Summary
Das Protokoll stellt ein Mausmodell der vaginalen Besiedlung mit anaerob kultivierten menschlichen Vaginalbakterien vor. Wir konzentrieren uns auf Gardnerella vaginalis, während wir Vorschläge für Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum enthalten. Dieses Protokoll kann auch als Leitfaden für vaginale Impfungen und eine lebensfähige Wiederherstellung anderer anaerob gezüchteter Bakterien verwendet werden.
Abstract
Die Vagina von Säugetieren kann von vielen bakteriellen Taxa besiedelt werden. Das menschliche vaginale Mikrobiom wird oft von Lactobacillus-Arten dominiert, aber jede vierte Frau erlebt eine bakterielle Vaginose, bei der ein niedriger Laktobazillenspiegel mit einem übermäßigen Wachstum verschiedener anaeroben Bakterien einhergeht. Dieser Zustand wurde mit vielen gesundheitlichen Komplikationen in Verbindung gebracht, einschließlich Risiken für die reproduktive und sexuelle Gesundheit. Während es immer mehr Beweise für die komplexe Natur mikrobieller Interaktionen in der menschlichen vaginalen Gesundheit gibt, sind die individuellen Rollen dieser verschiedenen anaeroben Bakterien nicht vollständig verstanden. Dies wird durch das Fehlen geeigneter Modelle zur Untersuchung anaerob gezüchteter Vaginalbakterien erschwert. Mausmodelle erlauben es uns, die Biologie und Virulenz dieser Organismen in vivo zu untersuchen. Andere Mausmodelle der vaginalen bakteriellen Impfung wurden bereits beschrieben. Hier beschreiben wir Methoden zur Inokulation von anaerob gezüchteten Bakterien und deren lebensfähige Erholung in konventionell gezüchteten C57Bl/6-Mäusen. Eine neue, weniger belastende Verfahrensmethode zur vaginalen Impfung und zum Waschen wird ebenfalls beschrieben. Die Impfung und lebensfähige Wiederherstellung von Gardnerella wird detailliert beschrieben, und Strategien für zusätzliche Anaerobier wie Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum werden diskutiert.
Introduction
Bei Säugetieren beherbergt die Vagina ein Konsortium von Bakterienarten. Das menschliche vaginale Mikrobiom ist einzigartig unter den Säugetieren in seiner Fülle an Mitgliedern der Gattung Lactobacillus und dem entsprechend niedrigen vaginalen pH-Wert (3,8-4,5)1,2,3,4. Eine Störung dieser Lactobacillus-Dominanz ist mit einer Vielzahl von negativen gesundheitlichen Folgen verbunden.
Bei der bakteriellen Vaginose (BV) gibt es weniger Laktobazillen und eine erhöhte Häufigkeit verschiedener anaeroben Bakterien wie Gardnerella vaginalis und Prevotella bivia 5,6. Frauen mit BV haben ein erhöhtes Risiko für sexuell übertragbare Infektionen 7,8,9, Unfruchtbarkeit 10, Schwangerschaftsverluste 11, Frühgeburten 12,13,14, intrauterine Infektionen 15, Gebärmutterhalsinfektionen 16 und Krebs16,17,18 . BV ist auch mit einer höheren Wahrscheinlichkeit einer vaginalen Besiedelung durch potentiell pathogene Bakterien verbunden, wie z.B. Fusobacterium nucleatum 1,19,20, ein häufiges Isolat aus Fruchtwasserinfektionen 21.
Aufgrund der Bedeutung von anaeroben Bakterien für die menschliche vaginale Gesundheit besteht ein Bedarf an Tiermodellen, mit denen die Biologie und Pathogenese dieser Organismen untersucht werden kann. Hier beschreiben wir Methoden zur vaginalen Inokulation und lebensfähigen Wiederherstellung von Gardnerella vaginalis in östrogenisierten Mäusen und schlagen zusätzliche Strategien für Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum vor. Andere Modelle der murinen vaginalen Besiedelung wurden bereits beschrieben, aber diese konzentrierten sich auf die Impfung und Erholung von fakultativen anaeroben Bakterien wie Streptococcus 22 der Gruppe B 22 und Neisseria gonorrhoeae23, die aerob kultiviert wurden. Die Beimpfung und Gewinnung von obligaten Anaerobier kann mit geeigneten experimentellen Strategien erfolgreich durchgeführt werden. Wir diskutieren Ansätze für die lebensfähige Wiederherstellung mehrerer bakterieller Taxa und schlagen eine empirische Bewertung der Bedingungen für die Lebensfähigkeit weiterer Spezies/Stämme vor.
Die klassische Methode zur Abschätzung der Besiedelung durch lebende Bakterien ist die Rückgewinnung von koloniebildenden Einheiten (KBE). Bei konventionell gezüchteten Mäusen mit ihrer eigenen endogenen Mikrobiota erfordert dies eine Erholung auf Agarmedien, die gegen Mitglieder der endogenen vaginalen Mikrobiota selektieren, während der inokulierte Bakterienstamm immer noch wachsen kann. Hier verwenden wir ein Streptomycin-resistentes Isolat von G. vaginalis24 , das selektiv auf einem Streptomycin-haltigen Agarmedium wiederhergestellt werden kann. Um sicherzustellen, dass das Medium ausreichend selektiv ist und umgekehrt keine Streptomycin-resistenten Bakterien im endogenen Mikrobiom vorhanden sind, sollten vaginale Lavagen, die kurz vor der Impfung gesammelt werden, auf selektivem (Streptomycin-haltigen) Agar plattiert werden.
Die beste Methode zur Impfvorbereitung kann je nach Bakterienart und -stämme variieren. Vor Beginn der Versuche an Mäusen sollten Vorarbeiten durchgeführt werden, um die bevorzugten Bedingungen für das Kulturmedium, den Wachstumsendpunkt und die Herstellung des Inokulums sowie die Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff und die Lebensfähigkeit bei PBS zu bestimmen. Bei sauerstoffempfindlicheren Bakterien können alternative Präparationen des Inokulums in Betracht gezogen werden (z.B. in einem anaeroben Nährmedium mit einer geeigneten Vehikel-Kontrollgruppe)25,26.
Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der University of California San Diego (UCSD, Protokollnummer: S20057, ab 2020) und davor an der Washington University, St. Louis (Protokoll 20110149, bis 2020) genehmigt und durchgeführt.
HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet konventionell aufgezogene weibliche C57Bl/-Mäuse im Alter von 6-11 Wochen zum Zeitpunkt der Impfung. Bitte beachten Sie Herstellerinformationen und spezifische Altersgruppen, die zuvor in der jeweiligen zitierten Arbeit verwendet wurden.
1. Herstellung und Verabreichung von β-Estradiol-17-valerat
HINWEIS: β-Estradiol-17-valerat ist ein Karzinogen und ein Fortpflanzungstoxin, das über die Haut aufgenommen werden kann27,28. Tragen Sie bei der Handhabung von Pulver und flüssiger Lösung geeignete PSA. Es ist auch ein Wassertoxin29; Entsorgen Sie es ordnungsgemäß in einem entsprechend verschlossenen und etikettierten Behälter.
- Filter sterilisiert bis zu 50 ml Sesamöl durch einen 0,22 μm Filter mit einem 50 ml konischen Schlauch-Vakuumfiltersystem. Nur in einer Biosicherheitswerkbank öffnen, um die Sterilität zu gewährleisten.
- Berechnen Sie das Volumen der β-Östradiol-Valerat-Lösung, die für das Experiment benötigt wird: 200 μl pro Maus plus 2-3 ml zusätzlich, um den Probenverlust während der Spritzenbefüllung zu berücksichtigen (z. B. benötigt ein 10-Maus-Experiment insgesamt 4 ml). Berechnen Sie die Menge an β-Östradiolvalerat, die zur Herstellung einer 5 mg/ml-Lösung benötigt wird, und wiegen Sie sie direkt in ein 14-ml-Röhrchen mit rundem Boden.
- Verschließen Sie das 14-ml-Röhrchen fest und wirbeln Sie, um Klumpen im Pulver aufzulösen (dadurch kann sich das β-Östradiolvalerat schneller auflösen). Geben Sie steril filtriertes Sesamöl in das 14-ml-Röhrchen, so dass die Endkonzentration von β-Östradiolvalerat 5 mg/ml beträgt.
- Legen Sie das fest verschlossene 14-ml-Röhrchen für 30-40 min auf einen Rotator bei 37 °C, bis sich das feste Pulver vollständig aufgelöst hat. Die Homogenität der Lösung vor der Injektion in die Mäuse ist visuell zu bestätigen. Die Inkubation bei 37 °C verringert die Viskosität des Sesamöls und erleichtert so die Injektion.
- Ziehen Sie β-Estradiolvalerat-Lösung in eine 1-ml-Spritze (ohne Nadel). Um dies zu tun, ohne Blasen einzuführen, ziehen Sie zuerst ein wenig von der Lösung auf und stoßen Sie sie dann vorsichtig aus, während Sie die Spitze der Spritze im Sesamöl halten. Ziehen Sie die Lösung langsam wieder auf, etwas über die 100-μl-Marke.
- Legen Sie eine 25 g x 5/8 in der Nadel auf die Spritze. Dann grundieren Sie die Nadel, indem Sie die Sesamöllösung langsam ausstoßen, bis sie aus der Nadelspitze austritt. Stoßen Sie die Lösung aus, bis die Spritze die 100-μl-Marke erreicht hat. Bereiten Sie eine Spritze pro Maus vor.
- Das β-Östradiol-17-valerat wird 48 h oder 72 h vor der Impfung intraperitoneal injiziert. Injizieren Sie jeder Maus 100 μl der 5 mg/ml β-Estradiolvalerat-Lösung (0,5 mg β-Estradiolvalerat/Maus), wie zuvor beschrieben22,30. Die restliche Lösung ist bis zur nächsten Injektion 72 h bei 4 °C lagern.
- Die β-Östradiol-Valerat-Lösung ist am Tag der Beimpfung, unmittelbar vor der vaginalen Impfung der Mäuse, erneut zu verabreichen. Die Lösung wird bei 4 °C entnommen und vor der Injektion 30 Minuten lang bei 37 °C auf einen Rotator gestellt, damit sich das Sesamöl erwärmen und weniger viskos werden kann. Fahren Sie mit den Injektionen fort, wie in Schritt 1.7 beschrieben.
2. Herstellung des Inokulums
ANMERKUNG: Dieser Abschnitt enthält die allgemeinen Schritte für die Herstellung von Inokula aus anaerob gezüchtetem Streptomycin-resistentem Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Alle Schritte in diesem Abschnitt sollten in einer anaeroben Kammer durchgeführt werden.
- Alle Reagenzien, einschließlich vorbereiteter NYC III-Brühe, Agar und PBS, werden mindestens 24 Stunden vor der Verwendung in eine anaerobe Kammer gegeben, um sie auszugleichen.
HINWEIS: Hier wurde eine anaerobe Vinylkammer verwendet, die mit einem 5%igen Wasserstoffgasgemisch äquilibriert war. Die interne Sauerstoffkonzentration liegt typischerweise bei 0 ppm, obwohl es zu geringfügigen vorübergehenden Erhöhungen (10-25 ppm) kommen kann, wenn Materialien in die Kammer gelangen. - Zwei Tage vor der vaginalen Impfung streifen Sie Gardnerella aus einer gefrorenen Glycerinbrühe auf eine NYC III-Agarplatte in der anaeroben Kammer. Verwenden Sie einen kleinen Behälter (z. B. eine leere Pipettenspitzenbox), der mit Trockeneis gefüllt ist, um den Glycerinvorrat während des Transports in und aus der Kammer gefroren zu halten.
- Verwenden Sie 1 Tag vor der vaginalen Impfung 5-10 einzelne Gardnerella-Kolonien von der Platte, um 10 ml NYC III-Brühe zu impfen. Die flüssige Kultur über Nacht 16 h bei 37 °C wachsen lassen. Geben Sie ein zweites 1 ml aliquot des Nährmediums ein, das unbeimpft bleibt, und inkubieren Sie es neben der beimpften Kultur, um zu bestätigen, dass das Medium nicht kontaminiert ist.
- Bereiten Sie das Inokulum aus flüssiger Kultur wie unten beschrieben vor. Führen Sie die Impfvorbereitung so weit wie möglich in der anaeroben Kammer durch.
- Die optische Dichte (OD) der Kultur wird bestimmt, indem 200 μl Kultur zu 800 μl frischem Medium in einer 1,5 ml Küvette (1:5 Verdünnung) gegeben werden. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Dichte (OD) der verdünnten Kultur bei einer Wellenlänge von 600 nm zu messen (verwenden Sie eine separate Küvette mit frischem Medium allein als Rohling). Multiplizieren Sie den OD-Wert mit 5, um den tatsächlichen OD600 der 16-Stunden-Kultur zu erhalten.
- Berechnen Sie das Inokulumvolumen, das für das Experiment benötigt wird. Um beispielsweise 15 Mäuse mit einem Inokulum von 20 μL pro Maus zu infizieren, werden 15 x 20 μL = 300 μL Inokulum benötigt. Bereiten Sie etwa 25% mehr Inokulum als benötigt vor, also bereiten Sie für 15 Mäuse 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL Inokulum vor.
- Berechnen Sie mit dem in Schritt 2.4.1 ermittelten OD 600 das Volumen der 16-Stunden-Kultur, die heruntergeschleudert und resuspendiert werden muss, um ein OD600 = 5,0-Inokulum in dem in Schritt 2.4.2 berechneten Volumen zu erhalten. Wenn zum Beispiel der OD600 der Kultur 1,5 beträgt und das benötigte Inokulumvolumen 375 μL beträgt, dann ist das Volumen der zu schleudernden Kultur (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
- Das in Schritt 2.4.3 berechnete Kulturvolumen wird pipettiert. in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugieren bei 16.000 x g für 1-3 min.
- Der Überstand wird entfernt und das Pellet in anaerobem PBS mit dem in Schritt 2.4.2 berechneten Volumen resuspendiert. Das Inokulum wird nun bei einem berechneten OD600 von 5,0 liegen. Bereiten Sie gegebenenfalls auch ein Röhrchen PBS vor, das als Vehikelkontrolle für Mäuse in der nicht infizierten Kontrollgruppe dient.
- Bevor Sie das Inokulumröhrchen aus der anaeroben Kammer entnehmen, bereiten Sie eine serielle Verdünnungsreihe von 1:10 bis 1:10 x 106 in PBS vor. Die Spotplatte 5 repliziert jede Verdünnung auf einer Agarplatte mit einer Mehrkanalpipette, um die KBE des Inokulums zu bestimmen. Dies ist die KBE vor der Impfung.
3. Vaginale Vorspülung und Impfung mit Gardnerella
- Vaginale Spül-/Waschschläuche in der anaeroben Kammer vorbereiten (dies kann gleichzeitig mit der Impfvorbereitung in Schritt 2.4 erfolgen). Pipettieren Sie 70 μL steriles, anaerobes PBS in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, die mit Mausnummern markiert sind. Bereiten Sie eine Waschtube pro Maus vor. Verschließen Sie die Schläuche fest und fahren Sie sie aus der anaeroben Kammer heraus.
- An jeder Maus wird eine vaginale Spülung mit 50 μl anaerobem PBS aus den einzelnen Röhrchen durchgeführt, die in Schritt 3.1 hergestellt wurden. Diese vaginalen Spülungen sind die Waschungen vor der Inokulation und können für nachgeschaltete Messungen und Assays verwendet werden.
- Nach Verabreichung der zweiten β-Estradiol-Valerat-Injektion (Schritt 1.8) legt jede Maus auf einen Käfig oder eine saubere, harte Oberfläche, die sie mit den Vorderpfoten greifen kann. Fassen Sie vorsichtig den mittleren Teil des Schwanzes und heben Sie ihn an, so dass die Hinterhand leicht erhöht ist und die Vaginalöffnung freiliegt.
- Ziehen Sie mit einer Pipette und einer p-200-Filterspitze 50 μL PBS aus dem Waschschlauch auf, die der entsprechenden Maus entsprechen. Führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in das Vaginallumen ~2-3 mm ein und pipettieren Sie das 50 μL Volumen vorsichtig ein und aus, 3x-4x.
- Übertragen Sie das gesammelte Waschmaterial (~ 50 μL) zurück in das gleiche Waschrohr, aus dem es stammt, und pipettieren Sie in dem Waschschlauch, der noch die restlichen 20 μL PBS enthält, auf und ab. Wenn übermäßiger Schleim vorhanden ist und die Spitze verstopft ist, verwenden Sie eine saubere p-200-Spitze, um das restliche Material zu sammeln und in dasselbe Waschrohr zu legen.
- Verabreichen Sie 20 μl der konzentrierten Bakteriensuspension oder Vehikelkontrolle vaginal in die Vagina jeder Maus. Impfen Sie jede Maus unmittelbar nach der vaginalen Spülung für diese Maus (d.h. führen Sie die Spülung und Impfung nacheinander für jede Maus durch, bevor Sie mit der nächsten fortfahren). Um diesen Prozess zu vereinfachen, verwenden Sie zwei p200-Pipetten - eine auf 50 μL für Lavagen und die andere auf 20 μL für Impfungen.
- Halten Sie die Maus zurück, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben. Mit einer p-200-Spitze 20 μL Bakteriensuspension in die Vagina pipettieren. Bei Co-Inco-Inokulationsexperimenten mit zwei verschiedenen Bakterienarten/-stämmen sind 10 μl jeder Bakteriensuspension zu verwenden und eine Vermischung der beiden Stämme vor der Beimpfung zu vermeiden.
HINWEIS: Das gesamte Impfvolumen sollte 20 μl nicht überschreiten, um ein Überlaufen aus der Vagina zu vermeiden. - Halten Sie das hintere Ende jeder Maus für 10-20 Sekunden hoch, um zu verhindern, dass sich das verabreichte Volumen sofort am vaginalen Introitus sammelt. Setzen Sie die Maus dann in einen neuen Käfig oder in einen neuen Käfig oder in einen Käfigpartner, der bereits geimpft wurde.
- Wiederholen Sie Schritt 3.2. und Schritt 3.3. für jede Maus. Setzen Sie Mäuse niemals wieder in einen Käfig mit Tieren, die noch nicht geimpft wurden. Dies verhindert eine versehentliche Exposition von Mäusen gegenüber Streptomycin-resistenten Bakterien vor der Impfung.
- Halten Sie die Maus zurück, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben. Mit einer p-200-Spitze 20 μL Bakteriensuspension in die Vagina pipettieren. Bei Co-Inco-Inokulationsexperimenten mit zwei verschiedenen Bakterienarten/-stämmen sind 10 μl jeder Bakteriensuspension zu verwenden und eine Vermischung der beiden Stämme vor der Beimpfung zu vermeiden.
- Nachdem alle Mäuse geimpft wurden, zirkulieren Sie das Inokulumröhrchen zurück in die anaerobe Kammer. Eine weitere serielle Verdünnung, wie in Schritt 2.5 beschrieben, wird hergestellt und plattiert. Dies ist die KBE nach der Impfung. Vergleichen Sie die KBEs aus den Platten nach der Inokulation und vor der Impfung, um festzustellen, ob die Lebensfähigkeit des Inokulums außerhalb der anaeroben Kammer während der Impfung der Tiere abnahm.
- Die in Schritt 3.2 gesammelten Vaginalspülungen werden mit einer Platte versehen. auf selektivem Agar (in diesem Fall 1 mg/ml Streptomycin). Die Platten 1-2 Tage in einer anaeroben Kammer bei 37 °C inkubieren und auf Wachstum untersuchen.
HINWEIS: Das Wachstum deutet darauf hin, dass endogene Mitglieder des Mikrobioms resistent gegen den Selektionsmarker sind und daher die KBE-Zählung des Zielorganismus verdecken können.
4. Entnahme von vaginalen Spülungen zur Bestimmung einer lebensfähigen Gardnerella-Besiedlung
- Sammeln Sie die vaginalen Waschungen zu ausgewählten Zeitpunkten, um die vaginale Besiedlung zu analysieren. Sammeln Sie wie in Schritt 3.2 beschrieben.
- Unmittelbar nach der Entnahme werden die vaginalen Spülungen in eine anaerobe Kammer geleitet. Verwenden Sie 10 μl jeder Lavage, um eine serielle Verdünnung und Beschichtung auf selektivem Agar durchzuführen, wie in Schritt 2.5 beschrieben. Verwenden Sie die KBE-Zählungen als Maß für die vaginale Besiedlung durch Gardnerella (oder ein anderes Anaerobier von Interesse).
5. Opferung, Dissektion und Homogenisierung des Gewebes
- Bereiten Sie ein 5-ml-Röhrchen für jedes Organ vor, das von jeder Maus entnommen wird (z. B. wenn die Vagina, der Gebärmutterhals und die Gebärmutter alle entnommen werden, bereiten Sie drei Röhrchen pro Maus vor). Füllen Sie jedes Röhrchen mit sterilem anaeroben 1x PBS (oder einem anderen Homogenisierungsmedium) in der anaeroben Kammer. Verwenden Sie 1 ml PBS für Röhrchen, die zur Entnahme von Vaginas und Gebärmutterhalskrebs verwendet werden, und 750 μl für Röhrchen, die zur Entnahme von Gebärmutterhörnern verwendet werden.
- Sobald PBS zugegeben wurde, wiegen Sie jedes einzelne Röhrchen (dies ist das Gewicht vor der Entnahme und wird verwendet, um das Gesamtgewicht jedes entnommenen Gewebes zu bestimmen). Wenn in der anaeroben Kammer keine Waage verfügbar ist, verschließen Sie die Röhrchen fest und lassen Sie sie zum Wiegen aus der Kammer heraus und dann wieder einfahren.
HINWEIS: Die Vorbereitung des Röhrchens und die Gewichtserfassung können 1 Tag vor dem Töten durchgeführt werden, aber die Röhrchen sollten in der anaeroben Kammer mit dicht verschlossenen Kappen aufbewahrt werden, um eine Verdunstung zu verhindern. - Bereiten Sie einen Satz Vaginalspülschläuche vor, wie in Schritt 3.1 beschrieben. um die letzte Lavage beim Opfer zu sammeln. Bereiten Sie auch ein 50-ml-Becherglas mit deionisiertem Wasser (DI) und ein zweites 50-ml-Becherglas mit 70% -90% Ethanol vor, das zum Spülen und Sterilisieren von Standard-Stahlsezierinstrumenten während der Opferung verwendet wird.
- Füllen Sie die PBS-gefüllten Organentnahmeröhrchen aus der anaeroben Kammer aus. Halten Sie die Röhrchen fest verschlossen, bis die Taschentücher bereit sind, hinzugefügt zu werden.
- Opfern Sie jede Maus mit IACUC-zugelassenen Methoden. Führen Sie die letzte Spülung wie in Schritt 3.2.2 beschrieben durch. und 3.2.3. entweder unmittelbar vor der Opferung oder unmittelbar danach.
- Beginnen Sie mit der Dissektion und Gewebeentnahme. Besprühen Sie den Bauch und den Rücken jeder Maus mit 70% Ethanol. Sterilisieren Sie die Schere in einem Becherglas mit Ethanol, lassen Sie sie trocknen und machen Sie dann einen einzigen vertikalen Schnitt in die Bauchhöhle der Maus.
- Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Haut zurückzuziehen und den Darm sanft aus der Körperhöhle und zur Seite des offenen Feldes zu drücken, wodurch der Fortpflanzungstrakt freigelegt wird.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Darm nicht zu durchstechen oder zu durchbohren, da er Streptomycin-resistente Bakterien beherbergen kann, die die experimentellen Ergebnisse verfälschen können. - Um das maximale Vaginalgewebe zu sammeln, brechen Sie das Schambein während der Obduktion. Schneiden Sie mit einer sterilen Schere die Mitte des Schambeins (die Schambeinsymphyse) ab und achten Sie darauf, nicht in die Vagina zu schneiden. Greifen Sie mit zwei sterilen Pinzetten jede Seite des Beckens und ziehen Sie das Becken seitlich auf, wodurch der untere Teil der darunter liegenden Vagina freigelegt wird.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den Gebärmutterhals (eine härtere Struktur im Vergleich zum umgebenden Gewebe) vorsichtig zu greifen. Ziehen Sie vorsichtig am Gebärmutterhals nach oben, um den Dickdarm freizulegen, der hinter der Vagina versteckt und eng mit ihr verbunden ist.
- Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Vagina vom äußeren Bindegewebe zu befreien. Trennen Sie vorsichtig die Vagina vom Dickdarm und vermeiden Sie es, den Darmtrakt zu punktieren. Wenn Sie vollständig losgelassen sind, flankieren Sie die Vagina am Introitus mit einer Schere und einem Schnippe, um sie vom Mauskörper zu lösen.
- Halten Sie den Gebärmutterhals sanft fest, während Sie ihn leicht nach oben ziehen, um die Hörner der Gebärmutter besser sichtbar zu machen. Schneiden Sie mit der anderen Hand direkt unter den Eierstöcken auf der rechten und linken Seite, um die Gebärmutterhörner freizugeben. Entfernen Sie den jetzt getrennten Fortpflanzungstrakt aus der Körperhöhle und legen Sie ihn in eine sterile Petriplatte.
- Trennen Sie mit einem Rasiermesser die Gebärmutterhörner, den Gebärmutterhals und die Vagina. Legen Sie jedes Gewebe in das entsprechend gekennzeichnete Entnahmeröhrchen. Wenn Zytokine gesammelt werden sollen, legen Sie die Röhrchen nach der Zugabe von Gewebe auf Eis.
- Wiegen Sie jedes Röhrchen erneut, nachdem das Gewebe hinzugefügt wurde. Dies ist das Gewicht nach der Abholung. Subtrahieren Sie das Gewicht vor der Entnahme vom Gewicht nach der Entnahme, um das Gesamtgewicht des Gewebes zu erhalten.
- Verwenden Sie einen tragbaren Homogenisator, um die Organe in ihren Sammelröhrchen zu homogenisieren. Bei Gardnerella JCP8151B führen Sie diesen Schritt in der Biosicherheitswerkbank (aerob) oder in der anaeroben Kammer durch.
- Bereiten Sie mehrere Sätze von Röhrchen für das Waschen und die aseptische Behandlung des tragbaren Homogenisators zwischen den Proben vor. Stellen Sie sicher, dass jedes Set drei konische 50-ml-Röhrchen hat: eine mit DI-Wasser, eine mit 70% Ethanol und die dritte mit 1x PBS. Bereiten Sie für jede Mausbehandlungsgruppe einen separaten Satz Waschschläuche vor.
- Um den Homogenisator zu reinigen, senken Sie die Schaufeln in jedem Waschschlauch in die Flüssigkeit und drehen Sie das Instrument auf maximale Geschwindigkeit. Halten Sie den Homogenisator in jedem der drei Röhrchen für ca. 3 s. Die Reihenfolge des Waschens ist DI-Wasser (zum Entfernen von physischen Ablagerungen), dann Ethanol (zum Desinfizieren) und schließlich 1x PBS (zum Neutralisieren). Schütteln Sie die Sonde auf ein Papiertuch oder eine Einweg-Tischunterlage, um überschüssige Flüssigkeit zwischen den einzelnen Spülungen zu entfernen.
- Nach dem ersten Spülen homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie die Homogenisatorsonde auf den Boden des Sammelröhrchens absenken und das darunter liegende Gewebe einfangen. Schalten Sie den Homogenisator ein, um das Gewebe zu mahlen, und bewegen Sie die Sonde vorsichtig etwa 5x auf und ab, während Sie unter Wasser bleiben. Homogenisieren Sie jedes Organ für ca. 15-30 s.
- Nach dem Ausschalten und Entfernen des Homogenisators aus dem Röhrchen ist der Inhalt visuell zu prüfen, um einen vollständigen Gewebeaufschluss sicherzustellen. Dies ist besonders wichtig für den Gebärmutterhals und die Vagina, die manchmal nicht von der Sonde erfasst werden.
HINWEIS: Es ist in Ordnung, wenn sich überschüssiges Fett an den Gebärmutterhörnern nicht vollständig homogenisiert. - Wiederholen Sie die Schritte 5.14.1.-5.14.4 und waschen und sterilisieren Sie die Sonde zwischen den einzelnen Proben. Wechseln Sie zu einem neuen Satz Waschschläuche für jede Versuchsgruppe.
- Bewegen Sie die Röhrchen mit homogenisierten Proben in die anaerobe Kammer. Um die Bakterienbelastung jedes Gewebes zu bestimmen, führen Sie ein kurzes sanftes Wirbeln der zu mischenden Probe durch, entfernen Sie dann 100 μL Gewebehomogenat für die serielle Verdünnung und Beschichtung auf selektivem Agar für die KBE-Bestimmung (die erste Verdünnung ist 1 x 100). Wenn eine untere Nachweisgrenze erforderlich ist, führen Sie eine Streubeschichtung von 200-250 μL unverdünntem Homogenat durch.
Representative Results
Eine schematische Darstellung eines Beispielexperiments zeigt einige der Möglichkeiten, wie man das beschriebene Protokoll ausführen kann (Abbildung 1).
Einige Tiere tragen endogene Mikroben in ihren vaginalen Mikrobiomen, die auf nicht-selektiven Medien wachsen. Die hier beschriebenen Methoden beruhen auf Streptomycin-resistenten Isolaten der untersuchten Bakterienstämme zusammen mit selektiven Medien, die Streptomycin enthalten, um gegen körpereigene Bakterien zu selektieren (Abbildung 2A, B). Es ist möglich, dass sich eine Streptomycin-Resistenz spontan entwickelt, so dass die Überprüfung von Mäusen vor der Infektion (Tag 0 Waschungen) helfen kann, festzustellen, ob dies ein Problem sein könnte.
Die Rückgewinnung lebensfähiger Bakterien aus vaginalen Waschungen erfolgt durch serielle Verdünnung und Beschichtung auf Agarmedien. Eine Standard-Petrischale kann bis zu 6 x 6 Arrays von 5-μL-Spots aufnehmen, was die Zählung von Bakterientitern aus sechs Replikationsspots über sechs Größenordnungen für jede Probe ermöglicht, wenn 10-fache serielle Verdünnungen verwendet werden (Abbildung 3A). Diese Methode kann verwendet werden, um Titer von Bakterien zu zählen, die von Gardnerella über Prevotella bis hin zu Fusobacterium reichen (Abbildung 3B-D).
Zusammen erlauben diese Methoden, Hypothesen zu testen und Interpretationen über die bakterielle Besiedlung / Infektion des weiblichen Fortpflanzungstraktes zu machen. Zum Beispiel zeigte ein Vergleich von Gardnerella-Titern in vaginalen Waschungen und vaginalen Gewebehomogenaten eine Übereinstimmung zwischen diesen Methoden (Abbildung 4A). Ebenso waren in einem vaginalen Koinokulationsmodell die Titer von Prevotella im Gebärmuttergewebe während der Gardnerella-Koinfektion signifikant höher (etwa 20-fach) als bei einer Prevotella-Monoinfektion (Abbildung 4B). Schließlich können Wildtyp- und mutierte Bakterienstämme in diesen Modellen verglichen werden, um die Rolle bestimmter Gene und ihrer Produkte bei der Besiedlung / Infektion des Fortpflanzungstrakts zu ermitteln. Zum Beispiel führte ein mutierter Stamm von Fusobacterium, der nicht in der Lage war, das Kohlenhydrat Sialinsäure zu transportieren und zu konsumieren, 3 Tage nach der Impfung zu einer geringeren Kolonisierung (Abbildung 4C).
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Beispielexperiments33. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Wachstum endogener muriner vaginaler Mikroben auf selektivem versus nicht-selektivem Agar. Vaginale Spülungen von fünf weiblichen C57Bl/6-Mäusen (1-5) wurden auf zwei verschiedene NYC III-Agarplatten gestreift und anaerob inkubiert. (A) Die linke Platte enthält keine Antibiotika und ermöglicht das Wachstum von endogenen anaeroben Bakterien aus dem murinen Vaginaltrakt. (B) Die Platte auf der rechten Seite enthält 1 mg/ml Streptomycin und selektiert gegen das Wachstum endogener Bakterien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Rückgewinnung lebensfähiger G. vaginalis, P. bivia und F. nucleatum CFUs aus vaginalen Waschungen. (A) KFUs von G. vaginalis JCP8151B-SmR-Inokulum, repliziert als Verdünnungsreihe auf NYC III-Agar. (B-D) Wiederherstellung lebensfähiger (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 und (D) F. nucleatum26 aus den vaginalen Spülungen von einfach infizierten Tieren. Für jede Grafik (B-D) werden die Daten aus zwei unabhängigen Experimenten kombiniert, mit 10-15 Mäusen pro Experiment24,25,26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Weitere Analyse der anaeroben bakteriellen Besiedlung in einem murinen vaginalen Impfmodell. (A) G. vaginalis-Titer in vaginalen Waschungen korrelieren mit G. vaginalis-Titern, die 24 h und 72 h nach der Inokulation aus vaginalen Gewebehomogenaten gewonnen wurden (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten, jeweils n = 10). Signifikanz bestimmt durch Spearmans Rangkorrelationstest)24. (B) Eine Koinfektion mit G. vaginalis führt 48 Stunden nach der Impfung zu erhöhten P. bivia-Titern im Horngewebe der Gebärmutter im Vergleich zu monoinfizierten Tieren mit P. bivia (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils 6-10 Mäusen pro Gruppe). Signifikanz bestimmt durch Mann-Whitney-U-Test, **p = 0,0017)25. (C) Die F. nucleatum-Mutante mit gestörtem Sialinsäuretransporter (Ω SiaT) hat 72 Stunden nach der Inokulation (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils 10 Mäusen pro Gruppe) im Vergleich zum Wildtyp von F. nucleatum 72 Stunden nach der Inokulation (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils 10 Mäusen pro Gruppe) verringerte Titer. Signifikanz bestimmt durch Mann-Whitney-U-Test, **p < 0,01)26. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsdossier 1: Beispiele für Methoden, die für verschiedene Vaginalbakterien verwendet werden, die unter anaeroben Bedingungen gezüchtet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Der wichtigste Unterschied zwischen dem hier beschriebenen Modell und den bisher veröffentlichten vaginalen Impfmodellen ist die Verwendung von anaerob kultivierten Bakterien, die besondere Überlegungen für die Herstellung von lebensfähigem Inokulum und die Rückgewinnung von Bakterien aus den Mäusen erfordern. Spezifische Schritte im obigen Protokoll können je nach verwendeter Bakterienart/-stämme leicht variieren, wie in der Zusatzdatei 1 vorgeschlagen. Darüber hinaus beschreibt dieses Manuskript eine neue Verfahrensmethode für die Verabreichung von Bakterien und Vaginalspülungen, die weniger Erfahrung seitens des Prüfarztes und weniger Zurückhaltung für die Mäuse erfordert. Wenn der Experimentator mit der in Schritt 3.2 beschriebenen Form der Zurückhaltung nicht einverstanden ist. und Schritt 3.3. können die Mäuse stattdessen wie zuvor beschrieben34 mit oder ohne Anästhesie gemäß dem experimentellen Design und den institutionellen IACUC-Richtlinien gereinigt werden.
Ein wichtiger Vorbehalt bei der Verwendung von anaerob kultivierten Bakterien in Mausmodellen besteht darin, dass bestimmte Schritte (z. B. mit lebenden Tieren) außerhalb der anaeroben Kammer durchgeführt werden müssen. Daher sind die kritischsten Schritte in diesem Protokoll diejenigen, bei denen die interessierenden Bakterien einer aeroben Umgebung ausgesetzt werden, z. B. während der Impfung der Mäuse. Die Verwendung eines neuen Anaerobs in diesem Modell erfordert eine vorläufige Untersuchung seiner Fähigkeit, die Lebensfähigkeit bei Sauerstoffexposition aufrechtzuerhalten (z. B. der Vergleich von KFUs vor und nach der Impfung, wie in Schritt 2.5 und Schritt 3.4 beschrieben). Je nach Grad der Sauerstoff- und PBS-Empfindlichkeit des Organismus sollten unterschiedliche Methoden der Impfvorbereitung in Betracht gezogen werden (Ergänzungsdatei 1, Schritt 2.4.5.). Für Impfungen mit G. vaginalis JCP8151B haben wir festgestellt, dass ein einzelnes Inokulumröhrchen in PBS hergestellt und verwendet werden kann, um alle Mäuse zu infizieren. Wenn ein anderes anaerobes Bakterium verwendet wird, das sauerstoffempfindlicher ist, kann das Inokulum stattdessen in separaten Röhrchen für jede Maus vorbereitet werden, so dass ein wiederholtes Öffnen / Schließen des Röhrchens nicht erforderlich ist. Wenn die interessierende Bakterienart anspruchsvoller / weniger in der Lage ist, in PBS zu überleben als G. vaginalis, kann die Impfung stattdessen in Nährmedien hergestellt werden. Wenn das verwendete Medium Reduktionsmittel enthält, wie z. B. das anaerobe CDC-Medium, das zur Kultivierung von Prevotella bivia verwendet wird (Ergänzungsdatei 1, Schritt 2.1. und Schritt 2.2.), dann haben die Bakterien auch einen erhöhten Schutz vor Sauerstoffbelastung.
Alternative Verfahren zur Homogenisierung können ebenfalls in Betracht gezogen werden, wie z. B. das Kügelchen22,35, das bei geschlossenem Schlauchdeckel durchgeführt wird und daher weniger Sauerstoff einbringen kann als der tragbare Homogenisator. Darüber hinaus können sauerstoffempfindlichere Organismen eine längere Gleichgewichtszeit für Medien benötigen. Ein Sauerstoffindikator wie Resazurin kann verwendet werden, um zu überprüfen, ob anaerobe Bedingungen erreicht wurden (Schritt 2.1.). Alternative Methoden wie anaerobe Gläser können die Ergebnisse beeinflussen und sollten vor der Verwendung auf bakterielle Lebensfähigkeit überprüft werden.
Die Sauerstoffempfindlichkeit und -genauigkeit des Versuchsorganismus kann auch eine Rolle bei der erfolgreichen Gewinnung lebensfähiger Bakterien aus der Maus während der Lavage/Homogenisierung spielen (Ergänzungsdatei 1, Schritt 3.2. und Schritt 5.1.). Bei hochempfindlichen Organismen kann die Zeit zwischen der Spülung und der Beschichtung zu einem Verlust der Lebensfähigkeit führen und zu einer künstlich niedrigen Schätzung der bakteriellen vaginalen Besiedlung führen. Um diesen Effekt zu mildern, können gesammelte Lavagen sofort in frische anaerobe Nährmedien (mit Reduktionsmittel) verdünnt werden. In ähnlicher Weise kann die Organhomogenisierung in frischen Nährmedien anstelle von PBS durchgeführt werden, um die bakterielle Lebensfähigkeit zu erhöhen, und kann auch in der anaeroben Kammer selbst durchgeführt werden, um die Sauerstoffbelastung zu minimieren.
Je nach Zweck eines bestimmten Experiments muss der Experimentator auf Kontrollgruppen achten. Um Hypothesen zu testen, werden Baseline-Messungen von nicht infizierten Kontrollmäusen, die nur mit Vehikel behandelt werden, helfen festzustellen, ob es eine Induktion von Chemokinen / Zytokinen oder andere spezifische Infektionsergebnisse gibt. Das verwendete Kontrollvehikel muss das gleiche sein wie das Vehikel, das für die Beimpfung verwendet wird, d. h., wenn die Bakterien in Nährmedien beimpft werden, müssen unbeimpfte Nährmedien als Kontrolle verwendet werden (Ergänzungsdatei 1, Schritt 2.4.5.).
Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden könnten auch auf fakultative Bakterien angewendet werden, die anaerob wachsen können, aber traditionell unter aeroben Kulturbedingungen untersucht werden (wie Escherichia coli oder Streptokokken der Gruppe B). Dies könnte besonders relevant für Infektionen durch diese Organismen an Körperstellen sein, von denen angenommen wird, dass sie wenig Sauerstoff enthalten, wie z. B. der Gebärmutterhals. Es kann sein, dass ein fakultativer Organismus Stellen erfolgreicher mit weniger Sauerstoff infiziert, wenn das Inokulum anaerob als aerob hergestellt wird. In einem solchen Experiment erfordert die Rückgewinnung lebensfähiger Bakterien für die KBE-Zählung möglicherweise keine anaeroben Bedingungen.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Wir danken Lynne Foster für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Modelle. Wir freuen uns über Startkapital von der Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und dem Center for Women's Infectious Disease Research (an AL) sowie den March of Dimes (Basil O'Connor-Preis an AL), die dazu beigetragen haben, Experimente im Frühstadium zu unterstützen. Auch das Nationale Institut für Allergie und Infektionskrankheiten (R01 AI114635) unterstützte die Entwicklung dieser Modelle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
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