diabetes mellitus og aterosklerose. Nuværende forskningsmodeller til undersøgelse af vaskulær forkalkning er begrænsede og er kun levedygtige i de sene stadier af forkalkningsudvikling in vivo. In vitro-værktøjer til undersøgelse af vaskulær forkalkning bruger slutpunktsmålinger, hvilket øger kravene til biologisk materiale og risikerer at indføre variabilitet i forskningsundersøgelser. Vi demonstrerer anvendelsen af en ny fluorescerende mærket sonde, der binder til in vitro-forkalkningsudvikling på humane vaskulære glatte muskelceller og bestemmer realtidsudviklingen af in vitro-forkalkning. I denne protokol beskriver vi anvendelsen af vores nyudviklede forkalkningsassay, et nyt værktøj inden for sygdomsmodellering, der har potentielle translationelle anvendelser. Vi forestiller os, at denne analyse er relevant i et bredere spektrum af mineralaflejringsforskning, herunder anvendelser inden for knogle-, brusk- eller tandforskning.
Introduction
Vaskulær forkalkning (VC) er en uafhængig risikofaktor for kardiovaskulær sygelighed og dødelighed 1,2,3. Længe betragtet som en passiv kemisk proces med ektopisk mineralaflejring, ser det nu ud til at være et modificerbart vævshelingsrespons, der involverer det aktive bidrag fra forskellige celler, herunder aktiverede vaskulære glatte muskelceller (hVSMC) som en drivkraft for sygdommen 4,5. In vivo VC kan måles ved multislice CT-scanninger som en vurdering af aterosklerotisk byrde 6,7,8. I øjeblikket er et paradigmeskift i gang, hvor VC-sværhedsgrad bliver anerkendt som en risikofaktor i hjerte-kar-sygdomme, type II-diabetes, kronisk nyresygdom og aldring 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC'er er den mest rigelige celletype i det kardiovaskulære system og en hovedaktør i udviklingen af VC. In vitro hVSMC-induceret forkalkning er en meget anvendt sygdomsmodel til at studere hjerte-kar-sygdomme16,17. Imidlertid bruger de fleste protokoller til påvisning af in vitro-forkalkning slutpunktsmålinger, der kan begrænse dataindsamling, kræver større brug af cellulært materiale og kan bremse forskningen. Almindelige metoder til påvisning af in vitro hVSMC-forkalkning omfatter o-cresolphthalein-assayet, som måler opløselig calciumaflejring mod total protein og kræver cellelyse18. Alizarin Red farvning anvendes også, som binder direkte til calciumaflejringer på faste celler eller væv19. At studere hVSMC-forkalkning over tid med enten o-cresolphthalein eller Alizarin Red kræver partier af replikater pr. Tidspunkt, hvilket øger efterspørgslen efter biologisk materiale og igen øger chancen for variabilitet.
I dette papir beskriver vi metoden til anvendelse af et nyt assay, der anvender hVSMC'er med en fluorescerende billedsonde til at bestemme in vitro VC-progression samt fungere som et enestående forkalkningsassay i slutstadiet. Vi har tidligere vist, at dette assay er direkte sammenligneligt med o-cresolphthalein og Alizarin Red metoderne og kan bruges til at skelne mellem varierende kulturforhold20. Ud over realtidsmålinger kan dette assay bruges til at bestemme tilbøjeligheden af serum- eller plasmaprøver som en surrogatmarkør til klinisk VC-udvikling20. Dette vil hjælpe med anvendelsen af biologiske strategier for kardiovaskulær videnskab og sygdomsmodellering. En yderligere anvendelse af analysen kan være som et translationelt BioHybrid-system til vurdering af VC-sværhedsgrad eller progression fra blodbestanddele såsom serum eller plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellesåning, vedligeholdelse og forkalkningsinduktion
- Til dyrkning af primære celler skal du bruge et laminært luftstrømsskab, handsker og sterilt udstyr. Desinficer hænder og arbejdsområde før og efter udførelse af arbejde. Behandl alle primære celler og kulturmedier som en potentiel biohazard, medmindre andet er bevist. Fortrinsvis autoklave overskydende celler og medier inden bortskaffelse. Inaktiver ikke kemisk og autoklave, da dette vil frigøre giftige dampe.
- Kultur hVSMC på ubelagte cellekulturplader.
- Rutinemæssigt vedligeholdes hVSMC i vækstmedium bestående af M199 medium suppleret med 10% -20% FBS og 1% Pen / Strep og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Opdel cellerne efter 70% -90% sammenløb.
- For at opdele skal du vaske hVSMC'erne 2x med PBS. Tilsæt trypsin og inkuber i 2-5 minutter ved 37 °C. Kontroller for løsrivelse af celler under mikroskopet.
- Hæmmer trypsinreaktionen ved at tilsætte serumholdigt medium. Cellerne centrifugeres ved 350 x g i 4 minutter, og pelleten resuspenderes i vedligeholdelsesmedium. hVSMC'er følger en 1:2-opdelingsordning.
- For at starte forkalkningseksperimentet skal du forberede cellerne ved at følge instruktionerne for en opdeling (trin 1.4.1). Ved resuspension tælles cellerne og frøet i en 48-brøndsplade med en tæthed på 10-15 x 103 celler / cm2. Frø cellerne undgå brug af de ydre brønde, som anbefalet i supplerende figur 1.
- Cellerne klæber og restituerer i 24 timer (natten over), mens de inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
- Vask forsigtigt cellerne 2x med PBS, og opsug forsigtigt alle de resterende PBS efter 2. vask.
- Tilsæt forsigtigt forkalkningsmedium og inkuberes yderligere ved 37 °C og 5 % CO2. Forkalkningsmedium skal indeholde en forkalkningsstimulering, fluorescerende mærket fetuin-A (f.eks. med rødt fluorescerende protein [RFP]) (1 μg/ml) og HOECHST 33342 (0,1 μg/ml) nuklear plet eller lignende levende fluorescerende kerneplet. Brug ikke DAPI, da dette ikke er gennemtrængeligt.
- Kontroller dagligt med et lysmikroskop, indtil forkalkning finder sted.
BEMÆRK: For noter om cellekultur og vedligeholdelse af hVMSC'er, se venligst Supplerende fil 1.
2. Detektion af forkalkning via billeddannelse
BEMÆRK: Følgende protokol indeholder de generelle trin, der skal tages i forberedelse, billeddannelse og dataanalyse. Skærmbilleder, der understøtter instruktionerne for hvert trin ved hjælp af en automatiseret billedbehandlingsplatform og tilsvarende billedanalysesoftware (se materialetabel for detaljer), findes i supplerende fil 2 og supplerende fil 3. Andre billedbehandlingsinstrumenter og billedbehandlingsværktøjer kan bruges til at anvende denne protokol. Imidlertid er gentagen billeddannelse på samme sted i hver brønd afgørende for meningsfuld dataindsamling. Oprettelse af en protokol til billedforkalkning og genbrug ved hvert billedbehandlingstrin er nødvendig for at opnå reproducerbare resultater. Første gang du anvender metoden, skal du følge nedenstående trin for at forberede dig inden billeddannelsen.
- Opsætning af protokol
- Åbn softwaren, og vælg derefter Protokoller og Opret ny.
- Vælg Procedure , og klik på Indstil temperatur. I pop op-vinduet skal du indstille temperaturen til 37 °C og gradienten til 1 °C og klikke på OK. Vælg den valgte pladetype i rullemenuen. Tilføj billedbehandlingstrinnet ved at klikke på Billede. Vælg det omvendte billede, og klik på OK.
- Tilføj tre billedkanaler, og indstil dem til DAPI (377, 447 nm), RFP (531, 593 nm) og brightfield. Marker feltet Montage , og indstil det ønskede antal og placering af billederne. 2 x 2 for en 48-brønds plade er et almindeligt valg. Skift overlapningen for at repræsentere en bedre dækning af hver brønd. Vælg, hvilke brønde der skal afbildes. Et nyt vindue åbnes, hvor brøndene af interesse kan vælges.
- Klik på Fokusindstillinger for at indstille fokustilstanden. Et nyt vindue åbnes. Indstil hver kanal individuelt. Almindeligvis er brønde autofokuseret på "DAPI" -kanalen. Indstil alle andre kanaler til Fast brændvidde fra første kanal , og indstil ved at klikke på OK. Luk vinduet.
- Start trinnene til forudindstilling af datareduktion ved at klikke på Datareduktion , og vælg Billedforbehandling. Opsætning af dette trin reducerer fluorescensbaggrunden. Accepter standardindstillingerne ved at vælge OK. Et nyt sæt billeder oprettes med præfikset "TSF". De originale billeder vil blive bevaret.
- Opret et trin til at tælle cellerne ved at vælge Cellulær analyse. Vælg TSF DAPI-billeder i rullemenuen Kanal . Angiv yderligere detaljer, efter at billeddannelsen er udført. Dette trin kan også betragtes som datareduktion; Sørg altid for at beholde de originale billeder.
- Forbered analysen af RFP -signalet (forkalkning) ved at vælge Statistik. I pop op-vinduet skal du mærke Trin og vælge TSF RFP som inputkanal. Marker felterne Øvre værdi og Nedre værdi. Marker afkrydsningsfeltet for Samlet areal på den nederste liste. Vælg Ingen i kolonnen Farveeffekt. I pop op-vinduet skal du klikke på Brugerdefineret og markere afkrydsningsfeltet Baggrund. Dette vil farvekode resultaterne fra lav-høj for nem vurdering. Tryk på OK.
- For en retfærdig udlæsning skal du normalisere RFP-signalet pr. Celle. Dermed divideres et samlet areal pr. Celle. For at konfigurere dette trin skal du trykke på Forhold i venstre side. I pop op-vinduet skal du vælge for datainput 1 RFP-kvantificering: Samlet areal i rullemenuen. Vælg yderligere Celleantal som datainput 2.
- Til sidst skal du vælge et nyt datasætnavn og trykke på OK og OK igen. Vælg Farveeffekt som beskrevet tidligere. Vælg Filer i øverste venstre hjørne, og gem filen som protokol (filtypen .prt).
- Dagligt efter den første forkalkning sker
- Gentag disse trin for hvert tidspunkt. I opstartssoftwaren skal du trykke på Læs nu og eksisterende protokol .... Vælg den protokol, der blev oprettet i det forrige trin. Programmet vil bede om at gemme eksperimentet. Dette kan gøres på dette trin, men også på ethvert senere trin manuelt ved at klikke på knappen Gem øverst til venstre.
- Et pop op-vindue beder om at vente på, at systemet opvarmes. Tænd for CO2 gasregulatoren, og indstil den til 5%.
- Når systemet har nået den indstillede temperatur, vises en prompt om at indsætte en plade og læse. Tryk på Annuller. Dette skyldes, at eksponeringen af hvert fluorkrom for hvert tidspunkt skal justeres individuelt.
- Transporter pladen fra inkubatoren til billedapparatet i en pengeskab, der modstår brud og spild og er i overensstemmelse med lokale biosikkerhedsbestemmelser for transport af levende celler i tilfælde af en ulykke. Placer pladen i pladelæseren.
- Når du har annulleret, skal du klikke på Procedure. I pop op-vinduet skal du vælge Forudindstillet billedbehandlingstrin. Juster fokus og eksponering på DAPI-kanalen først. Fjern markeringen i feltet Automatisk eksponering ved alle kanaler. Klik derefter på mikroskopikonet ved siden af DAPI-kanalen . Et nyt vindue åbnes.
- Vælg den brønd, der skal fokuseres på. Brug en brønd med medium til høj forkalkning til dette trin. Hvis et signal allerede er synligt, skal du først klikke på Autofokus og derefter på Autoeksponering. Hvis ikke, skal du først øge eksponeringen og gentage Autofokus og Autoeksponering. Hvis det ønskes, kan eksponeringen justeres manuelt ved at vælge rullemenuen eksponering. Kontroller indstillingerne på flere brønde. Når du er tilfreds, skal du gemme indstillingerne.
- Juster eksponeringen på samme måde for alle kanaler.
FORSIGTIG: Fokuser ikke på andre kanaler; juster kun eksponeringen. Fokus skal være det samme for alle kanaler. - Luk procedurevinduet. Vælg den grønne Læs nu-knap i den øverste proceslinje. Gem eksperimentet som angivet af softwaren.
BEMÆRK: Softwaren læser nu automatisk alle de valgte brønde i de valgte indstillinger.
3. Dataanalyse
BEMÆRK: For detaljerede skærmbilleder om, hvordan du udfører dataanalysen ved hjælp af en automatiseret billedbehandlingsplatform og tilsvarende billedanalysesoftware (se Materialetabel for detaljer), se venligst Supplerende fil 4. Hvis der anvendes alternative billeddannelsesinstrumenter eller analysesoftware, skal billederne eksporteres og batchbehandles, hvilket sikrer, at eksponeringen, fluorescensgrænsen eller intensiteten justeres ens for alle billeder i et sammenlignende datasæt.
- Mens systemet læser pladen, behandles alle billederne automatisk i baggrunden. Juster indstillingerne for celleantal ved at vælge TSF DAPI-billeder , der skal vises. Vælg den valgte brønd ved at dobbeltklikke. Et nyt vindue vises. Vælg et af billederne.
- Vælg fanen Analyse . I pop op-vinduet skal du vælge Cellulær analyse: Celleantal. Klik på OK. Fravælg RFP- og brightfield-kanalerne. Marker afkrydsningsfeltet Fremhæv objekter .
- Klik på Indstillinger for at åbne menuen. Juster størrelses- og intensitetstærsklen til at omfatte alle kerner, men ekskluder snavs. Klik på OK. Klik på Anvend ændringer nederst til venstre for også at overføre indstillingerne til alle andre billeder.
- På samme måde som før skal du vælge en brønd og et billede med en medium til høj mængde forkalkning for bedst at justere signal-støj-forholdet; Klik på fanen Analyse i opgavemenuen.
- Denne gang skal du vælge Billedstatistik. Fravælg DAPI- og brightfield-kanalen. Klik på Indstillinger for at åbne menuen. Marker afkrydsningsfeltet Tærskel outliers. Juster tærsklens øvre og nedre værdier. Tæl kun signalet, hvis det er over baggrunden, og ekskluder, hvis der er snavs / artefakter.
- Hvis du vil angive en ikke-subjektiv tærskelværdi for signalet over baggrunden, skal du vælge linjeværktøjet på proceslinjen. Et vindue vises. Tegn en linje gennem et stykke signal, men sørg for også at medtage et baggrundsområde.
BEMÆRK: En graf vises i pop op-vinduet, der viser en top, der repræsenterer signalet over baggrundslinjen. Tophøjdeværdien på 25 % repræsenterer den anbefalede tærskel. Det anbefales også at måle flere signalrettelser for at sikre valg af den rigtige tærskel. Når du vælger pletter af signal, kan valg af regioner med meget høj signalstyrke resultere i en tærskel, der forsømmer mellemstore og eller lavere signaler. Det anbefales derfor at vælge patches af medium til lavt signal over baggrunden. Eksempler på for høje, for lave og nøjagtige tærskler vises i supplerende fil 4. - Når du er tilfreds, skal du klikke på OK og Anvend ændringer for at overføre indstillingerne til alle andre brønde. Kontroller, om tærsklen er nøjagtigt valgt i de andre brønde.
- Når celletællings- og RFP-tærsklerne er indstillet, skal du eksportere dataene. Vælg pladen af interesse. I rullemenuen kan flere parametre vælges til eksport. Af relevans kan være celleantal, RFP-område og "område / celle", som er den metrik, der bruges til sammenligning mellem grupper. Klik på Excel-knappen ved siden af rullemenuen for at eksportere dataene direkte til et regneark.
BEMÆRK: I rullemenuen kan de beregnede værdier for celletællingen, det samlede areal af RFP-signalet (der afspejler forkalkningsområdet) samt det normaliserede forhold mellem det samlede areal af RFP-signal pr. celle nu vælges individuelt og eksporteres til et regneark. Vis resultaterne som forholdet mellem det samlede areal af RFP-signal pr. celle, og visualiser (f.eks. Søjlediagrammer). Anvend en uparret studerendes t-test for at sammenligne to grupper eller en uparret ANOVA for at sammenligne forskellige grupper på samme tidspunkt. Sammenligning af den samme gruppe på forskellige tidspunkter kan kræve parret statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet omfatter originale billeder af HOECHST-farvede kerner, RFP-mærket forkalkning og brightfield-billeder. Forskellige forkalkningsstadier, der spænder fra lav (figur 2) til høj (figur 3), kan detekteres og analyseres. Forkalkning kan normalt ses som sorte pletter ved hjælp af lysmikroskopi (figur 2D og figur 3B, pile angiver forkalkning), som er nyttige til primær vurdering og til at bestemme, hvornår billeddannelse skal startes. For at forbedre signal-støj-forholdet skal de behandlede RFP-billeder analyseres for at kvantificere forkalkning (figur 2F og figur 3D, pile angiver forkalkning). Endelig kan data præsenteres som et søjlediagram, der sammenligner to eller flere forhold på et tidspunkt, ledsaget af repræsentative billeder (figur 4A, B, C). Data skal vises normaliseret til celleantal (f.eks. som forkalkningsområde pr. Celle). Data kan også vises som tidsseriedata, der viser den samme tilstand på forskellige tidspunkter (figur 4D).
Figur 1: Visuelt abstrakt, der opsummerer trinene til den halvautomatiske forkalkningsdetektion og analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempel på forkalkning i tidlig fase . (A) Overlejringsbilledet kan vises og analyseres som (B) separate DAPI (kerner), (C) RFP (forkalkning) og (D) brightfield-billeder. (E) Kerner identificeres af softwaren og kan fremhæves som gule cirkler for at justere indstillingerne. (F) Til analyse af RFP-signalet forbehandles billeder for at reducere baggrundssignalet, og (G) efterfølgende kan der indstilles en tærskel til måling af signalet. Pile angiver forkalkning i (D) brightfield og (F & G) transformerede RFP-billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempel på senere forkalkning. (A) Overlejringsbilledet kan vises og analyseres som separate (B) brightfield-, (C) RFP-billeder (forkalkning) og (E) DAPI-billeder (kerner). (D) Til analyse af RFP-signalet forbehandles billeder for at reducere baggrundssignalet. Pile angiver forkalkning i (B) brightfield og (D) transformerede RFP-billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativ sammenligning mellem lav og høj forkalkning af hVSMC efter 14 dage i kultur med forkalkningsmedium. Almindeligvis kan data vises som et søjlediagram og analyseres ved hjælp af den uparrede studerendes t-test. Repræsentative billeder af (A) lav forkalkning og (B) høj forkalkning. Det røde signal (RFP) reflekterer forkalkning, og det blå signal (HOECHST) viser kerner. (C) Forkalkning præsenteret som fetuin A-RFP positivt signal (samlet areal) pr. Celle. (D) Eksempel på et forkalkningsassay målt over tid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Eksempel på en række brønde, der anvendes til et forkalkningsforsøg med hVSMC'er. Brøndenes ydre ring bruges ikke til forkalkningsforsøget, men fyldes med væske. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Noter om cellekultur og vedligeholdelse af hVMSC. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Automatiseret billeddannelsesprotokol. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Billedanalyseprotokol. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Dataanalyseprotokol. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en halvautomatisk metode til in vitro-forkalkningsbestemmelse . Til denne metode skal tre kritiske trin i hVSMC-forkalkning optimeres. For det første er cellulær tæthed afgørende for udviklingen af hVSMC-forkalkning. Lave tætheder af hVSMC'er vil resultere i langsom eller ingen forkalkning og celledød på grund af manglen på celle-til-celle-kontakt og den stress, der induceres under forkalkningsforhold21. Høje cellulære tætheder resulterer i overkonfluens, hvorefter celler bliver senescent22 og forkalkningsudvikling stopper. Det er afgørende at så ca. 70% sammenløb i brøndpladen, der vil blive brugt til efterfølgende forkalkningsudvikling, hvilket sikrer proliferativ kapacitet og cellulære forbindelser af hVSMC'er.
For det andet kræver cellekulturmediet, der skal bruges til forkalkningsinduktion, optimering. Inden for vaskulær forkalkningsforskning er en række tilstande og mediesammensætninger rapporteret at forkalke hVSMCs23,24. Vi mener, at metoden er egnet til at detektere alle former for in vitro-medieret forkalkning, og den er blevet brugt til at detektere calcium-, fosfat- eller calciumphosphatstimulerede aflejringer. Uanset tilstanden til forkalkningsinduktion er optimering af det forkalkende medie afgørende. I den præsenterede protokol optimerede vi forkalkningsinduktion ved at bruge M199 med en samlet calciumkoncentration på 4,5 mM Ca2+ med 2,5% FBS.
Endelig er der observeret lokale forskelle i plader under forkalkning. Det er afgørende at anvende tilfældig indlæsning af tekniske replikater for at forhindre stikprøvebias. Derudover bør belastning af de ydre brøndbaner undgås, da disse brønde altid forkalkes hurtigere i 48-brøndindstillingen. Dette er potentielt forårsaget af dysregulering af intrapladefugtighed, hvor ikke brug af de yderste brønde og belastning af disse brønde med store mængder væske hjælper med at kontrollere dette.
Mens selve forkalkningsanalysen kan kræve flere optimeringstrin for at sikre reproducerbarhed med en bestemt opsætning, bliver det ligetil, når det først er i gang. Forkalkningsanalyser kan køres samtidigt og gentagne gange under etablerede forhold uden behov for yderligere optimering. hVSMC-medieret forkalkning kan være udfordrende og kræve eksperimenter, før assays er robuste. En forsker skal være i stand til at bestemme den optimale timing, inden man starter regelmæssig billeddannelse, hvilket kan tage op til 1 uge. En fast billedbehandlingsplan kan etableres fra starten af eksperimentet, selvom dette kan producere mange billeder uden differentielle udlæsninger, bruge en relativt stor mængde datalagring til billeder og være tidskrævende i analysen.
Proceduren beskrevet i denne protokol er en måde at udføre analysen af forkalkningsanalysen på. Til andre formål bør proceduren tilpasses i overensstemmelse hermed. Vores analyse ved hjælp af den refererede automatiserede billedbehandlingsplatform sikrer reproducerbarhed, selvom analyse kan udføres ved hjælp af enhver levende celle- og temperatur- og CO2 -kontrolleret billeddannelsesenhed. Derudover er de tilsvarende kommercielle softwarepakker optimeret til cellulær screening og analyse med højt indhold, ideelt egnet til måling af forkalkningstilbøjelighed over tid. Andre softwareløsninger, såsom freeware ImageJ, kan også levere billedanalyse og kvantificere forkalkningsudvikling.
Billeddannelsen af forkalkningsplader i sen fase kan være vanskelig på grund af problemer med autofokusering, hvis kulturen støder på flydende affald, hvilket resulterer i et reduceret antal skarpe billeder og replikater. Billedanalyse bør justeres i overensstemmelse hermed, og nogle løsninger er udviklet i den software, der anvendes i denne protokol for at forbedre og forenkle analysen.
Cellulær heterogenitet spiller en afgørende rolle i kvantificeringen af forkalkning in vitro. I denne platform bruger vi hVSMC'er som biosensorer til udvikling af forkalkning. Primære hVSMC'er er afledt af forskellige donorer med forskellige underliggende vaskulære patologier; derfor er dette assay stadig udsat for høj variabilitet på grund af heterogeniteten af VSMCs batches. En mulig løsning er brugen af udødeliggjorte cellelinjer eller brugen af hVSMC'er afledt af pluripotente stamceller.
En anden begrænsning er, at kvantificeringsmetoden stadig er følsom over for subjektivitet. Subjektivitet i forkalkningsassays opstår på grund af slutpunktsassays, som kun var tilgængelige indtil for nylig. Forskere skal beslutte, hvornår de skal stoppe eksperimentet og måle forkalkning, hvilket øger analysens subjektivitet. Vi mener, at metoden, der introduceres i dette manuskript, er overlegen, da vi måler over tid og kan sammenligne forkalkningsudvikling i en bestemt periode. Forbundet med dette skal belysningsindstillingen justeres for hvert tidspunkt separat på grund af faldet i signal over tid. På grund af dette er mængden af signal, der er repræsenteret i et billede, stadig påvirket af en persons mening. Det er afgørende, at belysningen udføres med de højeste signal-støj-forhold, så post-billedanalyse kan udføres så objektivt som muligt.
Selvom vi ser subjektiviteten af denne analyse som en begrænsning, mener vi, at den er bedre end andre in vitro-forkalkningsmetoder . I modsætning til de eksisterende metoder har vores halvautomatiske forkalkningsanalyse den fordel, at billeder kan analyseres anonymt og derved give en uafhængig blindet mening. Derudover kan billederne analyseres på et senere tidspunkt med de samme definerede indstillinger på tværs af et datasæt og derved reducere subjektiviteten.
De nuværende metoder til bestemmelse af forkalkning er afhængige af endepunktsmålinger eller mangler den vaskulære komponent25,26,27. Inden for klinikken er værktøjer som computertomografi, intravaskulær ultralyd og magnetisk resonansbilleddannelse dyre og en byrde for patienterne. Biomarkørforskning har bevist sin anvendelse, men afspejler ikke patienternes forkalkningsbyrde. Vi mener, at dette halvautomatiske assay ikke kun bruger en enkelt biomarkør, men en samling cirkulerende komponenter, der afspejler en patients kardiovaskulære status. Dette kan bruges til at måle et forkalkningsrespons som en biosensor. Potentielle yderligere anvendelser af den beskrevne metode omfatter patienters serumscreening for in vitro forkalkningsudvikling som en surrogatmarkør til personlig udvikling af vaskulær forkalkning. Platformen har demonstreret sin følsomhed over for dialyse og vitamin K-behandling ud over både metaboliske og ikke-metaboliske sygdomme, der er forbundet med patienter med dårlig kardiovaskulær status og prognose20. Da analysens princip er baseret på påvisning af calciumkrystaller, antager vi, at det også kan være relevant inden for andre forskningsområder, hvor mineralisering kan være relevant, såsom slidgigt, osteoporose, knogleregenerativ medicin eller tandforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Leon Schurgers har modtaget institutionelle tilskud fra Bayer, Boehringer Ingelheim, NattoPharma og IDS. Leon Schurgers ejer aktier i Coagulation Profile. Willi Jahnen-Dechent er medstifter og aktionær i CALCISCON AG.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogrammer under Marie Sklodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 722609 og 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denne forskning blev støttet af BioSPX. WJ-D modtog støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) TRR219-project ID 322900939 og project ID 403041552
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O'Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -R., Zhang, J. -J., Xu, X. -X., Wu, Y. -G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
