Summary
Her presenterer vi en protokoll for å redusere mitokondrie-DNA-kopinumrene betydelig i en storfe oocytt (P < 0,0001). Denne metoden benytter sentrifugering og biseksjon for å redusere oocytt mitokondrier betydelig og kan gi økt sjanse for utvikling i de rekonstruerte interspecies somatiske celle kjernefysiske overføring embryoer.
Abstract
Interspecies somatisk celle kjernefysisk overføring (iSCNT) kan brukes til å redde truede arter, men to forskjellige populasjoner av mitokondrie DNA (mtDNA) eksisterer innenfor det rekonstruerte embryoet: en i mottaker ooplasma og en i donor somatisk celle. Denne mitokondrie heteroplasmien kan føre til utviklingsproblemer i embryoet og fosteret. Håndlagde kloningsprotokoller inkluderer oocytt biseksjon, som kan brukes til å redusere mtDNA-kopinummeret, noe som reduserer graden av mitokondrie heteroplasmy i et rekonstruert embryo. Sentrifugering av denuded, modne storfe oocytter produserte en synlig mitokondri-tett brøkdel på en pol av oocytten. Oocytes' zonae pellucidae ble fjernet ved eksponering for en pronaseløsning. Biseksjon ble utført ved hjelp av et mikroblad for å fjerne den synlige mitokondrierfraksjonen. qPCR ble brukt til å kvantifisere mtDNA tilstede i DNA-prøver hentet fra hele oocytter og bisected ooplasts, noe som gir en sammenligning av mtDNA kopinumre før og etter biseksjon. Kopieringsnumre ble beregnet ved hjelp av syklusterskelverdier, en standardkurves regresjonslinjeformel og et forhold som inkluderte de respektive størrelsene på mtDNA PCR-produkter og genomiske PCR-produkter. En bovint oocytt hadde et gjennomsnittlig mtDNA-kopinummer (± standardavvik) på 137 904 ± 94 768 (n = 38). En mitokondri-utarmet ooplast hadde et gjennomsnittlig mtDNA kopinummer på 8 442 ± 13 806 (n = 33). Gjennomsnittlig mtDNA kopier til stede i en mitokondri-rik ooplast var 79,390 ± 58,526 mtDNA kopier (n = 28). Forskjellene mellom disse beregnede gjennomsnittene indikerer at sentrifugering og påfølgende biseksjon kan redusere mtDNA-kopinumrene som finnes i mitokondriene utarmet ooplast betydelig sammenlignet med den opprinnelige oocytten (P < 0,0001, bestemt av enveis ANOVA). Reduksjonen i mtDNA bør redusere graden av mitokondrie heteroplasmy i et rekonstruert embryo, muligens fremme standard embryonal og fosterutvikling. Tilskudd med mitokondrieekstrakt fra den somatiske donorcellen kan også være avgjørende for å oppnå vellykket embryonal utvikling.
Introduction
Somatisk celle kjernefysisk overføring (SCNT) inkluderer sammensmelting av en enuklet oocytt fra ett dyr og en somatisk celle fra et dyr av samme art. I de fleste tilfeller stammer oocytten og somatisk celle fra samme art, og levende fødselsrater er under 6%1. Noe forskning innebærer bruk av interspecies SCNT (iSCNT), som inkluderer sammensmelting av en somatisk celle og oocytt som stammer fra to forskjellige arter. I disse studiene er levende fødselstall enda lavere enn i SCNT-vanligvis mindre enn 1%1. Imidlertid har iSCNT kapasitet til å brukes som en metode for å redde truede arter, siden somatiske celler fra disse dyrene er mer tilgjengelige enn deres bakterieceller1. Mottaker oocytter som brukes i iSCNT er ofte innenlandske eller vanlige laboratoriearter, for eksempel kyr, griser og mus. Noen forsøk så langt har lykkes med å produsere levende unge, selv om avkomene som produseres har vært intrageneriske dyr (mottaker oocyttarter og donorcellearter var medlemmer av samme slekt)2,3,4. Intergeneric modeller (som bruker en oocytt og somatisk celle fra dyr i forskjellige slekter) har ennå ikke produsert levende dyr, og flertallet av rekonstruerte embryoer arresterer på 8-16 cellestadiet av in vitro utvikling 5,6,7,8. En mulig forklaring på denne embryonale utviklingsstansen er forekomsten av mitokondrie heteroplasmy i embryoene - tilstedeværelsen av mer enn en mitokondrier DNA (mtDNA) type i en enkelt celle. Heteroplasmy kan føre til problemer som utviklingssvikt eller svikt i embryoet eller i det levende dyret1. Patogenese kan også forekomme senere i dyrets levetid9. Selv om dette problemet også er til stede i SCNT-avkom, forverrer den interspesifikke komponenten i iSCNT-embryoer problemet.
Når den embryonale mtDNA kommer fra to forskjellige arter, fungerer mottakeren oocytt mitokondrier, som representerer flertallet, ikke effektivt med donorcellens kjerne 1,10. Større taksonomiske hull mellom de to artene som brukes i iSCNT, intensiverer sannsynligvis dette problemet; intrageneriske levende avkom produsert (Bos gaurus og Bos indicus avkom ved hjelp av Bos taurus oocytter), samt avkom produsert via tradisjonell SCNT (f.eks Ovis aries avkom ved hjelp av Ovis aries oocytes) ble vist å være chimeras (mtDNA fra to personer var til stede i disse dyrene 11,12,13). Likevel utviklet de seg mye lenger enn de intergeneriske SCNT-embryoene14,15. Utvekslingen av informasjon mellom oocytt mitokondriene og donorcellens kjerne kan være mer vellykket i det intrageneriske embryoet enn i det intergeneriskeembryoet 16.
Mengden mtDNA i en moden storfe oocytt er ca. 100 ganger større enn mengden som finnes i en somatisk celle12. Å redusere dette forholdet kan oppmuntre de somatiske celle mitokondriene til å spre seg innenfor det rekonstruerte embryoet, slik at en større befolkning av produktive mitokondrier kan være til stede16. Dette kan igjen gi mer energi til å møte kravene til det utviklendeembryoet 15. Tidligere forsøk på å redusere mtDNA-kopinummeret til oocytten eller embryoet inkluderer kjemisk anvendelse, mikromanipulering og supplere oocytten eller embryoet med ytterligere mitokondrier fra donorcelleartene 16,17,18,19,20. Kjemisk anvendelse (for eksempel 2',3'-dideoxycytidine) er imidlertid ikke ideell for embryonal utvikling, og har redusert oocytt mtDNA kopitall med omtrent halvparten18. Tidligere oocytt mtDNA reduksjon ved mikromanipulering har bare fjernet et gjennomsnitt på 64% av oocyttens mtDNA17. Selv om tilskudd av donorcelle mitokondrier kan være et levedyktig alternativ, har bruken ennå ikke produsert et levende intergenerisk dyr i iSCNT-studiene21.
Bruk av biseksjon for å redusere oocytt mtDNA kopinummer er ennå ikke brukt i publiserte studier. Bisecting oocytter med den hensikt å fusjonere ooplastene med en somatisk celle er premisset for håndlaget kloning (HMC), som vanligvis bruker biseksjon som metode for å fjerne polarlegemet og metafaseplaten fra metafasen II (MII) oocytt. HMC har med hell produsert avkom i flere arter, inkludert geiter, storfe, griser, sauer og hester 22,23,24,25,26, men inkluderer vanligvis ikke et sentrifugeringstrinn før biseksjon. Integrering av høyhastighets sentrifugering av oocytten muliggjør isolering av mitokondrier (og derfor mtDNA) på en pol av oocytten, som deretter kan krysses ved hjelp av et mikroblad for å fjerne de mitokondri-tette fraksjonene. To mitokondrier-utarmede ooplaster kan deretter smeltes sammen med en somatisk celle, som det er tilfelle i HMC, for å danne et rekonstruert embryo som inneholder betydelig mindre mtDNA fra oocyttarter.
Spørsmålet vi prøver å svare på med denne protokollen er hvordan du kan redusere mtDNA i bovin oocytten for å produsere et levedyktig rekonstruert embryo som inneholder mindre heteroplasmatisk mtDNA. I denne protokollen ble oocytter sentrifugert og bisected. Ooplast og intakte oocytt mtDNA kopinumre ble beregnet for å bestemme effektiviteten av denne teknikken for å redusere bovint oocytes mtDNA kopinummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll følger retningslinjene for dyrepleie og etikk fra Utah State University.
1. Medieforberedelse
- Før oocytthåndtering, klargjør du følgende løsninger, som beskrevet i tabell 1: 400 μL hyaluronidaseløsning, 500 μL T2-medier, 1020 μL T20-medier og 800 μL T10-medier.
- Del T10-mediet i to brønner på en firebrønns plate, 400 μL per brønn. Merk en brønn med "M" og den andre brønnen med "MR." Plasser i en 5% CO2 inkubator til etter biseksjon.
- Forbered 500 μL Cytochalasin B (CB)/Syntetisk oviduktvæske med HEPES (HSOF). Aliquot 50 μL CB/HSOF-oppløsning i et separat sentrifugerør på 1,5 ml.
- Forbered 40 μL pronaseløsning. Sentrifuge i minst 30 s ved 2680 x g. Bland 20 μL av supernatanten med 20 μL T2 til et nytt sentrifugerør; Dette danner en fortynnet, 5 mg / ml pronaseoppløsning.
- Forbered 3 ml HSOF. På en søkeplate, separat deponere fire 400 μL dråper; plasser platen under et stereomikroskop.
- Forbered 500 μL CB/T20-oppløsning.
2. In vitro modning (IVM) av storfe oocytter
- IVM: Kultur aspirerte cumulus-oocyttkomplekser (COC) ved 38,5 °C i en 5 % CO 2-inkubator i 21 timer i en fire-brønns tallerken med modningsmedier som inneholder 10 % FBS, 0,26 IE/ml FSH og 100 U/ml penicillin/streptomycin.
- Utfør følgende trinn for å benekte oocyttene.
- Samle ønsket antall COCer ved hjelp av en 200 μL pipette, og deponer dem på bunnen av et 1,5 μL sentrifugerør.
- Tilsett samme volum på 0,6 mg/ml hyaluronidase i sentrifugerøret med oocyttene (dvs. hvis volumet av oocytter og IVM-medier er 100 μL, tilsett 100 μL hyaluronidase).
- Pipette løsningen opp og ned uten å lage bobler, til alle cumuluscellene er fjernet.
- Sjekk modningen av oocyttene.
- Bruk pipetten til å tilsette 200 μL HSOF fra en av de fire HSOF-dråpene på søkeplaten til oocytten/hyaluronidase-løsningen.
- Overfør oocyttene fra hyaluronidase/HSOF-dråpen og plasser dem i ubrukt 400 μL HSOF-dråpe. Vask dem med to ekstra HSOF-dråper for å hjelpe til med å fjerne hyaluronidase og cumulus cellerester.
- Bruk en munnpipette (eller en 10 μL pipette og spiss) og høy mikroskopisk forstørrelse, rull og velg oocyttene basert på polar kropps tilstedeværelse.
- Etter å ha sortert oocyttene, samle ønsket antall MII oocytter som skal krysses, og plasser dem i 400 μL HSOF-slipp.
MERK: Hvis oocyttene har vært utenfor inkubatoren i mer enn 30 minutter, kan oocytter plasseres tilbake i en brønn med modningsmedier og plasseres i en CO2-kontrollert inkubator for å hvile i minst 30 minutter. Begrens antall oocytter som skal krysses til et beløp som er mulig å fullføre bisecting i ca 30 min for å minimere tiden utenfor inkubasjon. Hvis ooplaster skal smeltes sammen med en somatisk celle, aktiveres og dyrkes som embryoer, bør oocytter enukles på dette tidspunktet.
3. Sentrifugering av oocyttene
MERK: Hvis oocytter ble plassert i inkubatoren i modningsmedier, flytt dem til HSOF-dråpen de sist ble samlet inn fra.
- Bruk en munnpipette, samle de valgte modne oocyttene fra HSOF-dråpen, og legg dem i 1,5 ml-røret som inneholder 50 μL av HSOF / CB-løsningen. Sentrifuger oocyttene på 15 000 x g i 12 minutter.
MERK: Det er ikke skadelig for bobler å være til stede i sentrifugerøret. - Mens oocyttene blir sentrifugert, forberede biseksjonsplaten.
- Lag mønsteret som vist i figur 1 på lokket på en 60 mm petriskål (20 μL per dråpe), og dekk dråpene helt med mineralolje.
- Bruk en tynnspisset markør til å markere linjene under parabolen, som vist i figur 2.
- Tegn en boks rundt pronase-dråpen og en linje mellom CB / T20-dråper og den nederste raden med T20-dråper.
- Dekk parabolen med et ugjennomsiktig lokk til sentrifugering er fullført for å forhindre osmolaritetsendringer av mikrodråper.
- Så snart sentrifugeringen er fullført, bruk en 200 μL pipette for å samle oocyttene i løsningen, og flytt dem inn i en tom del av en ny søkeplate med fire 400 μL HSOF-dråper.
- Samle og vask oocyttene gjennom de fire HSOF-dråpene.
Figur 1: Biseksjonsplaten. Alle dråper som vises har et volum på 20 μL. Platen har en diameter på 60 mm. Dråper har blitt helt dekket med mineralolje. Oocytter vil først bli plassert i det øverste og venstre T2-fallet (angitt her med en stjerne). PRO/T2: 10 μL pronase og 10 μL T2, kombinert før du lager mikrodråper. CB/T20: 1 μL cytochalasin B per 1 ml T20, kombinert før mikrodråper opprettes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Merket biseksjonsplate. Linjer tegnes med en tynn tippet markør på bunnen av platen, for å gi stedsreferanser for observasjoner og oocytt- og ooplastoverføringer gjort under mikroskopet. Oocytter vil først bli plassert i det øverste og venstre T2-fallet (angitt her med en stjerne). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Forberedelse av oocytten for biseksjon
MERK: Følgende prosess innebærer forberedelse av oocyttene for biseksjon.
- Vri varmetrinnet på til 37 °C.
- Bruk en munnpipette til å flytte sentrifugede oocytter fra HSOF-dråpen til øverste venstre T2-dråpe av biseksjonsplaten, og vask deretter oocyttene gjennom de neste tre dråpene på øverste rad (T2, T20, T20).
- Deponer oocyttene i en av pronasedråpene, og forsikrer at det er liten eller ingen kontakt mellom dem.
MERK: Fjerning av zona pellucida kan ta varierende tid, men oppstår vanligvis mellom 30-120 s ved bruk av et varmetrinn. Fraværet av et oppvarmingsstadium vil forlenge denne tiden. - Vær oppmerksom på oocyttene til det er klar deformasjon av zonae pellucidae (se figur 3).
- Når en enkelt oocytt zona pellucida har blitt deformert, flytt den oocytten til nabo-T2-dråpen. Gjenta etter hvert som flere oocytter blir deformert, til alle oocytter er fjernet fra pronasen og plassert i T2-dråpen.
- Vær oppmerksom på oocyttene til bare et tynt lag av sonen pellucida forblir.
- Vask oocyttene gjennom de neste tre dråpene i raden (T2, T20, T20), og deponer dem deretter i vertikale linjer i CB/T20-dråpene (se figur 4).
- Begynn med færre oocytter i de vertikale linjene og øk antall oocytter per slipp etter hvert som biseksjonsferdighetene utvikler seg.
Figur 3: Fjerning av zona pellucida ved hjelp av pronase. (80x) En oocytt zona pellucida vil begynne å virke deformert når pronasen har påvirket zona pellucida nok til at oocytten kan flyttes til den tilstøtende T2-dråpen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oocyttorientering i biseksjonsdråper. (80x) Zona-frie oocytter deponeres i en nesten vertikal orientering innenfor hvert CB/T20-fall før biseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Biseksjon av oocyttene
- Fokuser på den første, venstre-mest CB / T20 (bisection) dråpen som inneholder oocytter, og bruk en munnpipette for å rotere oocyttene, slik at mitokondriene-tette delen av hver oocytt enten vender mot eller bort fra mikroskopets arm.
MERK: Den mitokondri-tette delen vil ikke inneholde lipider, som fremstår som den mørkeste delen av oocytten etter sentrifugering. - Hvil spissen av mikrobladet til venstre for den øverste oocytten, i tråd med rommet rett over mitokondrienes tette del. Hold spissen av bladet på samme sted, senk forsiktig bladet for å kutte hele veien gjennom oocytten.
- Forsikre deg om at mitokondriene-tette ooplast og mitokondrier-redusert ooplast er like i størrelse; biseksjon bør kutte hver oocytt i halvparten for å produsere to ooplaster.
MERK: Sammenligningsstørrelser på ooplaster produsert fra en enkelt oocytt kan variere basert på forskningsmål; Hvis mitokondrier-reduserte ooplaster skal smeltes sammen med en somatisk celle, bør volumet være større enn mitokondriene-tette ooplaster'. - Forsikre deg om at bladet krysser oocytten over mitokondrie-tett delen og under den lipid-tette delen, i det klareste segmentet av sentrifugert oocytt.
- Forsikre deg om at mitokondriene-tette ooplast og mitokondrier-redusert ooplast er like i størrelse; biseksjon bør kutte hver oocytt i halvparten for å produsere to ooplaster.
- Når du løfter bladet, må du sørge for at den samme linjen opprettholdes, og at spissen av bladet forblir på samme sted, og løft deretter spissen forsiktig fra platen.
- Gjenta biseksjonstrinn for alle oocytter innenfor det første biseksjonsfallet. Hvis oocytter er til stede i ekstra dråper, orienter og bisect de resterende oocytter.
- Bruk en munnpipette, samle mitokondrier-reduserte ooplaster fra den første biseksjonsdråpen. Plasser dem i den venstre T20-dråpen som er plassert i den nederste raden av platen. Gjenta for alle gjenværende biseksjonsdråper.
MERK: Mitokondrier-reduserte ooplaster vil inneholde lipider, som er mørkere i fargen enn resten av oocytten. - Bruk en munnpipette, samle mitokondri-tette ooplaster fra den første biseksjonsdråpen. Plasser dem i høyre T20-dråpe plassert i den nederste raden av platen. Gjenta for alle gjenværende biseksjonsdråper.
MERK: Mitokondrier-tette regioner vil ha en synlig konglomerasjon av organeller som vil være lysegrå i utseende. - Hent T10 firebrønnsfatet fra inkubatoren. Bruk en munnpipette, flytt alle mitokondrier-reduserte ooplaster til brønnen merket "MR", og flytt mitokondri-tette ooplaster til brønnen merket "M".
- Plasser firebrønnsplaten tilbake i den CO2-kontrollerte inkubatoren. La ooplaster hvile i minst 30 minutter før kvantifisering av mtDNA.
6. Kvantifisering av mtDNA
- Bruk et DNA-ekstraksjonssett designet for å trekke ut materiale fra en liten prøve for å trekke ut DNA fra individuelle prøver (enkle oocytter, enkle mitokondrier-tette ooplaster, enkle mitokondrier-utarmede ooplaster).
- Bruk en dna-kvantifiseringsmetode etter eget valg for å sikre at DNA ble hentet ut fra hver prøve. Hvis kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) ikke vil bli fullført på det tidspunktet, fryser du det ekstraherte DNA-et i et merket rør i en -80 °C fryser.
- Utfør qPCR
- Se tabell 2 for å bestemme volumet på hvert reagens som skal legges til hvert qPCR-rør, sammen med primersekvensene. Disse primerne er designet for å forsterke 12S-regionen bovin mtDNA.
- Still inn den første denatureringstiden i 10 minutter, etterfulgt av 35 sykluser av: 30 s denaturering ved 94 °C, 15 s gløding ved 60 °C og 15 s forlengelse ved 72 °C. Når reaksjonen er fullført, registrerer du syklusterskelverdiene (Ct).
MERK: For å oppnå relative mtDNA-kopinummerverdier, må det produseres en standardkurve ved hjelp av prøver med kjente mengder mtDNA-kopitall, som øker eksponentielt. Syklusterskelverdiene må deretter manipuleres ved hjelp av følgende formler for å bestemme relative mtDNA-kopinumre. - Oppnå konsentrasjonen av DNA ved hjelp av ligningen nedenfor:
Konsentrasjon av DNA = (10 (Ct-intercept/slope)) x testet volum - Hent kopinummeret ved hjelp av formelen nedenfor:
Kopier nummer =
- Hent kopinummeret ved hjelp av formelen nedenfor:
Kopier tall per celle = 2 x
Figur 5: Somatisk celle mtDNA standardkurve. Denne standardkurven ble opprettet gjennom mtDNA-kvantifisering av logaritmiske konsentrasjoner av bovine somatiske celler ved hjelp av qPCR-reagenser og program som beskrevet i protokolltrinn 6.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantitative PCR-resultater (qPCR) brukes til å bestemme de relative mengdene mtDNA som finnes i hver ooplast. Den beskrevne reaksjonen er designet for å forsterke 12S-regionen av bovin mtDNA.
Hvis biseksjonen var vellykket, vil prøvene fra hele oocytter og mitokondri-tette ooplaster ha lignende Ct-verdier . Prøvene fra mitokondriereduserende ooplaster vil ha høyere Ct-verdier sammenlignet med prøvene fra de to andre gruppene. En Ct-graf som viser vellykkede biseksjonsresultater er vist nedenfor. Disse resultatene indikerer at biseksjon effektivt reduserte mtDNA-innholdet i mitokondrienes reduserte ooplaster (figur 6).
Figur 6: Vellykkede resultater av biseksjon qPCR. Graf som sammenligner syklusnummer og fluorescens viser syklusterskelverdier for enkle oocytter, mitokondrier-reduserte ooplaster (representert av lilla linjer) og mitokondri-tette ooplaster. Ct-verdiene til mitokondrier-reduserte ooplaster har et gjennomsnitt på 29,931 (lilla linjer), mens den gjennomsnittlige Ct-verdien for de enkle oocyttene er 20,802 (røde og grønne linjer), og den gjennomsnittlige Ct-verdien for mitokondriene-tette ooplaster er 21,389 (blå og gulllinjer). De økte Ct-verdiene til mitokondrie-reduserte ooplastprøver indikerer en reduksjon i mtDNA-kopinummeret i disse prøvene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
En Ct-graf som viser mislykkede biseksjonsresultater, vises i figur 7. Disse resultatene indikerer at biseksjon ikke effektivt reduserte mtDNA-innholdet i mitokondrienes reduserte ooplaster:
Figur 7: Mislykkede resultater av biseksjon qPCR. Linjediagram som sammenligner syklusnummer og fluorescens viser syklusterskelverdier for enkle oocytter (mørkegrønne og lysegrønne linjer), mitokondrier-reduserte ooplaster (lilla linjer) og mitokondri-tette ooplaster (blå og gull linjer), som alle har Ct verdier innenfor området 20.232-20.757. Dette indikerer fraværet av en betydelig endring i mtDNA kopinummer i mitokondrier-reduserte ooplastprøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter produksjon av en standardkurve og bruk av de medfølgende mtDNA-kopinummerformlene, er det oppnådd en gjennomsnittlig oocytt mtDNA-reduksjon på 93,88% ved hjelp av denne protokollen (figur 8).
Figur 8: Boxplot som sammenligner relative mitokondrie-DNA-kopinumre hentet fra hele oocytter, mitokondri-reduserte ooplaster og mitokondri-tette ooplaster. Hele oocytter (n = 38), mitokondrier-reduserte ooplaster (n = 34) og mitokondri-tette ooplaster (n = 29). Mitokondrier-reduserte ooplaster har betydelig færre kopitall sammenlignet med de to andre gruppene (P < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Totalt volum | Løsemiddel | Solute |
| Hyaluronidase-løsning | 400 μL | 1 ml M-199 | 0,6 mg Hyaluronidase |
| T2-medier | 500 μL | M-199 | 2% Fetal Bovine Serum (v / v) |
| T20-medier | 1020 μL | M-199 | 20% Fetal Bovine Serum (v / v) |
| T10-medier | 800 μL | 400 μL T2 | 400 μL T20 |
| CB/HSOF | 500 μL | 499,5 μL syntetisk oviduktvæske med HEPES (HSOF) | 0,5 μL av 10 mg/ml cytochalasin B (CB) |
| Pronase-løsning | 40 μL | 1 ml M-199 | 10 mg pronase |
| T20/CB | 500 μL | 499,5 μL T20 | 0,5 μL 10 mg/ml CB |
Tabell 1: Nødvendige løsninger. Gir volumer av løsemidler og løsemidler for hver løsning som kreves i protokollen.
| Reagent | Volum |
| qPCR-hovedmiks | 10 μL |
| Fremoverprimer | 0,6 μL |
| Omvendt primer | 0,6 μL |
| DNA-prøve | 4,4 μL |
| DNasefritt vann | 4,4 μL |
| Totalt volum | 20 μL |
| Fremre primer GGGCTACATTCTACACCAAG | |
| Omvendt primer GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | |
Tabell 2: Kvantitativ PCR-sammensetning. Gir fremover- og reversprimersekvenser og volumer av alle reagenser som trengs for hvert kvantitative PCR-rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder som tidligere ble brukt til å redusere mtDNA-kopinumre i oocytter, har sine respektive ulemper. Mikromanipuleringsbasert fjerning av mitokondrier fra oocytter reduserer mtDNA-kopieringsnumre med i gjennomsnitt 64%27. En unik metode, tidligere brukt til enukleasjon, innebærer bruk av pasteurpipetter med liten diameter og splitting av en zona pellucidafri oocytt ved grensen mellom en mikrodråpe medier og den omkringliggende mineraloljen. Sammen med utnyttelsen av oocytt sentrifugering kan denne tilnærmingen gi levedyktig mitokondrier-reduserte ooplaster28. Kombinasjonen av sentrifugering og denne oocyttsplittende metoden er imidlertid ennå ikke rapportert å produsere embryoer. Kjemiske mitokondrier reduksjonsmetoder (som eksponering av oocytter til 2′,3′-dideoxycytidine (ddC), en mtDNA syntese inhibitor) har redusert oocyte mtDNA kopi tall med opptil 50% og krever COC's å bli utsatt for kjemikaliet i over 40 h under intro vi modning (IVM) 16,27. Selv om inkubering av porcine oocytter i et ddC-supplert medium i 40 timer ikke har presentert problemer for de rekonstruerte embryoene16, er det ennå ikke publisert data om eksponering av bovine oocytter til ddC i løpet av deres 20-22 timers IVM eller noen påfølgende embryonal utvikling. Metoden som er beskrevet i dette dokumentet, reduserer det relative mtDNA-kopieringsnummeret med omtrent 93,88 %, fra et gjennomsnitt på 45 565 ± 37 169 eksemplarer (gjennomsnittlig ± SD) til 8 396 ± 13 287.
Flere trinn i protokollen er avgjørende for å oppnå tilfredsstillende resultater når det gjelder effektivt å redusere mitokondrienes DNA (mtDNA) kopinummer til en oocytt. Sentrifugering av oocyttene med optimalisert hastighet (15 000 x g) og tid (12 min) vil skape en mer konsentrert mitokondrifraksjon på en pol av hver oocytt. Riktig volum cytochalasin B/syntetisk oviductalvæske med HEPES (CB/HSOF)-oppløsning (50 μL) vil sannsynligvis eliminere oocyttlys på grunn av sentrifugering. Etter sentrifugering fjernes zona pellucida (ZP) ved eksponering for en pronaseløsning; fullstendig fjerning av ZP vil sikre mer presis biseksjon og bør også skille eventuelle gjenværende cumulus celler fra oocytter. Bruk av et varmetrinn på mikroskopet mens du fjerner ZP er valgfritt, men fremskynder ZP-fjerning med minst 1 min. Orienteringen av zona pellucida-frie (ZF) oocytter i biseksjonsdråper er avgjørende for å krysse dem nøyaktig. Mitokondriefraksjonen, som finnes på en pol av hver oocytt, skal være tydelig synlig og plassert på enten toppen eller bunnen av oocytten før biseksjon. Den motsatte polen vil inneholde mørke lipiddråper. Etter biseksjon er utvelgelse og korrekt klassifisering av ooplastene (som mitokondrier-tett eller mitokondrier-utarmet) avgjørende for å oppnå en nøyaktig vurdering av biseksjonen. Det er også viktig å velge hvilke Metaphase II (MII) oocytter som skal krysses. Å sikre at oocyttene som brukes er sfæriske og har homogen cytoplasma, vil sannsynligvis utgjøre en forskjell i mtDNA-kopinumrene som finnes i hver oocytt og ooplast. Ved utforming og syntetisering av individuelle kvantitative polymerasekjedereaksjoner (qPCR), er det viktig å sikre at de riktige primerne og reagenskonsentrasjonene brukes i hver reaksjon for å oppnå nøyaktige resultater. Skulle det produseres en standardkurve, bør den opprettes så presist som mulig, og alle reaksjoner bør utføres i triplikat for å oppnå større nøyaktighet. Tidene og temperaturene i hver qPCR-fase skal forbli de samme for hver kjøring.
Det kan oppstå noen problemer når du følger protokollen. Når du tilsetter olje til biseksjonsplaten, må du sørge for at dråpene bare er dekket; For mye olje vil gjøre pipettebruken mindre effektiv, mens for lite vil føre til fordampning av dråper. Denne fordampning vil føre til en endring i osmolariteten til løsningene, noe som kan være skadelig for oocyttene og ooplastene. Hvis oocyttene lyser etter fordøyelsen av ZP, skyldes dette sannsynligvis ett eller begge av følgende, basert på personlig erfaring og observasjon: oocyttene ble ikke sentrifugert for foreskrevet tid og hastighet, og / eller oocyttene ble utsatt for pronase for lenge. Noen ZF oocytter kan ikke gjenvinne en helt sfærisk form i biseksjonsdråpene. Husk at ikke alle ZF-oocytter vil kunne plasseres optimalt for biseksjon. I dette tilfellet er det tre alternativer: gi ZF oocytter ekstra tid til å gjenvinne en sfærisk form; hold oocytter forsiktig i en mer oppreist stilling med mikrobladet før biseksjon; Ikke bisect oocytter som ikke er i stand til å plasseres riktig. Å bestemme hvilke ooplaster som er mitokondrier-tette eller mitokondrier-utarmet etter biseksjon vil påvirke kvantifiseringsresultatene. Hvis det er vanskelig å klassifisere ooplastene, plasser oocyttene som skal krysses slik at mitokondrienes brøkdel enten alltid peker mot toppen eller bunnen av dråpen, og / eller se etter en mørk del av oocytten på en av polene (disse lipiddråpene er konsentrert på motsatt pol fra mitokondriene). Til tider kan ooplaster holde seg til hverandre og / eller innrykket laget av mikrobladet i platen. Noen ganger vil det å gi ooplastene ekstra tid til å gjenvinne en sfærisk form hjelpe med separasjon. Andre alternativer inkluderer å banke forsiktig på platen, forsiktig suge dem inn og ut av pipetten, og / eller bruke kanten av pipetten for å forsiktig skille ooplastene.
Denne mtDNA kopinummerreduksjonsmetoden har sine begrensninger; den ene er basert på oocyttkilde, og den andre skyldes fjerning av ZP fra oocytten. Oocyttkilde (selve dyret, den spesifikke eggstokken og den spesifikke follikkelen) vil i stor grad påvirke mtDNA-kopinumrene i den spesifikke oocytten. Det er et stort standardavvik rundt gjennomsnittlig mtDNA-kopinummer for en enkelt oocytt, som angir hvor variabelt kopinummeret kan være. Mange enkelt oocytt kvantifiseringsreaksjoner er pålagt å ha et robust enkelt oocytt standard kopinummer som vil bli sammenlignet med ooplaster og andre oocytter. Det betydelige standardavviket gjør også sammenligningen av ooplast til oocytt mindre absolutt, da ooplastens kopinummer ikke kan sammenlignes med opprinnelsesoocytten.
Fordøyelsen av oocyttens zonae pellucidae gjør den resulterende ZF oocyte og ooplasts mye mer skjøre enn de var før fjerning av deres zonae pellucidae. Denne skjørheten fører til høyere lysishastigheter av ooplaster og ZF oocytes selv, spesielt ved bruk av et mikroblad- en stor mengde omsorg og presisjon må brukes. Skulle ooplastene brukes til fusjon, krever de hvile etter biseksjon før fusjon kan forsøkes. Ellers vil mange av ooplastene sannsynligvis lyse. Mitokondrie-utarmede ooplaster har en tendens til å være mer delikate enn deres mitokondrier-tette kolleger. Mikrotubulene i oocytten har en tendens til å migrere med mitokondriene til samme pol av oocytten under sentrifugering, noe som etterlater mitokondriene utarmede ooplaster med færre strukturelle komponenter29. Ytterligere forskning og farging er nødvendig for å avgjøre om andre oocyttorganeller påvirkes negativt av kombinasjonen av sentrifugering og biseksjon som brukes til å produsere ooplaster i denne protokollen.
Reduksjonen i oocytt mitokondrier ville redusere oocyttartenes mitokondrier i et resulterende iSCNT-embryo, og dermed redusere forekomsten av mitokondrier heteroplasma i det rekonstruerte embryoet. Embryoets sjanser for utvikling vil øke relativt, men vil sannsynligvis kreve tilskudd av mitokondrier fra donorcelleartene for å møte energibehovet under utviklingen. Så langt har iSCNT-forsøk som har brukt intergeneriske kryss ikke produsert levende avkom. Redusere heteroplasma i iSCNT embryoer kan øke sannsynligheten for vellykkede graviditeter. iSCNT er en metode som kan bidra til å redde noen av de 40 000 artene klassifisert som truet30. Siden somatiske celler fra disse artene vanligvis er mer tilgjengelige enn bakteriecellene, kan iSCNT bruke disse somatiske cellene, sammen med oocytter fra husdyr. Intrageneriske forsøk har vært vellykket i å produsere levende dyr 31,32,33, selv om avkomene vanligvis er chimeric for mtDNA, og det er ikke alltid mulig å finne en intragenerisk oocyttkilde. Biseksjon av oocytter med sikte på å redusere mtDNA-kopitall, etterfulgt av sammensmelting av disse ooplastene med en interspesifikk somatisk celle, ville redusere chimerisme og heteroplasmy i iSCNT-embryoene. På grunn av disse reduksjonene gir bruken av den beskrevne metoden et større potensial for intergeneriske levende fødsler og videreføring av truede arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke sine kolleger ved Utah State University, reproduktive vitenskapsforskere ved San Diego Zoo, og Dr. Rebecca Krisher ved Genus PLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
References
- Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid. Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).
- Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels. PLOS ONE. 12 (5), 0177800 (2017).
- Oh, H. J., et al. Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem. Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).
- Srirattana, K., et al. Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment. Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).
- Kwon, D. K., et al. Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).
- Lee, E., et al. Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes. Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285 (2009).
- Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes. Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).
- Hong, S. G., et al. Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer. Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Takeda, K. Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs. Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
- Evans, M. J., et al. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).
- Meirelles, F. V., et al. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).
- Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology. Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).
- Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems. Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).
- Jiang, Y., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors. PLoS ONE. 6 (4), 14805 (2011).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Cagnone, G. L., et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency. Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).
- Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development. Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).
- Ferreira, A. F., et al. Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review. Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).
- Bhat, M. H., et al. Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos. Journal of Reproduction and Development. , (2019).
- Tecirlioglu, R. T., et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo. Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361 (2003).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene. Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).
- Zhang, P., et al. Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids. PLOS ONE. 8 (2), 55941 (2013).
- Lagutina, I., et al. Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type. Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).
- Chiaratti, M. R., et al. Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle. Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).
- Hosseini, S. M., et al. and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- International Union for Conservation of Nature. The IUCN Red List of Threatened Species. International Union for Conservation of Nature. , (2021).
- Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny. Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).
- Gómez, M. C., et al. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).
- Lanza, R. P., et al. Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).
