Den nuværende protokol beskriver krystalliseringen af mikroskopiske iskrystaller og clathrathydrathydrater i mikrofluidiske enheder, hvilket muliggør væskeudveksling omkring de dannede krystaller. Dette giver uovertrufne muligheder for at undersøge krystalliseringsprocessen og bindingsmekanismerne for hæmmerne.
En nøjagtig mekanistisk beskrivelse af vandkrystallisation er udfordrende og kræver et par nøgleelementer: fremragende temperaturkontrol for at muliggøre dannelse af enkeltmikroskopiske krystaller og et passende mikroskopisystem koblet til det kolde stadium. Metoden, der er beskrevet heri, tilføjer en anden vigtig funktion, der inkluderer udveksling af opløsninger omkring is og clathrathydratkrystaller. Det beskrevne system består af en kombination af unikke og hjemmeudviklede instrumenter, herunder mikrofluidik, kolde stadier med høj opløsning og fluorescensmikroskopi. Det kolde stadium blev designet til mikrofluidiske enheder og giver mulighed for dannelse af is / hydratkrystaller i mikronstørrelse inde i mikrofluidiske kanaler og udveksling af opløsninger omkring dem. Temperaturopløsningen og stabiliteten af det kolde stadium er en millikelvin, hvilket er afgørende for at kontrollere væksten af disse små krystaller. Dette forskelligartede system bruges til at studere de forskellige processer af is og hydratkrystallisation og den mekanisme, hvormed væksten af disse krystaller hæmmes. Protokollen beskriver, hvordan man forbereder mikrofluidiske enheder, hvordan man dyrker og styrer mikroskopiske krystaller i de mikrofluidiske kanaler, og hvordan udnyttelsen af strømmen af væsker omkring is / hydratkrystaller giver ny indsigt i krystalliseringen af vand.
Frostvæskeproteiner (AFP’er) og frostvæskeglycoproteiner (AFGP’er) beskytter forskellige kuldetilpassede organismer mod frostskader1. AFP’er og AFGP’er (generaliseret som AF(G)Ps) hæmmer væksten af iskrystaller ved at binde irreversibelt til deres overflader og hæmme yderligere vækst på grund af Gibbs-Thomson-effekten 2,3,4,5. Det resulterende mellemrum, der dannes mellem smeltetemperaturen, som stort set er uændret, og den nyligt deprimerede frysetemperatur kaldes termisk hysterese (TH) og repræsenterer en målbar parameter svarende til AFP-aktivitet6. Brugen af AFP’er til at hæmme isvækst har vidtrækkende og forskellige anvendelser, der tilbyder potentiel forbedring på forskellige områder, herunder kryopræservering, frossen fødevarekvalitet og beskyttelse af koldt udsatte afgrøder.
Krystalliseringen af vand ved lave temperaturer og høje tryk i nærværelse af små organiske molekyler resulterer i dannelsen af clathrathydrathydrater (eller gashydrater), hvor det mest rigelige hydrat er metanhydrat7. Krystalliseringen af metanhydrater i gas/olie flowlines kan forårsage propper, som kan forårsage eksplosioner på grund af gasantændelse 8,9,10. Nuværende bestræbelser på at forhindre hydratkrystallisation i flowlinjer omfatter anvendelse af termodynamiske (alkoholer og glycoler) og kinetiske (hovedsageligt polymerer) hæmmere11,12,13,14. AFP’er har også vist sig at binde for at klatrathydrere krystaller og hæmme deres vækst, hvilket peger på den potentielle anvendelse af AFP’er til at forhindre dannelsen af propper og derved give en grønnere opløsning15.
Microfluidics er en udbredt metode, der bruges til at studere egenskaberne af væsker ved små prøvevolumener (ned til fL), der strømmer gennem et netværk af mikrokanaler16. Mikrokanalerne følger et mønster skabt på en siliciumskive (formen) ved hjælp af litografi17. Et almindeligt anvendt materiale til fremstilling af mikrofluidiske enheder er polydimethylsiloxan (PDMS), som er billigt og relativt enkelt at arbejde med i forskningslaboratorier. Designet af funktionerne (kanalerne) er sammensat med hensyn til enhedens specifikke formål; det kan således bruges til en række forskellige applikationer, herunder DNA-sensing18, medicinsk diagnose19 og krystalliseringsprocesser 3,20,21.
Den nuværende protokol beskriver en unik mikrofluidisk metode til dyrkning af is i mikronstørrelse og hydratkrystaller med forskellige hæmmere, herunder AFP’er og AFGP’er. Til disse eksperimenter blev Tetrahydrofuran (THF) hydrater brugt til at efterligne egenskaberne af metangasshydrater22, som kræver specialudstyr til tryk- og temperaturkontrol23. Fluorescerende mærket AF (G) Ps blev brugt til at visualisere og analysere adsorptionen af proteinerne til krystaloverfladen, og kombineret med fluorescerende billeddannelse tillod den mikrofluidiske tilgang opnåelse af nøglefunktioner i bindingsprocessen af disse molekyler til krystaloverflader.
Den nuværende protokol blev designet til at udnytte kombinationen af mikrofluidisk strømning med mikroskopiske krystaller for at afsløre ny indsigt i krystalvækst og dens hæmning. Et millikelvinopløsnings temperaturstyret koldt trin27 muliggør kontrol af enkeltmikroskopiske krystaller placeret inde i mikrofluidiske kanaler, hvilket muliggør udveksling af opløsninger omkring dem. Mens fremstillingen af mikrofluidiske enheder er standard og ligner almindelig praksis17,18, er kontrollen over vækst og smeltning af krystaller inde i enheden unik og ny. Den mest kritiske komponent i dette system er den fremragende temperaturregulering, som opnås ved hjælp af Peltier termoelektriske kølere, feedback fra en termistor, der er placeret tæt på prøven, og en temperaturregulator med høj opløsning, der styrer feedback-sløjfen.
Et andet kritisk trin er selve opløsningsudvekslingen, da krystallerne kan smelte eller vokse under denne proces; Temperaturen skal således justeres under opløsningsudvekslingen for at forhindre vækst/smeltning. Dannelsen af krystaller i mikrofluidiske kanaler forstyrrer væskestrømmen og udgør den største udfordring i dette system; Således skal væksten af disse krystaller kontrolleres. Her blev en IR-laser (980 nm) monteret på det omvendte mikroskop og blev brugt til lokalt at smelte uønskede is/hydratkrystaller28. Hvis en sådan laser ikke kan bruges, kan de metalliske stik på den mikrofluidiske enhed opvarmes af en ekstra Peltier termoelektrisk køler, som smelter isen i enhedens indløb / udløb.
Den her beskrevne metode omfatter hjemmeudviklede instrumenter (kold fase) og kræver træning, da nogle af de ovennævnte trin er udfordrende. Da koncentrationen af opløsningen omkring krystallerne kan ændre sig, selv når strømmen ikke er beregnet, kan et simpelt kalibreringstrin5 give et pålideligt skøn over koncentrationen baseret på fluorescenssignalet. En anden mulig løsning på uønsket flow (f.eks. under TH-målinger) er mikrofluidiske ventiler, som er beskrevet i reference4.
Dette system blev også brugt til at undersøge vækstadfærden af D2O-is iH2O-væske, en undersøgelse, der afslørede et nyt fænomen med mikroskopiske, kammuslede isoverflader27. Således kan mikrofluidik anvendes i undersøgelsen af forskellige krystallinske systemer, der reagerer godt på temperaturændringer.
The authors have nothing to disclose.
Anerkendelse gives til donorerne fra American Chemical Society Petroleum Research Fund til støtte for denne forskning (bevillingsnummer 60191-UNI5). Forfatterne vil gerne takke prof. Ido Braslavsky for banebrydende brugen af mikrofluidiske enheder til at studere frostvæskeproteiner og is. Forfatterne er taknemmelige for prof. Arthur DeVries, prof. Konrad Meister og prof. Peter Davies for at levere frostvæskeproteinprøver.
0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
Cold stage | Home made | ||
Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
Glass syringe | |||
Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
Inverted microscope, Eclipse Ti – S | Nikon | ||
Invisible tape | Staples | ||
lint-free wipe | Kimwipes | ||
Newport 3040 temperature controller | Newport 3040 | ||
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |