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Chemistry

बर्फ और क्लैथरेट हाइड्रेट क्रिस्टलीकरण के अध्ययन के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण

Published: August 18, 2022 doi: 10.3791/64072
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, Yeshiva University, 2Department of Physics, Katz School of Science and Health, Yeshiva University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में सूक्ष्म बर्फ क्रिस्टल और क्लैथरेट हाइड्रेट्स के क्रिस्टलीकरण का वर्णन करता है, जो गठित क्रिस्टल के चारों ओर तरल विनिमय को सक्षम करता है। यह अवरोधकों के क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया और बाध्यकारी तंत्र की जांच करने के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करता है।

Abstract

पानी के क्रिस्टलीकरण का एक सटीक यांत्रिक विवरण चुनौतीपूर्ण है और इसके लिए कुछ प्रमुख तत्वों की आवश्यकता होती है: एकल सूक्ष्म क्रिस्टल के गठन की अनुमति देने के लिए शानदार तापमान नियंत्रण और ठंडे चरण के साथ युग्मित एक उपयुक्त माइक्रोस्कोपी प्रणाली। यहां वर्णित विधि एक और महत्वपूर्ण विशेषता जोड़ती है जिसमें बर्फ और क्लैथरेट हाइड्रेट क्रिस्टल के आसपास समाधानों का आदान-प्रदान शामिल है। वर्णित प्रणाली में माइक्रोफ्लुइडिक्स, उच्च-रिज़ॉल्यूशन कोल्ड स्टेज और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी सहित अद्वितीय और घर-विकसित उपकरणों का एक संयोजन शामिल है। कोल्ड स्टेज को माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के लिए डिज़ाइन किया गया था और माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के अंदर माइक्रोन आकार के बर्फ / हाइड्रेट क्रिस्टल के गठन और उनके आसपास समाधानों के आदान-प्रदान की अनुमति देता है। ठंडे चरण का तापमान संकल्प और स्थिरता एक मिलीकेल्विन है, जो इन छोटे क्रिस्टल के विकास को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस विविध प्रणाली का उपयोग बर्फ और हाइड्रेट क्रिस्टलीकरण की विभिन्न प्रक्रियाओं और तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जिसके द्वारा इन क्रिस्टल की वृद्धि को रोक दिया जाता है। प्रोटोकॉल बताता है कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को कैसे तैयार किया जाए, माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में सूक्ष्म क्रिस्टल को कैसे विकसित और नियंत्रित किया जाए, और बर्फ / हाइड्रेट क्रिस्टल के आसपास तरल पदार्थों के प्रवाह का उपयोग पानी के क्रिस्टलीकरण में नई अंतर्दृष्टि कैसे प्रदान करता है।

Introduction

एंटीफ्ऱीज़ प्रोटीन (एएफपी) और एंटीफ्ऱीज़ ग्लाइकोप्रोटीन (एएफजीपी) विभिन्न ठंडे-अनुकूलितजीवों को ठंढ के नुकसान से बचाते हैं। एएफपी और एएफजीपी (एएफ (जी) पीएस के रूप में सामान्यीकृत) बर्फ के क्रिस्टल के विकास को रोकते हैं, अपरिवर्तनीय रूप से उनकी सतहों पर बांधते हैं और गिब्स-थॉमसन प्रभाव 2,3,4,5 के कारण आगे के विकास को रोकते हैं। परिणामी अंतर जो पिघलने के तापमान के बीच बनता है, जो काफी हद तक अपरिवर्तित है, और नए उदास ठंड तापमान को थर्मल हिस्टैरिसीस (टीएच) कहा जाता है और एएफपी गतिविधि6 के अनुरूप एक औसत दर्जे का पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है। बर्फ के विकास को रोकने के लिए एएफपी के उपयोग में दूरगामी और विविध अनुप्रयोग हैं, जो क्रायोप्रिजर्वेशन, जमे हुए खाद्य गुणवत्ता और ठंड-उजागर फसलों की सुरक्षा सहित विभिन्न क्षेत्रों में संभावित वृद्धि की पेशकश करते हैं।

छोटे कार्बनिक अणुओं की उपस्थिति में कम तापमान और उच्च दबाव पर पानी के क्रिस्टलीकरण के परिणामस्वरूप क्लैथरेट हाइड्रेट्स (या गैस हाइड्रेट्स) का निर्माण होता है, जहां सबसे प्रचुर मात्रा में हाइड्रेट मीथेन हाइड्रेट7 है। तेल प्रवाह लाइनों में मीथेन हाइड्रेट्स के क्रिस्टलीकरण से प्लग हो सकते हैं, जो गैस इग्निशन 8,9,10 के कारण विस्फोट का कारण बन सकता है। प्रवाह रेखाओं में हाइड्रेट क्रिस्टलीकरण को रोकने के वर्तमान प्रयासों में थर्मोडायनामिक (अल्कोहल और ग्लाइकोल्स) और गतिज (मुख्य रूप से पॉलिमर) अवरोधक 11,12,13,14 का उपयोग करना शामिल है। एएफपी को क्लैथरेट हाइड्रेट क्रिस्टल से बांधने और उनके विकास को रोकने के लिए भी पाया गया है, जो प्लग के गठन में बाधा डालने के लिए एएफपी के संभावित उपयोग की ओर इशारा करता है, जिससे एक हरियाली समाधान प्रदान होताहै।

माइक्रोफ्लुइडिक्स एक प्रचलित विधि है जिसका उपयोग सूक्ष्म नमूना मात्रा (एफएल तक) पर तरल पदार्थों के गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जो माइक्रोचैनल16 के नेटवर्क के माध्यम से प्रवाहित होते हैं। माइक्रोचैनल लिथोग्राफी17 का उपयोग करके सिलिकॉन वेफर (मोल्ड) पर बनाए गए पैटर्न का पालन करते हैं। माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली सामग्री पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) है, जो अनुसंधान प्रयोगशालाओं में काम करने के लिए सस्ती और अपेक्षाकृत सरल है। सुविधाओं (चैनलों) का डिजाइन डिवाइस के विशिष्ट उद्देश्य के संबंध में बना है; इस प्रकार, इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें डीएनए सेंसिंग18, चिकित्सा निदान19 और क्रिस्टलीकरणप्रक्रियाएं 3,20,21 शामिल हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल एएफपी और एएफजीपी सहित विभिन्न अवरोधकों के साथ माइक्रोन आकार की बर्फ और हाइड्रेट क्रिस्टल को बढ़ाने की एक अनूठी माइक्रोफ्लुइडिक विधि का वर्णन करता है। इन प्रयोगों के लिए, टेट्राहाइड्रोफ्यूरान (टीएचएफ) हाइड्रेट्स का उपयोग मीथेन गैस हाइड्रेट्स22 के गुणों की नकल करने के लिए किया गया था, जिन्हें दबाव और तापमान नियंत्रण23 के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंटली लेबल एएफ (जी) पीएस का उपयोग क्रिस्टल सतह पर प्रोटीन के सोखना की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए किया गया था, और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ मिलकर, माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण ने क्रिस्टल सतहों पर इन अणुओं की बाध्यकारी प्रक्रिया की प्रमुख विशेषताओं को प्राप्त करने की अनुमति दी।

Protocol

1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण

  1. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पेट्री डिश की अंदरूनी सतह को कवर करें और पहले से तैयार मोल्ड को पेट्री डिश में रखें।
    1. संदर्भों में वर्णित लिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके मोल्डों का निर्माण करें। वर्तमान कार्य में उपयोग किए गए दो डिवाइस डिज़ाइन चित्र 1 में दर्शाए गए हैं।
  2. इलाज एजेंट और इलास्टोमर ( सामग्री की तालिका देखें) के 1:10 (वजन से) मिश्रण को तौलकर पीडीएमएस मिश्रण का 30-40 एमएल तैयार करें और लगभग 5 मिनट तक लगातार मिलाएं जब तक कि मिश्रण सफेद और लगभग अपारदर्शी न दिखाई दे।
    नोट: वजन पैमाने पर एक प्लास्टिक कप रखें, कप में इलास्टोमर डालें, और फिर 1: 10 वजन अनुपात प्राप्त करने के लिए इलाज एजेंट जोड़ें।
  3. पीडीएमएस मिश्रण को पेट्री डिश में मोल्ड के साथ डालें और एक डेसिकेटर में डेगैस डालें जब तक कि कोई बुलबुले न रहें (लगभग 30 मिनट)।
  4. मोल्ड को तरल पीडीएमएस के साथ ओवन में या गर्म प्लेट पर 70 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें जब तक कि रबर जैसी स्थिरता प्राप्त न हो जाए। इस प्रक्रिया में लगभग एक घंटा लगता है।
  5. स्केलपेल के साथ सुविधाओं के चारों ओर ट्रेस करके डिवाइस को काटें, क्योंकि मोल्ड नाजुक है, इसलिए नीचे के बजाय स्केलपेल के साथ आगे बढ़ने का ध्यान रखें। कट-आउट पीडीएमएस डिवाइस को हटा दें, इसे एक नए पेट्री डिश में उल्टा रखें। चिपकने वाले टेप के एक टुकड़े को संलग्न और हटाकर नीचे की सतह से धूल और गंदगी के कणों को हटा दें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. यदि आवश्यक हो तो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, अंकित पैटर्न के आधार पर डिवाइस में छेद को बाहर निकालने के लिए एक कुंद सिरिंज सुई (20 जी) का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि छेद डिवाइस के दूसरी तरफ से प्रवेश करता है, और छिद्रित टुकड़ों को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
  7. अच्छी तरह से एक कवरस्लिप (18 x 18 मिमी, 0.14 मिमी मोटी) को पानी और साबुन से धो लें, और फिर आइसोप्रोपेनोल के साथ। साफ किए गए कवरस्लिप को सुखाने के लिए हवा के दबाव का उपयोग करें।
  8. साफ किए गए पीडीएमएस डालें और प्लाज्मा क्लीनर में कवरस्लिप डालें, वाल्व बंद करें, और बिजली, वैक्यूम और पंप चालू करें। प्लाज्मा क्लीनर को लगभग एक मिनट तक चलने दें, आरएफ को एचआई पर सेट करें, और ठीक वाल्व का उपयोग करके प्लाज्मा क्लीनर में कुछ हवा प्रवेश करने की अनुमति दें।
    1. जब देखने वाली खिड़की का रंग बैंगनी से गुलाबी में बदल जाता है, तो प्लाज्मा क्लीनर को 50 सेकंड तक काम करने दें और आरएफ को बंद कर दें। पंप को एक मिनट के लिए चालू रखें, और इसे बंद करने के बाद, धीरे-धीरे प्लाज्मा क्लीनर में हवा की अनुमति देने के लिए मुख्य वाल्व खोलें।
      नोट: तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक विधि गर्मी बंधन है। इस विधि के लिए, मोल्ड को कवरस्लिप पर रखें और इसे लगभग 60 मिनट के लिए 70-80 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्म प्लेट पर रखें।
  9. साफ किए गए कवरस्लिप पर पीडीएमएस सतह दबाएं और पुष्टि करें कि वे कवरस्लिप पर थोड़ा ऊपर खींचते समय कोई अलगाव नहीं देखकर बंधे हुए हैं।
  10. 90 ° कुंद सुई (18 ग्राम) की सुई को प्लियर्स की एक जोड़ी के साथ सुरक्षित करें और इसे हटाने के लिए प्लास्टिक सिरिंज कनेक्टर को खींचें। सुई के एक छोर को टाइगॉन ट्यूब (0.020 "आईडी, 0.060" ओडी, सामग्री की तालिका देखें) में डालें और दूसरे छोर को डिवाइस के छिद्रित छेदों में से एक में डालें। अन्य छेदों के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
  11. हवा के बुलबुले को हटाने के लिए, ग्लास सिरिंज के साथ चैनलों में पानी / बफर इंजेक्ट करें (एक पंप वैकल्पिक है, लेकिन यहां कोई पंप का उपयोग नहीं किया गया था)। डिवाइस में इंजेक्ट करने से पहले सभी तरल पदार्थों को 0.22 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
  12. पीडीएमएस दीवारों पर प्रतिदीप्ति-लेबल वाले एएफपी के बंधन को रोकने के लिए 1% बीएसए समाधान जैसे ब्लॉकिंग एजेंट का उपयोग करें। ब्लॉकिंग एजेंट को इनलेट चैनल में इंजेक्ट करें और इसे 20 मिनट के लिए माइक्रोचैनल में रहने दें। फिर, बीएसए समाधान को बाहर निकालने के लिए इनलेट चैनल में बफर समाधान इंजेक्ट करें।
    नोट: परिणामस्वरूप पीडीएमएस डिवाइस इसकी निचली सतह के साथ एक कवरस्लिप से जुड़ा हुआ है, इसके इनलेट और आउटलेट छेद में ट्यूबिंग से जुड़ा हुआ है, और इसके चैनलों में एक ब्लॉकिंग एजेंट के साथ लेपित है।

2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस स्थापित करना

  1. तांबे के ठंडे चरण की सतह पर थोड़ी मात्रा में विसर्जन तेल लागू करें ( सामग्री की तालिका देखें) और तेल की एक पतली परत बनाने के लिए इसे लिंट-मुक्त पोंछे का उपयोग करके फैलाएं। इसके बाद, बनाई गई तेल परत पर एक साफ नीलम डिस्क ( सामग्री की तालिका देखें) रखें। नीलम डिस्क के केंद्र पर विसर्जन तेल की एक बूंद लागू करें और पीडीएमएस डिवाइस को ड्रॉप पर रखें ताकि डिवाइस की विशेषताएं ठंडे चरण के देखने वाले छेद पर संरेखित हों।
  2. डिवाइस को पकड़ें और टयूबिंग को एल्यूमीनियम बॉक्स की बाहरी दीवारों पर सुरक्षित करें जिसमें चिपकने वाला टेप का उपयोग करके ठंडा चरण होता है। प्रत्येक विशिष्ट ट्यूब के प्लेसमेंट पर ध्यान दें।
  3. इनलेट चैनल में एएफ (जी) पी समाधान के 4-5 μL ( सामग्री की तालिका देखें) इंजेक्ट करने के लिए ग्लास सिरिंज का उपयोग करें। ठंडे चरण का ढक्कन बंद करें।
    नोट: एएफपी समाधानों की एकाग्रता को उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर विविध और तय किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, सांद्रता की सीमा 5-40 μL थी।

3. माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में एकल क्रिस्टल का गठन

  1. ठंडे चरण को सूखी हवा / नाइट्रोजन के साथ शुद्ध करें ताकि इसके अंदर संघनन को बनने से रोका जा सके। ठंडे चरण के माध्यम से पानी को प्रसारित करने के लिए एक परिसंचारी शीतलन स्नान को सक्रिय करें और गर्मी सिंक के रूप में काम करें।
  2. तापमान नियंत्रण कार्यक्रम शुरू करें और तापमान को -25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    नोट: ठंड तब होगी जब नमूना ~ -20 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुंच जाता है, जिसे नमूने के अचानक कालेपन और खुरदरेपन के रूप में देखा जा सकता है। इस बिंदु पर किसी भी उद्देश्य का उपयोग किया जा सकता है, अधिमानतः 4x उद्देश्य, जो उपयोगकर्ता को माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की संपूर्णता का निरीक्षण करने में सक्षम बनाता है।
  3. धीरे-धीरे, तापमान को लगभग 1 डिग्री सेल्सियस / 5 सेकंड तक बढ़ाते हुए, नमूने के पिघलने बिंदु तक पहुंचते हैं, जो एएफ (जी) पी समाधान में उपयोग किए जाने वाले बफर के आधार पर -1 से -0.2 डिग्री सेल्सियस तक हो सकता है। जैसे ही तापमान पिघलने बिंदु तक पहुंचता है, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कुछ एकल क्रिस्टल अलग न हो जाएं।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो अवांछित बर्फ को आईआर लेजर (980 एनएम) का उपयोग करके स्थानीय रूप से पिघलाया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें), जिसे माइक्रोस्कोप पर तय किया गया है। लेजर आस-पास के बर्फ के क्रिस्टल को पिघलादेता है जब तक यह चालू रहता है।
  4. इस बिंदु पर, एकल क्रिस्टल का बेहतर निरीक्षण करने के लिए 10x या 20x उद्देश्यों पर स्विच करने की सिफारिश की जाती है। वांछित स्थान पर एक एकल क्रिस्टल प्राप्त करने के बाद, क्रिस्टल को तापमान को थोड़ा कम करके (~ 0.01 डिग्री सेल्सियस) बढ़ाएं जब तक कि क्रिस्टल के किनारे चैनल की दीवारों से नहीं मिलते।
  5. 50x उद्देश्य पर स्विच करें, चैनलों में एएफ (जी) पी समाधान इंजेक्ट करें, और प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि का निरीक्षण करें, यह दर्शाता है कि प्रोटीन समाधान सफलतापूर्वक चैनलों में इंजेक्ट किया गया था। समाधानों के आदान-प्रदान के दौरान बर्फ क्रिस्टल के पिघलने से बचने के लिए इस चरण को सावधानीपूर्वक करें। समाधान विनिमय प्रक्रिया के दौरान प्रवाह दर (ग्लास सिरिंज पर अधिक / कम दबाव लागू करके) और तापमान दोनों की बारीकी से निगरानी और समायोजन करें।
  6. प्रोटीन को क्रिस्टल की सतह पर जमा करने और बांधने के लिए पर्याप्त समय दें।
    नोट: यह एएफ (जी) पी5,25 के संचय और सोखना दरों के आधार पर भिन्न होता है। एक विशिष्ट प्रयोग में, एएफपी संचय के लिए 5-10 मिनट की अनुमति है

4. थर्मल हिस्टैरिसीस (टीएच) गतिविधि माप

नोट: यह चरण वैकल्पिक है।

  1. 0.002 डिग्री सेल्सियस के छोटे चरणों के साथ तापमान को समायोजित करके और उच्चतम तापमान का अवलोकन करके क्रिस्टल के पिघलने बिंदु का निर्धारण करें जो एक छोटे क्रिस्टल को पिघलने के बिना किया जा सकता है।
  2. तापमान नियंत्रक के रैंप फ़ंक्शन पर, शीतलन दर को -0.05 से -0.01 डिग्री सेल्सियस / 4 एस पर सेट करें और रैंप को सक्रिय करें। सटीक तापमान पर ध्यान दें जिस पर अचानक क्रिस्टल वृद्धि होती है।
    नोट: इस मान को विस्फोट तापमान कहा जाता है और ठंड के तापमान से मेल खाता है। पिघलने और ठंड के तापमान के बीच का अंतर टीएच गतिविधि25 है।

5. एकल क्रिस्टल के आसपास समाधान विनिमय

  1. सुनिश्चित करें कि प्रयोग के दौरान क्रिस्टल के पिघलने या विकास को रोकने के लिए नमूना तापमान टीएच अंतराल में है।
  2. बाद में फ्लोरेसेंस डेटा विश्लेषण के लिए एनआईएस तत्व इमेजिंग प्रोग्राम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके समाधान विनिमय प्रक्रिया रिकॉर्ड करें। धीरे-धीरे बफर समाधान को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के दूसरे इनलेट में इंजेक्ट करें, और फ्लोरोसेंट सिग्नल में एक दर पर कमी का निरीक्षण करें जो सिरिंज पर लागू दबाव पर निर्भर करता है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए इस दृश्य प्रतिनिधित्व का उपयोग करें कि लागू दबाव बहुत अधिक नहीं है ताकि क्रिस्टल पिघल न जाए। समाधान विनिमय प्रक्रिया को प्रदर्शित करने वाली छवियों के अनुक्रम के लिए चित्रा 2 देखें।
  3. इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें।
    नोट: सिग्नल क्रिस्टल की सतह के पास के क्षेत्र में चरम पर होना चाहिए, एएफपी बाइंडिंग का संकेत देता है, और आसपास के समाधान में अपेक्षाकृत कम होना चाहिए, जिसे बफर के साथ फ्लश किया गया है।
  4. चरण 4 के बाद समाधान विनिमय के बाद टीएच गतिविधि को मापें।
  5. एक नए क्रिस्टल (चरण 3.3-3.5) को अलग करके प्रयोग को दोहराएं। एएफपी समाधान को ग्लास सिरिंज के साथ इंजेक्ट करें और समाधान विनिमय को दोहराएं (चरण 5.1-5.3)। एक नया एकल क्रिस्टल (चरण 3.3-3.5) प्राप्त करें और ग्लास सिरिंज का उपयोग करके चैनलों में एएफपी समाधान प्रवाहित करें।

6. क्लैथरेट हाइड्रेट्स के साथ प्रयोग

  1. टीएचएफ हाइड्रेट्स प्राप्त करने के लिए, 1: 15 के दाढ़ अनुपात के साथ एक टीएचएफ / पानी का घोल तैयार करें, जो 1: 3.326 का आयतन अनुपात है। निम्नलिखित प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों में इस अनुपात को बनाए रखें, जिसमें एएफ (जी) पीएस या अन्य अवरोधक शामिल हैं।
  2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस तैयार करने के लिए चरण 1 और 2 का पालन करें और इसे ठंडे चरण में रखें। तापमान को -25 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें; नमूना ~ -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज हो जाएगा जैसा कि चरण 3.2 में वर्णित है।
  3. टीएचएफ समाधान जमने के बाद, धीरे-धीरे तापमान बढ़ाएं जब तक कि सभी बर्फ पिघल न जाए।
    नोट: बर्फ का पिघलने बिंदु टीएचएफ द्वारा थोड़ा उदास है।
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि हाइड्रेट्स के बहिष्करण पर सभी बर्फ क्रिस्टल पिघल गए, तापमान को 3 मिनट के लिए 1 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. तापमान को -2 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और अवरोधकों की अनुपस्थिति में माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में दिखाई देने वाले हाइड्रेट्स की बहुतायत का निरीक्षण करें।
    नोट: टीएचएफ हाइड्रेट्स को ऑक्टाहेड्रॉन (चित्रा 2) के रूप में आकार दिया जाता है, और कुछ मामलों में, क्रिस्टल बहुत पतले होते हैं; इस प्रकार, स्पष्ट अवलोकन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इन मामलों में, नए क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए चरण 6.4-6.5 को दोहराने की सिफारिश की जाती है।
  6. तापमान को समायोजित करते समय ग्लास सिरिंज का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में एएफ (जी) पी / अवरोधक इंजेक्ट करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्राप्त क्रिस्टल पिघल / विकसित न हों। अवरोधक अणुओं को क्रिस्टल की सतह पर अधिशोषित करने के लिए कुछ मिनट दें।
  7. यदि आवश्यक हो, तो चरण 4 के बाद टीएच गतिविधि को मापें।
  8. चरण 5.2-5.3 में वर्णित क्रिस्टल के चारों ओर समाधान का आदान-प्रदान करें।

Representative Results

बर्फ के क्रिस्टल के साथ समाधान विनिमय
एक बर्फ क्रिस्टल के चारों ओर एक सफल समाधान विनिमय चित्रा 3 में प्रस्तुत किया गया है। प्रत्येक स्नैपशॉट पर टाइम स्टैम्प इंगित करता है कि समाधान विनिमय अपेक्षाकृत तेज था; हालांकि, एक धीमी विनिमय संभव है। विनिमय पूरा होने के बाद बर्फ-अधिशोषित एएफजीपी अणुओं से आने वाली प्रतिदीप्ति तीव्रता स्पष्ट रूप से देखी जाती है (चित्रा 3, दाएं)। बर्फ की सतह पर एएफपी एकाग्रता का मात्रात्मक विश्लेषण एक निर्दिष्ट क्षेत्र (आरओआई) उपकरण (चित्रा 4) का उपयोग करके निगरानी की जाती है। इस प्रयोग4 में, एएफपी टाइप III (क्यूएई आइसोफॉर्म) को 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.8) और 100 एमएम एनएसीएल में पतला किया गया था। समाधान को एक बाइपिरामिडल के आकार के क्रिस्टल के चारों ओर आदान-प्रदान किया जाता है, और समाधान में और बर्फ पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की निगरानी की जाती है। समाधान में प्रतिदीप्ति संकेत को इंगित करने वाला लाल भूखंड समाधान विनिमय के दौरान 100 के कारक से कम हो जाता है, जबकि बर्फ की सतह पर गणना संकेत (हरा भूखंड) स्थिर रहता है। बर्फ-अधिशोषित अणुओं का परिकलितसंकेत बर्फ से आने वाले सिग्नल से समाधान से आने वाले संकेत को घटाकर प्राप्त किया गया था (एक स्थिरांक से गुणा जो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की मोटाई से संबंधित है)।

टीएचएफ हाइड्रेट्स के साथ समाधान विनिमय
टीएचएफ हाइड्रेट्स के साथ माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग बर्फ के साथ प्रयोगों के समान किए गए थे। हाइड्रेट क्रिस्टल को समाधान से अवरोधक अणुओं को अधिशोषित करने की अनुमति देने के बाद, चैनलों में एक अवरोधक-मुक्त समाधान इंजेक्ट किया गया था। चित्रा 5 दो प्रकार के अवरोधकों के साथ समाधान विनिमय के बाद टीएचएफ हाइड्रेट्स प्रस्तुत करता है: एएफजीपी1-5 फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) (चित्रा 5 ए) और सैफ्रानिन ओ ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ लेबल किया गया है, जो एक फ्लोरेसेंस डाई26 (चित्रा 5 बी) है। यह क्लैथरेट हाइड्रेट की सतह पर एएफजीपी बाइंडिंग का पहला प्रदर्शन है।

Figure 1
चित्रा 1: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। दोनों डिजाइनों में दो इनलेट और एक आउटलेट शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: तापमान को ~ -2 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के बाद माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में टीएचएफ हाइड्रेट्स का गठन होता है। प्रस्तुत सभी क्रिस्टल की आकृति विज्ञान एक टेट्राहेड्रॉन है; हालांकि, कुछ क्रिस्टल अलग तरह से उन्मुख होते हैं। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में एक एकल बर्फ क्रिस्टल के आसपास समाधान विनिमय का प्रदर्शन करने वाला एक प्रतिनिधि प्रयोग। प्रारंभ में, समाधान में एफआईटीसी के साथ लेबल किए गए एएफजीपी1-5 शामिल थे, और बर्फ-अधिशोषित एएफजीपी नहीं देखे गए थे। एएफजीपी-मुक्त समाधान के लिए समाधान का आदान-प्रदान किए जाने के बाद, प्रोटीन जो पहले बर्फ की सतह पर अधिशोषित किए गए थे, स्पष्ट रूप से पता लगाया गया था (दाईं ओर छवि)। स्केल बार = 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: बर्फ की सतह पर एएफपी एकाग्रता का एक मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण। (ए) उच्च एएफपी समाधान एकाग्रता पर एक बर्फ क्रिस्टल (समाधान विनिमय से पहले)। (बी) एएफपी समाधान के बाद उसी क्रिस्टल को एएफपी-मुक्त बफर समाधान के साथ आदान-प्रदान किया गया था। स्केल बार = 20 μm. (C) समाधान विनिमय के दौरान बर्फ की सतह (काली) और समाधान (लाल) पर प्रतिदीप्ति तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण। हरा वक्र बर्फ की सतह पर गणना की गई तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। चित्र संदर्भ 4 से अनुमति के साथ अनुकूलित कियागया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में एकल टीएचएफ हाइड्रेट क्रिस्टल उनके आसपास के समाधान (ए, एएफजीपी1-5) या (बी,  सैफ्रानिन ओ) का आदान-प्रदान किया गया था। (बी) में छवि को संदर्भ26 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। स्केल बार = 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल को क्रिस्टल विकास और इसके निषेध में नई अंतर्दृष्टि प्रकट करने के लिए सूक्ष्म क्रिस्टल के साथ माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह के संयोजन का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एक मिलीकेल्विन-रिज़ॉल्यूशन तापमान-नियंत्रित ठंडा चरण27 माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के अंदर स्थित एकल सूक्ष्म क्रिस्टल के नियंत्रण को सक्षम बनाता है, जिससे उनके चारों ओर समाधानों का आदान-प्रदान होता है। जबकि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का निर्माण मानक है और सामान्य प्रथाओं17,18 के समान है, डिवाइस के अंदर क्रिस्टल के विकास और पिघलने पर नियंत्रण अद्वितीय और नया है। इस प्रणाली में सबसे महत्वपूर्ण घटक शानदार तापमान नियंत्रण है, जो पेल्टियर थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, एक थर्मिस्टर से प्रतिक्रिया जो नमूने के करीब स्थित है, और एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन तापमान नियंत्रक जो प्रतिक्रिया लूप को नियंत्रित करता है।

एक और महत्वपूर्ण कदम समाधान विनिमय है, क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान क्रिस्टल पिघल सकते हैं या बढ़ सकते हैं; इस प्रकार, विकास / पिघलने को रोकने के लिए समाधान विनिमय के दौरान तापमान को समायोजित किया जाना चाहिए। माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में क्रिस्टल का गठन तरल प्रवाह में हस्तक्षेप करता है और इस प्रणाली की मुख्य चुनौती है; इस प्रकार, इन क्रिस्टल के विकास को नियंत्रित किया जाना चाहिए। यहां, एक आईआर लेजर (980 एनएम) उल्टे माइक्रोस्कोप पर लगाया गया था और इसका उपयोग स्थानीय रूप से अवांछित बर्फ / हाइड्रेट क्रिस्टल28 को पिघलाने के लिए किया गया था। यदि इस तरह के लेजर का उपयोग नहीं किया जा सकता है, तो माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के धातु कनेक्टर को एक अतिरिक्त पेल्टियर थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर द्वारा गर्म किया जा सकता है, जो डिवाइस के इनलेट / आउटलेट में बर्फ को पिघला देगा।

यहां वर्णित विधि में घर-विकसित उपकरण (कोल्ड स्टेज) शामिल हैं और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, क्योंकि उपर्युक्त चरणों में से कुछ चुनौतीपूर्ण हैं। चूंकि प्रवाह का इरादा नहीं होने पर भी क्रिस्टल के आसपास के समाधान की एकाग्रता बदल सकती है, एक सरल अंशांकन चरण5 प्रतिदीप्ति संकेत के आधार पर एकाग्रता का एक विश्वसनीय अनुमान प्रदान कर सकता है। अवांछित प्रवाह का एक और संभावित समाधान (टीएच माप के दौरान, उदाहरण के लिए) माइक्रोफ्लुइडिक वाल्व है, जिसे संदर्भ4 में वर्णित किया गया है।

इस प्रणाली काउपयोग एच2 ओ तरल में डी2ओ बर्फ के विकास व्यवहार का पता लगाने के लिए भी किया गया था, एक अध्ययन जिसने सूक्ष्म, स्कैलप्ड बर्फ सतहोंकी एक नई घटना का खुलासा किया। इस प्रकार, माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग विभिन्न क्रिस्टलीय प्रणालियों के अध्ययन में किया जा सकता है जो तापमान परिवर्तनों के लिए अच्छी तरह से प्रतिक्रिया करते हैं।

Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

इस शोध के समर्थन के लिए अमेरिकन केमिकल सोसाइटी पेट्रोलियम रिसर्च फंड के दाताओं को पावती दी जाती है (अनुदान संख्या 60191-यूएनआई 5)। लेखक एंटीफ्ऱीज़ प्रोटीन और बर्फ का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपयोग का नेतृत्व करने के लिए प्रोफेसर इडो ब्रास्लावस्की को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखक प्रोफेसर आर्थर डेव्रीज़, प्रोफेसर कोनराड मिस्टर और प्रोफेसर पीटर डेविस के प्रति आभारी हैं कि उन्होंने एंटीफ्ऱीज़ प्रोटीन नमूने प्रदान किए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22-micron filters Fisher Scientific
90-degree bent blunt needles 18 Gauge
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins A gift See references 5 and 28
Blunt needles 18 Gauge and 20 Gauge
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich
Cold stage Home made
Cover slips Globe Scientific 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness
Glass syringe
Infrared laser 980 nm Opto Engine LLC
Inverted microscope, Eclipse Ti - S Nikon
Invisible tape Staples
lint-free wipe Kimwipes
Newport 3040 temperature controller Newport
NIS-Elements Imaging Software Nikon
Oil vacuum pump Harrick Plasma
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) Dow Corning Syglard
Safranine O Sigma-Aldrich S2255-25G
Sapphire disc Ted Pella Inc 16005-1010  25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness
sCMOS Camera, Neo 5.5 Andor
Tetrahydrofuran (THF) Sigma-Aldrich 401757-100ML
Tygon Microbore tubing for microfluidic device Cole-Parmer  0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll.
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas Cole-Parmer 1/8” ID, 3/16” OD

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References

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रसायन विज्ञान अंक 186
बर्फ और क्लैथरेट हाइड्रेट क्रिस्टलीकरण के अध्ययन के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण
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Drori, R., Shalom, Y. A Microfluidic … More

Drori, R., Shalom, Y. A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization. J. Vis. Exp. (186), e64072, doi:10.3791/64072 (2022).

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