Summary
ここでは、ウシ卵母細胞におけるミトコンドリアDNAコピー数を有意に減少させるプロトコールを提示する(P < 0.0001)。この方法は、遠心分離および二分法を利用して卵母細胞ミトコンドリアを実質的に減少させ、再構成された種間体細胞核移植胚における発生の増大の機会を可能にし得る。
Abstract
種間体細胞核移植(iSCNT)は絶滅危惧種を救うために使用することができるが、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の2つの異なる集団が再構築された胚内に存在する:1つはレシピエント卵形質内および1つはドナー体細胞内である。このミトコンドリアヘテロプラスミーは、胚および胎児の発達上の問題につながる可能性がある。手作りのクローニングプロトコルには卵母細胞二切除が含まれ、mtDNAコピー数を減らし、再構築された胚におけるミトコンドリアヘテロプラズムの程度を低下させるために使用できる。脱蹄した成熟したウシ卵母細胞の遠心分離は、卵母細胞の一極に目に見えるミトコンドリア緻密画分を生じた。卵母細胞の透明帯は、プロナーゼ溶液への曝露によって除去した。可視ミトコンドリア画分を除去するためにマイクロブレードを用いて二分断を行った。qPCRを使用して、卵母細胞全体および二等分した卵子から抽出したDNAサンプル中に存在するmtDNAを定量し、二分切除前後のmtDNAコピー数を比較した。コピー数は、サイクル閾値、標準曲線の回帰直線式、およびmtDNA PCR産物およびゲノムPCR産物のそれぞれのサイズを含む比率を用いて計算した。1つのウシ卵母細胞は、137,904±94,768(n=38)の平均mtDNAコピー数(標準偏差±)を有していた。1つのミトコンドリア枯渇卵母細胞は、8,442±13,806(n = 33)の平均mtDNAコピー数を有していた。ミトコンドリアに富む卵母細胞中に存在する平均mtDNAコピーは、79,390±58,526 mtDNAコピーであった(n = 28)。これらの計算された平均の差は、遠心分離とその後の二分割が、元の卵母細胞(P<0.0001、一元配置分散分析によって決定される)と比較して、ミトコンドリア枯渇した卵細胞中に存在するmtDNAコピー数を有意に減少させることができることを示している。mtDNAの減少は、再構築された胚におけるミトコンドリアヘテロプラミーの程度を低下させ、おそらく標準的な胚および胎児の発達を促進するはずである。体細胞ドナー細胞からのミトコンドリア抽出物の補充もまた、胚発生を成功させるために不可欠であり得る。
Introduction
体細胞核移植(SCNT)は、1匹の動物からの除核卵母細胞と、同じ種の動物からの体細胞との融合を含む。ほとんどの場合、卵母細胞と体細胞は同じ種に由来し、出生率は6%1未満です。いくつかの研究は、2つの異なる種に由来する体細胞と卵母細胞の融合を含む種間SCNT(iSCNT)の使用を含む。これらの研究では、出生率はSCNTよりもさらに低く、通常は1%未満です1。しかしながら、iSCNTは、これらの動物由来の体細胞が生殖細胞1よりもアクセスしやすいため、絶滅危惧種を救出する方法として使用できる能力を有する。iSCNTで使用されるレシピエント卵母細胞は、多くの場合、ウシ、ブタ、およびマウスなどの国内または一般的な実験室種である。これまでになされたいくつかの試みは、生産された子孫がジェネリック内動物であったが(レシピエント卵母細胞種およびドナー細胞種は同じ属のメンバーであった)2、3、4。ジェネリック間モデル(異なる属の動物由来の卵母細胞および体細胞を利用する)はまだ生きた動物を産生しておらず、再構成された胚の大部分は、in vitro発生の8〜16細胞段階で停止する5、6、7、8。この胚発生停止の1つの可能な説明は、胚におけるミトコンドリアヘテロプラスミーの発生、すなわち単一の細胞における複数のミトコンドリアDNA(mtDNA)型の存在である。ヘテロプラスミーは、胚または生きた動物1における発生の非効率性または障害などの問題をもたらし得る。病因は、動物の生涯の後半にも起こり得る9。この問題はSCNTの子孫にも存在するが、iSCNT胚内の種間成分が問題を悪化させる。
胚性mtDNAが2つの異なる種に由来する場合、大多数を占めるレシピエント卵母細胞ミトコンドリアは、ドナー細胞の核1,10と効率的または効果的に機能しない。iSCNTで使用される2つの種の間の分類学的ギャップが大きいほど、この問題が激化する可能性が高い。内ジェネリック内で産生された生きた子孫(ボス・ガウルスおよびボス・インディカス子孫はボス・トーラス・卵母細胞を使用)、ならびに伝統的なSCNTを介して産生された子孫(例えばオービス・アリエス・卵母細胞を用いたオビス・アリエス子孫)はキメラであることが示された(2個体由来のmtDNAがこれらの動物に存在していた11、12、13)。しかし、彼らはジェネリック間SCNT胚よりもはるかに発展しました14,15。卵母細胞ミトコンドリアとドナー細胞の核との間の情報交換は、ジェネリック間胚よりもジェネリック内胚においてより成功する可能性がある16。
成熟ウシ卵母細胞中のmtDNAの量は、1つの体細胞12中に見出される量の約100倍である。この比率を低くすると、体細胞ミトコンドリアが再構築された胚内で増殖し、生産的なミトコンドリアのより大きな集団が存在することを可能にする可能性がある16。これは、順番に、発達胚15の要件を満たすためにより多くのエネルギーを提供することができる。卵母細胞または胚のmtDNAコピー数を減少させるためになされた以前の試みには、化学的適用、微小操作、およびドナー細胞種からの追加のミトコンドリアで卵母細胞または胚を補うことが含まれる16、17、18、19、20。しかし、化学的適用(2',3'-ジデオキシシチジンなど)は胚発生には理想的ではなく、卵母細胞mtDNAコピー数を約半分に18個減少させている。マイクロマニピュレーションによる以前の卵母細胞mtDNA減少は、卵母細胞のmtDNAの平均64%しか除去していない17。ドナー細胞ミトコンドリアの補充は実行可能な選択肢であるかもしれないが、その使用はまだiSCNT研究21内で生きたジェネリック間動物を産生していない。
卵母細胞mtDNAコピー数を減らすための二分法の使用は、公表された研究においてまだ使用されていない。卵子細胞と体細胞を融合させる目的で卵母細胞を二等分することは、手作りクローニング(HMC)の前提であり、これは典型的には、中相II(MII)卵母細胞から極性体および中期プレートを除去する方法として二分割を利用する。HMCは、ヤギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ22、23、24、25、26を含むいくつかの種で子孫を首尾よく産出してきたが、典型的には二分分離前の遠心分離工程を含まない。卵母細胞の高速遠心分離を統合することで、卵母細胞の1極でミトコンドリア(したがってmtDNA)を単離することができ、マイクロブレードを使用して二等分してミトコンドリア密度の高い画分を除去することができます。その後、2つのミトコンドリア枯渇した卵胞体を、HMCの場合のように体細胞と融合させて、卵母細胞種からのmtDNAをかなり少なく含む再構成胚を形成することができる。
このプロトコルで答えようとする質問は、ヘテロプラズムmtDNAの含有量が少ない生存可能な再構築胚を生成するために、ウシ卵母細胞中のmtDNAをどのように低減するかということです。このプロトコールでは、卵母細胞を遠心分離し、二等分した。ウープラストおよびインタクトな卵母細胞のmtDNAコピー数を計算し、ウシ卵母細胞のmtDNAコピー数を減少させる上でのこの技術の有効性を決定した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
以下のプロトコルは、ユタ州立大学が提供する動物ケアと倫理のガイドラインに従っています。
1. メディアの準備
- 卵母細胞の取り扱いに先立って、 表1に記載されるように、以下の溶液を調製する:400 μLのヒアルロニダーゼ溶液、500 μLのT2培地、1,020 μLのT20培地、および800 μLのT10培地。
- T10培地を4ウェルプレートの2つのウェル(1ウェルあたり400μL)に分割します。1 つのウェルに "M" のラベルを付け、2 番目のウェルに "MR" のラベルを付けます。二分後まで5%CO2 インキュベーターに入れる。
- サイトカラシンB(CB)/合成卵管液500μLをHEPES(HSOF)で調製する。50 μL の CB/HSOF 溶液を別の 1.5 mL 遠沈管にアリコートします。
- 40 μLのプロナーゼ溶液を調製する。2,680 x gで少なくとも30秒間遠心分離機。20 μLの上清と20 μLのT2を新しい遠沈管に混合する。これは、希釈された5mg/mLプロナーゼ溶液を形成する。
- 3mLのHSOFを調製する。検索プレート上に、400μL滴4滴を別々に堆積させる。このプレートを実体顕微鏡の下に置きます。
- 500 μL の CB/T20 溶液を調製します。
2. ウシ卵母細胞の インビトロ 成熟(IVM)
- IVM:吸引した積雲-卵母細胞複合体(COC)を、10%FBS、0.26 IU/mL FSH、および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを含む成熟培地の4ウェルディッシュ中で、5%CO2インキュベーター内で38.5°Cで21時間培養した。
- 卵母細胞をデヌードするには、次の手順を実行します。
- 200 μL のピペットを使用して必要な数の COC を収集し、1.5 μL の遠沈管の底に堆積させます。
- 同じ容量の0.6 mg/mLヒアルロニダーゼを卵母細胞とともに遠沈管に加えます(すなわち、卵母細胞およびIVM培地の体積が100 μLの場合は、100 μLのヒアルロニダーゼを加えます)。
- すべての積雲細胞が除去されるまで、泡を作らずに溶液を上下にピペットで送ります。
- 卵母細胞の成熟を確認してください。
- ピペットを使用して、検索プレート上の4つのHSOF滴のうちの1つから200μLのHSOFを卵母細胞/ヒアルロニダーゼ溶液に加えます。
- ヒアルロニダーゼ/HSOF滴から卵母細胞を移し、未使用の400μLのHSOF滴に入れます。ヒアルロニダーゼと積雲細胞の残骸を除去するのを助けるために、2つの追加のHSOF滴でそれらを洗ってください。
- 口内ピペット(または10 μLピペットおよびチップ)および高顕微鏡倍率を用いて、ロールし、極性体存在に基づいて卵母細胞を選択する。
- 卵母細胞を選別した後、二等分されるMII卵母細胞の所望の数を収集し、400μLのHSOF滴に入れる。
注:卵母細胞が30分を超えてインキュベーターの外側にいた場合、卵母細胞を成熟培地の井戸に戻してCO2制御インキュベーターに入れ、少なくとも30分間休ませることができます。二等分される卵母細胞の数を、インキュベーション以外の時間を最小限に抑えるために、約30分で二等分を終えることが実現可能な量に制限する。卵子を体細胞と融合させ、活性化し、胚として培養する場合、卵母細胞はこの時点で除核されるべきである。
3. 卵母細胞の遠心分離
注:卵母細胞を成熟培地中のインキュベーターに入れた場合は、最後に収集されたHSOFドロップに移動します。
- マウスピペットを使用して、HSOF滴から選択した成熟卵母細胞を回収し、50μLのHSOF/CB溶液を含む1.5mLチューブに入れます。卵母細胞を15,000 x g で12分間遠心分離する。
注:気泡が遠沈管に存在することは有害ではありません。 - 卵母細胞が遠心分離されている間に、二分割プレートを準備する。
- 60mmシャーレの蓋に 図1 のようなパターンを作り(1滴あたり20μL)、鉱油で滴を完全に覆います。
- 図 2 に示すように、先端の細いマーカーを使用して、皿の下の線に印を付けます。
- プロナーゼ滴の周囲にボックスを描き、CB/T20 滴と T20 滴の一番下の行の間に線を引きます。
- マイクロドロップの浸透圧変化を防ぐために、遠心分離が完了するまで皿を不透明な蓋で覆います。
- 遠心分離が完了したらすぐに、200 μLのピペットを使用して溶液中の卵母細胞を収集し、4つの400 μL HSOF滴を含む新しい探索プレートの空部分に移動します。
- 4滴のHSOF滴を通して卵母細胞を集めて洗い流します。
図1:二等分プレート 示されているすべての滴は、20μLの容量を有する。プレートの直径は60mmです。滴は鉱物油で完全に覆われています。卵母細胞は、まず最上部と左端のT2ドロップに配置されます(ここでは星印で示されています)。PRO/T2:10 μL のプロナーゼと 10 μL の T2 をマイクロドロップを作成する前に組み合わせた。CB/T20:T20の1mLあたり1μLのサイトカラシンBを、マイクロドロップを作成する前に組み合わせた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マークされた二等分プレート プレートの下部に細い先端のマーカーで線が描かれ、顕微鏡の下で行われた観察および卵母細胞および卵芽細胞の移動のための位置参照を提供します。卵母細胞は、まず最上部と左端のT2ドロップに配置されます(ここでは星印で示されています)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4.二分切除のための卵母細胞の調製
注:以下のプロセスは、二分切除のための卵母細胞の調製を含む。
- 加熱ステージを37°Cにオンにします。
- マウスピペットを使用して、遠心分離した卵母細胞をHSOF滴から二分割プレートの左上のT2滴に移動し、次に卵母細胞を上段の次の3滴(T2、T20、T20)を通して洗浄する。
- 卵母細胞をプロナーゼ滴の1つに沈着させ、それらの間にほとんどまたはまったく接触がないことを保証する。
注:透明帯の除去にはさまざまな時間がかかることがありますが、通常、加熱段階を使用すると30〜120秒の間に発生します。加熱段階の不在は、この時間を延長する。 - 透明帯の明確な変形があるまで卵母細胞を観察します( 図3参照)。
- 単一の卵母細胞透明帯が変形したら、その卵母細胞を隣接するT2ドロップに移動します。追加の卵母細胞が変形するにつれて、すべての卵母細胞がプロナーゼから除去され、T2ドロップに入れられるまで繰り返す。
- ゾーン透明体の薄い層だけが残るまで卵母細胞を観察します。
- 卵母細胞を列内の次の3滴(T2、T20、T20)を通して洗浄し、CB/T20滴内の垂直線に沈着させます( 図4参照)。
- 縦線の卵母細胞の数を減らすことから始め、二分法スキルが進歩するにつれて、1滴あたりの卵母細胞の数を増やします。
図3:プロナーゼを使用した透明帯の除去(80x)プロナーゼが透明帯に影響を与え、卵母細胞が隣接するT2滴に移動するのに十分になると、透明帯が変形して見え始めます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:二分割滴における卵母細胞の向き (80x) Zonaフリーの卵母細胞は、二分切除前に各CB/T20液滴内で垂直に近い向きで沈着する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5.卵母細胞の二分割
- 卵母細胞を含む最初の左端のCB/T20(二分割)滴に焦点を合わせ、口のピペットを使用して卵母細胞を回転させ、各卵母細胞のミトコンドリア密度部分が顕微鏡の腕に向かっているか、または顕微鏡の腕から離れるようにします。
注:ミトコンドリアの緻密な部分には脂質は含まれず、遠心分離後に卵母細胞の最も暗い部分として表示されます。 - マイクロブレードの先端を、ミトコンドリア緻密な部分の真上の空間に沿って、最上部の卵母細胞の左側に置きます。刃の先端を同じ場所に保ち、卵母細胞を最後まで切断するために慎重に刃を下げます。
- ミトコンドリア密度の高い卵子とミトコンドリア縮小卵子の大きさが類似していることを確認する。二分割は、2つの卵胞体を生成するために各卵母細胞を半分に切断する必要があります。
注:単一の卵母細胞から産生される卵胞体の比較サイズは、研究目標に基づいて異なる可能性がある。ミトコンドリア還元型卵胞体を体細胞と融合させる場合、その体積はミトコンドリア緻密性卵胞体よりも大きくなければならない。 - ブレードが、遠心分離された卵母細胞の最も透明な部分において、ミトコンドリア緻密部の上および脂質緻密部の下方の卵母細胞を二等分していることを確認する。
- ミトコンドリア密度の高い卵子とミトコンドリア縮小卵子の大きさが類似していることを確認する。二分割は、2つの卵胞体を生成するために各卵母細胞を半分に切断する必要があります。
- ブレードを持ち上げるときは、同じラインが維持されていること、およびブレードの先端が同じ場所に残っていることを確認してから、プレートから先端を慎重に持ち上げます。
- 最初の二分切除滴内のすべての卵母細胞について二分切開ステップを繰り返します。卵母細胞が追加の滴で存在する場合は、残りの卵母細胞を配向させ、二等分する。
- 口のピペットを使用して、最初の二分割滴からミトコンドリア還元型卵子を採取する。プレートの一番下の列にある左側のT20ドロップに置きます。残りのすべての二等分滴について繰り返します。
注:ミトコンドリア還元卵子は脂質を含みます, それは卵母細胞の残りの部分よりも色が濃いです. - 口のピペットを使用して、最初の二分割滴からミトコンドリア密度のオプラストを収集する。プレートの一番下の列にある右側のT20ドロップに置きます。残りのすべての二等分滴について繰り返します。
注:ミトコンドリア密集領域は、外観が薄い灰色になる細胞小器官の目に見える集合体を有する。 - インキュベーターからT10 4ウェルディッシュを取り出します。マウスピペットを使用して、すべてのミトコンドリア還元型卵子を「MR」とラベル付けされたウェルに移動し、ミトコンドリア密度のウープラストを「M」とラベル付けされたウェルに移動します。
- 4ウェルプレートをCO2制御インキュベーターに戻します。mtDNAの定量を行う前に、ウープラストを少なくとも30分間休ませてください。
6. mtDNAの定量
- 個々のサンプル(単一卵母細胞、単一ミトコンドリア高密度卵細胞、単一ミトコンドリア枯渇卵胞)からDNAを抽出するために、小さなサンプルから材料を抽出するように設計されたDNA抽出キットを使用します。
- 選択した DNA 定量方法を使用して、各サンプルから DNA が正常に抽出されたことを確認します。その時点で定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)が完了しない場合は、-80°Cの冷凍庫で標識チューブ内の抽出DNAを凍結する。
- qPCR の実行
- 表 2 を参照して、プライマー配列とともに各 qPCR チューブに追加する各試薬の容量を決定します。これらのプライマーは、ウシmtDNAの12S領域を増幅するように設計されている。
- 初期変性時間を10分間に設定し、続いて94°Cで30秒の変性、60°Cで15秒のアニーリング、72°Cで15秒の伸長を35サイクル行った。 反応が完了したら、サイクルしきい値 (Ct) の値を記録します。
注: 相対的な mtDNA コピー数値を取得するには、指数関数的に増加する既知の量の mtDNA コピー数を持つサンプルを使用して標準曲線を作成する必要があります。サイクルしきい値は、以下の式を使用して操作し、相対的なmtDNAコピー数を決定する必要があります。 - 以下の式を使用してDNAの濃度を求める:
DNA濃度 = (10(Ct-切片/傾き)) x 試験量 - コピー番号は、次の式を使用して求めます。
コピー番号 =
- コピー番号は、次の式を使用して求めます。
セルあたりのコピー数 = 2 x
図5:体細胞mtDNA標準曲線。 この標準曲線は、プロトコルステップ6.3に記載されているqPCR試薬およびプログラムを使用したウシ体細胞の対数濃度のmtDNA定量によって作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
定量PCR(qPCR)結果は、各ウープラスト中に存在するmtDNAの相対量を決定するために使用されます。記載された反応は、ウシmtDNAの12S領域を増幅するように設計されている。
二分割が成功した場合、卵母細胞全体およびミトコンドリア密度の卵子からのサンプルは、同様のCt 値を有するであろう。ミトコンドリア還元型卵子からのサンプルは、他の2つの群からのサンプルと比較すると、より高いCt 値を有するであろう。成功した二分割 結果を示すCtグラフを以下に示す。これらの結果は、二分切除がミトコンドリア減少卵胞のmtDNA含量を効果的に減少させたことを示している(図6)。
図6:成功した二分qPCR結果。 サイクル数と蛍光を比較したグラフは、単一卵母細胞、ミトコンドリア還元型卵子(紫色の線で表わされる)、およびミトコンドリア密度の高い卵胞体の周期閾値を表示します。ミトコンドリア還元卵胞のCt値は平均29.931(紫色の線)であり、単一の卵母細胞の平均Ct値は20.802(赤と緑の線)であり、ミトコンドリア密度の高い卵胞体の平均Ct値は21.389(青と金の線)である。ミトコンドリア減少型卵子原体サンプルのCt値の増加は、これらのサンプル内のmtDNAコピー数の減少を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
失敗した二分断面の結果を示すCt グラフを 図7に示す。これらの結果は、二分切除がミトコンドリア減少卵胞中のmtDNA含量を効果的に減少させなかったことを示している:
図7:失敗した二分qPCR結果。 サイクル数と蛍光を比較する折れ線グラフは、単一卵母細胞(濃い緑色および薄緑色の線)、ミトコンドリア縮小卵胞(紫色の線)、およびミトコンドリア密度の高い卵胞(青色および金色の線)のサイクル閾値を表示し、いずれもCt値が20.232-20.757の範囲内にある。これは、ミトコンドリア還元型ooplastサンプルにおいてmtDNAコピー数に有意な変化がないことを示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
標準曲線の作成と提供されたmtDNAコピー数式の使用に続いて、このプロトコルを使用して93.88%の平均卵母細胞mtDNA減少が達成されました(図8)。
図8:全卵母細胞、ミトコンドリア還元型卵胞体、およびミトコンドリア緻密性卵胞体から得られた相対ミトコンドリアDNAコピー数を比較する箱ひげ図。 全卵母細胞(n = 38)、ミトコンドリア還元卵胞(n = 34)、およびミトコンドリア密集卵胞体(n = 29)。ミトコンドリア還元型卵子は、他の2群と比較してコピー数が有意に少ない(P <0.001)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 総ボリューム | 溶媒 | 溶質 |
| ヒアルロニダーゼ溶液 | 400 μL | 1 mL M-199 | 0.6 mg ヒアルロニダーゼ |
| T2 メディア | 500 μL | M-199 · | 2% ウシ胎児血清 (v/v) |
| T20 メディア | 1020 μL | M-199 · | 20%ウシ胎児血清(v / v) |
| T10 メディア | 800 μL | 400 μL T2 | 400 μL T20 |
| CB/HSOF | 500 μL | 499.5 μL 合成卵管液と HEPES (HSOF) | 0.5 μL の 10 mg/mL サイトカラシン B (CB) |
| プロナーゼ溶液 | 40 μL | 1 mL M-199 | 10 mgのプロナーゼ |
| T20/CB | 500 μL | 499.5 μL T20 | 0.5 μL の 10 mg/mL CB |
表 1: 必要なソリューション プロトコル内で必要な各溶液に大量の溶質と溶媒を提供します。
| 試薬 | 容積 |
| qPCR マスターミックス | 10 μL |
| フォワードプライマー | 0.6 μL |
| リバースプライマー | 0.6 μL |
| DNAサンプル | 4.4 μL |
| DNaseフリーウォーター | 4.4 μL |
| 総ボリューム | 20 μL |
| フォワードプライマー GGGCTACATTCTCTACACCAAG | |
| リバースプライマー GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | |
表2:定量PCR組成物。 各定量 PCR チューブに必要なすべての試薬のフォワードプライマー配列とリバースプライマー配列と容量を提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
卵母細胞におけるmtDNAコピー数を減少させるために以前に用いられた方法は、それぞれの欠点を有する。卵母細胞からのミトコンドリアのマイクロマニピュレーションベースの除去は、mtDNAコピー数を平均64%減少させる27。以前は除核に使用されていたユニークな方法は、小径パスツールピペットの使用と、媒体のマイクロドロップと周囲の鉱物油との境界で透明帯を含まない卵母細胞の分割を含みます。卵母細胞遠心分離の利用とともに、このアプローチは、生存可能なミトコンドリア還元オプラストを産生し得る28。しかしながら、遠心分離法とこの卵母細胞分裂法の組み合わせが胚を産生することは未だ報告されていない。化学的ミトコンドリア還元法(mtDNA合成阻害剤である2',3'-ジデオキシシチジン(ddC)への卵母細胞の曝露など)は、卵母細胞のmtDNAコピー数を最大50%減少させ、COCをin vitro成熟(IVM)中に40時間以上化学物質に曝露することを必要とする16,27。ブタ卵母細胞をddC添加培地中で40時間インキュベートしても、再建された胚16に問題は提示されていないが、20〜22時間のIVMまたはその後の胚発生中のウシ卵母細胞のddCへの曝露に関するデータはまだ公表されていない。この論文に記載されている方法は、相対mtDNAコピー数を平均45,565 ± 37,169コピー(平均± SD)から8,396 ± 13,287に減少させます。
プロトコル内のいくつかのステップは、卵母細胞のミトコンドリアDNA(mtDNA)コピー数を効果的に減少させるという点で、満足のいく結果を得るために重要である。最適化された速度(15,000 x g)および時間(12分)で卵母細胞を遠心分離すると、各卵母細胞の1極でより濃縮されたミトコンドリア画分が作成されます。HEPES(CB/HSOF)溶液(50μL)を含むサイトカラシンB /合成卵管液の正しい容量は、遠心分離による卵母細胞溶解を排除する可能性が高い。遠心分離に続いて、透明帯(ZP)をプロナーゼ溶液への曝露によって除去する。ZPを完全に除去すると、より正確な二分割が保証され、残りの積雲細胞を卵母細胞から分離する必要があります。ZPを除去しながら顕微鏡上の加熱ステージを使用することは任意であるが、ZP除去を少なくとも1分間早める。二分割滴における透明帯フリー(ZF)卵母細胞の向きは、それらを正確に二等分するために重要です。各卵母細胞の1つの極に見られるミトコンドリア画分は、はっきりと見え、二分切除前に卵母細胞の上部または下部に位置するべきである。反対側の極には濃い脂肪滴が含まれます。二分切除に続いて、大生物(ミトコンドリア密度またはミトコンドリア枯渇)の選択と正しい分類は、二分割の正確な評価を得るために重要です。どの中期II(MII)卵母細胞を二等分するかを選択することも重要です。使用される卵母細胞が球状であり、均質な細胞質を有することを保証することは、各卵母細胞および卵胞体に含まれるmtDNAコピー数に違いを生む可能性が高い。個々の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を設計および合成する場合、正確な結果を得るためには、各反応で正しいプライマーと試薬濃度が使用されるようにすることが重要です。標準曲線を生成する場合は、できるだけ正確に作成し、すべての反応を3連で実行して精度を高める必要があります。各 qPCR フェーズの時間と温度は、すべての実行で同じままにする必要があります。
プロトコルに従っている間にいくつかの問題が発生する可能性があります。二分割プレートにオイルを追加するときは、滴がちょうど覆われていることを確認してください。オイルが多すぎるとピペットの使用効率が低下しますが、少なすぎると滴が蒸発します。この蒸発は、溶液の浸透圧に変化を引き起こし、卵母細胞および卵胞体に有害であり得る。卵母細胞がZPの消化後に溶解する場合、これはおそらく、個人的な経験および観察に基づいて、以下のいずれかまたは両方に起因する可能性が高い:卵母細胞は所定の時間と速度の間遠心分離されなかった、および/または卵母細胞はプロナーゼにあまりにも長い間曝露された。一部のZF卵母細胞は、二分割滴内で完全に球形の形状を取り戻さない場合があります。すべてのZF卵母細胞が二分切除に最適に配置できるわけではないことにご留意ください。この場合、3つの選択肢があります:ZF卵母細胞に球形を取り戻すための追加の時間を与えます。卵母細胞を二分割前にマイクロブレードでより直立した位置に静かに保持する。正しく配置できない卵母細胞を二等分しないでください。二分割後にどのオプラストがミトコンドリア密度であるか、またはミトコンドリア枯渇であるかを決定することは、定量化結果に影響する。卵胞体の分類が困難な場合は、ミトコンドリア画分が常に滴の上または下に向けられるように二等分される卵母細胞を配置するか、卵母細胞の暗い部分をその極の1つで探します(これらの脂肪滴はミトコンドリア画分とは反対側の極に集中します)。時には、Ooplastsは互いに固着したり、プレート内のマイクロブレードによって作られたくぼみにくぼみが付着することがあります。場合によっては、球形を取り戻すためにOoplastsに追加の時間を提供することで、分離が役立ちます。その他のオプションには、プレートを静かに叩く、ピペットに静かに吸い出す、および/またはピペットの端を使用してOoplastsを静かに分離することが含まれる。
このmtDNAコピー数低減方法には限界があります。1つは卵母細胞源に基づいており、もう1つは卵母細胞からのZPの除去によるものです。卵母細胞源(動物自体、特定の卵巣、および特定の卵胞)は、その特定の卵母細胞内のmtDNAコピー数に大きく影響します。単一の卵母細胞の平均mtDNAコピー数の周りには大きな標準偏差があり、コピー数がどれほど変動し得るかを示す。多くの単一卵母細胞定量化反応は、卵胞体および他の卵母細胞に対して比較されるであろう堅牢な単一卵母細胞標準コピー数を有することが必要である。また、かなりの標準偏差は、卵子細胞のコピー数を原産卵母細胞と比較することができないため、卵母細胞と卵母細胞の比較を絶対的にも少なくします。
卵母細胞の透明帯の消化は、結果として生じるZF卵母細胞および卵子を、透明帯を除去する前よりもはるかに脆弱にする。この脆弱性は、特にマイクロブレードの使用により、特にマイクロブレードの使用により、卵胞体およびZF卵母細胞自体の溶解率が高くなり、多大な注意と精度を使用する必要があります。Ooplastsが融合のために利用されるならば、それらは融合が試みられる前に二分割後に休息を必要とする。さもなければ、Ooplastsの多くはおそらく溶解するでしょう。ミトコンドリア枯渇した大生物は、ミトコンドリア密度の高いものよりも繊細である傾向があります。卵母細胞の微小管は、遠心分離中にミトコンドリアとともに卵母細胞の同じ極に移動する傾向があり、これはミトコンドリア枯渇した卵胞体により少ない構造成分29を残す。他の卵母細胞小器官が、このプロトコールで卵胞体を産生するために使用される遠心分離と二分分離の組み合わせによって悪影響を受けるかどうかを判断するには、追加の研究と染色が必要です。
卵母細胞ミトコンドリアの減少は、結果として生じるiSCNT胚における卵母細胞種のミトコンドリアを減少させ、したがって、再構築された胚におけるミトコンドリアヘテロプラスミーの発生率を低下させる。胚の発生可能性は比較的高まるが、発生中のエネルギー要件を満たすためにはドナー細胞種からのミトコンドリアの補充が必要になる可能性が高い。これまでのところ、ジェネリック間クロスを使用したiSCNTの試みは、生きた子孫を産んでいない。iSCNT胚におけるヘテロプラスミーの減少は、妊娠の成功確率を高める可能性がある。iSCNTは、絶滅危惧種に分類される40,000種のうちのいくつかを救うのに役立つ方法です。これらの種由来の体細胞は、典型的には、それらの生殖細胞よりもアクセスしやすいので、iSCNTは、国内種由来の卵母細胞と共に、これらの体細胞を利用することができる。ジェネリック内試みは、生きた動物31、32、33を産生することに成功しているが、子孫は典型的にはmtDNAに対してキメラであり、そしてジェネリック内卵母細胞源を見つけることは必ずしも可能ではない。mtDNAコピー数を減らすことを目的とした卵母細胞の二分、続いてこれらの卵子と種間体細胞との融合は、iSCNT胚におけるキメラリズムおよびヘテロプラスミーを減少させるであろう。これらの減少のために、記載された方法の使用は、ジェネリック間の出生および絶滅危惧種の継続のより大きな可能性を可能にする。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、ユタ州立大学の同僚、サンディエゴ動物園の生殖科学研究者、およびPLC属のレベッカ・クリッシャー博士に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
