Denne protokollen beskriver krystallisering av mikroskopiske iskrystaller og clathrate hydrater i mikrofluidiske enheter, noe som muliggjør væskeutveksling rundt de dannede krystallene. Dette gir enestående muligheter til å undersøke krystallisasjonsprosessen og bindingsmekanismene til inhibitorene.
En nøyaktig mekanistisk beskrivelse av vannkrystallisering er utfordrende og krever noen få nøkkelelementer: suveren temperaturkontroll for å tillate dannelse av enkeltmikroskopiske krystaller og et passende mikroskopisystem koblet til det kalde stadiet. Metoden beskrevet her legger til en annen viktig funksjon som inkluderer utveksling av løsninger rundt is og clathrate hydratkrystaller. Det beskrevne systemet består av en kombinasjon av unike og hjemmeutviklede instrumenter, inkludert mikrofluidikk, høyoppløselige kalde stadier og fluorescensmikroskopi. Det kalde stadiet ble designet for mikrofluidiske enheter og muliggjør dannelse av is- / hydratkrystaller av mikronstørrelse inne i mikrofluidiske kanaler og utveksling av løsninger rundt dem. Temperaturoppløsningen og stabiliteten til det kalde stadiet er en millikelvin, noe som er avgjørende for å kontrollere veksten av disse små krystallene. Dette mangfoldige systemet brukes til å studere de forskjellige prosessene for is- og hydratkrystallisering og mekanismen der veksten av disse krystallene hemmes. Protokollen beskriver hvordan man tilbereder mikrofluidiske enheter, hvordan man dyrker og kontrollerer mikroskopiske krystaller i de mikrofluidiske kanalene, og hvordan utnyttelsen av væskestrømmen rundt is / hydratkrystaller gir ny innsikt i krystallisering av vann.
Frostvæskeproteiner (AFPs) og frostvæskeglykoproteiner (AFGPs) beskytter ulike kuldetilpassede organismer mot frostskader1. AFPs og AFGPs (generalisert som AF (G) Ps) hemmer veksten av iskrystaller ved å binde seg irreversibelt til overflatene og hemme ytterligere vekst på grunn av Gibbs-Thomson-effekten 2,3,4,5. Det resulterende gapet som dannes mellom smeltetemperaturen, som i stor grad er uendret, og den nylig deprimerte frysetemperaturen kalles termisk hysterese (TH) og representerer en målbar parameter som tilsvarer AFP-aktivitet6. Bruken av AFP for å hemme isvekst har vidtrekkende og varierte applikasjoner, og tilbyr potensiell forbedring på ulike felt, inkludert kryopreservering, frossen matkvalitet og beskyttelse av kaldt eksponerte avlinger.
Krystalliseringen av vann ved lave temperaturer og høyt trykk i nærvær av små organiske molekyler resulterer i dannelse av clathrathydrater (eller gasshydrater), hvor det mest omfattende hydratet er metanhydrat7. Krystallisering av metanhydrater i gass / oljerørledninger kan forårsake plugger, noe som kan forårsake eksplosjoner på grunn av gassantennelse 8,9,10. Nåværende innsats for å forhindre hydratkrystallisering i strømningsrør inkluderer bruk av termodynamiske (alkoholer og glykoler) og kinetiske (hovedsakelig polymerer) hemmere11,12,13,14. AFP har også vist seg å binde seg til clathrate hydratkrystaller og hemme veksten, noe som peker på potensiell bruk av AFP for å hindre dannelsen av plugger, og dermed gi en grønnere løsning15.
Mikrofluidikk er en utbredt metode som brukes til å studere egenskapene til væsker ved små prøvevolumer (ned til fL) som strømmer gjennom et nettverk av mikrokanaler16. Mikrokanalene følger et mønster opprettet på en silisiumskive (formen) ved hjelp av litografi17. Et vanlig materiale for å fremstille mikrofluidiske enheter er polydimetylsiloksan (PDMS), som er billig og relativt enkelt å jobbe med i forskningslaboratorier. Utformingen av funksjonene (kanalene) er sammensatt med hensyn til det spesifikke formålet med enheten; dermed kan den brukes til en rekke applikasjoner, inkludert DNA-sensing18, medisinsk diagnose19 og krystalliseringsprosesser 3,20,21.
Denne protokollen beskriver en unik mikrofluidisk metode for dyrking av is- og hydratkrystaller på mikronstørrelse med forskjellige hemmere, inkludert AFP og AFGP. For disse forsøkene ble tetrahydrofuran (THF) hydrater brukt til å etterligne egenskapene til metangasshydrater22, som krever spesialutstyr for trykk og temperaturkontroll23. Fluorescerende merket AF (G) Ps ble brukt til å visualisere og analysere adsorpsjonen av proteinene til krystalloverflaten, og kombinert med fluorescerende avbildning tillot den mikrofluidiske tilnærmingen oppnåelse av nøkkelegenskaper ved bindingsprosessen av disse molekylene til krystalloverflater.
Denne protokollen ble designet for å utnytte kombinasjonen av mikrofluidisk strømning med mikroskopiske krystaller for å avsløre ny innsikt i krystallvekst og dens inhibering. Et temperaturkontrollert kuldetrinn27 med millikelvinoppløsning muliggjør kontroll av enkeltmikroskopiske krystaller som ligger inne i mikrofluidiske kanaler, og tillater dermed utveksling av løsninger rundt dem. Mens fabrikasjon av mikrofluidiske enheter er standard og ligner på vanlig praksis17,18, er kontrollen over vekst og smelting av krystaller inne i enheten unik og ny. Den mest kritiske komponenten i dette systemet er den suverene temperaturkontrollen, som oppnås ved å bruke Peltier termoelektriske kjølere, tilbakemelding fra en termistor som ligger nær prøven, og en høyoppløselig temperaturregulator som styrer tilbakemeldingssløyfen.
Et annet kritisk skritt er selve løsningsutvekslingen, da krystallene kan smelte eller vokse under denne prosessen; Temperaturen må derfor justeres under løsningsutvekslingen for å hindre vekst/smelting. Dannelsen av krystaller i mikrofluidiske kanaler forstyrrer væskestrømmen og utgjør hovedutfordringen i dette systemet; Dermed må veksten av disse krystallene kontrolleres. Her ble en IR-laser (980 nm) montert på det inverterte mikroskopet og ble brukt til å lokalt smelte uønsket is / hydratkrystaller28. Hvis en slik laser ikke kan brukes, kan metallkontaktene til den mikrofluidiske enheten oppvarmes av en ekstra Peltier termoelektrisk kjøler, som vil smelte isen i innløpet / utløpet til enheten.
Metoden beskrevet her inkluderer hjemmeutviklede instrumenter (cold stage) og krever trening, da noen av de ovennevnte trinnene er utfordrende. Siden konsentrasjonen av løsningen som omgir krystallene kan endres selv når strømmen ikke er ment, kan et enkelt kalibreringstrinn5 gi en pålitelig estimering av konsentrasjonen basert på fluorescenssignalet. En annen mulig løsning på uønsket strømning (for eksempel under TH-målinger) er mikrofluidiske ventiler, som er beskrevet i referanse4.
Dette systemet ble også brukt til å utforske vekstoppførselen til D 2O-is i H2O-væske, en studie som avslørte et nytt fenomen med mikroskopiske, kamskjellede isflater27. Dermed kan mikrofluidikk brukes i studiet av forskjellige krystallinske systemer som reagerer godt på temperaturendringer.
The authors have nothing to disclose.
Giverne av American Chemical Society Petroleum Research Fund gis en bekreftelse på støtte til denne forskningen (Grant number 60191-UNI5). Forfatterne vil gjerne takke prof. Ido Braslavsky for banebrytende bruk av mikrofluidiske enheter for å studere frostvæskeproteiner og is. Forfatterne er takknemlige for prof. Arthur DeVries, prof. Konrad Meister og prof. Peter Davies for å gi frostvæskeproteinprøver.
0.22-micron filters | Fisher Scientific | ||
90-degree bent blunt needles | 18 Gauge | ||
Antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins | A gift | See references 5 and 28 | |
Blunt needles | 18 Gauge and 20 Gauge | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | ||
Cold stage | Home made | ||
Cover slips | Globe Scientific | 18 X 18 mm, 0.14 mm thickness | |
Glass syringe | |||
Infrared laser 980 nm | Opto Engine LLC | ||
Inverted microscope, Eclipse Ti – S | Nikon | ||
Invisible tape | Staples | ||
lint-free wipe | Kimwipes | ||
Newport 3040 temperature controller | Newport 3040 | ||
NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
Oil vacuum pump | Harrick Plasma | ||
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
Polydimethylsiloxane (Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer kit) | Dow Corning Syglard | ||
Safranine O | Sigma-Aldrich | S2255-25G | |
Sapphire disc | Ted Pella Inc | 16005-1010 | 25.4 mm diameter, 0.3 mm thickness |
sCMOS Camera, Neo 5.5 | Andor | ||
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-100ML | |
Tygon Microbore tubing for microfluidic device | Cole-Parmer | 0.020" ID, 0.060"OD, 100 ft/roll. | |
Tygon tubing for water circulation and nitrogen gas | Cole-Parmer | 1/8” ID, 3/16” OD |