Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Модели вагинальной колонизации мышей анаэробно выращенными бактериями

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/64032
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 2,3, 4, 2,3
1Division of Biology and Biomedical Sciences, Washington University School of Medicine, 2Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, University of California, 3Glycobiology Research and Training Center, UCSD, 4Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine

Summary

В протоколе представлена мышиная модель вагинальной колонизации анаэробно культивируемыми вагинальными бактериями человека. Мы фокусируемся на Gardnerella vaginalis, включая предложения для Prevotella bivia и Fusobacterium nucleatum. Этот протокол также может быть использован в качестве руководства для вагинальных прививок и жизнеспособного восстановления других анаэробно выращенных бактерий.

Abstract

Влагалище млекопитающих может быть колонизировано многими бактериальными таксонами. В микробиоме влагалища человека часто доминируют виды Lactobacillus , но каждая четвертая женщина испытывает бактериальный вагиноз, при котором низкий уровень лактобактерий сопровождается чрезмерным ростом разнообразных анаэробных бактерий. Это состояние было связано со многими осложнениями со здоровьем, включая риски для репродуктивного и сексуального здоровья. Хотя появляется все больше доказательств, свидетельствующих о сложной природе микробных взаимодействий в здоровье влагалища человека, индивидуальные роли этих различных анаэробных бактерий не полностью поняты. Это осложняется отсутствием адекватных моделей для изучения анаэробно выращенных вагинальных бактерий. Мышиные модели позволяют исследовать биологию и вирулентность этих организмов in vivo. Ранее были описаны другие мышиные модели вагинальной бактериальной инокуляции. Здесь мы описываем методы инокуляции анаэробно выращенных бактерий и их жизнеспособного восстановления у традиционно выращенных мышей C57Bl/6. Также описан новый, менее стрессовый процедурный метод вагинальной прививки и промывания. Подробно описаны инокуляция и жизнеспособное восстановление Gardnerella , а также обсуждаются стратегии для дополнительных анаэробов, таких как Prevotella bivia и Fusobacterium nucleatum .

Introduction

У млекопитающих влагалище является домом для консорциума видов бактерий. Микробиом влагалища человека уникален среди млекопитающих обилием представителей рода Lactobacillus и соответствующим низким рН влагалища (3,8-4,5)1,2,3,4. Нарушение этого доминирования Lactobacillus связано с различными негативными последствиями для здоровья.

При бактериальном вагинозе (БВ) меньше лактобактерий и повышенное обилие разнообразных анаэробных бактерий, таких как Gardnerella vaginalis и Prevotella bivia 5,6. Женщины с БВ подвергаются повышенному риску инфекций, передающихся половым путем 7,8,9, бесплодия10, потерь беременности11, преждевременных родов 12,13,14, внутриутробных инфекций15, инфекций шейки матки 16 и рака 16,17,18 . BV также связан с более высокой вероятностью вагинальной колонизации потенциально патогенными бактериями, такими как Fusobacterium nucleatum 1,19,20, распространенный изолят от инфекций амниотической жидкости21.

Из-за важности анаэробных бактерий в здоровье влагалища человека существует потребность в животных моделях, которые могут быть использованы для исследования биологии и патогенеза этих организмов. Здесь мы описываем методы вагинальной прививки и жизнеспособного восстановления Gardnerella vaginalis у эстрогенизированных мышей и предлагаем дополнительные стратегии для Prevotella bivia и Fusobacterium nucleatum. Другие модели вагинальной колонизации мышей были ранее описаны, но они были сосредоточены на инокуляции и восстановлении факультативных анаэробных бактерий, таких как Streptococcus22 группы B и Neisseria gonorrhoeae23 , которые культивировались аэробно. Инокуляция и восстановление облигатных анаэробов могут быть успешно выполнены с помощью соответствующих экспериментальных стратегий. Мы обсуждаем подходы к жизнеспособному восстановлению нескольких бактериальных таксонов и предлагаем эмпирическую оценку условий жизнеспособности дополнительных видов/штаммов, представляющих интерес.

Классическим методом оценки колонизации живыми бактериями является восстановление колониеобразующих единиц (КОЕ). У традиционно выращенных мышей с собственной эндогенной микробиотой это требует восстановления на агаровой среде, которая выбирает против членов эндогенной вагинальной микробиоты, в то же время позволяя инокулированному штамму бактерий расти. Здесь мы используем устойчивый к стрептомицину изолят G. vaginalis24 , который может быть избирательно восстановлен на стрептомицинсодержащей агаровой среде. Чтобы среда была достаточно селективной и, наоборот, чтобы в эндогенном микробиоме отсутствовали устойчивые к стрептомицину бактерии, вагинальные лаважи, собранные непосредственно перед инокуляцией, должны быть покрыты селективным (стрептомицинсодержащим) агаром.

Лучший способ приготовления инокулята может варьироваться в зависимости от вида и штаммов бактерий. До начала экспериментов на мышах следует провести предварительную работу по определению предпочтительных условий для питательной среды, конечной точки роста и приготовления инокулята, а также восприимчивости к кислороду и жизнеспособности в ПБС. В случае более чувствительных к кислороду бактерий можно рассмотреть альтернативные препараты инокулята (например, в анаэробной питательной среде с соответствующей контрольной группой транспортного средства)25,26.

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены и проведены в соответствии с институциональными руководящими принципами и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Калифорнийского университета в Сан-Диего (UCSD, номер протокола: S20057, 2020-далее), а до этого в Вашингтонском университете, Сент-Луис (протокол 20110149, до 2020 года).

ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном ниже протоколе используется традиционно выращенная самка C57Bl/ мышей в возрасте 6-11 недель на момент инокуляции. Обратите внимание на информацию о поставщиках и конкретные возрастные диапазоны, используемые ранее в соответствующей цитируемой работе.

1. Препарат и введение β-эстрадиола 17-валерата

ПРИМЕЧАНИЕ: β-эстрадиол 17-валерат является канцерогеном и репродуктивным токсином, который может всасываться через кожу 27,28. Изнашивайте надлежащие СИЗ во время обработки порошка и жидкого раствора. Это также водный токсин29; утилизируйте его надлежащим образом в надлежащим образом запечатанном и маркированном контейнере.

  1. Фильтр стерилизует до 50 мл кунжутного масла через фильтр 0,22 мкм с использованием 50 мл конической трубчатой вакуумной фильтрующей системы. Открываются только в шкафу биобезопасности для поддержания стерильности.
  2. Рассчитайте объем раствора валерата β-эстрадиола, необходимого для эксперимента: 200 мкл на мышь плюс 2-3 мл дополнительно для учета потерь образца во время заполнения шприца (например, эксперимент на 10 мышах требует в общей сложности 4 мл). Рассчитайте количество β-эстрадиола валерата, необходимого для приготовления раствора 5 мг/мл, и взвесьте его непосредственно в трубке с круглым дном объемом 14 мл.
  3. Плотно закройте трубку объемом 14 мл и вихрь, чтобы разбить сгустки в порошке (это позволит β-эстрадиола валерату растворяться быстрее). Добавьте стерильно-фильтрованное кунжутное масло в пробирку объемом 14 мл таким образом, чтобы конечная концентрация β-эстрадиола валерата составляла 5 мг/мл.
  4. Поместите плотно закрытую трубку объемом 14 мл на ротатор при 37 °C в течение 30-40 мин, пока твердый порошок полностью не растворится. Визуально подтверждают однородность раствора перед инъекцией мышам. Инкубация при 37 °C снижает вязкость кунжутного масла, облегчая его инъекцию.
  5. Вводят раствор β-эстрадиола валерата в шприц объемом 1 мл (без иглы). Чтобы сделать это без введения пузырьков, сначала нарисуйте немного раствора, затем аккуратно вытолкните, сохранив кончик шприца в кунжутном масле. Вытягивайте раствор снова медленно, немного выше отметки 100 мкл.
  6. Поместите иглу размером 25 Г х 5/8 на шприц. Затем загрунтуйте иглу, медленно выталкивая раствор кунжутного масла, пока он не начнет выходить из кончика иглы. Выталкивайте раствор до тех пор, пока шприц не достигнет отметки 100 мкл. Приготовьте по одному шприцу на мышь.
  7. Вводят β-эстрадиола 17-валерат путем внутрибрюшинной инъекции за 48 ч или 72 ч до инокуляции. Вводят каждой мышке 100 мкл 5 мг/мл раствора β-эстрадиола валерата (0,5 мг β-эстрадиола валерата на мышь), как описано ранее22,30. Хранить оставшийся раствор при 4 °С в течение 72 ч до следующей инъекции.
  8. Снова вводят раствор β-эстрадиола валерата в день инокуляции, непосредственно перед вагинальной инокуляцией мышей. Снимите раствор с температуры 4 °C и поместите его на ротатор при 37 °C в течение 30 мин перед инъекцией, чтобы кунжутное масло нагрелось и стало менее вязким. Продолжайте инъекции, как описано в шаге 1.7.

2. Приготовление инокулята

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел содержит общие этапы приготовления инокулы из анаэробно выращенной стрептомицин-резистентной Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Все шаги в этом разделе должны быть выполнены в анаэробной камере.

  1. Зациклите любые реагенты, включая приготовленный отвар NYC III, агар и PBS, в анаэробную камеру, чтобы уравновесить по крайней мере за 24 часа до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовалась виниловая анаэробная камера, уравновешенная 5% газовой смесью водорода. Внутренняя концентрация кислорода обычно находится на уровне 0 ppm, хотя при циклическом попадании материалов в камеру может наблюдаться низкоуровневое переходное увеличение (10-25 ppm).
  2. За два дня до вагинальной прививки выведите гарднереллу из замороженного запаса глицерина на агаровую пластину NYC III в анаэробной камере. Используйте небольшой контейнер (например, пустой ящик для пипетки), заполненный сухим льдом, чтобы запас глицерина был заморожен во время транспортировки в камеру и из нее.
  3. За 1 день до вагинальной прививки используйте 5-10 отдельных колоний гарднереллы из пластины для прививки 10 мл отвара NYC III. Дайте жидкой культуре расти в течение ночи в течение 16 ч при 37 °C. Включите вторую аликвоту 1 мл питательной среды, которую оставляют неинокализованной, и инкубируйте ее вместе с инокулированной культурой, чтобы подтвердить, что среда не загрязнена.
  4. Приготовьте инокулятив из жидкой культуры, как описано ниже. Выполняйте приготовление инокулята в анаэробной камере как можно больше.
    1. Определяют оптическую плотность культуры (OD) путем добавления 200 мкл культуры к 800 мкл свежей среды в кювете 1,5 мл (разбавление 1:5). Используйте спектрофотометр для измерения плотности (OD) разбавленной культуры на длине волны 600 нм (используйте отдельную кювету только со свежими средами в качестве заготовки). Умножьте показания OD на 5, чтобы получить фактический OD600 из 16-часовой культуры.
    2. Рассчитайте объем инокулята, необходимый для эксперимента. Например, чтобы заразить 15 мышей инокулятором 20 мкл на мышь, необходимо 15 х 20 мкл = 300 мкл инокулята. Приготовьте примерно на 25% больше инокулята, чем необходимо, поэтому для 15 мышей приготовьте 300 мкл + (0,25 х 300 мкл) = 375 мкл инокулята.
    3. Используя OD600 , определенный на шаге 2.4.1., рассчитайте объем культуры за 16 ч, который необходимо раскрутить и повторно суспендировать, чтобы получить OD600 = 5,0 инокулята в объеме, рассчитанном на шаге 2.4.2. Например, если OD600 культуры равен 1,5, а необходимый объем инокулята составляет 375 мкл, то объем культуры, подлежащей раскручиванию, составляет (375 мкл х 5)/1,5 = 1250 мкл.
    4. Пипетка объема культуры рассчитана на шаге 2.4.3. в стерильную микроцентрифужную трубку. Гранулируют бактерии центрифугированием при 16 000 х г в течение 1-3 мин.
    5. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в анаэробном PBS в объеме, рассчитанном на этапе 2.4.2. Инокулятив теперь будет иметь расчетный OD600 5,0. Если применимо, также подготовьте трубку PBS, которая будет служить в качестве контроля транспортного средства для мышей в неинфицированной контрольной группе.
  5. Перед извлечением трубки инокулята из анаэробной камеры подготовьте серию последовательного разведения от 1:10 до 1:10 x 106 в PBS. Точечная пластина 5 реплицирует каждое разбавление на агаровую пластину с использованием многоканальной пипетки для определения КОЕ инокулята. Это предпрививочная КОЕ.

3. Вагинальное предварительное промывание и прививка гарднереллой

  1. Подготовьте вагинальное промывание/промывные трубки в анаэробной камере (это можно сделать одновременно с приготовлением инокулята на этапе 2.4.). Пипетка 70 мкл стерильного, анаэробного PBS в 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, помеченных номерами мышей. Подготовьте по одной промывочной трубке на мышь. Плотно закройте трубки и выведите их из анаэробной камеры.
  2. Выполните вагинальное промывание каждой мыши с 50 мкл анаэробной PBS из отдельных пробирок, приготовленных на этапе 3.1. Эти влагалищные промывания являются промывками перед прививкой и могут использоваться для последующих измерений и анализов.
    1. После введения второй инъекции β-эстрадиола валерата (шаг 1.8) поместите каждую мышь поверх клетки или чистой твердой поверхности, которую она может схватить передними лапами. Осторожно захватите среднюю часть хвоста и поднимите так, чтобы задние четвертины были слегка приподняты, а влагалищное отверстие открыто.
    2. Используя пипетку и наконечник фильтра p-200, вытяните 50 мкл PBS из промывочной трубки, соответствующей соответствующей мыши. Осторожно вставьте кончик пипетки во влагалищный просвет ~2-3 мм, а пипетку объемом 50 мкл осторожно, 3x-4x.
    3. Перенесите собранный моющий материал (~ 50 мкл) обратно в ту же промывочную трубку, из которой он пришел, пипетируя вверх и вниз в промывочной трубке, которая все еще содержит оставшиеся 20 мкл PBS. Если слизь избыточна и кончик засоряется, используйте чистый наконечник p-200, чтобы собрать оставшийся материал и поместить его в ту же промывочную трубку.
  3. Вагинально вводят 20 мкл концентрированной бактериальной суспензии или контроля транспортного средства во влагалище каждой мыши. Инокулируйте каждую мышь сразу после вагинального лаважа для этой мыши (т. Е. Выполняйте промывание и инокуляцию последовательно для каждой мыши, прежде чем перейти к следующей). Чтобы упростить этот процесс, используйте две пипетки p200 - одна установлена на 50 мкл для промывания, а другая на 20 мкл для прививок.
    1. Удерживайте мышь, как описано в шаге 3.2.1. Используя наконечник p-200, пипетку 20 мкл бактериальной суспензии во влагалище. Для экспериментов по совместной вакцинации с использованием двух различных видов / штаммов бактерий используйте 10 мкл каждой бактериальной суспензии и избегайте смешивания двух штаммов перед посевом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем прививок не должен превышать 20 мкл, чтобы избежать перетекания из влагалища.
    2. Продолжайте удерживать задний конец каждой мыши в течение 10-20 с, чтобы предотвратить немедленное накопление введенного объема во влагалищном интроитусе. Затем поместите мышь в новую клетку / сосуд или с партнерами по клетке, которые уже были привиты.
    3. Повторите шаг 3.2. и шаг 3.3. для каждой мыши. Никогда не помещайте мышей обратно в клетку с животными, которые еще не были привиты. Это предотвращает непреднамеренное воздействие на мышей устойчивых к стрептомицину бактерий перед прививкой.
  4. После того, как все мыши были привиты, циклическую трубку инокулята обратно в анаэробную камеру. Подготовьте и нанесите еще одно последовательное разбавление, как описано на этапе 2.5. Это пост-инокуляционный КОЕ. Сравните КОЕ из пластин после инокуляции и до инокуляции, чтобы определить, снизилась ли жизнеспособность инокулята за пределами анаэробной камеры во время посева животных.
  5. Пластинчатые влагалищные промывания собраны на этапе 3.2. на селективный агар (в данном случае 1 мг/мл стрептомицина). Инкубируйте пластины в течение 1-2 дней в анаэробной камере при 37 °C и исследуйте на наличие роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рост указывает на то, что эндогенные члены микробиома устойчивы к маркеру отбора и, следовательно, могут скрывать перечисление КОЕ целевого организма.

4. Сбор влагалищных лаважей для определения жизнеспособной колонизации Gardnerella

  1. Соберите вагинальные промывки в выбранные моменты времени, чтобы проанализировать колонизацию влагалища. Соберите, как описано в шаге 3.2.
  2. Сразу после сбора проведите вагинальные промывания в анаэробную камеру. Используйте 10 мкл каждого промывания для выполнения последовательного разбавления и нанесения покрытия на селективный агар, как описано на этапе 2.5. Используйте количество КОЕ в качестве меры вагинальной колонизации гарднереллой (или другим анаэробом, представляющим интерес).

5. Жертвоприношение, рассечение и гомогенизация тканей

  1. Подготовьте трубку 5 мл для каждого органа, собираемого у каждой мыши (например, если собираются влагалище, шейка матки и матка, подготовьте три трубки на мышь). Заполните каждый тюбик стерильным анаэробным 1x PBS (или другими средами гомогенизации) в анаэробной камере. Используйте 1 мл PBS для трубок, используемых для сбора влагалища и шейки матки, и 750 мкл для трубок, используемых для сбора маточных рогов.
  2. После добавления PBS взвесьте каждую отдельную трубку (это вес перед сбором и будет использоваться для определения общего веса каждой собранной ткани). Если весы недоступны в анаэробной камере, плотно закройте трубки и выведите их из камеры для взвешивания, а затем верните их обратно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка трубок и сбор веса могут быть сделаны за 1 день до жертвоприношения, но трубки должны храниться в анаэробной камере с плотно закрытыми колпачками для предотвращения испарения.
  3. Подготовьте набор ванн для промывания влагалища, как описано в шаге 3.1. собрать последний промывание при жертвоприношении. Кроме того, приготовьте стакан деионизированной (DI) воды объемом 50 мл и второй стакан 70-90% этанола объемом 50 мл для использования для промывки и стерилизации стандартных инструментов для рассечения стали во время жертвоприношения.
  4. Выведите заполненные PBS трубки для сбора органов из анаэробной камеры. Держите трубки плотно закрытыми, пока ткани не будут готовы к добавлению.
  5. Принесите в жертву каждую мышь, используя методы, одобренные IACUC. Выполните окончательное промывание, как описано в шагах 3.2.2. и 3.2.3. либо непосредственно перед жертвоприношением, либо сразу после него.
  6. Начинают рассечение и сбор тканей. Распылите вниз по животу и спине каждой мыши 70% этанола. Стерилизуйте ножницы в стакане с этанолом, дайте им высохнуть, а затем сделайте один вертикальный срез мышей абдоминопелвистической полости.
  7. Используйте стерильные щипцы, чтобы оттянуть кожу назад и осторожно вытолкнуть кишечник из полости тела и в сторону открытого поля, что обнажит репродуктивный тракт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть или не проколоть кишечник, так как они могут содержать устойчивые к стрептомицину бактерии, которые могут спутать результаты экспериментов.
  8. Чтобы собрать максимум влагалищной ткани, переломите лобковую кость во время некропсии. Используя стерильные ножницы, обрежьте центр лобковой кости (лобковый симфиз), стараясь не врезаться во влагалище. Используя два набора стерильных щипцов, захватите каждую сторону таза и потяните таз открытым сбоку, обнажая нижнюю часть влагалища под ним.
  9. Используйте щипцы, чтобы мягко захватить шейку матки (более твердая структура по сравнению с окружающими тканями). Осторожно подтяните шейку матки, чтобы обнажить толстую кишку, скрытую позади и тесно связанную с влагалищем.
  10. Используйте небольшие ножницы, чтобы освободить влагалище от наружных соединительных тканей. Тщательно отделите влагалище от толстой кишки и избегайте прокалывания кишечного тракта. Когда вы полностью освобождены, обрамляйте влагалище в интроиту ножницами и ножницами, чтобы освободиться от тела мыши.
  11. Поддерживайте мягкий захват шейки матки, слегка подтягиваясь, чтобы сделать рога матки более заметными. Другой рукой обрежьте непосредственно под яичниками с правой и левой стороны, чтобы освободить рога матки. Удалите теперь отключенный репродуктивный тракт из полости тела и поместите его в стерильную пластину Петри.
  12. С помощью бритвы отделите рога матки, шейку матки и влагалище. Поместите каждую ткань в соответствующую маркированную коллекционную трубку. Если цитокины собираются собирать, поместите трубки на лед после добавления ткани.
  13. Взвесьте каждый тюбик еще раз после того, как ткань была добавлена. Это вес после сбора. Вычтите вес до сбора из веса после сбора, чтобы получить общий вес ткани.
  14. Используйте портативный гомогенизатор для гомогенизации органов в их коллекционных трубках. Для Gardnerella JCP8151B выполните этот шаг в шкафу биобезопасности (аэробно) или анаэробной камере.
    1. Подготовьте несколько комплектов трубок для промывки и асептической обработки ручного гомогенизатора между образцами. Убедитесь, что каждый набор имеет три конические трубки по 50 мл: одна заполнена водой DI, одна с 70% этанолом, а третья с 1x PBS. Подготовьте отдельный набор промывочных трубок для каждой группы лечения мышей.
    2. Чтобы очистить гомогенизатор, опустите лезвия в жидкость в каждой промывочной трубке и поверните прибор на максимальную скорость. Держите гомогенизатор в каждой из трех трубок около 3 с. Порядок промывки - вода DI (для удаления физического мусора), затем этанол (для дезинфекции) и, наконец, 1x PBS (для нейтрализации). Встряхните зонд на бумажное полотенце или одноразовую прокладку для скамейки, чтобы удалить лишнюю жидкость между каждым ополаскивателем.
    3. После первоначального промывания гомогенизируйте ткани, опустив зонд гомогенизатора на дно коллекционной трубки, захватывая ткань под ней. Включите гомогенизатор, чтобы измельчить ткань, осторожно перемещая зонд вверх и вниз примерно в 5 раз, оставаясь под водой. Гомогенизируйте каждый орган в течение примерно 15-30 с.
    4. После выключения и извлечения гомогенизатора из пробирки визуально осмотрите содержимое, чтобы убедиться в полном разрушении тканей. Это особенно важно для шейки матки и влагалища, которые иногда не могут быть пойманы зондом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально, если избыток жира на рогах матки не полностью гомогенизируется.
    5. Повторите шаги 5.14.1.-5.14.4., промывая и стерилизуя зонд между каждым образцом. Переключитесь на новый набор промывочных трубок для каждой экспериментальной группы.
  15. Переместите трубки с гомогенизированными образцами в анаэробную камеру. Чтобы определить бактериальную нагрузку каждой ткани, выполняют кратковременное мягкое вихрь образца для смешивания, затем удаляют 100 мкл тканевого гомогената для последовательного разведения и нанесения покрытия на селективный агар для определения КОЕ (первое разведение составляет 1 х 100). Если требуется нижний предел обнаружения, выполните разбрасывание 200-250 мкл неразбавленного гомогената.

Representative Results

Схематическое представление примера эксперимента показывает некоторые способы выполнения описанного протокола (рисунок 1).

Некоторые животные будут нести эндогенные микробы в своих вагинальных микробиомах, которые будут расти на неселективных средах. Методы, описанные здесь, основаны на стрептомицин-резистентных изолятах исследуемых бактериальных штаммов вместе с селективными средами, содержащими стрептомицин, для отбора против эндогенных бактерий (рисунок 2A,B). Устойчивость к стрептомицину может развиваться спонтанно, поэтому проверка мышей перед инфекцией (стирки 0-го дня) может помочь установить, может ли это быть проблемой.

Восстановление жизнеспособных бактерий из вагинальных промывок осуществляется путем последовательного разбавления и нанесения покрытия на агаровые среды. Стандартная чашка Петри может вмещать до 6 x 6 массива пятен 5 мкл, что позволяет перечислять бактериальные титры из шести реплик пятен на шесть порядков величины для каждого образца при использовании 10-кратных последовательных разведений (рисунок 3A). Этот метод может быть использован для перечисления титров бактерий, начиная от Gardnerella до Prevotella и Fusobacterium (рисунок 3B-D).

Вместе эти методы позволяют проверить гипотезы и сделать интерпретации о бактериальной колонизации/инфекции женского репродуктивного тракта. Например, сравнение титров Gardnerella в вагинальных промывках и гомогенатах влагалищной ткани продемонстрировало соответствие между этими методами (рисунок 4A). Аналогичным образом, в модели вагинальной коинокуляции титры Prevotella в ткани матки были значительно выше (примерно в 20 раз) во время коинфекции Gardnerella по сравнению с моноинфекцией Prevotella (рисунок 4B). Наконец, в этих моделях можно сравнить штаммы бактерий дикого типа и мутантные бактерии, чтобы установить роль, которую играют конкретные гены и их продукты в процессах колонизации /инфекции репродуктивных путей. Например, мутантный штамм Fusobacterium, не обладающий способностью транспортировать и потреблять углеводную сиаловую кислоту, привел к снижению уровня колонизации через 3 дня после посева (рисунок 4C).

Figure 1
Рисунок 1: Схема примера эксперимента33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Рост эндогенных мышиных вагинальных микробов на селективном и неселективном агаре. Влагалищные промывания пяти самок мышей C57Bl/6 (1-5) наносили на две разные агаровые пластины NYC III и инкубировали анаэробно. (A) Пластина слева не содержит антибиотиков и позволяет расти эндогенным анаэробным бактериям из мышиных вагинальных путей. (B) Пластина справа содержит 1 мг/мл стрептомицина и отбирает против роста эндогенных бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Восстановление жизнеспособных G. vaginalis, P. bivia и F. nucleatum CFU из вагинальных промываний. (A) КОЕ G. vaginalis JCP8151B-SmR inoculum, покрытые репликами в виде серии разбавления на агаре NYC III. (Б-Д) Восстановление жизнеспособных (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 и (D) F. nucleatum26 из влагалищных промываний моноинфицированных животных. Для каждого графика (B-D) данные объединяются из двух независимых экспериментов, с 10-15 мышами на эксперимент 24,25,26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Дальнейший анализ анаэробной бактериальной колонизации в модели посева влагалища мышей. (A) Титры G. vaginalis во влагалищных промывках коррелируют с титрами G. vaginalis , извлеченными из гомогенатов влагалищной ткани через 24 ч и 72 ч после посева (комбинация двух независимых экспериментов, n = 10 каждый. Значимость, определяемая тестом Спирмена на ранговую корреляцию)24. (B) Коинфекция с G. vaginalis приводит к увеличению титров P. bivia в ткани рога матки по сравнению с моноинфицированными животными P. bivia через 48 ч после посева (комбинация двух независимых экспериментов, каждый с 6-10 мышами в группе). Значимость, определяемая U-тестом Манна-Уитни, **p = 0,0017)25. (C) Мутант F. nucleatum с нарушенным переносчиком сиаловой кислоты (Ω SiaT) снизил титры во влагалищных лаважах моноинфицированных мышей по сравнению с F. nucleatum дикого типа через 72 ч после посева (комбинация двух независимых экспериментов, каждый с 10 мышами на группу). Значимость определяется U-тестом Манна-Уитни, **p < 0,01)26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Примеры методов, используемых для различных вагинальных бактерий, выращиваемых в анаэробных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Наиболее существенным отличием описанной здесь модели от ранее опубликованных моделей вагинальной прививки является использование анаэробно культивируемых бактерий, которые требуют особых соображений для получения жизнеспособного инокулята и восстановления бактерий у мышей. Конкретные шаги в приведенном выше протоколе могут незначительно варьироваться в зависимости от вида/штамма используемых бактерий, как предложено в Дополнительном файле 1. Кроме того, в этой рукописи описывается новый процедурный метод введения бактерий и вагинальных промывок, который требует меньше опыта со стороны исследователя и меньшей сдержанности для мышей. Если экспериментатора не устраивает форма сдерживания, описанная в шаге 3.2. и на этапе 3.3., мышей можно вместо этого зажимать, какописано ранее 34 , с анестезией или без нее в соответствии с экспериментальным дизайном и институциональными руководящими принципами IACUC.

Важным предостережением к использованию анаэробно культивируемых бактерий в мышиных моделях является то, что определенные шаги (например, с участием живых животных) должны выполняться за пределами анаэробной камеры. Поэтому наиболее важными шагами в этом протоколе являются те, в которых интересующие бактерии будут подвергаться воздействию аэробной среды, например, во время прививки мышей. Использование любого нового анаэроба в этой модели потребует предварительного изучения его способности сохранять жизнеспособность при воздействии кислорода (например, сравнение коЕ до и после инокуляции, как описано на этапе 2.5 и этапе 3.4.). В зависимости от степени чувствительности организма к кислороду и ПБС следует рассматривать различные способы получения инокулята (Дополнительный файл 1, этап 2.4.5.). Для прививок с использованием G. vaginalis JCP8151B мы обнаружили, что одна трубка инокулята может быть приготовлена в PBS и использована для заражения всех мышей. Если используется другая анаэробная бактерия, более чувствительная к кислороду, инокулятив может быть приготовлен в отдельных пробирках для каждой мыши, так что повторное открытие/ закрытие трубки не требуется. Аналогичным образом, если интересующий вид бактерий более привередлив / менее способен выживать в PBS , чем G. vaginalis, вместо этого можно приготовить прививку в питательных средах. Если используемая среда содержит восстановители, такие как анаэробная среда CDC, используемая для культивирования Prevotella bivia (Дополнительный файл 1, шаг 2.1. и шаг 2.2.), то бактерии также будут иметь повышенную защиту от воздействия кислорода.

Также могут быть рассмотрены альтернативные способы гомогенизации, такие как бисерное биение22,35, которое делается с закрытой крышкой трубки и, следовательно, может вводить меньше кислорода, чем ручной гомогенизатор. Кроме того, более чувствительным к кислороду организмам может потребоваться более длительное время равновесия для сред. Индикатор кислорода, такой как ресазурин, может быть использован для проверки того, что анаэробные условия были достигнуты (шаг 2.1.). Альтернативные методы, такие как анаэробные банки, могут влиять на результаты и должны быть проверены на жизнеспособность бактерий перед использованием.

Чувствительность к кислороду и привередливость экспериментального организма могут также играть роль в успешном восстановлении жизнеспособных бактерий у мыши во время промывания/гомогенизации (Дополнительный файл 1, этап 3.2. и этап 5.1.). Для высокочувствительных организмов время между приемом и покрытием лаважа может привести к потере жизнеспособности и вызвать искусственно заниженную оценку бактериальной вагинальной колонизации. Чтобы смягчить этот эффект, собранные промывания можно сразу же разбавить в свежие анаэробные питательные среды (с восстановителем). Аналогичным образом, гомогенизация органов может быть выполнена в свежих питательных средах, а не в PBS для повышения жизнеспособности бактерий, а также может быть выполнена в самой анаэробной камере, чтобы свести к минимуму воздействие кислорода.

В зависимости от цели данного эксперимента экспериментатор должен обращать внимание на контрольные группы. Чтобы проверить гипотезы, базовые показатели неинфицированных контрольных мышей, которые искусственно обрабатываются только транспортным средством, помогут установить, есть ли индукция хемокинов / цитокинов или других конкретных исходов инфекции. Используемое контрольное транспортное средство должно быть таким же, как и транспортное средство, используемое для инокуляции, поэтому, если бактерии инокулируются в питательных средах, то в качестве контроля должны использоваться неинокализованные питательные среды (Дополнительный файл 1, этап 2.4.5.).

Методы, описанные в этом протоколе, также могут быть применены к факультативным бактериям, способным расти анаэробно, но которые традиционно изучаются с использованием аэробных условий культивирования (таких как Escherichia coli или стрептококк группы B). Это может быть особенно актуально для инфекций этими организмами в участках тела, которые, как полагают, содержат низкий уровень кислорода, таких как шейка матки. Может случиться так, что факультативный организм более успешно заражает участки с меньшим количеством кислорода, когда инокулятив готовится анаэробно по сравнению с аэробным. В таком эксперименте восстановление жизнеспособных бактерий для перечисления КОЕ может не требовать анаэробных состояний.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы выражаем признательность Линн Фостер за техническую помощь в разработке этих моделей. Мы ценим стартовые средства от Департамента молекулярной микробиологии и Центра исследований инфекционных заболеваний женщин (для AL), а также March of Dimes (награда Бэзила О'Коннора для AL), которые помогли поддержать эксперименты на ранней стадии. Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (R01 AI114635) также поддержал разработку этих моделей.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-estradiol 17-valerate Sigma E1631 estrogenization of mice
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter Fisher  SCGP00525 sterile filtering sesame oil
14 mL tube Falcon 352059 estrogenization of mice
190-proof ethanol Koptec  V1105M dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media
1x PBS Fisher MT21040CM vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization
25 G × 5/8 -in needle BD 305122 estrogenization of mice
5 mL tube Falcon 352063 Tissue collection and homogenization
Anaerobic chamber Coy 7200000 Growth of anaerobic bacteria
Bacto agar Fisher DF0140074 G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates
Bacto peptone Fisher DF0118170 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Columbia broth Fisher DF0944170 Columbia media for F. nucleatum growth
Defibrinated sheep blood Hemostat DSB500 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Forceps Fine Science Tools  11008-13 mouse/tissue dissection
Glucose Sigma G7528 NYCIII media for G. vaginalis growth
Handheld homogenizer ISC Bio 3305500 Tissue homogenization
Hemin Sigma 51280 CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth
HEPES Cellgro 25-060-Cl NYCIII media for G. vaginalis growth
Horse serum Hemostat SHS500 NYCIII media for G. vaginalis growth
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) Matheson Gas for anaerobic chamber
Isofluorane VetOne 502017 mouse anaethesia at sacrifice
L-cysteine Sigma C1276 CDC anaerobic media for P. bivia growth
L-glutamate Sigma G1626 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 for making media and homogenization
NaCl Sigma S3014 NYCIII media for G. vaginalis growth
NaOH tablets Sigma S5881 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Nitrogen gas  Airgas  Gas for anaerobic chamber
p-200 filter tips ISC Bio  P-1237-200 vaginal lavages and bacterial inoculations
pancreatic digest of casein Sigma 70169 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Proteose peptone #3 Fisher DF-122-17-4 NYCIII media for G. vaginalis growth
Scissors Fine Science Tools  14084-08 mouse/tissue dissection
Sesame oil Fisher  ICN15662191 estrogenization of mice
Single edge surgical carbon steel razor blades VWR 55411-050 tissue dissection
Sodium chloride Sigma S3014 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
Streptomycin Gibco 11860038 add to agar media to make selective plates
Tuberculin slip tip 1ml syringe BD 309659 estrogenization of mice
Vitaim K3 Sigma M5625 Columbia media for F. nucleatum growth
Vitamin K1 Sigma 95271 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Yeast extract Fisher DF0127-17-9 NYCIII media for G. vaginalis growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
  2. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Supplement_1 4680-4687 (2011).
  3. Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. Bacteriology of the vagina. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).
  4. van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
  5. Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
  6. Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
  7. Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
  8. Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
  9. Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
  10. Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
  11. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  12. Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
  13. DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
  14. Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
  15. Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
  16. Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
  17. Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
  18. Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
  19. Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
  20. Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
  21. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).
  22. Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
  23. Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
  24. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  25. Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
  26. Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
  27. Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
  28. Yager, J. D., Davidson, N. E. Estrogen carcinogenesis in breast cancer. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).
  29. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
  32. Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
  33. Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
  34. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  35. Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 183 Влагалище микробиом микробиота бактерии колонизация бактериальный вагиноз Gardnerella vaginalis Prevotella bivia Fusobacterium nucleatum инфекция мышиная модель
Модели вагинальной колонизации мышей анаэробно выращенными бактериями
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morrill, S. R., Agarwal, K., Saha,… More

Morrill, S. R., Agarwal, K., Saha, S., Lewis, W. G., Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (183), e64032, doi:10.3791/64032 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter