本协议描述了微流体装置中微观冰晶和包合物水合物的结晶,使形成的晶体周围的液体交换成为可能。这为检查抑制剂的结晶过程和结合机制提供了无与伦比的可能性。
水结晶的准确机理描述具有挑战性,需要几个关键要素:出色的温度控制,允许形成单个微观晶体,以及与冷阶段耦合的合适显微镜系统。本文描述的方法增加了另一个重要特征,其包括在冰和包合物水合物晶体周围交换溶液。所描述的系统包括独特和自主开发的仪器的组合,包括微流体、高分辨率冷台和荧光显微镜。冷阶段是为微流体装置设计的,允许在微流体通道内形成微米大小的冰/水合物晶体,并在它们周围交换溶液。冷阶段的温度分辨率和稳定性为一毫开尔文,这对于控制这些小晶体的生长至关重要。这种多样化的系统用于研究冰和水合物结晶的不同过程以及抑制这些晶体生长的机制。该协议描述了如何制备微流体装置,如何在微流体通道中生长和控制微观晶体,以及如何利用冰/水合物晶体周围的液体流动为水的结晶提供新的见解。
防冻蛋白 (AFP) 和防冻糖蛋白 (AFGP) 可保护各种适应寒冷的生物免受冻害1.AFP和AFGP(广义为AF(G)Ps)通过不可逆地结合到冰晶表面并抑制由于吉布斯 – 汤姆逊效应2,3,4,5而进一步生长来抑制冰晶的生长。在熔化温度(基本不变)和新降低的冻结温度之间形成的间隙称为热滞后(TH),代表对应于AFP活动6的可测量参数。使用AFPs抑制冰的生长具有深远而多样的应用,在各个领域提供了潜在的增强功能,包括冷冻保存,冷冻食品质量和保护暴露在寒冷的作物。
在小有机分子存在下,水在低温高压下结晶导致包合物水合物(或气体水合物)的形成,其中最丰富的水合物是甲烷水合物7。天然气/石油输油管线中甲烷水合物的结晶可能会导致堵塞,这可能会导致气体点火引起的爆炸8,9,10。目前防止水合物在流水线中结晶的努力包括使用热力学(醇和乙二醇)和动力学(主要是聚合物)抑制剂11,12,13,14。还发现AFP与包合物水合物晶体结合并抑制其生长,这表明AFP的潜在用途是阻止堵塞的形成,从而提供更绿色的解决方案15。
微流体是一种流行的方法,用于研究流经微通道网络16 的微小样品体积(低至 fL)的流体特性。微通道遵循使用光刻技术17在硅晶圆(模具)上创建的图案。制造微流体器件的常用材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS),它在研究实验室中价格低廉且相对简单。功能(通道)的设计是根据设备的特定用途组成的;因此,它可用于各种应用,包括DNA传感18,医学诊断19和结晶过程3,20,21。
本协议描述了一种独特的微流体方法,该方法使用各种抑制剂(包括AFP和AFGP)生长微米大小的冰和水合物晶体。在这些实验中,使用四氢呋喃(THF)水合物来模拟甲烷气体水合物22的性质,这需要专门的压力和温度控制设备23。荧光标记的AF(G)Ps用于可视化和分析蛋白质对晶体表面的吸附,并与荧光成像相结合,微流控方法允许获得这些分子与晶体表面结合过程的关键特征。
本协议旨在利用微流体流与微观晶体的组合,以揭示晶体生长及其抑制的新见解。毫开尔文分辨率温控冷级27 能够控制位于微流体通道内的单个微观晶体,从而允许在其周围交换溶液。虽然微流体装置的制造是标准的,并且类似于常见的做法17,18,但对装置内部晶体生长和熔化的控制是独特而新颖的。该系统中最关键的组件是出色的温度控制,这是通过使用帕尔贴热电冷却器、来自样品附近的热敏电阻的反馈以及控制反馈回路的高分辨率温度控制器来实现的。
另一个关键步骤是溶液交换本身,因为在此过程中晶体可能会熔化或生长;因此,在溶液交换过程中必须调整温度以防止生长/熔化。微流体通道中晶体的形成会干扰液体流动,并构成该系统的主要挑战;因此,必须控制这些晶体的生长。在这里,红外激光器(980nm)安装在倒置显微镜上,用于局部融化不需要的冰/水合物晶体28。如果无法使用这种激光器,微流体装置的金属连接器可以通过额外的帕尔贴热电冷却器加热,该冷却器将融化装置入口/出口中的冰。
这里描述的方法包括家庭开发的仪器(冷阶段),需要培训,因为上述一些步骤具有挑战性。由于即使不打算流动,晶体周围溶液的浓度也可能发生变化,因此简单的校准步骤5 可以根据荧光信号提供可靠的浓度估计。不需要的流量(例如在TH测量期间)的另一种可能的解决方案是微流体阀,如参考文献4中所述。
该系统还用于探索D 2 O冰在H2O液体中的生长行为,该研究揭示了微观扇形冰表面的新现象27。因此,微流体可用于研究对温度变化反应良好的各种晶体系统。
The authors have nothing to disclose.
感谢美国化学学会石油研究基金的捐助者支持这项研究(批准号60191-UNI5)。作者要感谢Ido Braslavsky教授率先使用微流体装置来研究防冻蛋白和冰。作者感谢Arthur DeVries教授,Konrad Meister教授和Peter Davies教授提供防冻蛋白样品。
0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
Cold stage | Home made | ||
Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
Glass syringe | |||
Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
Inverted microscope, Eclipse Ti – S | Nikon | ||
Invisible tape | Staples | ||
lint-free wipe | Kimwipes | ||
Newport 3040 temperature controller | Newport 3040 | ||
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |