Detta protokoll beskriver en metod för immunmärkning av ett protein i hjärtvävnadssektionerna med hjälp av kvantprickar. Denna teknik ger ett användbart verktyg för att visualisera alla proteins subcellulära lokalisering och uttryck på ultrastrukturell nivå.
Den subcellulära lokaliseringen är avgörande för att avgränsa korrekt funktion och bestämma de molekylära mekanismerna för ett visst protein. Flera kvalitativa och kvantitativa tekniker används för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av proteiner. En av de framväxande teknikerna för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av ett protein är kvantprickar (QD) -medierad immunmärkning av ett protein följt av avbildning av dem med transmissionselektronmikroskopi (TEM). QD är en halvledarnanokristall med en dubbel egenskap av kristallin struktur och hög elektrondensitet, vilket gör dem tillämpliga på elektronmikroskopi. Denna nuvarande metod visualiserade den subcellulära lokaliseringen av Sigma 1-receptor (Sigmar1) protein med QD-TEM i hjärtvävnaden på ultrastrukturell nivå. Små kuber av hjärtvävnadssektionerna från en vildmusmus fixerades i 3% glutaraldehyd, därefter osmicerade, färgade med uranylacetat, följt av sekventiell uttorkning med etanol och aceton. Dessa uttorkade hjärtvävnadssektioner inbäddades i epoxihartser med låg viskositet, skars i tunna sektioner med 500 nm tjocklek, sattes på gallret och utsattes därefter för antigenavmaskering med 5% natriummetaperiodat, följt av släckning av restaldehyderna med glycin. Vävnaderna blockerades, följt av sekventiell inkubation i primär antikropp, biotinylerad sekundär antikropp och streptavidinkonjugerad QD. Dessa färgade sektioner torkades fläcktorkade och avbildades med hög förstoring med TEM. QD-TEM-tekniken möjliggjorde visualisering av Sigmar1-proteinets subcellulära lokalisering på ultrastrukturell nivå i hjärtat. Dessa tekniker kan användas för att visualisera närvaron av någon protein och subcellulär lokalisering i vilket organsystem som helst.
Människokroppen består av många proteiner som är ansvariga för många kroppsfunktioner. Proteinernas funktion beror till stor del på deras lokalisering i organ- och cellorganellerna. Flera tekniker, inklusive subcellulär fraktionering, immunofluorescens och tvättmedelsmedierad proteinextraktion, används vanligtvis för att bestämma proteinets subcellulära lokalisering 1,2. Mikroskopi med immunofluorescerande färgämne är den mest använda metoden bland dessa tekniker. De fluorescerande färgämnena som används i denna teknik är emellertid mindre stabila och benägna att fotobleka3. Andra tekniker involverade högupplöst mikroskopi för att visualisera proteinet på ultrastrukturell nivå genom att immunmärka proteiner med elektrontäta, tungmetaller (guld, ferritin) eller kvantprickar nanokristaller och följt av visualisering av dem med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM)4,5.
QD är en halvledarnanokristall som består av halvledarmetallföreningar med kontrollerbara fotoluminescensegenskaper som har stor betydelse i biologiska system3. QD-nanokristaller tillverkas i ett kärnskalformat där en nanokristall är inkapslad i bildandet av nanokristaller för att säkerställa att de är korrekt stabila och fungerar. Vanliga kombinationer av kärnskal nanokristaller är CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS och CdTe/CdS/ZnS (core/shell/shell)3. Bland dessa nanokristallkombinationer studeras CdSe/ZnS och CdSe/CdS mest kraftfullt och används ofta som sekundära antikroppskonjugat 3,6. Dessa QD-nanopartiklar har också fluorescerande egenskaper med olika excitations- och emissionsspektra än traditionella fluoroforer. QD använder excitering av elektroner från bulkvalensbandet för att uppvisa högre fluorescenskvantutbyten jämfört med traditionella fluoroforer. Nanokristallarrangemanget av halvledarmetaller gör QD-medierad märkning mer stabil och motståndskraftig mot fotoblekning6. Dessutom tillåter nanokristallkärnan i QD och dess kristallina struktur QD i olika storlekar att ha ett brett spektrum av absorptionsspektra och mycket smala emissionstoppar7. Dessutom är dessa QD-partiklar tillräckligt stora för att ge hög elektrondensitet, vilket gör dem användbara i högupplösta mikroskopitekniker, inklusive transmissionselektronmikroskopi 5,8,9. Dessa QD-nanokristaller är också kommersiellt tillgängliga i flera storlekar med olika fluorescensemissionsspektra och former, vilket gör dem till en utmärkt kandidat för märkning med flera antikroppar10,11.
QD-tekniken fick stor betydelse i biologisk forskning på grund av flera funktionella egenskaper, inklusive användning vid avbildning av levande celler, studier av transportmekanismer i cellen, membrantransport av proteinets diffusionsrörelse, funktionell heterogenitet hos celler och märkning av intracellulär organell 3,12,13,14,15,16 . QD är också användbart inom molekylär diagnostik för att rikta in sig på och upptäcka cancervävnader, karakterisera tumörens molekylära profil och immunstatus och visualisera glaskropp och epiretinala membran 3,17,18. Dessutom kan QD också användas i medicinska terapier för att behandla tumörmaligniteter via fotodynamisk terapi och oftalmiska anomalier genom att leverera läkemedel till ögon 3,17,18,19.
Med hjälp av dessa mycket användbara QD-nanokristaller bestämde den aktuella studien den subcellulära lokaliseringen av ett protein som heter Sigma 1-receptor (Sigmar1). Sigmar1 är ett allestädes närvarande uttryckt multi-tasking molekylärt chaperonprotein. Omfattande studier med fokus på Sigmar1s subcellulära lokalisering i olika vävnader och organ rapporterade en cell- och vävnadstypspecifik subcellulär lokalisering som framkallade molekylär funktion20. I olika celler (neuronala, fotoreceptor- och immunceller) och vävnader (lever och hjärna) med olika biokemiska tillvägagångssätt rapporterade studier lokaliseringen av Sigmar1 på endoplasmatisk retikulum (ER), mitokondrierassocierat ER-membran (MAM), kärnhölje, plasmamembran, nukleoplasmatisk retikulum, kärna och mitokondrier. Trots alla dessa studier förblev den subcellulära lokaliseringen av Sigmar1 i hjärtat okänd20. Därför bestämdes den subcellulära lokaliseringen av Sigmar1 i hjärtvävnad med användning av QD-medierad immunmärkning följt av TEM-avbildning.
I den aktuella studien användes QD-medierad immunmärkning för att tydligt visa den subcellulära lokaliseringen av Sigmar1. Med hjälp av QD avbildades Sigmar1s lokalisering på mitokondriellt membran, särskilt det inre mitokondriella membranet, i hjärtvävnad. Dessutom befanns Sigmar1 också vara belägen på sarkoplasmatisk / endoplasmatisk retikulum (S / ER) och lysosomer på ultrastrukturell nivå, som visas i figur 2A-D.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är etsnings- eller antigenavmaskeringssteget med högkoncentrerad natriummetaperiodatlösning för att avslöja antigenet efter glutaraldehydfixering och osmication. Detta protokoll använde en enda behandling med en hög koncentration (5%) natriummetaperiodat i 30 minuter vid rumstemperatur. Extra försiktighet behövs i detta steg eftersom en längre varaktighet eller högre koncentration för natriummetaperiodatinkubation kommer att resultera i aggregering av strukturer, förlust av membrandefinition för organellerna och orsaka perforeringar i sektionen, vilket gör det svårt att visualisera proteinet eller strukturen. Alternativt kan en lägre koncentration av (3%) metaperiodatlösning i två steg i 30 minuter också användas istället för 5% metaperiodat. Studier har visat att detta alternativ uppvisar liknande resultat som med 5% metaperiodatlösning för enstegs 30 min inkubation. En 3% metaperiodatlösning för 30 minuters inkubation i två gånger ger dock bättre kontroll över processen26,27,28. Ursprungligen använde detta protokoll inkubation av sektionerna med 10% metaperiodatlösning i 30 min. På grund av för många perforeringar som skapades i vävnadssektionen av denna koncentration minskade emellertid den slutliga koncentrationen och inkubationstiden för metaperiodatlösningen och optimerades till 5% i 30 minuter.
Ett annat steg krävde optimering av fixeringstiden med glutaraldehyd. Suboptimal fixering av vävnader resulterar i otillräcklig QD-märkning, medan överfixering av vävnader resulterar i högre icke-specifik märkning. Därför måste noggrann övervägning göras vid bestämning och titrering av en optimal nivå av vävnadsfixering för korrekt och specifik märkning av proteiner. I denna metod med användning av hjärtvävnader titrerades fixeringstiden med glutaraldehyd med användning av 24 h och 48 h som tidpunkter. Baserat på färgningsbilderna av de sektioner som var fixerade för båda tidpunkterna, fann man att sektioner fixerade i 24 timmar visade bättre resultat. Hittills finns QD-nanokristaller i flera storlekar, inklusive 525, 565, 585, 605, 655 och 705 nm11,29. Var och en av dessa QD har sina egna emissionsspektra och avger fluorescens vid olika våglängder. Dessutom visar dessa kommersiellt tillgängliga QD: er i olika storlekar olika former; till exempel är QD 525, 565 och 585 praktiskt taget sfäriska med olika storlekar, medan QD 605, 655 och 705 är oregelbundna avlånga formade. Av dessa olika QD-nanokristaller är QD 525, 565 och 655 lätta att skilja från varandra11,29. Dessa skillnader i emissionsspektra och former gör QD till en utmärkt kandidat för multimärkning av proteiner och visualisering genom fluorescens och elektronmikroskopi. I denna studie användes en kommersiellt tillgänglig QD, QD 655, för att märka Sigmar1-proteinet för att skilja det från någon icke-specifik bakgrund i de färgade sektionerna.
En annan motsvarighet till QD för proteinmärkning i högupplöst mikroskopi är immunogoldpartikeln. Immunogoldpartiklarna används traditionellt för att märka proteiner för högupplöst mikroskopi. Dessa guldpartiklar är mycket elektrontäta och lätt identifierbara jämfört med QD-nanokristaller. QD uppvisar dock bättre effektivitet med bättre penetration i vävnader, högre stabilitet och hållbarhet och bättre retention av ultrastrukturella komponenter, vilket gör dem till en bättre kandidat för proteinmärkning 4,5. QD har också en unik förmåga att detekteras med både ljus- och elektronmikroskopi, vilket ökar dess värde jämfört med immunogoldmärkning10.
En begränsning av denna QD-medierade immunmärkning är användningen av osmiumtetroxid under bearbetningen. Osmiumtetroxid används för att öka elektrondensiteten, konduktiviteten och kontrasten hos annars mindre elektrontäta och mindre kontrasterande biologiska membranstrukturer 5,30. Användningen av osmiumtetrexid förstör emellertid omedelbart och irreversibelt provets egenskap för att skapa fluorescens när den är märkt med QD6. Detta begränsar användningen av QD i fluorescensmikroskopi. Ett alternativt tillvägagångssätt som utelämnar användningen av osmiumtetroxid kommer att vara fördelaktigt för att behålla de fluorescerande egenskaperna och därmed den dubbla tillämpningen av QD-medierad immunmärkning. Några av de nyare modellerna av TEM har möjlighet att fästa EDX-systemet (Energy Dispersive X-Ray Analysis) som möjliggör identifiering av materialets elementära sammansättning. En annan begränsning i studien är bristen på elementär kartläggning av ett prov och bildanalys med EDX. Därför bör framtida studier fokusera på EDX-analysen av QD-spektra för att analysera elementarkompositionen.
QD-märkning av proteiner har fått mycket uppmärksamhet på senare tid. QD erbjuder flera tillämpningar och fördelar inom både biologisk forskning och medicinsk terapi. QD som dessutom lindas in med polydentatligand uppvisar ökad stabilitet som upprätthåller kvantutbytet. Vidare ökar inkapslande QD med dessa biogynnsamma medel också dess biotillgänglighet i vävnader vilket gör det till en bra kandidat för potentiell tillämpning vid detektering av tumörer, levande cellavbildning, läkemedelsleverans och vävnadsavbildning 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 och R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award och LARC Research Award till MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist kardiovaskulärt och AHA postdoktoralt stipendium till CSA (20POST35210789); och LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship till RA.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |