Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

बोवाइन ओओसाइट में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए को कम करने के लिए द्विभाजन का उपयोग

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64060
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 3, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University, 2Reproductive Sciences, Beckman Center for Conservation Research, San Diego Zoo Wildlife Alliance, 3Genus PLC
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम गोजातीय ओओसाइट (पी < 0.0001) में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए कॉपी संख्या को काफी कम करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि ओओसाइट माइटोकॉन्ड्रिया को काफी हद तक कम करने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन और द्विभाजन का उपयोग करती है और पुनर्निर्मित इंटरस्पीशीज दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण भ्रूण में विकास की बढ़ती संभावना की अनुमति दे सकती है।

Abstract

लुप्तप्राय प्रजातियों को बचाने के लिए इंटरस्पीशीज दैहिक सेल परमाणु हस्तांतरण (आईएससीएनटी) का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन पुनर्निर्मित भ्रूण के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) की दो अलग-अलग आबादी मौजूद है: एक प्राप्तकर्ता ओप्लाज्म के भीतर और एक दाता दैहिक कोशिका के भीतर। यह माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी भ्रूण और भ्रूण में विकास संबंधी मुद्दों को जन्म दे सकता है। हस्तनिर्मित क्लोनिंग प्रोटोकॉल में ओओसाइट द्विभाजन शामिल है, जिसका उपयोग एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने के लिए किया जा सकता है, जिससे पुनर्निर्मित भ्रूण में माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी की डिग्री कम हो जाती है। विकृत, परिपक्व गोजातीय ओओसाइट्स के सेंट्रीफ्यूजेशन ने ओओसाइट के एक ध्रुव पर एक दृश्यमान माइटोकॉन्ड्रिया-घने अंश का उत्पादन किया। ओओसाइट्स के ज़ोनी पेलुसिडे को प्रोनेस समाधान के संपर्क में आने से हटा दिया गया था। दृश्यमान माइटोकॉन्ड्रिया अंश को हटाने के लिए माइक्रोब्लेड का उपयोग करके द्विभाजन किया गया था। क्यूपीसीआर का उपयोग पूरे ओओसाइट्स और विभाजित ओप्लास्ट से निकाले गए डीएनए नमूनों में मौजूद एमटीडीएनए को मापने के लिए किया गया था, जो द्विभाजन से पहले और बाद में एमटीडीएनए कॉपी संख्याओं की तुलना प्रदान करता है। कॉपी संख्याओं की गणना चक्र थ्रेशोल्ड मानों, एक मानक वक्र के प्रतिगमन रेखा सूत्र और एक अनुपात का उपयोग करके की गई थी जिसमें एमटीडीएनए पीसीआर उत्पादों और जीनोमिक पीसीआर उत्पादों के संबंधित आकार शामिल थे। एक गोजातीय ओओसाइट में 137,904 ± 94,768 (एन = 38) की औसत एमटीडीएनए कॉपी संख्या (± मानक विचलन) थी। एक माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओप्लास्ट में 8,442 ± 13,806 (एन = 33) की औसत एमटीडीएनए कॉपी संख्या थी। माइटोकॉन्ड्रिया समृद्ध ओप्लास्ट में मौजूद औसत एमटीडीएनए प्रतियां 79,390 ± 58,526 एमटीडीएनए प्रतियां (एन = 28) थीं। इन गणना किए गए औसतों के बीच अंतर से संकेत मिलता है कि सेंट्रीफ्यूजेशन और बाद में द्विभाजन मूल ओओसाइट (पी < 0.0001, वन-वे एनोवा द्वारा निर्धारित) की तुलना में माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओओप्लास्ट में मौजूद एमटीडीएनए कॉपी संख्या को काफी कम कर सकता है। एमटीडीएनए में कमी से एक पुनर्निर्मित भ्रूण में माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी की डिग्री कम होनी चाहिए, संभवतः मानक भ्रूण और भ्रूण के विकास को बढ़ावा देना चाहिए। सफल भ्रूण के विकास को प्राप्त करने के लिए दैहिक दाता सेल से माइटोकॉन्ड्रियल निकालने के साथ पूरक भी आवश्यक हो सकता है।

Introduction

दैहिक कोशिका परमाणु हस्तांतरण (एससीएनटी) में एक जानवर से एक एन्यूक्लिएटेड ओओसाइट और एक ही प्रजाति के जानवर से एक दैहिक कोशिका का संलयन शामिल है। ज्यादातर मामलों में, ओओसाइट और दैहिक कोशिका एक ही प्रजाति से उत्पन्न होती है, और जीवित जन्म दर 6% 1 से नीचे होती है। कुछ शोधों में इंटरस्पीशीज एससीएनटी (आईएससीएनटी) का उपयोग शामिल है, जिसमें एक दैहिक कोशिका और ओओसाइट का संलयन शामिल है जो दो अलग-अलग प्रजातियों से उत्पन्न होता है। इन अध्ययनों में, जीवित जन्म दर एससीएनटी की तुलना में भी कम है-आमतौर पर 1% 1 से कम। हालांकि, आईएससीएनटी में लुप्तप्राय प्रजातियों को बचाने की एक विधि के रूप में उपयोग करने की क्षमता है, क्योंकि इन जानवरों से दैहिक कोशिकाएं उनके रोगाणु कोशिकाओंकी तुलना में अधिक सुलभ हैं 1. आईएससीएनटी में उपयोग किए जाने वाले प्राप्तकर्ता ओओसाइट्स अक्सर घरेलू या सामान्य प्रयोगशाला प्रजातियां होती हैं, जैसे कि गाय, सूअर और चूहे। इस प्रकार अब तक किए गए कुछ प्रयासों ने सफलतापूर्वक जीवित युवा का उत्पादन किया है, हालांकि उत्पादित संतानें इंट्राजेनेरिक जानवर हैं (प्राप्तकर्ता ओओसाइट प्रजातियां और दाता कोशिका प्रजातियां एक ही जीनस के सदस्य थे)2,3,4। इंटरजेनेरिक मॉडल (जो विभिन्न पीढ़ी में जानवरों से एक ओओसाइट और दैहिक कोशिका का उपयोग करते हैं) ने अभी तक जीवित जानवरों का उत्पादन नहीं किया है, और अधिकांश पुनर्निर्मित भ्रूण इन विट्रो विकास 5,6,7,8 के 8-16 सेल चरण में गिरफ्तार होते हैं। इस भ्रूण विकासात्मक गिरफ्तारी का एक संभावित स्पष्टीकरण भ्रूण में माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी की घटना है- एक कोशिका में एक से अधिक माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (एमटीडीएनए) प्रकार की उपस्थिति। हेटरोप्लाज्मी भ्रूण में या जीवित जानवर में विकासात्मक अक्षमता या विफलता जैसे मुद्दों को जन्म दे सकती है1. रोगजनन जानवर के जीवनकाल में बाद में भी हो सकता है9. यद्यपि यह समस्या एससीएनटी संतानों में भी मौजूद है, आईएससीएनटी भ्रूण के भीतर अंतर-विशिष्ट घटक इस मुद्दे को बढ़ाता है।

जब भ्रूण एमटीडीएनए दो अलग-अलग प्रजातियों से आता है, तो प्राप्तकर्ता ओओसाइट माइटोकॉन्ड्रिया, जो बहुमत का प्रतिनिधित्व करता है, दाता कोशिका के नाभिक1,10 के साथ कुशलतापूर्वक या प्रभावी ढंग से काम नहीं करता है। आईएससीएनटी में उपयोग की जाने वाली दो प्रजातियों के बीच बड़े वर्गीकरण अंतराल संभवतः इस समस्या को तेज करते हैं; उत्पन्न इंट्राजेनेरिक जीवित संतानों (बोस टॉरस ओओसाइट्स का उपयोग करके बोस गौरस और बोस इंडिकस संतान), साथ ही पारंपरिक एससीएनटी के माध्यम से उत्पादित संतान (जैसे ओविस एरीज़ ओओसाइट्स का उपयोग करके ओविस संतान) को चिमेरा दिखाया गया था (दो व्यक्तियों से एमटीडीएनए इन जानवरों में मौजूद था 11,12,13)। फिर भी, वे इंटरजेनेरिक एससीएनटी भ्रूण14,15 की तुलना में बहुत आगे विकसित हुए। ओओसाइट माइटोकॉन्ड्रिया और दाता कोशिका के नाभिक के बीच जानकारी का आदान-प्रदान इंटरजेनेरिक भ्रूण16 की तुलना में इंट्राजेनेरिक भ्रूण में अधिक सफल हो सकता है।

एक परिपक्व गोजातीय ओओसाइट में एमटीडीएनए की मात्रा एक दैहिक कोशिका12 में पाई जाने वाली मात्रा से लगभग 100 गुना अधिक है। इस अनुपात को कम करने से दैहिक कोशिका माइटोकॉन्ड्रिया को पुनर्निर्मित भ्रूण के भीतर प्रसार करने के लिए प्रोत्साहित किया जा सकता है, जिससे उत्पादक माइटोकॉन्ड्रिया की अधिक आबादी मौजूद हो सकतीहै 16. यह बदले में विकासशील भ्रूण15 की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अधिक ऊर्जा प्रदान कर सकता है। ओओसाइट या भ्रूण की एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने के लिए किए गए पिछले प्रयासों में रासायनिक अनुप्रयोग, माइक्रोमैनिपुलेशन और दाता कोशिका प्रजातियों 16,17,18,19,20 से अतिरिक्त माइटोकॉन्ड्रिया के साथ ओओसाइट या भ्रूण को पूरक करना शामिल है। हालांकि, रासायनिक अनुप्रयोग (जैसे कि 2',3'-डिडियोक्सीसाइटिडाइन) भ्रूण के विकास के लिए आदर्श नहीं है, और ओओसाइट एमटीडीएनए कॉपी संख्या को लगभग आधा18 तक कम कर दिया है। माइक्रोमैनिपुलेशन द्वारा पूर्व ओओसाइट एमटीडीएनए की कमी ने ओओसाइट के एमटीडीएनए17 का औसत केवल 64% हटा दिया है। यद्यपि दाता सेल माइटोकॉन्ड्रिया का पूरक एक व्यवहार्य विकल्प हो सकता है, इसके उपयोग ने अभी तक आईएससीएनटी अध्ययन21 के भीतर एक जीवित इंटरजेनेरिक जानवर का उत्पादन नहीं किया है।

ओओसाइट एमटीडीएनए कॉपी नंबर को कम करने के लिए द्विभाजन का उपयोग अभी तक प्रकाशित अध्ययनों में उपयोग नहीं किया गया है। दैहिक कोशिका के साथ ओओप्लास्ट को फ्यूज करने के इरादे से ओओसाइट्स को विभाजित करना हस्तनिर्मित क्लोनिंग (एचएमसी) का आधार है, जो आमतौर पर मेटाफ़ेज़ द्वितीय (एमआईआई) ओओसाइट से ध्रुवीय शरीर और मेटाफ़ेज़ प्लेट को हटाने की विधि के रूप में द्विभाजन का उपयोग करता है। एचएमसी ने बकरियों, मवेशियों, सूअरों, भेड़ों और घोड़ों सहित कई प्रजातियों में सफलतापूर्वक संतानों का उत्पादन किया है 22,23,24,25,26, लेकिन आमतौर पर द्विभाजन से पहले एक सेंट्रीफ्यूजेशन चरण शामिल नहीं होता है। ओओसाइट के उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन को एकीकृत करने से ओओसाइट के एक ध्रुव पर माइटोकॉन्ड्रिया (और इसलिए एमटीडीएनए) के अलगाव की अनुमति मिलती है, जिसे तब उन माइटोकॉन्ड्रिया-घने अंशों को हटाने के लिए माइक्रोब्लेड का उपयोग करके विभाजित किया जा सकता है। दो माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओओप्लास्ट को तब एक दैहिक कोशिका के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसा कि एचएमसी में होता है, एक पुनर्निर्मित भ्रूण बनाने के लिए जिसमें ओओसाइट प्रजातियों से काफी कम एमटीडीएनए होता है।

इस प्रोटोकॉल के साथ हम जिस प्रश्न का उत्तर देने का प्रयास करते हैं, वह यह है कि गोजातीय ओओसाइट में एमटीडीएनए को कैसे कम किया जाए ताकि एक व्यवहार्य पुनर्निर्मित भ्रूण का उत्पादन किया जा सके जिसमें कम हेटरोप्लाज्मिक एमटीडीएनए होता है। इस प्रोटोकॉल में, ओओसाइट्स को सेंट्रीफ्यूज और विभाजित किया गया था। गोजातीय ओओसाइट की एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने में इस तकनीक की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए ओप्लास्ट और बरकरार ओओसाइट एमटीडीएनए कॉपी नंबर की गणना की गई थी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी द्वारा प्रदान किए गए पशु देखभाल और नैतिकता दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. मीडिया की तैयारी

  1. ओओसाइट हैंडलिंग से पहले, निम्नलिखित समाधान तैयार करें, जैसा कि तालिका 1 में वर्णित है: हाइलूरोनिडेज़ समाधान के 400 μL, T2 मीडिया के 500 μL, T20 मीडिया के 1,020 μL और T10 मीडिया के 800 μL।
  2. टी 10 मीडिया को चार-अच्छी तरह से प्लेट के दो कुओं में विभाजित करें, 400 μL प्रति अच्छी तरह से। एक अच्छी तरह से "एम" के साथ लेबल करें और दूसरा अच्छी तरह से "एमआर" के साथ। द्विभाजन के बाद तक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  3. एचईपीईएस (एचएसओएफ) के साथ साइटोचालासिन बी (सीबी)/सिंथेटिक ओविडक्टल फ्लूइड के 500 μL तैयार करें। एचएसओएफ समाधान के विभाज्य 50 μL एक अलग 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में।
  4. प्रोनेस समाधान के 40 μL तैयार करें। 2,680 एक्स जी पर कम से कम 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र। एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए टी 2 के 20 μL के साथ सतह पर तैरनेवाला के 20 μL मिश्रण; यह एक पतला, 5 मिलीग्राम / एमएल प्रोनेस समाधान बनाता है।
  5. एचएसओएफ के 3 एमएल तैयार करें। एक खोज प्लेट पर, अलग से चार 400 μL बूंदों जमा; इस प्लेट को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
  6. टी 20 समाधान के 500 μL तैयार करें।

2. गोजातीय ओओसाइट्स की इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम)

  1. आईवीएम: 10% एफबीएस,0.26 आईयू / एमएल एफएसएच, और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त परिपक्वता मीडिया के चार अच्छी तरह से पकवान में 21 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 38.5 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति आकांक्षा क्यूम्यलस-ओओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी)।
  2. ओओसाइट्स को नष्ट करने के लिए निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
    1. एक 200 μL विंदुक का उपयोग कर सीओसी की वांछित संख्या ले लीजिए, और एक 1.5 μL अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल पर उन्हें जमा।
    2. एमएल हाइलूरोनिडेस की समान मात्रा को ओओसाइट्स के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें (यानी, यदि ओओसाइट्स और आईवीएम मीडिया की मात्रा 100 μL है, तो हाइलूरोनिडेज़ के 100 μL जोड़ें)।
    3. विंदुक बुलबुले बनाने के बिना समाधान ऊपर और नीचे, जब तक सभी क्यूम्यलस कोशिकाओं को हटा दिया गया है।
  3. ओओसाइट्स की परिपक्वता की जांच करें।
    1. हाइलूरोनिडेस समाधान के लिए खोज प्लेट पर चार एचएसओएफ बूंदों में से एक से एचएसओएफ के 200 μL जोड़ने के लिए विंदुक का उपयोग करें।
    2. एचएसओएफ ड्रॉप से ओओसाइट्स को स्थानांतरित करें और उन्हें एचएसओएफ ड्रॉप के अप्रयुक्त 400 μL में रखें। हाइलूरोनिडेस और क्यूम्यलस सेल अवशेषों को हटाने में सहायता के लिए उन्हें दो अतिरिक्त एचएसओएफ बूंदों से धो लें।
    3. एक मुंह विंदुक (या एक 10 μL विंदुक और टिप) और उच्च सूक्ष्म आवर्धन का उपयोग कर, रोल और ध्रुवीय शरीर की उपस्थिति के आधार पर ओओसाइट्स का चयन करें।
    4. ओओसाइट्स को सॉर्ट करने के बाद, विभाजित होने के लिए एमआईआई ओओसाइट्स की वांछित संख्या एकत्र करें, और उन्हें एचएसओएफ ड्रॉप के 400 μL में रखें।
      नोट: यदि ओओसाइट्स 30 मिनट से अधिक समय तक इनक्यूबेटर के बाहर रहे हैं, तो ओओसाइट्स को परिपक्वता मीडिया के एक कुएं में वापस रखा जा सकता है और कम से कम 30 मिनट के लिए आराम करने के लिए सीओ2-नियंत्रित इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है। इनक्यूबेशन के बाहर समय को कम करने के लिए लगभग 30 मिनट में द्विभाजन को समाप्त करने के लिए संभव राशि के लिए ओओसाइट्स की संख्या को सीमित करें। यदि ओओप्लास्ट को दैहिक कोशिका के साथ जोड़ा जाना है, सक्रिय किया जाना है, और भ्रूण के रूप में सुसंस्कृत किया जाना है, तो इस समय ओओसाइट्स को एन्यूक्लिएट किया जाना चाहिए।

3. ओओसाइट्स का सेंट्रीफ्यूजेशन

नोट: यदि परिपक्वता मीडिया में इनक्यूबेटर में ओओसाइट्स रखे गए थे, तो उन्हें एचएसओएफ ड्रॉप में ले जाएं जहां से उन्हें हाल ही में एकत्र किया गया था।

  1. एक मुंह विंदुक का उपयोग करके, एचएसओएफ ड्रॉप से चयनित परिपक्व ओओसाइट्स एकत्र करें, और उन्हें एचएसओएफ / सीबी समाधान के 50 μL युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। 12 मिनट के लिए 15,000 एक्स जी पर ओओसाइट्स अपकेंद्रित्र।
    नोट: बुलबुले अपकेंद्रित्र ट्यूब में मौजूद होने के लिए हानिकारक नहीं है।
  2. जबकि ओओसाइट्स को सेंट्रीफ्यूज किया जा रहा है, द्विभाजन प्लेट तैयार करें।
    1. एक 60 मिमी पेट्री डिश (20 μL प्रति बूंद) के ढक्कन पर चित्रा 1 में दिखाया गया पैटर्न बनाओ, और पूरी तरह से खनिज तेल के साथ बूंदों को कवर।
    2. एक पतली इत्तला दे दी मार्कर का उपयोग कर, पकवान के नीचे लाइनों को चिह्नित करें, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है।
      1. प्रोनेज़ ड्रॉप के चारों ओर एक बॉक्स और सीबी / टी 20 बूंदों और टी 20 बूंदों की निचली पंक्ति के बीच एक रेखा खींचें।
    3. माइक्रोड्रॉप्स के ऑस्मोलरिटी परिवर्तनों को रोकने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन पूरा होने तक डिश को अपारदर्शी ढक्कन के साथ कवर करें।
  3. जैसे ही सेंट्रीफ्यूजेशन पूरा हो जाता है, समाधान के भीतर ओओसाइट्स को इकट्ठा करने के लिए 200 μL पिपेट का उपयोग करें, और उन्हें चार 400 μL HSOF बूंदों के साथ एक नई खोज प्लेट के खाली हिस्से में ले जाएं।
  4. चार एचएसओएफ बूंदों के माध्यम से ओओसाइट्स को इकट्ठा करें और धो लें।

Figure 1
चित्र 1: द्विभाजन प्लेट। दिखाए गए सभी बूंदों में 20 μL वॉल्यूम है। प्लेट का व्यास 60 मिमी है। बूंदों को पूरी तरह से खनिज तेल के साथ कवर किया गया है। ओओसाइट्स को पहले सबसे ऊपरी और सबसे बाएं टी 2 ड्रॉप में रखा जाएगा (यहां एक स्टार के साथ इंगित किया गया है)। टी 2: प्रोनेस के 10 μL और T2 के 10 μL, माइक्रोड्रॉप बनाने से पहले संयुक्त। टी 20: टी 20 के 1 एमएल प्रति साइटोचालासिन बी का 1 μL, माइक्रोड्रॉप बनाने से पहले संयुक्त। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: चिह्नित द्विभाजन प्लेट। माइक्रोस्कोप के नीचे किए गए अवलोकनों और ओओसाइट और ओओप्लास्ट स्थानान्तरण के लिए स्थान संदर्भ प्रदान करने के लिए प्लेट के तल पर एक पतली इत्तला दे दी मार्कर के साथ रेखाएं खींची जाती हैं। ओओसाइट्स को पहले सबसे ऊपरी और सबसे बाएं टी 2 ड्रॉप में रखा जाएगा (यहां एक स्टार के साथ इंगित किया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. द्विभाजन के लिए ओओसाइट की तैयारी

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया में द्विभाजन के लिए ओओसाइट्स की तैयारी शामिल है।

  1. हीटिंग चरण को 37 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें।
  2. द्विभाजन प्लेट के शीर्ष बाएं टी 2 ड्रॉप में एचएसओएफ ड्रॉप से सेंट्रीफ्यूज्ड ओओसाइट्स को स्थानांतरित करने के लिए एक मुंह विंदुक का उपयोग करें, फिर शीर्ष पंक्ति (टी 2, टी 20, टी 20) पर अगली तीन बूंदों के माध्यम से ओओसाइट्स को धो लें।
  3. प्रोनेस बूंदों में से एक में ओओसाइट्स जमा करें, यह आश्वस्त करते हुए कि उनके बीच कोई संपर्क नहीं है।
    नोट: ज़ोना पेलुसीडा को हटाने में अलग-अलग समय लग सकता है, लेकिन आमतौर पर हीटिंग चरण के उपयोग के साथ 30-120 एस के बीच होता है। हीटिंग चरण की अनुपस्थिति इस समय का विस्तार करेगी।
  4. ज़ोना पेलुसिडे का स्पष्ट विरूपण होने तक ओओसाइट्स का निरीक्षण करें ( चित्रा 3 देखें)।
  5. एक बार जब एक एकल ओओसाइट ज़ोना पेलुसीडा विकृत हो जाता है, तो उस ओओसाइट को पड़ोसी टी 2 ड्रॉप में ले जाएं। दोहराएं क्योंकि अतिरिक्त ओओसाइट्स विकृत हो जाते हैं, जब तक कि सभी ओओसाइट्स को प्रोनेस से हटा नहीं दिया जाता है और टी 2 ड्रॉप में रखा जाता है।
  6. ओओसाइट्स का निरीक्षण करें जब तक कि ज़ोन पेलुसीडा की केवल एक पतली परत न रह जाए।
  7. पंक्ति (टी 2, टी 20, टी 20) के भीतर अगली तीन बूंदों के माध्यम से ओओसाइट्स को धो लें, फिर उन्हें सीबी / टी 20 बूंदों के भीतर ऊर्ध्वाधर रेखाओं में जमा करें ( चित्रा 4 देखें)।
    1. ऊर्ध्वाधर रेखाओं में कम ओओसाइट्स के साथ शुरू करें और द्विभाजन कौशल प्रगति के रूप में प्रति बूंद ओओसाइट्स की संख्या बढ़ाएं।

Figure 3
चित्रा 3: प्रोनेस का उपयोग करके ज़ोना पेलुसीडा को हटाना ( 80x) एक ओओसाइट ज़ोना पेलुसीडा विकृत दिखाई देने लगेगा जब प्रोनेस ने ओओसाइट को आसन्न टी 2 ड्रॉप में ले जाने के लिए ज़ोना पेलुसीडा को पर्याप्त रूप से प्रभावित किया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: द्विभाजन बूंदों में ओओसाइट अभिविन्यास (80x) ज़ोना-मुक्त ओओसाइट्स द्विभाजन से पहले प्रत्येक सीबी / टी 20 ड्रॉप के भीतर निकट-ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में जमा होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. ओओसाइट्स का द्विभाजन

  1. टी 20 (द्विभाजन) ड्रॉप पर ध्यान केंद्रित करें जिसमें ओओसाइट्स होते हैं, और ओओसाइट्स को घुमाने के लिए मुंह विंदुक का उपयोग करें, ताकि प्रत्येक ओओसाइट का माइटोकॉन्ड्रिया-घना हिस्सा या तो माइक्रोस्कोप की बांह की ओर या उससे दूर हो।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया-घने हिस्से में लिपिड नहीं होंगे, जो सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद ओओसाइट के सबसे गहरे हिस्से के रूप में दिखाई देते हैं।
  2. माइटोकॉन्ड्रिया-घने हिस्से के ठीक ऊपर की जगह के अनुरूप, सबसे ऊपरी ओओसाइट के बाईं ओर माइक्रोब्लेड की नोक को आराम दें। ब्लेड की नोक को एक ही स्थान पर रखते हुए, ओओसाइट के माध्यम से सभी तरह से काटने के लिए ब्लेड को सावधानीपूर्वक कम करें।
    1. सुनिश्चित करें कि माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओओप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओओप्लास्ट आकार में समान हैं; द्विभाजन को दो ओप्लास्ट का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक ओओसाइट को आधे में काटना चाहिए।
      नोट: एक एकल ओओसाइट से उत्पादित ओप्लास्ट के तुलनात्मक आकार अनुसंधान लक्ष्यों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं; यदि माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट को दैहिक कोशिका के साथ जोड़ा जाना है, तो उनकी मात्रा माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट से अधिक होनी चाहिए।
    2. सुनिश्चित करें कि ब्लेड माइटोकॉन्ड्रिया-घने हिस्से के ऊपर और लिपिड-घने हिस्से के नीचे, सेंट्रीफ्यूज्ड ओओसाइट के सबसे स्पष्ट खंड में ओओसाइट को विभाजित कर रहा है।
  3. ब्लेड उठाते समय, सुनिश्चित करें कि एक ही रेखा बनाए रखी गई है, और ब्लेड की नोक एक ही स्थान पर रहती है, फिर धीरे-धीरे प्लेट से टिप उठाएं।
  4. पहले द्विभाजन ड्रॉप के भीतर सभी ओओसाइट्स के लिए द्विभाजन चरणों को दोहराएं। यदि ओओसाइट्स अतिरिक्त बूंदों में मौजूद हैं, तो शेष ओओसाइट्स को उन्मुख और विभाजित करें।
  5. एक मुंह विंदुक का उपयोग करके, पहले द्विभाजन ड्रॉप से माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट एकत्र करें। उन्हें प्लेट की निचली पंक्ति में स्थित बाएं हाथ के टी 20 ड्रॉप में रखें। सभी शेष द्विभाजन बूंदों के लिए दोहराएं।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओओप्लास्ट में लिपिड होंगे, जो बाकी ओओसाइट की तुलना में गहरे रंग के होते हैं।
  6. एक मुंह विंदुक का उपयोग करके, पहले द्विभाजन ड्रॉप से माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट एकत्र करें। उन्हें प्लेट की निचली पंक्ति में स्थित दाएं हाथ के टी 20 ड्रॉप में रखें। सभी शेष द्विभाजन बूंदों के लिए दोहराएं।
    नोट: माइटोकॉन्ड्रिया-घने क्षेत्रों में ऑर्गेनेल का एक दृश्य समूह होगा जो दिखने में हल्का भूरा होगा।
  7. इनक्यूबेटर से टी 10 चार अच्छी तरह से पकवान पुनः प्राप्त करें। मुंह विंदुक का उपयोग करके, सभी माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओओप्लास्ट को अच्छी तरह से लेबल "एमआर" में ले जाएं और माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट को अच्छी तरह से लेबल "एम" में ले जाएं।
  8. सीओ2-नियंत्रित इनक्यूबेटर में चार अच्छी तरह से प्लेट वापस रखें। एमटीडीएनए की मात्रा का ठहराव करने से पहले ओप्लास्ट को कम से कम 30 मिनट तक आराम करने की अनुमति दें।

6. एमटीडीएनए का परिमाणीकरण

  1. व्यक्तिगत नमूनों (एकल ओओसाइट्स, एकल माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओओप्लास्ट, एकल माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओओप्लास्ट) से डीएनए निकालने के लिए एक छोटे से नमूने से सामग्री निकालने के लिए डिज़ाइन किए गए डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें।
  2. यह सुनिश्चित करने के लिए पसंद की डीएनए परिमाणीकरण विधि का उपयोग करें कि डीएनए प्रत्येक नमूने से सफलतापूर्वक निकाला गया था। यदि मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) उस समय पूरा नहीं होगा, तो निकाले गए डीएनए को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में लेबल ट्यूब में फ्रीज करें।
  3. क्यूपीसीआर निष्पादित करें
    1. प्राइमर अनुक्रमों के साथ प्रत्येक क्यूपीसीआर ट्यूब में जोड़ने के लिए प्रत्येक अभिकर्मक की मात्रा निर्धारित करने के लिए तालिका 2 देखें। इन प्राइमरों को गोजातीय एमटीडीएनए के 12 एस क्षेत्र को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
    2. 10 मिनट के लिए प्रारंभिक विकृतीकरण समय निर्धारित करें, इसके बाद 35 चक्र: 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 30 एस, 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग के 15 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार के 15 एस। जब प्रतिक्रिया पूरी हो जाती है, तो चक्र थ्रेशोल्ड (सी टी) मान रिकॉर्डकरें।
      नोट: सापेक्ष एमटीडीएनए कॉपी संख्या मान प्राप्त करने के लिए, एमटीडीएनए कॉपी संख्याओं की ज्ञात मात्रा वाले नमूनों का उपयोग करके एक मानक वक्र का उत्पादन किया जाना चाहिए, जो तेजी से बढ़ता है। चक्र थ्रेशोल्ड मानों को तब सापेक्ष एमटीडीएनए प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित सूत्रों का उपयोग करके हेरफेर करने की आवश्यकता होती है।
    3. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके डीएनए की एकाग्रता प्राप्त करें:
      डीएनए की एकाग्रता = (10(सीटी-इंटरसेप्ट/ढलान)) एक्स परीक्षण मात्रा
    4. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके प्रतिलिपि संख्या प्राप्त करें:
      कॉपी नंबर = Equation 1
    5. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके प्रतिलिपि संख्या प्राप्त करें:
      प्रति कक्ष प्रतिलिपि संख्या = 2 x Equation 2

Figure 5
चित्रा 5: दैहिक सेल एमटीडीएनए मानक वक्र। यह मानक वक्र प्रोटोकॉल चरण 6.3 में वर्णित क्यूपीसीआर अभिकर्मकों और कार्यक्रम का उपयोग करके गोजातीय दैहिक कोशिकाओं के लघुगणकीय सांद्रता के एमटीडीएनए परिमाणीकरण के माध्यम से बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) परिणामों का उपयोग प्रत्येक ओप्लास्ट में मौजूद एमटीडीएनए की सापेक्ष मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। वर्णित प्रतिक्रिया को गोजातीय एमटीडीएनए के 12 एस क्षेत्र को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

यदि द्विभाजन सफल रहा, तो पूरे ओओसाइट्स और माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट के नमूनों में समान सीटी मान होंगे। अन्य दो समूहों के नमूनों की तुलनामें माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट के नमूनों में उच्च सी टी मान होंगे। सफल द्विभाजन परिणाम दिखाने वाला एक सीटी ग्राफ नीचे दिखाया गया है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि द्विभाजन ने माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट (चित्रा 6) में एमटीडीएनए सामग्री को प्रभावी ढंग से कम कर दिया।

Figure 6
चित्रा 6: सफल द्विभाजन क्यूपीसीआर परिणाम। चक्र संख्या और प्रतिदीप्ति की तुलना करने वाला ग्राफ एकल ओओसाइट्स, माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट (बैंगनी रेखाओं द्वारा दर्शाया गया), और माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट के चक्र थ्रेशोल्ड मूल्यों को प्रदर्शित करता है। माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट के सीटी मूल्यों में औसतन 29.931 (बैंगनी रेखाएं) होती हैं, जबकि एकल ओओसाइट्स का औसत सीटी मान 20.802 (लाल और हरी रेखाएं) होता है, और माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट का औसत सीटी मूल्य 21.389 (नीली और सोने की रेखाएं) होता है। माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओओप्लास्ट नमूनों के बढ़े हुए सीटी मान इन नमूनों के भीतर एमटीडीएनए कॉपी संख्या में कमी का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

असफल द्विभाजन परिणाम दिखाने वाला एक सीटी ग्राफ चित्रा 7 में दिखाया गया है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि द्विभाजन ने माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट में एमटीडीएनए सामग्री को प्रभावी ढंग से कम नहीं किया:

Figure 7
चित्रा 7: असफल द्विभाजन क्यूपीसीआर परिणाम। चक्र संख्या और प्रतिदीप्ति की तुलना करने वाला लाइन ग्राफ एकल ओओसाइट्स (गहरे हरे और हल्के हरे रंग की रेखाओं), माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट (बैंगनी रेखाएं), और माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट (नीली और सोने की रेखाएं) के चक्र थ्रेशोल्ड मूल्यों को प्रदर्शित करता है, जिनमें से सभी में 20.232-20.757 की सीमा के भीतर सीटी मान होते हैं। यह माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट नमूनों में एमटीडीएनए कॉपी संख्या में महत्वपूर्ण परिवर्तन की अनुपस्थिति को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक मानक वक्र के उत्पादन और प्रदान की गई एमटीडीएनए कॉपी संख्या सूत्रों के उपयोग के बाद, इस प्रोटोकॉल (चित्रा 8) का उपयोग करके 93.88% की औसत ओओसाइट एमटीडीएनए कमी हासिल की गई है।

Figure 8
चित्रा 8: बॉक्सप्लॉट पूरे ओओसाइट्स, माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओओप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट से प्राप्त सापेक्ष माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए कॉपी संख्याओं की तुलना करता है। पूरे ओओसाइट्स (एन = 38), माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओओप्लास्ट (एन = 34), और माइटोकॉन्ड्रिया-घने ओप्लास्ट (एन = 29)। अन्य दो समूहों (पी < 0.001) की तुलना में माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओप्लास्ट में काफी कम प्रतिलिपि संख्या होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घोल कुल वॉल्यूम विलायक विलेय
हाइलूरोनिडेस समाधान 400 μL 1 एमएल एम -199 0.6 मिलीग्राम हाइलूरोनिडेस
टी 2 मीडिया 500 μL एम -199 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (वी /
टी20 मीडिया 1020 μL एम -199 20% भ्रूण बोवाइन सीरम (वी /
टी 10 मीडिया 800 μL 400 μL T2 400 μL T20
सीबी/एचएसओएफ 500 μL 499.5 μL सिंथेटिक ओविडक्टल द्रव एचईपीईएस (एचएसओएफ) के साथ एमएल साइटोचालासिन बी (सीबी) का 0.5 μL
प्रोनेस समाधान 40 μL 1 एमएल एम -199 10 मिलीग्राम प्रोनेज
टी20/सीबी 500 μL 499.5 μL T20 एमएल सीबी का 0.5 μL

तालिका 1: आवश्यक समाधान। प्रोटोकॉल के भीतर आवश्यक प्रत्येक समाधान के लिए विलेय और सॉल्वैंट्स की मात्रा प्रदान करता है।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन
क्यूपीसीआर मास्टर मिश्रण 10 μL
प्राइमर अग्रेषित करें 0.6 μL
रिवर्स प्राइमर 0.6 μL
डीएनए सैंपल 4.4 μL
डेनिस-मुक्त पानी 4.4 μL
कुल वॉल्यूम 20 μL
प्राइमर अग्रेषित करें जीजीजीसीटीसीटीसीएसीएजी
रिवर्स प्राइमर जीटीजीसीटीसीटीसीएटीजीसीटीटीएटीएसीटीएसीटीएसी

तालिका 2: मात्रात्मक पीसीआर संरचना। प्रत्येक मात्रात्मक पीसीआर ट्यूब के लिए आवश्यक सभी अभिकर्मकों के आगे और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम और वॉल्यूम प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ओओसाइट्स में एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने के लिए पहले उपयोग किए जाने वाले तरीकों के अपने संबंधित नुकसान हैं। ओओसाइट्स से माइटोकॉन्ड्रिया के माइक्रोमैनिपुलेशन-आधारित हटाने से एमटीडीएनए कॉपी संख्या औसतन 64% 27 कम हो जाती है। एक अनूठी विधि, जो पहले एन्यूक्लिएशन के लिए उपयोग की जाती थी, में छोटे व्यास पाश्चर पिपेट का उपयोग और मीडिया के माइक्रोड्रॉप और आसपास के खनिज तेल के बीच की सीमा पर ज़ोना पेलुसिडा मुक्त ओओसाइट का विभाजन शामिल है। ओओसाइट सेंट्रीफ्यूजेशन के उपयोग के साथ, यह दृष्टिकोण व्यवहार्य माइटोकॉन्ड्रिया-कम ओओप्लास्ट28 का उत्पादन कर सकता है। हालांकि, सेंट्रीफ्यूजेशन और इस ओओसाइट-विभाजन विधि के संयोजन को अभी तक भ्रूण का उत्पादन करने की सूचना नहीं दी गई है। रासायनिक माइटोकॉन्ड्रिया कमी विधियों (जैसे कि 2', 3'-डिडियोक्सीसाइटिडाइन (डीडीसी), एक एमटीडीएनए संश्लेषण अवरोधक के लिए ओओसाइट्स के संपर्क में) ने ओओसाइट एमटीडीएनए कॉपी संख्या को 50% तक कम कर दिया है और इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम) 16,27 के दौरान 40 घंटे से अधिक समय तक सीओसी को रासायनिक के संपर्क में आने की आवश्यकता होती है। यद्यपि 40 घंटे के लिए डीडीसी-पूरक मीडिया में पोर्सिन ओओसाइट्स को इनक्यूबेट करने से पुनर्निर्मित भ्रूण16 के लिए मुद्दे प्रस्तुत नहीं हुए हैं, लेकिन उनके 20-22 एच आईवीएम या किसी भी बाद के भ्रूण के विकास के दौरान डीडीसी के लिए गोजातीय ओओसाइट्स के संपर्क के बारे में अभी तक डेटा प्रकाशित नहीं हुआ है। इस पत्र में वर्णित विधि सापेक्ष एमटीडीएनए कॉपी संख्या को लगभग 93.88% तक कम कर देती ± है, औसतन 45,565 से 37,169 प्रतियां (एसडी ± मतलब) 13,287 ± 8,396 तक।

प्रोटोकॉल के भीतर कई कदम एक ओओसाइट की माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (एमटीडीएनए) कॉपी संख्या को प्रभावी ढंग से कम करने के मामले में संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अनुकूलित गति (15,000 एक्स जी) और समय (12 मिनट) पर ओओसाइट्स को सेंट्रीफ्यूज करना प्रत्येक ओओसाइट के एक ध्रुव पर अधिक केंद्रित माइटोकॉन्ड्रिया अंश बनाएगा। एचएसओएफ) समाधान (50 μL) के साथ साइटोचालासिन बी / सिंथेटिक ओविडक्टल द्रव की सही मात्रा सेंट्रीफ्यूजेशन के कारण ओओसाइट लाइसिस को समाप्त कर देगी। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ज़ोना पेलुसिडा (जेडपी) को प्रोनेस समाधान के संपर्क में आने से हटा दिया जाता है; जेडपी को पूरी तरह से हटाने से अधिक सटीक द्विभाजन सुनिश्चित होगा और ओओसाइट्स से किसी भी शेष क्यूम्यलस कोशिकाओं को भी अलग करना चाहिए। जेडपी को हटाते समय माइक्रोस्कोप पर हीटिंग चरण का उपयोग वैकल्पिक है, लेकिन कम से कम 1 मिनट तक जेडपी हटाने में तेजी लाता है। द्विभाजन बूंदों में ज़ोना पेलुसीडा-मुक्त (जेडएफ) ओओसाइट्स का अभिविन्यास उन्हें सटीक रूप से विभाजित करने के लिए महत्वपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया अंश, प्रत्येक ओओसाइट के एक ध्रुव पर पाया जाता है, स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए और द्विभाजन से पहले ओओसाइट के ऊपर या नीचे स्थित होना चाहिए। विपरीत ध्रुव में अंधेरे लिपिड बूंदें होंगी। द्विभाजन के बाद, ओप्लास्ट का चयन और सही वर्गीकरण (माइटोकॉन्ड्रिया-घने या माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त के रूप में) द्विभाजन का सटीक मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह चुनना कि कौन सा मेटाफ़ेज़ II (एमआईआई) ओओसाइट्स को विभाजित करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करना कि उपयोग किए जाने वाले ओओसाइट्स गोलाकार हैं और सजातीय साइटोप्लाज्म हैं, संभवतः प्रत्येक ओओसाइट और ओओप्लास्ट के भीतर निहित एमटीडीएनए कॉपी संख्या में अंतर होगा। व्यक्तिगत मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) को डिजाइन और संश्लेषित करते समय, यह सुनिश्चित करना कि प्रत्येक प्रतिक्रिया में सही प्राइमर और अभिकर्मक सांद्रता का उपयोग किया जाता है, सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक मानक वक्र का उत्पादन किया जाना चाहिए, इसे यथासंभव सटीक रूप से बनाया जाना चाहिए, और अधिक सटीकता प्राप्त करने के लिए सभी प्रतिक्रियाओं को तीन गुना में किया जाना चाहिए। प्रत्येक क्यूपीसीआर चरण का समय और तापमान प्रत्येक रन के लिए समान रहना चाहिए।

प्रोटोकॉल का पालन करते समय कुछ समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं। द्विभाजन प्लेट में तेल जोड़ते समय, सुनिश्चित करें कि बूंदें सिर्फ कवर की गई हैं; बहुत अधिक तेल पिपेट उपयोग को कम कुशल बना देगा, जबकि बहुत कम बूंदों के वाष्पीकरण का कारण होगा। यह वाष्पीकरण समाधानों की परासरणता में परिवर्तन का कारण होगा, जो ओओसाइट्स और ओप्लास्ट के लिए हानिकारक हो सकता है। यदि ओओसाइट्स जेडपी के पाचन के बाद लाइज़ करते हैं, तो यह व्यक्तिगत अनुभव और अवलोकन के आधार पर निम्नलिखित में से एक या दोनों के कारण होने की संभावना है: ओओसाइट्स को निर्धारित समय और गति के लिए सेंट्रीफ्यूज नहीं किया गया था, और / कुछ जेडएफ ओओसाइट्स द्विभाजन बूंदों के भीतर पूरी तरह से गोलाकार आकार हासिल नहीं कर सकते हैं। ध्यान रखें कि सभी जेडएफ ओओसाइट्स द्विभाजन के लिए बेहतर रूप से तैनात नहीं हो पाएंगे। इस मामले में, तीन विकल्प हैं: जेडएफ ओओसाइट्स को गोलाकार आकार हासिल करने के लिए अतिरिक्त समय दें; द्विभाजन से पहले माइक्रोब्लेड के साथ अधिक ईमानदार स्थिति में धीरे-धीरे ओओसाइट्स को पकड़ें; उन ओओसाइट्स को विभाजित न करें जो सही ढंग से तैनात होने में असमर्थ हैं। यह निर्धारित करना कि द्विभाजन के बाद कौन से ओप्लास्ट माइटोकॉन्ड्रिया-घने या माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त हो गए हैं, परिमाणीकरण परिणामों को प्रभावित करेंगे। यदि ओप्लास्ट को वर्गीकृत करना मुश्किल है, तो ओओसाइट्स को स्थिति दें जिन्हें विभाजित किया जाएगा ताकि माइटोकॉन्ड्रिया अंश या तो हमेशा ड्रॉप के ऊपर या नीचे की ओर इशारा किया जाए, और / या इसके ध्रुवों में से एक पर ओओसाइट के अंधेरे हिस्से की तलाश करें (ये लिपिड बूंदें माइटोकॉन्ड्रिया अंश से विपरीत ध्रुव पर केंद्रित हैं)। कभी-कभी, ओप्लास्ट एक दूसरे से चिपक सकते हैं और / या प्लेट में माइक्रोब्लेड द्वारा किए गए इंडेंटेशन। कभी-कभी, गोलाकार आकार हासिल करने के लिए अतिरिक्त समय के साथ ओप्लास्ट प्रदान करने से पृथक्करण में सहायता मिलेगी। अन्य विकल्पों में धीरे-धीरे प्लेट को टैप करना, धीरे-धीरे उन्हें पिपेट के अंदर और बाहर चूसना, और / या ओप्लास्ट को धीरे-धीरे अलग करने के लिए पिपेट के किनारे का उपयोग करना शामिल है।

इस एमटीडीएनए कॉपी संख्या में कमी विधि की अपनी सीमाएं हैं; एक ओओसाइट स्रोत पर आधारित है, और दूसरा ओओसाइट से जेडपी को हटाने के कारण है। ओओसाइट स्रोत (जानवर स्वयं, विशिष्ट अंडाशय, और विशिष्ट कूप) उस विशिष्ट ओओसाइट के भीतर एमटीडीएनए कॉपी संख्याओं को बहुत प्रभावित करेगा। एक एकल ओओसाइट की औसत एमटीडीएनए कॉपी संख्या के आसपास एक बड़ा मानक विचलन है, यह दर्शाता है कि कॉपी संख्या कितनी परिवर्तनशील हो सकती है। कई एकल ओओसाइट परिमाणीकरण प्रतिक्रियाओं को एक मजबूत एकल ओओसाइट मानक प्रतिलिपि संख्या की आवश्यकता होती है जिसकी तुलना ओप्लास्ट और अन्य ओओसाइट्स के खिलाफ की जाएगी। बड़े पैमाने पर मानक विचलन ओओप्लास्ट की तुलना ओओसाइट से कम निरपेक्ष बनाता है, क्योंकि ओओप्लास्ट की प्रतिलिपि संख्या की तुलना इसकी उत्पत्ति के ओओसाइट से नहीं की जा सकती है।

ओओसाइट के ज़ोना पेलुसिडे का पाचन परिणामी जेडएफ ओओसाइट और ओप्लास्ट को उनके ज़ोना पेलुसिडे को हटाने से पहले की तुलना में बहुत अधिक नाजुक बनाता है। यह नाजुकता ओप्लास्ट और जेडएफ ओओसाइट्स की उच्च लसीका दर की ओर ले जाती है, विशेष रूप से माइक्रोब्लेड के उपयोग के साथ-बड़ी मात्रा में देखभाल और परिशुद्धता का उपयोग किया जाना चाहिए। क्या ओप्लास्ट का उपयोग संलयन के लिए किया जाना चाहिए, संलयन का प्रयास करने से पहले उन्हें द्विभाजन के बाद आराम की आवश्यकता होती है। अन्यथा, कई ओप्लास्ट संभवतः लाइज़ होंगे। माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओप्लास्ट उनके माइटोकॉन्ड्रिया-घने समकक्षों की तुलना में अधिक नाजुक होते हैं। ओओसाइट के सूक्ष्मनलिकाएं माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान ओओसाइट के एक ही ध्रुव में पलायन करती हैं, जो माइटोकॉन्ड्रिया-समाप्त ओओप्लास्ट को कम संरचनात्मक घटकों के साथ छोड़ देती है29. अतिरिक्त शोध और धुंधला यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं कि क्या अन्य ओओसाइट ऑर्गेनेल इस प्रोटोकॉल में ओप्लास्ट का उत्पादन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेंट्रीफ्यूजेशन और द्विभाजन के संयोजन से नकारात्मक रूप से प्रभावित होते हैं।

ओओसाइट माइटोकॉन्ड्रिया में कमी एक परिणामी आईएससीएनटी भ्रूण में ओओसाइट प्रजातियों के माइटोकॉन्ड्रिया को कम कर देगी, इसलिए उस पुनर्निर्मित भ्रूण में माइटोकॉन्ड्रिया हेटरोप्लाज्मी की घटनाओं को कम कर देगी। भ्रूण के विकास की संभावना तुलनात्मक रूप से बढ़जाएगी, लेकिन विकास के दौरान ऊर्जा आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए दाता कोशिका प्रजातियों से माइटोकॉन्ड्रिया के पूरक की आवश्यकता होगी। इस प्रकार अब तक, इंटरजेनेरिक क्रॉस का उपयोग करने वाले आईएससीएनटी प्रयासों ने जीवित संतानों का उत्पादन नहीं किया है। आईएससीएनटी भ्रूण में हेटरोप्लाज्मी कम होने से सफल गर्भधारण की संभावना बढ़ सकती है। आईएससीएनटी एक ऐसी विधि है जो लुप्तप्राय30 के रूप में वर्गीकृत 40,000 प्रजातियों में से कुछ को बचाने में मदद कर सकती है। चूंकि इन प्रजातियों की दैहिक कोशिकाएं आमतौर पर उनकी रोगाणु कोशिकाओं की तुलना में अधिक सुलभ होती हैं, इसलिए आईएससीएनटी घरेलू प्रजातियों के ओओसाइट्स के साथ इन दैहिक कोशिकाओं का उपयोग कर सकता है। इंट्राजेनेरिक प्रयास जीवित जानवरों31,32,33 के उत्पादन में सफल रहे हैं, हालांकि संतान आमतौर पर एमटीडीएनए के लिए चिमेरिक होती है, और एक इंट्राजेनेरिक ओओसाइट स्रोत ढूंढना हमेशा संभव नहीं होता है। एमटीडीएनए कॉपी संख्या को कम करने के लक्ष्य के साथ ओओसाइट्स का द्विभाजन, इसके बाद एक अंतर-विशिष्ट दैहिक कोशिका के साथ इन ओप्लास्ट का संलयन, आईएससीएनटी भ्रूण में काइमेरिज्म और हेटरोप्लाज्मी को कम करेगा। इन कटौती के कारण, वर्णित विधि का उपयोग इंटरजेनेरिक जीवित जन्मों की अधिक क्षमता और लुप्तप्राय प्रजातियों की निरंतरता की अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक यूटा स्टेट यूनिवर्सिटी में अपने सहयोगियों, सैन डिएगो चिड़ियाघर में प्रजनन विज्ञान शोधकर्ताओं और जीनस पीएलसी में डॉ रेबेका क्रिशर को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 5408129
60 mm dish Sigma-Aldrich D8054
Centrifuge Eppendorf 5424
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442
M199 Media Sigma-Aldrich M4530
Mineral Oil Sigma-Aldrich M8410
Mini Centrifuge SCILOGEX D1008
mtDNA Primer: Forward (12S) GGGCTACATTCTCTACACCAAG
mtDNA Primer: Reverse (12S) GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND2000
Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle PFM Medical 207300633 Microblade for bisection
Protease/pronase Sigma-Aldrich P5147
QIAamp DNA Micro Kit Qiagen 56304
QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL ThermoFisher A28567
Search plate Fisher Scientific FB0875711A
SYBR Green qPCR Master Mix ThermoFisher K0221 qPCR master mix
Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF)
ThermoPlate Tokai Hit TPi-SMZSSX Heating stage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
  2. Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
  3. Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
  4. Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
  5. Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
  6. Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
  7. Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
  8. Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
  9. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  10. Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
  11. Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
  12. Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
  13. Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).
  14. Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
  15. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
  16. Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
  17. Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
  18. Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
  19. Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
  20. Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
  21. Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
  22. Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
  23. Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
  24. Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
  25. Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
  26. Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
  27. Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
  28. Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
  29. Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
  30. International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
  31. Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
  32. Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
  33. Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).

Tags

विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 185
बोवाइन ओओसाइट में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए को कम करने के लिए द्विभाजन का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adams, L., Liu, Y., Durrant, B.,… More

Adams, L., Liu, Y., Durrant, B., Ruggeri, E., Young, C., Krisher, R., Polejaeva, I. Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte. J. Vis. Exp. (185), e64060, doi:10.3791/64060 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter