Summary
이 프로토콜은 혐기성 배양 된 인간 질 박테리아를 사용한 질 식민지화의 마우스 모델을 제시합니다. 우리는 Gardnerella vaginalis에 초점을 맞추고 Prevotella bivia 및 Fusobacterium nucleatum에 대한 제안을 포함합니다. 이 프로토콜은 또한 질 접종 및 다른 혐기성 성장 박테리아의 실행 가능한 회복을위한 지침으로 사용될 수 있습니다.
Abstract
포유류의 질은 많은 박테리아 분류군에 의해 식민지화 될 수 있습니다. 인간의 질 마이크로바이옴은 종종 락토바실러스 종에 의해 지배되지만 여성 4명 중 1명은 낮은 수준의 유산균이 다양한 혐기성 박테리아의 과증식을 동반하는 세균성 질염을 경험합니다. 이 상태는 생식 및 성 건강에 대한 위험을 포함하여 많은 건강 합병증과 관련이 있습니다. 인간의 질 건강에서 미생물 상호 작용의 복잡한 특성을 보여주는 증거가 증가하고 있지만 이러한 다양한 혐기성 박테리아의 개별 역할은 완전히 이해되지 않았습니다. 이것은 혐기성으로 성장한 질 박테리아를 연구하기위한 적절한 모델이 없기 때문에 복잡합니다. 마우스 모델을 통해 우리는 생체 내에서 이러한 유기체의 생물학과 독성을 조사 할 수 있습니다. 질 박테리아 접종의 다른 마우스 모델이 이전에 설명되었습니다. 여기에서는 혐기성으로 성장한 박테리아의 접종 방법과 기존에 사육된 C57Bl/6 마우스에서 생존 가능한 회복 방법을 설명합니다. 질 접종 및 세척을위한 새롭고 스트레스가 적은 절차 적 방법도 설명합니다. Gardnerella 의 접종 및 생존 가능한 회복이 자세히 설명되어 있으며 Prevotella bivia 및 Fusobacterium nucleatum 과 같은 추가 혐기성 균에 대한 전략이 논의됩니다.
Introduction
포유류에서 질은 박테리아 종의 컨소시엄의 고향입니다. 인간의 질 마이크로바이옴은 락토바실러스 속의 구성원이 풍부하고 그에 상응하는 낮은 질 pH(3.8-4.5)1,2,3,4라는 점에서 포유류 중에서 독특합니다. 이 락토바실러스 우성의 붕괴는 다양한 부정적인 건강 결과와 관련이 있습니다.
세균성 질염(BV)에는 유산균이 더 적고 가드네렐라 질리스 및 프레보텔라 비비아 5,6과 같은 다양한 혐기성 박테리아가 증가합니다. BV가 있는 여성은 성병 7,8,9, 불임 10, 임신 손실 11, 조산 12,13,14, 자궁 내 감염 15, 자궁 감염 16 및 암16,17,18의 위험이 증가합니다. . BV는 또한 양수 감염으로부터 흔히 분리되는 Fusobacterium nucleatum 1,19,20과 같은 잠재적으로 병원성 박테리아에 의한 질 집락화의 더 높은 가능성과 관련이 있습니다 21.
인간의 질 건강에서 혐기성 박테리아의 중요성으로 인해, 이들 유기체의 생물학 및 병인을 조사하는데 사용될 수 있는 동물 모델이 필요하다. 여기에서는 에스트로겐화 마우스에서 Gardnerella vaginalis 의 질 접종 및 생존 가능한 회복 방법을 설명하고 Prevotella bivia 및 Fusobacterium nucleatum에 대한 추가 전략을 제안합니다. 쥐 질 집락화의 다른 모델은 이전에 설명되었지만 호기성으로 배양 된 그룹 B 연쇄상 구균22 및 Neisseria 임질23 과 같은 통성 혐기성 박테리아의 접종 및 회복에 중점을 두었습니다. 절대 혐기성 균의 접종 및 회복은 적절한 실험 전략으로 성공적으로 달성 될 수 있습니다. 우리는 여러 박테리아 분류군의 생존 가능한 회복을 위한 접근 방식을 논의하고 관심 있는 추가 종/균주의 생존 가능성에 대한 조건의 경험적 평가를 제안합니다.
살아있는 박테리아에 의한 식민지화를 추정하는 고전적인 방법은 집락 형성 단위 (CFU)의 회복입니다. 자체 내인성 미생물총을 가진 기존에 사육된 마우스에서 이를 위해서는 접종된 박테리아 균주가 계속 성장할 수 있도록 하면서 내인성 질 미생물총의 구성원에 대해 선택하는 한천 배지에서 회복해야 합니다. 여기에서는 스트렙토마이신 함유 한천 배지에서 선택적으로 회수할 수 있는 G. vaginalis24 의 스트렙토마이신 내성 분리물을 사용합니다. 배지가 충분히 선택적이고 반대로 스트렙토마이신 내성 박테리아가 내인성 마이크로바이옴에 존재하지 않도록 하려면 접종 직전에 수집된 질 세척물을 선택적(스트렙토마이신 함유) 한천에 도금해야 합니다.
접종 준비를위한 가장 좋은 방법은 박테리아의 종과 균주에 따라 다를 수 있습니다. 마우스에서 실험을 시작하기 전에 배양 배지, 성장 종점 및 접종 물 준비에 대한 바람직한 조건뿐만 아니라 PBS의 산소에 대한 감수성 및 생존력을 결정하기위한 예비 작업을 수행해야합니다. 더 많은 산소에 민감한 박테리아의 경우, 접종 물의 대체 제제가 고려 될 수 있습니다 (예 : 적절한 비히클 대조군이있는 혐기성 배양 배지에서) 25,26.
Protocol
모든 동물 실험은 캘리포니아 대학교 샌디에이고 (UCSD, 프로토콜 번호 : S20057, 2020- 이후)의 기관 지침 및 실험실 동물 관리 및 사용 가이드 (UCSD, 프로토콜 번호 : S20057, 2020-이후)와 그 이전에 세인트루이스 워싱턴 대학교 (프로토콜 20110149, 2020 년까지)에 따라 승인 및 수행되었습니다.
참고: 아래 프로토콜은 접종 당시 6-11주에 전통적으로 키운 암컷 C57Bl / 마우스를 사용합니다. 관련 인용 작업에 이전에 사용된 공급업체 정보 및 특정 연령 범위에 유의하십시오.
1. β-에스트라디올 17-발레레이트의 제조 및 투여
참고: β-에스트라디올 17-발레레이트는 발암 물질이며 피부를 통해 흡수될 수 있는 생식 독소입니다27,28. 분말 및 액체 용액을 취급하는 동안 적절한 PPE를 착용하십시오. 또한 수생 독소29; 적절하게 밀봉되고 라벨이 붙은 용기에 적절하게 폐기하십시오.
- 필터는 50mL 원추형 튜브 진공 필터 시스템을 사용하여 0.22μm 필터를 통해 최대 50mL의 참기름을 살균합니다. 무균 상태를 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서만 엽니 다.
- 실험에 필요한 β-에스트라디올 발레레이트 용액의 부피를 계산합니다: 마우스당 200μL에 주사기 충전 중 샘플 손실을 고려하기 위해 2-3mL를 추가로 추가합니다(예: 10-마우스 실험에는 총 4mL가 필요함). 5mg/mL 용액을 만드는 데 필요한 β-에스트라디올 발레레이트의 양을 계산하고 14mL 둥근 바닥 튜브에서 직접 칭량합니다.
- 14mL 튜브를 단단히 덮고 와동시켜 분말의 덩어리를 분해합니다 (이렇게하면 β- 에스트라 디올 발레 레이트가 더 빨리 용해 될 수 있습니다). 멸균 여과 된 참기름을 14mL 튜브에 첨가하여 β- 에스트라 디올 발레 레이트의 최종 농도가 5mg / mL가되도록합니다.
- 단단히 뚜껑을 덮은 14mL 튜브를 37°C의 회전 장치에 놓고 고체 분말이 완전히 녹을 때까지 30-40분 동안 놓습니다. 마우스에 주입하기 전에 용액의 균질성을 육안으로 확인하십시오. 37 ° C에서 배양하면 참기름의 점도가 낮아져 주입이 더 쉬워집니다.
- β- 에스트라 디올 발레 레이트 용액을 1mL 주사기 (바늘없이)에 넣습니다. 거품을 일으키지 않고 이렇게하려면 먼저 약간의 용액을 뽑은 다음 주사기 끝을 참기름에 유지하면서 부드럽게 배출하십시오. 100 μL 표시를 약간 지나서 천천히 용액을 다시 추출하십시오.
- 주사기에 25G x 5/8인치 바늘을 놓습니다. 그런 다음 참기름 용액이 바늘 끝에서 나오기 시작할 때까지 천천히 배출하여 바늘을 프라이밍합니다. 주사기가 100 μL 표시에 도달 할 때까지 용액을 배출하십시오. 마우스 당 하나의 주사기를 준비하십시오.
- 접종 전 48 시간 또는 72 시간에 복강 내 주사로 β- 에스트라 디올 17- 발레 레이트를 투여하십시오. 앞서 설명한 대로 각 마우스에 5mg/mL β-에스트라디올 발레레이트 용액(0.5mg β-에스트라디올 발레레이트/마우스) 22,30μL를 주사합니다. 나머지 용액을 다음 주입까지 4 ° C에서 72 시간 동안 보관하십시오.
- β- 에스트라 디올 발레 레이트 용액을 접종 당일, 마우스의 질 접종 직전에 다시 투여하십시오. 4 ° C에서 용액을 제거하고 참기름이 따뜻해지고 점성이 떨어지도록 주입하기 전에 37 ° C의 회전 장치에 30 분 동안 놓습니다. 1.7단계에 설명된 대로 주사를 진행합니다.
2. 접종물의 제조
알림: 이 섹션에는 혐기성으로 성장한 스트렙토마이신 내성 가드네렐라 질리스 JCP8151B-SmR 24,25,31,32에서 접종물을 준비하는 일반적인 단계가 포함되어 있습니다. 이 섹션의 모든 단계는 혐기성 챔버에서 수행해야합니다.
- 준비된 NYC III 국물, 한천 및 PBS를 포함한 모든 시약을 혐기성 챔버에 넣어 사용하기 최소 24시간 전에 평형을 이루십시오.
참고: 여기에서는 5% 수소 가스 혼합물로 평형화된 비닐 혐기성 챔버를 사용했습니다. 내부 산소 농도는 일반적으로 0ppm이지만 재료를 챔버로 사이클링할 때 낮은 수준의 과도 증가(10-25ppm)가 있을 수 있습니다. - 질 접종 이틀 전에 냉동 글리세롤 스톡에서 가드네렐라 를 혐기성 챔버의 NYC III 한천 플레이트로 제거합니다. 드라이 아이스로 채워진 작은 용기 (예 : 빈 피펫 팁 상자)를 사용하여 챔버 안팎으로 운송하는 동안 글리세롤 스톡을 냉동 상태로 유지하십시오.
- 질 접종 1일 전에 접시에서 5-10개의 개별 가드네렐라 콜로니를 사용하여 NYC III 브로스 10mL를 접종합니다. 액체 배양물이 37°C에서 16시간 동안 밤새 성장하도록 합니다. 접종되지 않은 상태로 남겨진 배양 배지의 두 번째 1mL 분취량을 포함하고 접종된 배양과 함께 배양하여 배지가 오염되지 않았는지 확인합니다.
- 아래에 설명 된대로 액체 배양으로부터 접종 물을 준비하십시오. 가능한 한 혐기성 챔버에서 접종 준비를 수행하십시오.
- 1.5mL 큐벳(1:5 희석)에 800μL의 새로운 배지에 200μL의 배양액을 추가하여 배양 광학 밀도(OD)를 측정합니다. 분광 광도계를 사용하여 600nm의 파장에서 희석 된 배양액의 밀도 (OD)를 측정합니다 (새로운 배지 만 블랭크로 별도의 큐벳 사용). OD 판독값에 5를 곱하여 16시간 배양의 실제 OD600 을 얻습니다.
- 실험에 필요한 접종 물의 양을 계산하십시오. 예를 들어, 마우스 당 20 μL의 접종 물로 15 마리의 마우스를 감염시키기 위해서는 15 x 20 μL = 300 μL의 접종 물이 필요합니다. 필요한 것보다 약 25% 더 많은 접종물을 준비하므로 15마리의 마우스에 대해 300μL + (0.25 x 300μL) = 375μL의 접종물을 준비합니다.
- 2.4.1단계에서 측정된 OD 600을 사용하여 2.4.2단계에서 계산된 부피에서 OD600 = 5.0 접종물을 얻기 위해 스핀다운하고 재현탁해야 하는 16시간 배양물의 부피를 계산합니다. 예를 들어, 배양의 OD600 이 1.5이고 필요한 접종 부피가 375μL인 경우 스핀다운할 배양 부피는 (375μL x 5)/1.5 = 1250μL입니다.
- 단계 2.4.3에서 계산된 배양량을 피펫팅한다. 멸균 마이크로 원심 분리기 튜브에. 16,000 x g 에서 1-3분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다.
- 상청액을 제거하고 단계 2.4.2에서 계산된 부피로 혐기성 PBS에 펠렛을 재현탁시킨다. 접종물은 이제 계산된 OD600 5.0이 됩니다. 적용가능하다면, 또한 감염되지 않은 대조군 내의 마우스에 대한 비히클 대조군으로서 기능할 PBS의 튜브를 준비한다.
- 혐기성 챔버로부터 접종 튜브를 제거하기 전에, PBS에서 1:10 내지 1:10 x 106의 연속 희석 시리즈를 준비한다. 스팟 플레이트 5는 접종물의 CFU를 결정하기 위해 다중 채널 피펫을 사용하여 한천 플레이트에 각 희석액을 반복합니다. 이것은 사전 접종 CFU입니다.
3. 질 전 세척 및 가드네렐라 접종
- 혐기성 챔버에서 질 세척 / 세척 튜브를 준비하십시오 (이것은 2.4 단계에서 접종 준비와 동시에 수행 할 수 있습니다.). 70μL의 멸균 혐기성 PBS를 마우스 번호가 표시된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다. 마우스 당 하나의 세척관을 준비하십시오. 튜브를 단단히 닫고 혐기성 챔버 밖으로 순환시킵니다.
- 단계 3.1에서 제조된 개별 튜브로부터 50 μL 혐기성 PBS로 각 마우스에 질 세척을 수행한다. 이러한 질 세척은 접종 전 세척제이며 다운스트림 측정 및 분석에 사용할 수 있습니다.
- 두 번째 β- 에스트라 디올 발레 레이트 주사 (단계 1.8)를 투여 한 후, 각 마우스를 케이지 또는 앞발로 잡을 수있는 깨끗하고 단단한 표면 위에 놓습니다. 꼬리의 중간 부분을 부드럽게 잡고 뒷부분이 약간 올라가고 질 입구가 노출되도록 들어 올립니다.
- 피펫과 p-200 필터 팁을 사용하여 적절한 마우스에 해당하는 세척관에서 50μL의 PBS를 추출합니다. 피펫 팁을 질 내강 ~ 2-3mm에 부드럽게 삽입하고 50μL 볼륨을 3x-4x 부드럽게 안팎으로 피펫팅합니다.
- 수집된 세척 물질(~50μL)을 원래 있던 동일한 세척 튜브로 다시 옮기고 나머지 20μL의 PBS가 여전히 들어 있는 세척 튜브에서 위아래로 피펫팅합니다. 과도한 점액이 있고 팁이 막히면 깨끗한 p-200 팁을 사용하여 남은 재료를 모아 동일한 세척 튜브에 넣으십시오.
- 농축된 박테리아 현탁액 또는 비히클 대조군 20μL를 각 마우스의 질에 질로 질질적으로 투여합니다. 해당 마우스에 대한 질 세척 직후 각 마우스를 접종합니다(즉, 다음 마우스로 이동하기 전에 각 마우스에 대해 순차적으로 세척 및 접종을 수행). 이 과정을 단순화하려면 두 개의 p200 피펫을 사용하십시오 - 하나는 세척을 위해 50 μL로, 다른 하나는 접종을 위해 20 μL로 설정하십시오.
- 3.2.1단계에 설명된 대로 마우스를 제지합니다. p-200 팁을 사용하여 20μL의 박테리아 현탁액을 질에 피펫팅합니다. 두 가지 다른 박테리아 종/균주를 사용한 공동 접종 실험의 경우 각 박테리아 현탁액 10μL를 사용하고 접종 전에 두 균주를 혼합하지 마십시오.
알림: 질 밖으로 유출되는 것을 방지하기 위해 총 접종량은 20μL를 초과해서는 안 됩니다. - 투여 된 부피가 질 내막에 즉시 고이는 것을 방지하기 위해 각 마우스의 뒷부분을 10-20 초 동안 계속 유지하십시오. 그런 다음 마우스를 새 케이지/용기 또는 이미 접종된 케이지 메이트와 함께 놓습니다.
- 3.2단계를 반복합니다. 및 3.3 단계. 각 마우스에 대해. 아직 접종되지 않은 동물과 함께 새장에 쥐를 다시 넣지 마십시오. 이것은 접종 전에 마우스가 스트렙토 마이신 내성 박테리아에 부주의하게 노출되는 것을 방지합니다.
- 3.2.1단계에 설명된 대로 마우스를 제지합니다. p-200 팁을 사용하여 20μL의 박테리아 현탁액을 질에 피펫팅합니다. 두 가지 다른 박테리아 종/균주를 사용한 공동 접종 실험의 경우 각 박테리아 현탁액 10μL를 사용하고 접종 전에 두 균주를 혼합하지 마십시오.
- 모든 마우스가 접종 된 후, 접종 튜브를 혐기성 챔버로 다시 순환시킵니다. 단계 2.5에 설명된 대로 다른 직렬 희석액을 준비하고 플레이팅합니다. 이것은 접종 후 CFU입니다. 접종 후 플레이트와 접종 전 플레이트의 CFU를 비교하여 동물 접종 중 혐기성 챔버 외부에서 접종물의 생존력이 감소했는지 확인합니다.
- 3.2단계에서 수집한 질 세척물을 접시에 담습니다. 선택적 한천 (이 경우 1 mg / mL 스트렙토 마이신). 플레이트를 37°C의 혐기성 챔버에서 1-2일 동안 인큐베이션하고 성장을 검사합니다.
참고: 성장은 마이크로바이옴의 내인성 구성원이 선택 마커에 내성이 있으므로 표적 유기체의 CFU 열거를 모호하게 할 수 있음을 나타냅니다.
4. 실행 가능한 가드네렐라 식민지화를 결정하기 위한 질 세척 수집
- 질 집락화를 분석하기 위해 선택한 시점에서 질 세척제를 수집합니다. 3.2단계에 설명된 대로 수집합니다.
- 수집 직후, 질 세척제를 혐기성 챔버로 순환시킵니다. 각 세척액 10μL를 사용하여 단계 2.5에 설명된 대로 선택적 한천에 연속 희석 및 도금을 수행합니다. CFU 카운트를 Gardnerella (또는 관심있는 다른 혐기성 균)에 의한 질 식민지화의 척도로 사용하십시오.
5. 희생, 해부 및 조직 균질화
- 각 마우스에서 채취하는 각 장기에 대해 5mL 튜브를 준비합니다(예: 질, 자궁경부, 자궁이 모두 채취되는 경우 마우스당 3개의 튜브를 준비). 혐기성 챔버에서 멸균 혐기성 1x PBS(또는 기타 균질화 매체)로 각 튜브를 채웁니다. 질과 경추를 수집하는 데 사용되는 튜브에는 1mL의 PBS를 사용하고 자궁 뿔을 수집하는 데 사용되는 튜브에는 750μL를 사용하십시오.
- PBS가 추가되면 각 개별 튜브의 무게를 측정합니다(이는 수집 전 중량이며 수확된 각 조직의 총 중량을 결정하는 데 사용됩니다). 혐기성 챔버에서 스케일을 사용할 수 없는 경우, 튜브를 단단히 캡핑하고 칭량할 챔버 밖으로 순환시킨 다음 다시 순환시킵니다.
알림: 튜브 준비 및 체중 수집은 희생 1일 전에 수행할 수 있지만 튜브는 증발을 방지하기 위해 캡을 단단히 밀봉한 상태로 혐기성 챔버에 보관해야 합니다. - 3.1단계에 설명된 대로 질 세척 튜브 세트를 준비합니다. 희생 제물로 마지막 세척을 수집합니다. 또한 탈이온수(DI) 50mL 비커와 70%-90% 에탄올의 두 번째 50mL 비커를 준비하여 희생 중에 표준 강철 해부 도구를 헹구고 살균하는 데 사용합니다.
- 혐기성 챔버에서 PBS로 채워진 장기 수집 튜브를 순환합니다. 티슈를 추가할 준비가 될 때까지 튜브를 단단히 닫아 두십시오.
- IACUC 승인 방법을 사용하여 각 마우스를 희생합니다. 3.2.2단계에 설명된 대로 최종 세척을 수행합니다. 및 3.2.3. 희생 직전 또는 그 직후.
- 해부 및 조직 수집을 시작하십시오. 각 마우스의 복부와 등에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 에탄올 비커에서 가위를 소독하고 건조시킨 다음 마우스 복부 골반강을 수직으로 자릅니다.
- 멸균 집게를 사용하여 피부를 뒤로 당기고 내장을 체강 밖으로 부드럽게 밀어 내고 열린 필드의 측면으로 밀어 넣어 생식 기관을 노출시킵니다.
알림: 장에 구멍을 뚫거나 구멍을 뚫지 않도록 주의하면 실험 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 스트렙토마이신 내성 박테리아가 서식할 수 있습니다. - 최대 질 조직을 수집하려면 부검 중에 음모를 부러 뜨립니다. 멸균 가위를 사용하여 질이 잘리지 않도록 주의하면서 치골의 중심(치골 결합)을 자릅니다. 두 세트의 멸균 집게를 사용하여 골반의 양쪽을 잡고 골반을 옆으로 당겨 질의 아래 부분을 노출시킵니다.
- 집게를 사용하여 자궁 경부를 부드럽게 잡습니다 (주변 조직에 비해 더 단단한 구조). 자궁 경부를 부드럽게 당겨 결장을 드러내고 뒤에 숨겨져 질에 밀접하게 연결되어 있습니다.
- 작은 가위를 사용하여 외부 결합 조직에서 질을 방출하십시오. 결장에서 질을 조심스럽게 분리하고 장에 구멍을 뚫지 마십시오. 완전히 풀리면 가위로 내측의 질 옆구리를 잡고 마우스 몸에서 떼어냅니다.
- 자궁 뿔이 더 잘 보이도록 약간 위로 당기면서 자궁 경부를 부드럽게 잡으십시오. 반면에 오른쪽과 왼쪽의 난소 바로 아래를 잘라 자궁 뿔을 자유롭게하십시오. 체강에서 현재 분리 된 생식 기관을 제거하고 멸균 된 페트리 플레이트에 넣으십시오.
- 면도기를 사용하여 자궁 뿔, 자궁 경부 및 질을 분리하십시오. 각 조직을 각각의 라벨이 붙은 수집 튜브에 넣습니다. 사이토 카인이 수집되면 조직을 추가 한 후 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 조직을 추가한 후 각 튜브의 무게를 다시 잰다. 이것은 수집 후 가중치입니다. 수집 후 무게에서 사전 수집 무게를 빼서 조직의 총 무게를 얻습니다.
- 휴대용 균질화기를 사용하여 수집 튜브의 장기를 균질화하십시오. Gardnerella JCP8151B의 경우 생물 안전 캐비닛 (호기성) 또는 혐기성 챔버에서이 단계를 수행하십시오.
- 샘플 사이의 휴대용 균질화기의 세척 및 무균 처리를 위해 여러 세트의 튜브를 준비하십시오. 각 세트에 3개의 50mL 원뿔형 튜브(하나는 DI 물, 하나는 70% 에탄올, 다른 하나는 1x PBS)가 있는지 확인합니다. 각 마우스 치료 그룹에 대해 별도의 세척 튜브 세트를 준비하십시오.
- 균질 기를 청소하려면 블레이드를 각 세척 튜브의 액체로 내리고 기기를 최대 속도로 돌립니다. 3 개의 튜브 각각에서 균질 기를 약 3 초 동안 유지하십시오. 세척 순서는 DI 물(물리적 파편 제거), 에탄올(살균), 마지막으로 1x PBS(중화)입니다. 프로브를 종이 타월이나 일회용 벤치 패드에 흔들어 각 헹굼 사이에 과도한 액체를 제거합니다.
- 초기 헹굼 후, 균질화기 프로브를 수집 튜브의 바닥으로 낮추고 조직을 아래에 포획하여 조직을 균질화합니다. 균질화기를 켜서 조직을 갈아서 잠긴 상태에서 프로브를 약 5배 위아래로 부드럽게 움직입니다. 각 장기를 약 15-30 초 동안 균질화하십시오.
- 튜브에서 균질 기를 끄고 제거한 후 내용물을 육안으로 검사하여 완전한 조직 파괴를 확인하십시오. 이것은 자궁 경부와 질에 특히 중요하며 때로는 프로브에 걸리지 않습니다.
참고: 자궁 뿔의 과도한 지방이 완전히 균질화되지 않아도 괜찮습니다. - 5.14.1.-5.14.4.단계를 반복하여 각 샘플 사이에서 프로브를 세척하고 멸균합니다. 각 실험 그룹에 대해 새로운 세척 튜브 세트로 전환하십시오.
- 균질화 된 샘플이있는 튜브를 혐기성 챔버로 옮깁니다. 각 조직의 박테리아 부담을 확인하려면 혼합할 샘플의 간단한 부드러운 와동을 수행한 다음 CFU 측정을 위해 선택적 한천에서 연속 희석 및 도금을 위해 100μL의 조직 균질액을 제거합니다(첫 번째 희석은 1 x 100). 검출 하한이 필요한 경우 희석되지 않은 균질액 200-250 μL의 확산 도금을 수행합니다.
Representative Results
예제 실험의 도식적 표현은 설명된 프로토콜을 수행할 수 있는 몇 가지 방법을 보여줍니다(그림 1).
일부 동물은 질 미생물군집에 내인성 미생물을 운반하여 비선택적 배지에서 자랄 것입니다. 여기에 설명된 방법은 내인성 박테리아에 대해 선택하기 위해 스트렙토마이신을 포함하는 선택적 배지와 함께 연구된 박테리아 균주의 스트렙토마이신 내성 분리주에 의존합니다(그림 2A,B). 스트렙토 마이신 내성이 자발적으로 발생할 수 있으므로 감염 전에 마우스를 확인하면 (0 일째 세척) 이것이 문제가 될 수 있는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.
질 세척에서 생존 가능한 박테리아의 회수는 한천 배지에 연속 희석 및 도금에 의해 수행됩니다. 표준 페트리 접시는 5μL 스팟의 최대 6 x 6 어레이를 보유할 수 있으므로 10배 연속 희석을 사용하는 경우 각 샘플에 대해 6배에 걸쳐 6개의 복제 스팟에서 박테리아 역가를 열거할 수 있습니다(그림 3A). 이 방법은 Gardnerella에서 Prevotella 및 Fusobacterium에 이르는 박테리아의 역가를 열거하는 데 사용할 수 있습니다 (그림 3B-D).
함께, 이러한 방법을 통해 가설을 테스트하고 여성 생식 기관의 박테리아 식민지 / 감염에 대한 해석을 할 수 있습니다. 예를 들어, 질 세척제와 질 조직 균질액에서 Gardnerella 역가의 비교는 이러한 방법 간의 일치를 입증했습니다(그림 4A). 마찬가지로, 질 공동 접종 모델에서 자궁 조직에서 Prevotella의 역가는 Prevotella 단일 감염에 비해 Gardnerella 공동 감염 동안 유의하게 높았습니다 (약 20 배). 마지막으로, 야생형 대 돌연변이 박테리아 균주를 이러한 모델에서 비교하여 생식 기관 집락화 / 감염 과정에서 특정 유전자와 그 산물이 수행하는 역할을 확립 할 수 있습니다. 예를 들어, 탄수화물 시알산을 운반하고 섭취하는 능력이 부족한 Fusobacterium의 돌연변이 균주는 접종 후 3일까지 집락화 수준을 낮췄습니다(그림 4C).
그림 1: 예제 실험의 개략도33. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 선택적 대 비선택적 한천에서 내인성 쥐 질 미생물의 성장. 5마리의 암컷 C57Bl/6 마우스(1-5)의 질 세척을 2개의 다른 NYC III 한천 플레이트에 줄무늬로 만들고 혐기성 배양했습니다. (A) 왼쪽의 플레이트에는 항생제가 포함되어 있지 않으며 쥐의 질관에서 내인성 혐기성 박테리아의 성장을 허용합니다. (B) 오른쪽 플레이트에는 1mg/mL 스트렙토마이신이 포함되어 있으며 내인성 박테리아의 성장에 대해 선택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 질 세척에서 생존 가능한 G. vaginalis, P. bivia 및 F. nucleatum CFU의 회복. (A) G. vaginalis JCP8151B-SmR 접종 물의 CFU, NYC III 한천에 희석 시리즈로 복제 도금. (B-D) 단일 감염 동물의 질 세척에서 생존 가능한 (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 및 (D) F. 핵26의 회복. 각 그래프 (B-D)에 대해, 데이터는 실험 당 10-15 마리의 마우스와 함께 24,25,26 개의 독립적 인 실험으로부터 결합된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 쥐 질 접종 모델에서 혐기성 박테리아 집락화에 대한 추가 분석 . (A) 질 세척제에서의 G . vaginalis 역가는 접종 후 24 시간 및 72 시간에 질 조직 균질 물로부터 회수 된 G. vaginalis 역가와 상관 관계가 있습니다 (2 개의 독립적 인 실험의 조합, 각각 n = 10. Spearman의 순위 상관 테스트에 의해 결정된 유의성)24. (B) G. vaginalis 와의 공동 감염은 접종 후 48 시간에 P. bivia 단일 감염된 동물과 비교할 때 자궁 경적 조직에서 P. bivia 역가를 증가시킵니다 (각각 그룹 당 6-10 마리의 마우스를 대상으로 한 두 개의 독립적 인 실험의 조합). Mann-Whitney U-검정에 의해 결정된 유의성, **p = 0.0017)25. (C) 파쇄된 시알산 수송체(Ω SiaT)를 갖는 F. 핵 돌연변이체는 접종 후 72시간에 F. 핵 야생형에 비해 단일 감염 마우스의 질 세척에서 역가가 감소했습니다(각각 그룹당 10마리의 마우스를 갖는 2개의 독립적인 실험의 조합). Mann-Whitney U-검정에 의해 결정된 유의성, **p < 0.01)26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 혐기성 조건에서 성장한 다양한 질 박테리아에 사용되는 방법의 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 모델이 이전에 발표 된 질 접종 모델과 다른 가장 중요한 방법은 생존 가능한 접종 물의 준비 및 마우스로부터의 박테리아 회수에 특별한 고려가 필요한 혐기성 배양 박테리아의 사용입니다. 위 프로토콜의 특정 단계는 보충 파일 1에 제안된 대로 사용된 박테리아의 종/균주에 따라 약간 다를 수 있습니다. 또한이 원고는 박테리아 및 질 세척제 투여를위한 새로운 절차 적 방법을 설명하는데, 이는 조사자의 경험이 적고 마우스에 대한 구속이 적습니다. 실험자가 3.2 단계에서 설명한 구속 형태에 익숙하지 않은 경우. 단계 3.3.을 참조하면, 마우스는 실험 설계 및 제도적 IACUC 가이드라인에 따라 마취 유무에 관계없이 앞서 기술된 바와 같이 (34 ) 대신에 긁힐 수 있다.
쥐 모델에서 혐기성 배양 박테리아를 사용할 때 중요한주의 사항은 특정 단계 (예 : 살아있는 동물과 관련된 모든 단계)가 혐기성 챔버 외부에서 수행되어야한다는 것입니다. 따라서이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 관심 박테리아가 마우스 접종 중과 같이 호기성 환경에 노출되는 단계입니다. 이 모델에서 새로운 혐기성 균을 사용하려면 산소 노출시 생존력을 유지하는 능력에 대한 예비 조사가 필요합니다 (예 : 2.5 단계 및 3.4 단계에 설명 된대로 접종 전 및 접종 후 CFU의 비교). 유기체의 산소 및 PBS 민감도의 정도에 따라 다른 접종 준비 방법을 고려해야합니다 (보충 파일 1, 2.4.5 단계). G. vaginalis JCP8151B를 사용한 접종의 경우, PBS에서 단일 접종 튜브를 준비하고 모든 마우스를 감염시키는 데 사용할 수 있음을 발견했습니다. 산소에 더 민감한 다른 혐기성 박테리아를 사용하는 경우 대신 각 마우스에 대해 별도의 튜브에 접종물을 준비하여 튜브를 반복적으로 열고 닫을 필요가 없습니다. 마찬가지로, 관심 박테리아 종이 G. vaginalis 보다 PBS에서 더 까다 롭고 생존 능력이 낮은 경우 대신 배양 배지에서 접종을 준비 할 수 있습니다. 사용 된 배지에 Prevotella bivia 배양에 사용 된 CDC 혐기성 배지와 같은 환원제가 포함 된 경우 (보충 파일 1, 2.1 단계 및 2.2 단계), 박테리아는 산소 노출로부터 보호가 증가합니다.
비드 비팅(22,35)과 같은 균질화를 위한 대안적인 방법도 고려될 수 있는데, 이는 튜브 캡이 닫힌 상태에서 수행되고, 따라서 휴대용 균질화기보다 더 적은 산소를 도입할 수 있다. 또한 산소에 더 민감한 유기체는 배지에 대해 더 긴 평형 시간이 필요할 수 있습니다. resazurin과 같은 산소 지시약을 사용하여 혐기성 조건에 도달했는지 확인할 수 있습니다 (단계 2.1). 혐기성 항아리와 같은 대체 방법은 결과에 영향을 미칠 수 있으며 사용하기 전에 박테리아 생존 가능성을 검사해야 합니다.
실험 유기체의 산소 민감도 및 까다로움은 또한 세척/균질화 동안 마우스로부터 생존 가능한 박테리아를 성공적으로 회수하는 역할을 할 수 있다(보충 파일 1, 단계 3.2. 및 단계 5.1). 매우 민감한 유기체의 경우, 세척과 도금 사이의 시간은 생존력의 상실로 이어질 수 있으며 박테리아 질 식민지화의 인위적으로 낮은 추정치를 유발할 수 있습니다. 이 효과를 완화하기 위해 수집 된 세척물을 즉시 신선한 혐기성 배양 배지 (환원제 포함)로 희석 할 수 있습니다. 유사하게, 장기 균질화는 박테리아 생존력을 높이기 위해 PBS가 아닌 신선한 배양 배지에서 수행 할 수 있으며 산소 노출을 최소화하기 위해 혐기성 챔버 자체에서도 수행 할 수 있습니다.
주어진 실험의 목적에 따라 실험자는 대조군에주의를 기울여야합니다. 가설을 테스트하기 위해, 비히클만으로 모의 처리된 감염되지 않은 대조군 마우스의 기준선 측정은 케모카인/사이토카인의 유도 또는 감염의 다른 특정 결과가 있는지 확인하는 데 도움이 될 것이다. 사용된 대조 비히클은 접종에 사용된 비히클과 동일해야 하므로 박테리아가 배양 배지에 접종되는 경우 접종되지 않은 배양 배지를 대조군으로 사용해야 합니다(보충 파일 1, 단계 2.4.5.).
이 프로토콜에 설명 된 방법은 혐기성으로 성장할 수 있지만 전통적으로 호기성 배양 조건 (예 : 대장균 또는 그룹 B 연쇄상 구균)을 사용하여 연구 된 통성 박테리아에도 적용될 수 있습니다. 이것은 자궁 경부와 같이 낮은 수준의 산소를 포함하는 것으로 여겨지는 신체 부위에서 이러한 유기체에 의한 감염과 특히 관련이있을 수 있습니다. 통성 유기체는 접종 물이 호기성에 비해 혐기성으로 준비 될 때 산소가 적은 부위를 더 성공적으로 감염시킬 수 있습니다. 이러한 실험에서, CFU 열거를 위한 생존 가능한 박테리아의 회수는 혐기성 조건을 필요로 하지 않을 수 있다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 이러한 모델을 개발하는 동안 기술 지원에 대해 Lynne Foster를 인정합니다. 분자 미생물학과와 여성 전염병 연구 센터 (AL)의 창업 자금과 초기 단계 실험을 지원하는 데 도움이 된 다임의 행진 (AL에 대한 Basil O'Connor 상)에 감사드립니다. 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (R01 AI114635)도 이러한 모델의 개발을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
References
- Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
- Ravel, J., et al.
- Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K.
- van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
- Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
- Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
- Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
- Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
- Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
- Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
- Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
- Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
- DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
- Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
- Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
- Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
- Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
- Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
- Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
- Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
- DiGiulio, D. B.
- Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
- Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
- Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
- Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
- Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
- Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
- Yager, J. D., Davidson, N. E.
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L.
- Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
- Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
- Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
- Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).
