Summary
Apresentamos aqui um método/instalação econômico e transportável para medir a produtividade primária de tapetes microbianos sob condições reais de temperatura e luz ambiente in situ . A configuração experimental é baseada em materiais amplamente disponíveis e pode ser usada sob várias condições, oferecendo as vantagens dos modelos baseados em laboratório.
Abstract
A medição da produtividade primária in situ do perifíton durante o gradiente da estação de crescimento pode elucidar o efeito quantitativo dos fatores ambientais (principalmente concentração de fósforo e intensidade luminosa) e da composição das espécies na produtividade primária. A produtividade primária é impulsionada principalmente pela intensidade da luz, temperatura, disponibilidade de nutrientes e distribuição das espécies iônicas do sistema carbonatado nas respectivas profundidades da zona eufótica. É um sistema complexo que é muito difícil de simular em laboratório. Esta barcaça flutuante barata, transportável e fácil de construir permite medir a produtividade primária com precisão diretamente sob as condições naturais reais. A metodologia baseia-se na medição da produtividade primária em tempo real usando sensores de oxigênio não invasivos integrados em frascos de vidro bem fechados, permitindo o monitoramento on-line do fluxo de oxigênio e fornecendo novos insights sobre as atividades metabólicas. Medições sazonais detalhadas in situ da produtividade primária bruta de tapetes microbianos (ou outros organismos bentônicos) podem melhorar o conhecimento atual dos processos que controlam a dinâmica da produtividade primária em águas lênticas.
Introduction
A produtividade primária é a única entrada de carbono autóctone nos sistemas aquáticos que formam toda a teia alimentar do sistema1. Assim, a estimativa precisa da produtividade primária é um passo essencial para a compreensão do funcionamento dos ecossistemas aquáticos. As zonas litorâneas são áreas de alta produtividade primária e biodiversidade. Além do fitoplâncton, presume-se que o perifíton (doravante denominados tapetes microbianos) e as macroalgas contribuam significativamente para a produtividade primária nas zonas litorâneas2. Devido ao seu estilo de vida séssil e heterogeneidade espacial significativa, a quantificação da produtividade primária não é trivial.
A produtividade primária é impulsionada principalmente pela intensidade da luz, temperatura, disponibilidade de nutrientes e distribuição das espécies iônicas do sistema carbonatado nas respectivas profundidades das zonas eufóticas 3,4. A profundidade influencia marcadamente a distribuição espacial dos tapetes microbianos. As comunidades microbianas devem lidar com os efeitos adversos da alta irradiação e das variações sazonais pronunciadas de temperatura em profundidades rasas e com menor intensidade de luz em profundidades maiores. Além do gradiente de profundidade, as interações tróficas dinâmicas geram padrões espaciais múltiplos e complexos em diferentes escalas5. Este sistema complexo é complicado de simular em laboratório. A maneira mais precisa de inferir a atividade metabólica de produtores primários individuais de zonas litorâneas é estabelecer experimentos in situ.
A metodologia introduzida neste trabalho baseia-se no método tradicional de câmara 2,6,7, juntamente com uma barcaça flutuante transportável e de fácil construção e de baixo custo. Isso permite a medição da produtividade primária em diferentes profundidades sob o espectro de luz natural, temperatura e distribuição diferente das espécies iônicas do sistema de carbonato com a profundidade. O método baseia-se no princípio do oxigênio claro versus escuro da garrafa, que foi empregado pela primeira vez para medir a fotossíntese do fitoplâncton 6 e ainda é comumente utilizado 6,7. Compara a taxa de variação do oxigênio em garrafas mantidas à luz (o que inclui os efeitos da produtividade primária e da respiração) com aquelas mantidas no escuro (apenas respiração)8. O método utiliza a evolução do oxigênio (fotossíntese) como proxy para a produtividade primária. As variáveis medidas são a produtividade líquida do ecossistema (NEP, como uma mudança na concentração de O 2 ao longo do tempo em condições de luz) e a respiração do ecossistema (RE, como uma mudança na concentração de O2 ao longo do tempo no escuro). A produtividade bruta do ecossistema (GEP) é o cálculo da diferença entre os dois (Tabela 1). O termo "ecossistema" é usado aqui para denotar que o perifíton é composto de organismos autotróficos e heterotróficos. A melhoria mais significativa deste método de câmara tradicional é o uso de sensores ópticos de oxigênio não invasivos e a otimização deste método principalmente planctônico para medir a produtividade primária perifítica.
A técnica é descrita no exemplo de medição de tapetes microbianos na zona litorânea de lagos pós-mineração recém-surgidos na República Tcheca-Milada, Most e Medar. A atividade metabólica dos tapetes microbianos é determinada usando a medição direta in situ dos fluxos de O2 realizada diretamente em profundidades específicas, onde as comunidades estudadas ocorrem naturalmente. A atividade heterotrófica e fototrófica é medida em garrafas de vidro fechadas equipadas com sensores ópticos de oxigênio não invasivos. Esses sensores detectam a pressão parcial de oxigênio usando a fluorescência de corantes sensíveis à luz. As garrafas com tapetes microbianos são suspensas e incubadas em um dispositivo flutuante nas profundidades apropriadas. A concentração de oxigênio dentro das garrafas foi medida continuamente durante o período de luz do dia a partir do pequeno barco.
Amostras de tapetes microbianos intactos são coletadas e colocadas em garrafas de incubação à prova de gás em profundidades designadas por mergulhadores. Cada garrafa é equipada com um microssensor óptico de oxigênio não invasivo, que monitora a produtividade/consumo de O2 ao longo do tempo. Todas as medições são feitas em cinco pares escuros/claros replicados em cada profundidade. As intensidades de temperatura e radiação fotossinteticamente ativa (PHAR) são medidas nas respectivas profundidades ao longo da incubação. Após 6 h de incubação in situ (horas de luz do dia), os tapetes microbianos são colhidos das garrafas e secos. Os fluxos O2 são normalizados para biomassa microbiana. Como controle, os fluxos são corrigidos para mudanças na concentração de O2 em garrafas separadas à prova de gás claro e escuro (controles em branco) contendo água do lago sem biomassa de esteira microbiana. Abaixo estão as instruções detalhadas para construir a barcaça flutuante e realizar todo o experimento passo a passo. Este trabalho também apresenta resultados representativos das medidas de tapetes microbianos em duas profundidades (1 m e 2 m), com cinco repetições em cada profundidade. A temperatura real e a intensidade da luz foram medidas durante todo o experimento usando dataloggers.
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Protocol
NOTA: Antes da amostragem, determine o grau de replicações com base nas necessidades gerais do projeto, no desenho estatístico ou na quantidade esperada de variabilidade da amostra. Cinco pares replicados de frascos de incubação clara e escura são sugeridos para análise estatística precisa e para explicar a potencial perda ou quebra da amostra. A barcaça experimental flutuante descrita é projetada para transportar cinco repetições mais um par de controles em branco; ver figura 1 para um desenho técnico da barcaça experimental.
Figura 1: Desenhos técnicos da barcaça experimental e do flutuador lateral. (A) Vista superior: a estrutura da barcaça consiste em quatro peças de perfil L de ângulo de alumínio (azul) que são unidas por quatro barras planas de alumínio (cinza). Os flutuadores XPS (rosa) são montados no quadro em dois pontos, cada um nas peças paralelas de alumínio. Correntes para garrafas de incubação são fixadas à estrutura em ambos os lados usando ganchos de encaixe em furos pré-perfurados (setas vermelhas) com 550 mm de separação entre eles. As correntes foram providas de ganchos de encaixe a distâncias de 1 m e 2 m para fixação do frasco de incubação (escolha a posição dos ganchos de encaixe de acordo com a profundidade experimental). A âncora de concreto é presa à proa da barcaça, onde uma saliência de 25 mm permite que dois furos pré-perfurados (pontas de flechas amarelas) sirvam como um ponto de fixação para a corrente da âncora e o navio de pesquisa. O quadro é montado ou desmontado facilmente através das juntas paralelas entre as quatro peças angulares de alumínio (pontas de seta verdes). (B) A vista lateral mostra as correntes suspensas com garrafas de incubação suspensas e âncora de concreto (quadrado marrom). (C) O flutuador XPS lateral: Parallelaluminum ângulo L peças (azul) são unidas por barras planas verticais de alumínio (cinza). Abaixo da seção da barra transversal, o flutuador XPS (rosa) é montado com os tamanhos de furo necessários indicados (4 mm). As correntes suspensas são presas com ganchos de encaixe em orifícios de 8 mm (ponta de seta vermelha). Na proa da barcaça, dois furos de 8 mm são perfurados no alumínio suspenso, um para prender a âncora à barcaça (ponta de flecha amarela) e outro para ancorar o navio de pesquisa à barcaça (azul). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Construção da barcaça experimental
NOTA: A barcaça flutuante consiste em duas seções iguais montadas juntas, permitindo fácil montagem/desmontagem. Todas as peças usadas podem ser compradas em qualquer mercado de hobby ou loja que venda materiais de construção.
- Primeiro, monte a estrutura da barcaça unindo quatro peças de perfil L angulares de alumínio (40 mm x 40 mm x 3 mm; comprimento de 2.000 mm) usando quatro barras planas de alumínio (40 mm x 3 mm x 350 mm), 16 parafusos (4 mm x 15 mm com porcas hexagonais) e 32 arruelas (4 mm x 10 mm).
NOTA: A distância e a posição das barras planas são mostradas no desenho técnico da Figura 1A. A fixação detalhada dos flutuadores às barras planas laterais é mostrada na Figura 1B. - Para unir as duas seções iguais do quadro, use quatro parafusos de 4 mm x 15 mm com porcas de asa e oito arruelas de 4 mm x 10 mm para parafusar os perfis L angulares de alumínio nas extremidades (Figura 1A, setas verdes).
- Use cinco peças de material de poliestireno extrudado (XPS) (500 mm x 200 mm x 150 mm), dez parafusos de 10 mm x 170 mm com porcas hexagonais e vinte arruelas de 10 mm x 50 mm para preparar cinco flutuadores de poliestireno extrudado (500 mm x 200 mm x 150 mm cada). Fixe os flutuadores ao quadro em cinco pontos mostrados no desenho técnico (Figura 1A).
- Faça furos no quadro (consulte as setas vermelhas na Figura 1A marcando as posições e distâncias dos furos para as correntes). Fixar as correntes de aço de 12 m (diâmetro do fio de 3 mm, elo interno de 5,5 mm x 26 mm) para os frascos de incubação aos orifícios no quadro usando ganchos de carabina de aço (50 mm x 5 mm). Fornecer a cada corrente pares de ganchos de encaixe (50 mm x 5 mm) para instalar os frascos de incubação na profundidade desejada de acordo com o projeto experimental. Neste caso, eles estavam sentados a 1 m e 2 m de profundidade.
- Para a âncora, encha a caçamba de 15 L com concreto. Insira um parafuso ocular no concreto e deixe-o secar sem ser perturbado. Prenda a corrente de aço de 5 m ao gancho. Prenda a âncora ao orifício pré-perfurado na proa da barcaça (marcado por setas amarelas na Figura 1A,B).
NOTA: Os desenhos técnicos com a descrição da montagem são mostrados na Figura 1A-C. A Figura 2 mostra a foto da barcaça experimental montada. A Figura 3 mostra a fixação dos frascos de incubação à cadeia.
Figura 2: Barcaça experimental montada. Fotografia da barcaça experimental montada. As pontas de seta vermelhas mostram os orifícios para a fixação de correntes com garrafas de incubação. As pontas de seta verdes apontam para onde as duas metades do flutuador estão unidas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Garrafas de incubação. Foto de dois pares de garrafas de incubação escuras e claras penduradas a uma profundidade de 1 m. Um par de frascos contém a amostra de tapetes microbianos intactos ainda crescendo na pedra (ponta de seta vermelha). A segunda é a garrafa em branco com a água do lago da respectiva profundidade. Uma ponta de seta amarela aponta para o ponto do sensor de oxigênio anexado à parede interna da garrafa de incubação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Instalação em campo
- O uso de um caiaque inflável é sugerido para colocação de barcaças e realização de experimentos, pois é facilmente transportável.
- Selecione um local com uma profundidade ideal para ancorar o flutuador. Escolha a profundidade para que as garrafas de incubação inferiores estejam pelo menos 2 m acima do fundo para evitar perturbar o sedimento na coluna de água ao redor das garrafas de incubação.
- Prenda a barcaça montada atrás da popa do barco. Abaixe cuidadosamente a âncora ao longo do lado do barco e alinhe-a de modo que ela fique ligeiramente abaixo da superfície da água, de modo que a flutuação possa ser facilmente rebocada junto com a âncora para o local com a profundidade necessária.
- Desamarre a âncora do barco, abaixe-a até o fundo e prenda a barcaça à corrente da âncora.
- Prenda as correntes para prender as garrafas de incubação à barcaça.
3. Preparação do frasco de incubação
- Use as garrafas transparentes de 0,5 L de gargalo largo com vedações à prova de gás.
NOTA: É possível ajustar o tamanho das garrafas, mas lembre-se de aumentar a flutuação da barcaça com mais folhas de poliestireno também. A barcaça descrita aqui pode transportar de forma confiável 24 garrafas de vidro de 0,5 L. - Fixe os pontos do sensor óptico de oxigênio na parede interna de cada garrafa.
- Adicione uma camada opaca aos frascos de tratamento escuros, envolvendo-os com fita adesiva preta.
- Corte um pequeno orifício no local com o sensor óptico. Para evitar que a luz entre na garrafa, faça o orifício um pouco menor do que o diâmetro do sensor.
NOTA: Qualquer camada opaca que impeça a entrada de luz na garrafa também funcionará. A vantagem da fita elétrica preta é que ela resiste à abrasão e não descasca na água.
4. Recolha e manuseamento de amostras
NOTA: Os mergulhadores realizam a coleta manual de amostras em águas mais profundas. Em águas rasas, pode ser feito por snorkeling ou vadiagem.
- Coloque os frascos de incubação na caixa portátil.
- Mergulhe com a caixa até a respectiva profundidade. Evite perturbar os sedimentos na água circundante.
- Encha cuidadosamente os frascos de incubação com as amostras. Tente perturbar a biomassa da amostra o mínimo possível, por exemplo, usando pinças longas. Se os tapetes microbianos crescerem em uma superfície sólida, como uma pequena pedra, transfira cuidadosamente toda a pedra com biomassa intacta para a garrafa.
NOTA: Evite coletar pedras grandes quando os tapetes de amostragem crescerem em pedras - as garrafas de vidro podem ser quebradas durante a manipulação adicional. - Encha um par de garrafas claras / escuras com água limpa das respectivas profundidades para servir como controles em branco.
NOTA: Os frascos sem a amostra de perifíton servem como um controlo que determina a produção/consumo de oxigénio dos organismos de água ambiente. Assegura que a produtividade primária líquida ou bruta calculada do perifíton é imparcial. - Certifique-se de que a água em todas as garrafas de incubação esteja limpa e não contenha sedimentos perturbadores.
- Feche as garrafas e leve-as para o barco ancorado na barcaça flutuante.
5. Medir a produtividade primária
NOTA: A pessoa sentada no barco pega a caixa do mergulhador e executa as seguintes etapas.
- Prenda os dois primeiros pares de garrafas de incubação aos ganchos de encaixe na primeira corrente.
- Meça a concentração inicial de oxigênio em cada garrafa usando o medidor de oxigênio de fibra óptica. Ligue o cabo óptico do contador ao sensor de oxigénio montado no interior do frasco e leia imediatamente (dentro de alguns segundos) a concentração de O2 sem contacto (através da parede do frasco). Registre o valor medido.
NOTA: O tempo de manuseio é curto; desde levar as garrafas dos mergulhadores até a configuração inicial até a respectiva profundidade, leva apenas alguns minutos. - Imediatamente depois, abaixe cuidadosamente a corrente com as garrafas presas de volta à água. Certifique-se de que as garrafas de incubação sejam colocadas na mesma profundidade que a biomassa que foi colocada nelas foi amostrada.
- Faça outra medição do navio após 1 h (ver NOTA abaixo). Puxe cuidadosamente cada corrente com as garrafas para o barco, leia o valor do oxigênio anexando o cabo óptico ao sensor e abaixe as amostras na água novamente.
NOTA: Ajustar o tempo entre as medições individuais durante a incubação de acordo com a intensidade da produtividade/consumo de O2 das amostras para evitar a sobresaturação dos frascos. - Repita este procedimento pelo menos quatro ou cinco vezes com todos os pares de garrafas.
NOTA: Toda a configuração do experimento no campo é mostrada na Figura 4.
Figura 4: Esquema da configuração experimental em campo. Ilustração da barcaça experimental ancorada na superfície do lago. Os frascos de incubação (0,5 L) com biomassa de esteira microbiana são pendurados em duas profundidades diferentes (1 m e 2 m). Os mergulhadores coletaram amostras de tapetes microbianos diretamente nas garrafas de incubação nas profundidades apropriadas. A concentração de oxigênio em garrafas individuais é medida a partir do navio. As garrafas são retiradas da água. O valor da concentração de oxigênio é medido em poucos segundos conectando um cabo óptico ao sensor de oxigênio. As garrafas são então cuidadosamente abaixadas de volta para a água. Todo o procedimento de medição de dois pares de garrafas de incubação a partir de duas profundidades leva ~ 2 min. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Análises de amostras
- Após o término das medições, retire as amostras diretamente das garrafas e transfira a biomassa do tapete microbiano para os pequenos frascos de plástico. Se as esteiras crescerem em substratos sólidos (por exemplo, pedras), esfregue-as com uma escova de dentes ou uma pequena faca.
- No laboratório, filtrar cada replicação através de filtros de fibra de vidro pré-pesados para determinar o peso seco9.
7. Análise dos dados
- Durante o período de incubação, meça a concentração de oxigênio nas garrafas claras e escuras e compare-a com a concentração de oxigênio na coluna de água quando as garrafas estiverem cheias.
NOTA: A mudança no oxigênio na garrafa de luz ao longo do tempo é o resultado combinado da produtividade bruta do ecossistema (GEP) e da respiração por todos os organismos na garrafa (autótrofos e heterótrofos da água ambiente e da comunidade perifítica). A diminuição do oxigênio na garrafa escura mede as perdas respiratórias de autótrofos e heterótrofos. A mudança na concentração de oxigênio no controle (ou seja, garrafas sem o perifíton) é apenas o produto de organismos heterotróficos ou autotróficos na água ambiente. A produtividade e a respiração do perifíton foram estimadas subtraindo-se a produtividade da água ambiente e a respiração medida em garrafas de incubação em branco. - Observe a concentração de O2 em porcentagem de saturação de oxigênio (ou seja, calibre os sensores de oxigênio para 0% e 100% de saturação de oxigênio). Antes de estimar a produtividade primária, converta os dados brutos (
) em alguma unidade razoável.
NOTA: Neste estudo, os dados são convertidos em mmol de O2 por grama de matéria orgânica (MO) da massa de perifítons na base de peso seco, de acordo com Benson e Krause10.- Calcule a conversão usando a equação (1):
(1)
Onde Cp é Aconcentração de O 2 em água (mg (O 2) L-1) quando está totalmente saturada por O 2, VBottle é o volume da garrafa em mL, VStones é o volume ocupado pela pedra em mL, é o peso da massa de perifíton em g, e 32 é o peso molar de O 2. - Calcule Cp usando a equação (2):
(2)
Onde Cs é a concentração padrão de O2, P é a pressão atmosférica na superfície do lago, Pw é a pressão parcial do vapor de água na superfície do lago e ω é a densidade da água. - Calcular Cs, ω, P e Pw a partir de equações empíricas previamente definidas (3-6) quando a elevação do lago (h em km) e a temperatura da água na superfície do lago (t em °C) são conhecidas:
(3)
(4)
(5)
(6)
NOTA: A partir das equações (1-6), é evidente que a concentração de O2 calculada é mais precisa para profundidades rasas. À medida que a profundidade aumenta, a concentração calculada fica mais tendenciosa em termos de concentração absoluta. É ideal quando a taxa de mudança da concentração de oxigênio ao longo da profundidade é conhecida para cada lago, de modo que a concentração absoluta de O2 possa ser corrigida, se necessário. Uma vez que a concentração de O 2 é calculada, sua mudança ao longo do tempo pode ser usada para calcular dois fluxos diferentes de O2 em duas condições diferentes. Em condições de luz, a produtividade líquida do ecossistema (NEP) é diretamente proporcional à mudança na concentração de O2 ao longo do tempo (ver abaixo). O termo "ecossistema" é usado aqui para denotar que o perifíton é composto de organismos autotróficos e heterotróficos. No escuro, a mudança na concentração de O2 ao longo do tempo é proporcional à soma das perdas respiratórias de organismos autotróficos e heterotróficos, definindo assim a respiração do ecossistema (OD). A diferença entre NEP e RE define a produtividade bruta do ecossistema (GEP). Se as perdas respiratórias da parte heterotrófica da comunidade forem insignificantes, o GEP torna-se igual à produtividade bruta do ecossistema.
- Calcule a conversão usando a equação (1):
- Determinar a taxa de mudança da concentração de O2 ao longo do tempo por regressão polinomial de terceiro grau, como mostrado na equação (7).
(7)
Onde A 0 é Aconcentração de O 2 no tempo zero e A 1-A2 são coeficientes de regressão polinomial.
NOTA: A função polinomial é usada porque pode servir como uma aproximação de qualquer equação diferencial. Assim, não é necessário conhecer a relação funcional precisa entre a concentração de O2 e o tempo. Portanto, qualquer suposição associada à relação funcional (por exemplo, linearidade) não precisa ser controlada. Por definição, o segundo termo da regressão polinomial, A 1 define a taxa de variação da concentração de O 2 no tempo zero (ou seja, taxa instantânea), que é independente de A0 e, portanto, a concentração absoluta de O2 no tempo zero. Por essa razão, a estimativa do fluxo de O 2 não é afetada pelo viés nos cálculos absolutos de concentração de O2 causados pela mudança de pressão ao longo do gradiente de profundidade. A 1 tem unidades O2 (mmol g(OM)-1) por tempo (1 h neste estudo).- Calcular A1, calculado separadamente para garrafas com e sem exposição à luz e contendo biomassa microbiana (ou seja, V Stones > 0) e para garrafas de controle com e sem exposição à luz e contendo água livre (ou seja, V Stones = 0).
NOTA: Atribuindo essas diferentes notações
de coeficientes de regressão , , , e 
, respectivamente, 
a equação (8) para o cálculo GEP de produtividade pode ser escrita como:
(8.1)
(8.2)
(8.3)
O termo define a produtividade líquida do ecossistema (Figura 5A; ou seja, produtividade líquida de oxigênio), e o termo
representa a soma da respiração autotrófica e heterotrófica (Figura 5B; RE, ou seja, assumindo que ambas as respirações são semelhantes sob condições escuras e claras). - Subtraia R da NEP para obter GEP (Figura 5C).
NOTA: A equação (8) assume implicitamente que e são ambos positivos, e são ambos negativos. Se for positivo, verifique os dados brutos cuidadosamente para outliers. pode ser teoricamente negativo porque as perdas respiratórias causadas pela atividade heterotrófica podem ser maiores do que a atividade fotossintética.
- Calcular A1, calculado separadamente para garrafas com e sem exposição à luz e contendo biomassa microbiana (ou seja, V Stones > 0) e para garrafas de controle com e sem exposição à luz e contendo água livre (ou seja, V Stones = 0).
) em alguma unidade razoável.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
de coeficientes de regressão , , , e 
, respectivamente, 
a equação (8) para o cálculo GEP de produtividade pode ser escrita como:
(8.1)
(8.2)
(8.3)
representa a soma da respiração autotrófica e heterotrófica (Figura 5B; RE, ou seja, assumindo que ambas as respirações são semelhantes sob condições escuras e claras).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 5: Produtividade líquida e bruta do ecossistema de tapetes microbianos durante o dia. (A) Produtividade do ecossistema líquido de garrafas leves: dados de curso temporal da produtividade líquida de oxigênio de tapetes microbianos das garrafas leves. A mudança da concentração de oxigênio nos frascos de incubação foi medida após 1 h durante o dia. Círculos cinzentos: garrafas com amostras de tapetes microbianos. Círculos brancos: garrafas em branco apenas com água do lago. (B) Respiração escura do frasco: a soma da respiração autotrófica e heterotrófica das garrafas escuras. A mudança na concentração de oxigênio em garrafas de incubação foi medida após 1 h durante o período diurno. Círculos cinzentos: garrafas com amostras de tapetes microbianos. Círculos brancos: garrafas em branco apenas com água do lago. (C) Comparação da produtividade líquida do ecossistema, respiração e produtividade bruta do ecossistema: subtraindo as taxas de respiração das taxas líquidas de produtividade do ecossistema resulta na produtividade bruta do ecossistema da biomassa dos tapetes microbianos. Abreviaturas: NEP = produtividade líquida do ecossistema; OD = respiração; GEP = produtividade bruta do ecossistema. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Um esquema para a configuração experimental de barcaças flutuantes e garrafas de incubação é mostrado na Figura 1, Figura 2 e Figura 3. A Figura 4 demonstra como o experimento pode ser configurado em campo. A Figura 5 mostra o conjunto de dados representativos utilizado para calcular a produtividade líquida e bruta final do ecossistema. Na Figura 5A, a mudança na concentração de O 2 (ou seja, recalculada para mmol (O2) g(OM)-1) ao longo do tempo é mostrada para garrafas com (denotado como "amostra") ou sem (denotado como "controle") os tapetes microbianos que foram expostos à luz. O aumento da concentração de O2 é aparente tanto no controlo como na amostra. No entanto, a inclinação do aumento é significativamente maior em garrafas com esteiras microbianas. Ele mostra que o sinal da atividade do tapete microbiano é detectável contra o fundo.
O mesmo se aplica aos dados das garrafas mantidas no escuro, que são mostrados na Figura 5B. Neste caso, no entanto, a inclinação da concentração de O2 muda ao longo do tempo no controle não é significativamente diferente de zero. A Figura 5C mostra os produtos dos dados mostrados na Figura 5A,B, a produtividade líquida do ecossistema (NEP) e a respiração (RE), respectivamente. Por definição, o primeiro deve ser positivo e o segundo negativo. Os dados estão bem de acordo com a definição. A soma de NPP e RE é então a produtividade bruta do ecossistema (GEP). Observe que o erro de GEP aumenta porque é a raiz quadrada das somas quadradas de erros calculadas para NEP e RE. Cada evento de medição produz uma série de concentrações de O2 ao longo do dia para cada uma das garrafas de incubação monitoradas, que é a base para estimar a produtividade líquida e bruta do ecossistema. A Figura 5A mostra os dados do curso temporal da produtividade líquida de oxigênio (fotossíntese e respiração) de tapetes microbianos das garrafas de luz. A Figura 5B mostra os dados do curso temporal da respiração de tapetes microbianos de garrafas escuras. Subtraindo as taxas de respiração da produtividade líquida do ecossistema obtém-se as taxas de produtividade bruta do ecossistema (Figura 5C). A Figura 6 apresenta os resultados obtidos a partir da aplicação prática do método em campo. A produtividade bruta do ecossistema da comunidade perifítica foi medida em três lagos pós-mineração na República Tcheca durante a temporada de vegetação.
Figura 6. Produtividade bruta do perifíton em três lagos pós-mineração. Exemplo de variação sazonal da produtividade bruta do ecossistema (GEP) da biomassa de perifítons em três lagos pós-mineração na República Tcheca (Milada, Most, Medard). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Estimar | |||
| Unidade experimental | O2 proxy de fluxo | μmol O2 g OM-1 h-1 | SE |
| Garrafa leve | Produtividade líquida do ecossistema (NEP) | 38.6 | 1.98 |
| Garrafa escura | Respiração do ecossistema (ER) | -18.1 | 2.3 |
| Produtividade bruta do ecossistema (GEP) | 53.8 | 13.6 | |
Tabela 1: Um quadro resumido de resultados. Os resultados da regressão linear foram calculados como média e erro padrão. Valores médios de estimação de cinco repetições de frascos de incubação escuros e claros. SE = erro padrão.
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Discussion
A metodologia descrita neste trabalho baseia-se no princípio da técnica de oxigênio em garrafa clara e escura em combinação com a técnica não invasiva de medição da concentração de O2 usando sensores ópticos de oxigênio. Este sistema permite a medição paralela de diferentes configurações de incubação, pois a fibra óptica para medir O2 pode ser movida rapidamente de garrafa para garrafa. As comunidades bentônicas de várias profundidades podem diferir em composição taxonômica e produtividade; medi-los simultaneamente de forma paralela pode economizar tempo e tornar os resultados mais precisos, permitindo o cálculo de perfis de profundidade total onde o perifíton cresce. Sensores de oxigênio não invasivos integrados em frascos de agitação permitem o monitoramento do fluxo de oxigênio em tempo real.
A configuração experimental projetada permite a medição da produtividade primária de comunidades microbianas nas respectivas profundidades onde as comunidades ocorrem naturalmente, o que é difícil de simular em laboratório (pressão apropriada, rastrear as mudanças no curso diurno de temperatura e intensidade de luz in situ, disponibilidade de nutrientes diferentes). As principais melhorias no método proposto são a não invasividade, o custo-efetividade e a possibilidade de múltiplas medições simultâneas em um único local de coordenadas próximo ao local de coleta da amostra. O método é ecologicamente correto, pois todos os materiais podem ser usados repetidamente. Ele também permite a coleta de grandes conjuntos de dados sem despesas adicionais. A introdução de sondas O 2 altamente sensíveis (ou seja, limite de detecção de 15 ppb, resolução de 0,1% de 0,04 mg O2 L-1) também desloca o uso do método para ambientes aquáticos menos produtivos.
No entanto, o método proposto também apresenta limitações que estão associadas à natureza do arranjo experimental. A primeira limitação é a possibilidade de supersaturação O2 das garrafas fechadas. Isso ocorre especialmente durante os dias ensolarados se a biomassa altamente produtiva for incubada. Pode resultar em uma subestimação da fotossíntese causada pela dissolução incompleta de O2 na água7. Altas concentrações de O2 também podem desativar o PSII11. Para evitar a supersaturação, experimentos preliminares focados na otimização da quantidade de biomassa são fortemente recomendados. Em segundo lugar, a troca de gases produzidos pode ser limitada pela espessa camada limite difusiva do tapete perifítico. Juntamente com as condições estagnadas dentro das garrafas de incubação, pode levar à subestimação da produtividade. No entanto, no âmbito da metodologia descrita, as garrafas de incubação são manipuladas a cada hora quando retiradas da água durante o tempo de medição e abaixadas naquela época. Durante a incubação, a comunidade autotrófica também pode se tornar limitada pelo carbono inorgânico dissolvido (DIC), causando uma desaceleração na produção. Portanto, o aumento de O2 não é linear ao longo de todo o tempo de incubação. Normalmente, o problema é resolvido selecionando apenas a região linear da relação O2 com o tempo para o cálculo da taxa. Aqui, usamos uma regressão polinomial de terceiro grau, que serve como uma aproximação de qualquer função diferenciável que defina a taxa de mudança de O2 ao longo do tempo. Permite o cálculo da taxa de variação no tempo zero; portanto, a comunidade ainda não está limitada pelo DIC no tempo zero.
Estudos têm demonstrado que é necessária uma agitação mínima para homogeneização de gases entre tapetes perifíticos e água sobrejacente12. Em ambientes lênticos, a hidrodinâmica das zonas litorâneas não é forte de qualquer maneira, de modo que misturar a água dentro da garrafa de incubação durante as medições individuais pode ser um compromisso suficiente para os processos naturais de homogeneização. Outro passo problemático é retirar a amostra perifítica do contexto físico do fundo, o que pode levar à alteração da exposição à luz e da penetração de gás no tapete. A quantidade de iluminação do perifíton pode ser ligeiramente modulada, especialmente nas bordas dos tapetes coletados. No entanto, os organismos fotossintéticos enfrentam naturalmente flutuações de intensidade luminosa, por isso são adaptados para manter tais mudanças13,14. Para evitar um maior grau de perturbação, recomenda-se amostrar cuidadosamente um pedaço compacto do tapete perifítico para incubação. As amostras podem ser expostas a uma radiação mais intensa quando são retiradas da água durante as medições. No entanto, o tempo de incubação das garrafas nas respectivas profundidades é muito maior do que o tempo necessário para realizar a leitura da concentração de O2. O tempo de incubação é de 4 h, e uma leitura leva aproximadamente 30 s.
O método apresentado foi inventado para os ecossistemas de água lentica. Também pode ser usado em águas correntes, mas alguns problemas técnicos menores devem ser resolvidos. Em água corrente, as garrafas de incubação podem ser quebradas mais facilmente e ancorar todo o sistema seria um desafio no fluxo. No entanto, mesmo em água estagnada, as garrafas de incubação devem ser manuseadas com cuidado para que não se quebrem durante a manipulação. Atenção especial deve ser dada se os frascos de incubação incluírem esteiras microbianas que crescem em pedras. É fundamental não provar pedras grandes para evitar quebrar as garrafas de vidro.
Conforme observado na seção 7 do protocolo, o método descrito fornece estimativas da produtividade líquida do ecossistema, da taxa de respiração do ecossistema e da produtividade bruta do ecossistema do produto. Neste método, as taxas de respiração de partes heterotróficas e autotróficas da comunidade microbiana não podem ser distinguidas. Assim, a produtividade bruta do ecossistema é menor do que a produtividade primária bruta por uma taxa igual à respiração heterotrófica. Portanto, esse método não é diretamente comparável ao método frequentemente utilizado de estimativa de produtividade primária por marcação de isótopos 14C15,16,17. Este método baseia-se na introdução de uma quantidade conhecida de 14C-CO2 rotulado em garrafas de incubação cheias de água de concentração de C inorgânico dissolvido conhecido18. A taxa de perda de radioatividade ao longo do tempo é diretamente proporcional à produtividade primária bruta. O método proposto, de fato, complementa o método de radiomarcação porque a combinação de ambos os métodos teoricamente permite distinguir todos os fluxos de carbono, incluindo a respiração heterotrófica e autotrófica. No entanto, o método de radiomarcação também tem várias limitações. Por exemplo, baseia-se na suposição de incorporação rápida e homogênea do elemento marcado no tapete perifítico19, o que geralmente não é possível sem a ruptura mecânica da matriz perifíton. Para obter estimativas diárias precisas, as amostras devem ser coletadas, incubadas e amostradas várias vezes ao longo do dia, e o método deve ser executado em condições de laboratório para evitar a contaminação radioativa7. A medição contínua e não invasiva não é possível.
Outros métodos comumente utilizados para estimar a produtividade primária em ecossistemas aquáticos têm o mesmo desenho experimental, mas incluem diferentes tipos de sondas de oxigênio, que são menos convenientes, especialmente para estimar a produtividade primária do perifíton20. O uso de alguns tipos de sondas de oxigênio pode ajudar a detectar a concentração real de oxigênio dentro do tapete perifítico, mas não pode estimar a taxa de mudança ao longo do tempo, a menos que seja selado em um sistema fechado. A vedação da sonda de oxigênio é mais propensa a vazamentos do que os sensores ópticos não invasivos. Devido à sua necessidade de conexões com fio, outros métodos de metabolismo baseados em garrafas não permitem a medição das concentrações de oxigênio em maiores profundidades. Isso torna o método proposto, que não requer uma conexão com fio, mais capaz de fornecer estimativas precisas do metabolismo bentônico em águas profundas. Como cada sensor óptico é uma unidade independente, é possível medir simultaneamente a mudança na concentração de oxigênio ao longo do tempo em várias profundidades em um único local coordenado. Como resultado, o método poderia fornecer um conjunto de dados robusto que permite até mesmo o upscaling para todo o corpo de água, se necessário. A técnica de sensoriamento remoto, por exemplo, não é igualmente aplicável porque esse método não pode ser usado em profundidades variadas abaixo da superfície.
Medições sazonais detalhadas in situ da produtividade bruta do perifíton (ou outros organismos bentônicos) podem melhorar o conhecimento atual dos processos que controlam a dinâmica da produtividade primária em águas lênticas. Estimar a produtividade primária total na zona litorânea de cada lago pode dar uma ideia melhor de sua importância relativa para o metabolismo do carbono de todo o lago. No entanto, este método é inadequado para medir a produtividade primária do plâncton em águas oligotróficas. Em comparação com as comunidades bentônicas, a biomassa de plâncton em águas abertas é muito baixa. Assim, as mudanças na concentração de O2 seriam muito lentas para serem detectadas simultaneamente durante o experimento com biomassa bentônica. Nesse caso, a atividade metabólica do plâncton pode ser medida pelo método do bicarbonato C 14, conforme descrito por Šimek et al.21 , no mesmo tempo de amostragem. Em águas eutróficas, é possível usar este método para medir a produtividade primária do plâncton também. Cada técnica de mensuração da produtividade primária citada acima apresenta vantagens e desvantagens, que foram discutidas. A melhor técnica deve ser selecionada de acordo com as questões científicas que estão sendo investigadas. Além disso, o método deve imitar os parâmetros ecológicos dos ecossistemas estudados, tanto quanto possível.
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Disclosures
Os autores confirmam que não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Czech Science Foundation (GACR 19-05791S), RVO 67985939, e pelo CAS dentro do programa da Estratégia AV 21, Land save and recovery. Muito obrigado a Ondřej Sihelský por tirar as fotos no campo - sem ele, as filmagens teriam sido um inferno completo. O projeto não seria possível sem uma estreita cooperação com as empresas, Palivový Kombinát Ústí s.p. e Sokolovská Uhelná, que forneceram acesso às localidades estudadas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum angle L profile 40 x 40 mm x 3 mm, length 2,000 mm | |||
| Aluminum flat bar 40 x 3 x 350 mm | |||
| Bucket 15 L with concrete infill | |||
| Carabine hook with screw lock 50 x 5 mm | |||
| electric tape black | |||
| Extruded polystyrene (XPS) material 500 x 200 x 150 mm | |||
| Fibox 3 LCD trace | PreSens Precision Sensing GmbH | stand-alone fiber optic oxygen meter | |
| Hondex PS-7 Portable Depth Sounder | Hondex - Honda Electronics | to measures distances through water - to bottom depth measurement; https://www.honda-el.net/industry/ps-7e | |
| KORKEN - glass tight-seal jar 0.5 L | IKEA | incubation bottles; https://www.ikea.com/cz/en/p/korken-jar-with-lid-clear-glass-70213545/ | |
| metal hook | |||
| Oxygen Sensor Spot SP-PSt3-NAU-D5 | PreSens Precision Sensing GmbH | non-invasive optical oxygen sensor for measurements under Real Conditions | |
| SCOUT infantable canoe | GUMOTEX | https://www.gumotexboats.com/en/scout-standard#0000-044667-021-13/11C | |
| Screw 10 x 170 mm with hexagonal nuts | |||
| Screw 4 x 15 mm with hexagonal nuts | |||
| Screw 4 x 15 mm with wing nuts | |||
| Snap hooks 50 x 5 mm | |||
| Steel Carabine hook 50 x 5 mm | |||
| Steel chain with wire diameter 3 mm, inside link 5.5 x 26 mm | |||
| Steel chain, 5 m | |||
| toothbrush | |||
| tweezer | |||
| Washer 10 x 50 mm | |||
| Washer 4 x 10 mm | |||
| Washer 4 x 10 mm |
References
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