Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور التوطين تحت الخلوي لبروتين في القلب باستخدام وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية متبوعا بالمجهر الإلكتروني النافذ

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64085
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة لوضع العلامات المناعية على البروتين في أقسام أنسجة القلب باستخدام النقاط الكمومية. توفر هذه التقنية أداة مفيدة لتصور توطين أي بروتين تحت خلوي والتعبير عنه على مستوى البنية الفائقة.

Abstract

يعد التوطين تحت الخلوي أمرا بالغ الأهمية لتحديد الوظيفة المناسبة وتحديد الآليات الجزيئية لبروتين معين. يتم استخدام العديد من التقنيات النوعية والكمية لتحديد التوطين تحت الخلوي للبروتينات. إحدى التقنيات الناشئة في تحديد التوطين تحت الخلوي للبروتين هي وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية (QD) للبروتين متبوعا بتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). QD عبارة عن بلورة نانوية لأشباه الموصلات ذات خاصية مزدوجة للبنية البلورية وكثافة الإلكترون العالية ، مما يجعلها قابلة للتطبيق على المجهر الإلكتروني. تصور هذه الطريقة الحالية التوطين تحت الخلوي لبروتين مستقبلات سيغما 1 (Sigmar1) باستخدام QD-TEM في أنسجة القلب على مستوى البنية الفائقة. تم تثبيت مكعبات صغيرة من أقسام أنسجة القلب من فأر من النوع البري في 3٪ جلوتارالدهيد ، ثم تناضح لاحقا ، ملطخا بأسيتات اليورانيل ، يليه الجفاف المتسلسل مع الإيثانول والأسيتون. تم تضمين أقسام أنسجة القلب المجففة هذه في راتنجات الايبوكسي منخفضة اللزوجة ، مقطعة إلى أقسام رقيقة بسمك 500 نانومتر ، ووضعت على الشبكة ، ثم تعرضت بعد ذلك لكشف المستضد بنسبة 5٪ ميتادوريت الصوديوم ، تليها تبريد الألدهيدات المتبقية مع الجلايسين. تم حظر الأنسجة ، تليها الحضانة المتسلسلة في الجسم المضاد الأولي ، والجسم المضاد الثانوي البيوتينيل ، و QD المترافق بالستربتافيدين. تم تجفيف هذه المقاطع الملطخة وتصويرها بتكبير عال باستخدام TEM. سمحت تقنية QD-TEM بتصور التوطين تحت الخلوي لبروتين Sigmar1 على مستوى البنية التحتية في القلب. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصور وجود أي توطين بروتيني وتحت خلوي في أي جهاز عضوي.

Introduction

يتكون جسم الإنسان من العديد من البروتينات المسؤولة عن العديد من وظائف الجسم. تعتمد وظيفة البروتينات إلى حد كبير على توطينها في الأعضاء والعضيات الخلوية. تستخدم العديد من التقنيات ، بما في ذلك التجزئة تحت الخلوية ، والتألق المناعي ، واستخراج البروتين بوساطة المنظفات ، بشكل شائع لتحديد توطين البروتين تحت الخلوي 1,2. الفحص المجهري باستخدام صبغة الفلورسنت المناعية هو الطريقة الأكثر استخداما بين هذه التقنيات. ومع ذلك ، فإن الأصباغ الفلورية المستخدمة في هذه التقنية أقل استقرارا وعرضة للتبييض الضوئي3. تضمنت التقنيات الأخرى الفحص المجهري عالي الدقة لتصور البروتين على مستوى البنية التحتية عن طريق وضع علامات مناعية على البروتينات ذات الإلكترونات الثقيلة والمعادن الثقيلة (الذهب والفيريتين) أو بلورات النقاط الكمومية النانوية وتليها تصورها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)4,5.

QD عبارة عن بلورة نانوية أشباه الموصلات تتكون من مركبات معدنية أشباه الموصلات ذات خصائص تلألؤ ضوئي يمكن التحكم فيها ولها أهمية كبيرة في الأنظمة البيولوجية3. تصنع بلورات QD النانوية في شكل غلاف أساسي حيث يتم تغليف بلورة نانوية في تكوين بلورات نانوية لضمان استقرارها وعملها بشكل صحيح. تركيبة البلورات النانوية ذات القشرة الأساسية شائعة الاستخدام هي CdSe / ZnS و CdSe / CdS CdSe / ZnSe و CdTe / CdS و CdTe / ZnS و CdTe / CdS / ZnS (core / shell / shell) 3. من بين هذه المجموعات البلورية النانوية ، تتم دراسة CdSe / ZnS و CdSe / CdS بقوة أكبر وتستخدم بشكل متكرر كاتحادات ثانوية للأجسام المضادة 3,6. تمتلك هذه الجسيمات النانوية QD أيضا خصائص فلورية ذات أطياف إثارة وانبعاث مختلفة عن الفلوروفورات التقليدية. يستخدم QD إثارة الإلكترونات من نطاق التكافؤ السائب لإظهار عوائد كمية مضان أعلى مقارنة بالفلوروفورات التقليدية. يجعل ترتيب البلورات النانوية لمعادن أشباه الموصلات وضع العلامات بوساطة QD أكثر استقرارا ومقاومة للتبييض الضوئي6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قلب البلورات النانوية في QD وهيكله البلوري يسمح ل QD بأحجام مختلفة بالحصول على مجموعة واسعة من أطياف الامتصاص وقمم الانبعاث الضيقة جدا7. علاوة على ذلك ، فإن جسيمات QD هذه كبيرة بما يكفي لإنتاج كثافة إلكترونية عالية ، مما يجعلها مفيدة في تقنيات الفحص المجهري عالية الدقة ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني النافذ5،8،9. تتوفر هذه البلورات النانوية QD أيضا تجاريا بأحجام متعددة مع أطياف وأشكال انبعاث مضان مختلفة ، مما يجعلها مرشحا رائعا لوضع العلامات بأجسام مضادة متعددة10,11.

جذبت تقنية QD أهمية كبيرة في البحوث البيولوجية بسبب الخصائص الوظيفية المتعددة ، بما في ذلك استخدامها في تصوير الخلايا الحية ، ودراسة آليات النقل في الخلية ، والنقل الغشائي لحركة انتشار البروتين ، وعدم التجانس الوظيفي للخلايا ، ووضع علامات على العضيات داخل الخلايا3،12،13،14،15،16 . QD مفيد أيضا في التشخيص الجزيئي لاستهداف واكتشاف الأنسجة السرطانية ، وتوصيف الملف الجزيئي للورم والحالة المناعية ، وتصور الجسم الزجاجي والأغشية فوق الشبكية3،17،18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام QD في العلاجات الطبية لعلاج الأورام الخبيثة عن طريق العلاج الضوئي الديناميكي وتشوهات العيون عن طريق توصيل الأدوية إلى العيون3،17،18،19.

باستخدام هذه البلورات النانوية QD المفيدة للغاية ، حددت الدراسة الحالية التوطين تحت الخلوي لبروتين يسمى مستقبل Sigma 1 (Sigmar1). Sigmar1 هو بروتين مرافقون جزيئي متعدد المهام يتم التعبير عنه في كل مكان. أفادت الدراسات المكثفة التي تركز على توطين Sigmar1 تحت الخلوي في الأنسجة والأعضاء المختلفة عن توطين تحت خلوي محدد من نوع الخلية والأنسجة مما يؤدي إلى الوظيفة الجزيئية20. في الخلايا المختلفة (الخلايا العصبية والمستقبلات الضوئية والخلايا المناعية) والأنسجة (الكبد والدماغ) باستخدام مناهج كيميائية حيوية مختلفة ، أبلغت الدراسات عن توطين Sigmar1 على الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وغشاء ER المرتبط بالميتوكوندريا (MAM) ، والغلاف النووي ، وغشاء البلازما ، والشبكة النووية ، والنواة ، والميتوكوندريا. على الرغم من كل هذه الدراسات ، ظل التوطين تحت الخلوي ل Sigmar1 في القلب غير معروف20. لذلك ، تم تحديد التوطين تحت الخلوي ل Sigmar1 في أنسجة القلب باستخدام الوسم المناعي بوساطة QD متبوعا بتصوير TEM.

Protocol

امتثلت إجراءات التعامل مع الحيوانات في هذا البروتوكول لدليل رعاية واستخدام المختبر (الإصدار الثامن ، المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مركز العلوم الصحية بجامعة ولاية لويزيانا - شريفبورت. تم استخدام ذكور الفئران البالغة من العمر ستة أشهر مع خلفية FVB / N ، للدراسة الحالية. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد). تم إيواء الفئران المستخدمة في بيئة جيدة التنظيم في أقفاص تسمح بدورة 12 ساعة من الضوء والظلام ، وتم تزويدها بالماء ونظام غذائي منتظم للتشاو ، وتم الاعتناء بها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. العملية الكلية موضحة في الشكل 1.

1. إعداد الحيوانات

  1. تخدير الفئران باستخدام 3٪ إيزوفلوران. افتح الصدر عن طريق إجراء شق أفقي في المنطقة فوق منتصف البطن وسحب الجلد. بعناية ، قم بعمل شق آخر لفتح تجويف الصدر دون ثقب أي أعضاء أخرى21،22،23.
    1. Perfuse24 القلب من خلال القمة أولا ، ثم البطين الأيمن باستخدام الجلوتارالدهيد البارد 3٪ في محلول شلل القلب (50 mM KCl ، 5٪ سكر العنب في PBS ، انظر الملف التكميلي 1) لمدة 2 دقيقة لضمان الاسترخاء الكامل لعضلة القلب.
  2. قم بتغذية القلب باستخدام الجلوتارالدهيد المثلج 3٪ في 0.1 M من محلول كاكوديلات الصوديوم (درجة الحموضة 7.4 ، الخطوة 2.1.1) لمدة دقيقتين أخريين. باستخدام ضغط الجاذبية ، استخدم إبرة 25 G 5/8 "لإدخال المثبتات في القلب. مباشرة بعد أن يبدأ القلب في الامتلاء بالمثبت ، ارفع قمة القلب وقطع الأوعية تحته عند 1-2 مم من القلب لتخفيف الضغط والسماح للسوائل بالتصريف.
  3. قم بتشريح القلب وإزالة الأذينين24 وإسقاط البطينين في جلوتارالدهيد 3٪ ثلجي / 0.1 م كاكوديلات الصوديوم في طبق بتري. اصنع فراشة مقطوعة بعد 30-60 دقيقة من التثبيت وضعها في طبق بتري يحتوي على 3٪ جلوتارالدهيد / كاكوديلات (انظر جدول المواد). يقطع القلب باستخدام شفرة جراحية في مكعبات صغيرة من 1 مم3 أثناء وجوده في محلول الجلوتارالدهيد / الكاكوديلات.
  4. ثبت / اغمر أنسجة القلب المشرحة في محلول الجلوتارالدهيد / الكاكوديلات لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.

2. معالجة أنسجة القلب

  1. بعد 24 ساعة من التثبيت ، اغسل الأنسجة في 0.1 متر من محلول كاكوديلات الصوديوم لمدة 20 دقيقة.
    1. تحضير 0.1 M cacodylate العازلة باتباع الخطوات أدناه.
      1. لتحضير محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M، قم بإعداد مخزون من محلول كاكوديلات الصوديوم 1 M عن طريق إذابة كاكوديلات الصوديوم (21.4 جم) ومحلول كلوريد الكالسيوم 1٪ (3 مل) في 90 مل من الماء المقطر. ارفع حجم المحلول إلى 100 مل بإضافة الماء المقطر. حرك المحلول جيدا واتركه طوال الليل لإذابة المذاب.
      2. بعد ذلك ، خذ 10 مل من محلول مخزون كاكوديلات الصوديوم 1 M وأضفه إلى 80 مل من الماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك وقم بحجمه حتى 100 مل بإضافة الماء المقطر.
  2. كرر الغسيل في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 متر لمدة 20 دقيقة أخرى. قم بإزالة الأنسجة من محلول كاكوديلات الصوديوم واغمرها في محلول رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. وتسمى هذه العملية التناضح.
    1. تحضير محلول رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ باتباع الخطوات أدناه.
      1. لتحضير محلول رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ ، خذ 4٪ محلول رابع أكسيد الأوزميوم ، 4 مل (انظر جدول المواد) ، 1 م محلول مخزون كاكوديلات الصوديوم (0.8 مل) ، والماء المقطر (3.2 مل) ليصبح المجموع 8 مل محلول.
        ملاحظة: يجب تنفيذ هذه العملية برمتها والخطوات من الآن فصاعدا في غطاء الدخان.
  3. بعد التناضح ، اغمر الأنسجة في محلول أسيتات الصوديوم بنسبة 2٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. تحضير محلول أسيتات الصوديوم 2٪ عن طريق إذابة 4 جم من أسيتات الصوديوم في 20 مل من الماء المقطر.
  4. بعد ذلك ، اغمر الأنسجة في محلول أسيتات اليورانيل 2٪ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    1. تحضير محلول أسيتات اليورانيل 2٪ عن طريق إذابة 4 جم من أسيتات اليورانيل في 20 مل من الماء المقطر.
  5. بعد تلطيخ أسيتات اليورانيل ، قم بتجفيف الأنسجة بالتتابع من خلال الكحولات المتدرجة والأسيتون بالترتيب المذكور في الملف التكميلي 1.

3. تضمين أنسجة القلب

  1. قم بتضمين الأنسجة المجففة في راتنجات الايبوكسي منخفضة اللزوجة باتباع الخطوات أدناه.
    1. لصنع راتنجات الايبوكسي منخفضة اللزوجة ، امزج 10.24 مل من ثاني أكسيد الفينيل سيكلوهيكسين (ERL 4221) مونومر الإيبوكسي ، و 6.74 مل من إيثر ديجليسيديل من البولي بروبيلين جلايكول (DER 732) ، و 30.05 مل من أنهيدريد السكسينيك النونيل (NSA) (انظر جدول المواد) في أنبوب سعة 50 مل. حرك التعليق جيدا باليد لمدة 2 دقيقة.
    2. أضف 18 قطرة من مسرع الإيبوكسي 2-ثنائي ميثيل أمينو إيثانول (DMAE ، انظر جدول المواد) وحرك المعلق لخلط المكونات جيدا.
    3. تشريب الأنسجة في راتنجات الايبوكسي في التسلسل التالي من الخليط.
      1. استبدل الأسيتون 100٪ براتنج 1: 1: تعليق الأسيتون واغمر الأنسجة فيه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
      2. استبدل راتنج 1: 1: تعليق الأسيتون براتنج 6: 1: تعليق الأسيتون واغمر الأنسجة فيه لمدة 3 ساعات.
      3. أخيرا ، استبدل راتنج 6: 1: تعليق الأسيتون بتعليق راتينج 100٪ واترك الأنسجة مغمورة فيه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  2. ضع الأنسجة في راتنج طازج في قوالب صغيرة 8 مم (انظر جدول المواد) وعالج الأنسجة المدمجة عند 70 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: تأكد من أن الراتنج صلب ولكن ليس هشا بعد المعالجة.

4. تقسيم الأنسجة باستخدام ultramicrotome

  1. قم بقص كتل الراتنج بالأنسجة بحيث لا يزيد حجمها عن 1 مم قبل تركيبها على ultramicrotome (انظر جدول المواد). ضع القالب بدقة قدر الإمكان في الذراع المجزأة للميكروتوم الفائق وقم بدفع قالب العينة يدويا نحو سكين الماس.
  2. قم بقص الأقسام بسمك 500 نانومتر (نصف ميكرون) بسكين Histo (انظر جدول المواد) ، وباستخدام أداة حلقة EM ، التقطها وضعها على شريحة زجاجية.
  3. ضع الشريحة الزجاجية على طبق ساخن لصبغة تولويدين الزرقاء25 للعثور على منطقة الاهتمام.
  4. بعد العثور على منطقة الاهتمام ، استخدم سكين Ultra 45 ° (انظر جدول المواد) لإنتاج مقاطع ذهبية باهتة فائقة النحافة (100 نانومتر). ضع هذه الأقسام فائقة النحافة على الجانب الباهت من شبكة نحاسية مكونة من 200 شبكة.

5. تلطيخ قسم القلب فائق النحافة

  1. ابدأ التلوين عن طريق كشف المستضد باستخدام محلول النقش ، أي محلول ميتابوريات الصوديوم بنسبة 5٪.
    1. تحضير 500 ميكرولتر من محلول ميتافورات الصوديوم بنسبة 5٪ (انظر جدول المواد) في الماء المقطر.
      ملاحظة: تحضير محلول جديد قبل الاستخدام.
    2. ضع 20 ميكرولتر من محلول ميتافوردات الصوديوم على فيلم بارافين نظيف. ضع الشبكات المجففة تماما مع أقسام الأنسجة على قطرة محلول الحفر.
      ملاحظة: يجب أن يواجه الجانب الباهت من الشبكة مع قسم الأنسجة نحو محلول النقش.
    3. اترك شبكة المقطع على المحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. اغسل قسم الأنسجة المحفور بوضعه على قطرة من الماء المقطر لمدة 60 ثانية.
  3. اسد الألدهيدات المتبقية عن طريق وضع شبكات المقطع على قطرة من محلول جليكاين 0.05 M لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. امسح حواف الشبكة على ورق الترشيح لإزالة محلول الجلايسين المتبقي.
    1. تحضير محلول جليكاين 0.05 م (انظر جدول المواد) عن طريق إذابة 3.75 ملغ من الجلايسين في 1 مل من 1x PBS (درجة الحموضة 7.4).
  4. ضع شبكات المقطع في 10-20 ميكرولتر من محلول الحجب لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تكوين محلول الحظر: 2 ميكرولتر من 1٪ مصل الماعز الطبيعي (NGS) + 20 ميكرولتر من 1٪ BSA (التركيز النهائي: 10٪) + 178 ميكرولتر من 1x PBS (درجة الحموضة 7.4) لعمل حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر.
  5. امسح حواف الشبكة على ورق الترشيح وضع قسم الشبكة على مخفف الأجسام المضادة للتكييف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  6. احتضان أقسام الشبكة بالجسم المضاد الأولي (Sigmar1 في هذه الحالة ، انظر جدول المواد ؛ مخفف 1:10 في مخفف الأجسام المضادة) لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة في غرفة مرطبة.
  7. جفف الشبكة واغسل أقسام الشبكة بمخفف الأجسام المضادة مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  8. احتضان أقسام الشبكة بجسم مضاد ثانوي بيوتينيل (في هذه الحالة ، جسم مضاد ثانوي متعدد النسيلة مضاد للأرانب مضاد للأرانب ، انظر جدول المواد ؛ مخفف 1:10 في مخفف الأجسام المضادة) لمدة ساعة واحدة في غرفة مرطبة.
  9. جفف الشبكة واغسل أقسام الشبكة بمخفف الأجسام المضادة مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  10. احتضان أقسام الشبكة في QD المقترن بالستربتافيدين المتاح تجاريا (QD655nm ، انظر جدول المواد ؛ مخفف 1:10 في مخفف الأجسام المضادة) لمدة ساعة واحدة في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة. منع التعرض للضوء من خلال تغطية الغرفة بورق الألمنيوم.
  11. جفف حواف الشبكة باستخدام ورق الترشيح واغسل أقسام الشبكة بوضعها على قطرات الماء لمدة 2 دقيقة.
  12. لطخة حواف الشبكة لتجف.

6. نقل المجهر الإلكتروني (TEM) التصوير

  1. ضع المقاطع فائقة النحافة على شبكات نحاسية في حامل رباعي عينة وقم بتثبيتها في وضع يسمح باختيار الشبكات في حزمة الإلكترون.
  2. أدخل حامل العينة في عمود المجهر وقم بإشراك مفتاح المضخة لإخلاء مقياس الزوايا ، متبوعا بالإدخال الكامل لحامل العينة في عمود المجهر (انظر جدول المواد).
  3. اضبط الجهد على 80 كيلو فولت قبل توليد الحزمة لمراقبة الصورة.
  4. ركز جيدا على المنطقة المطلوبة ، والتقط الصورة باستخدام كاميرا رقمية عالية السرعة ، واحفظ الملف بتنسيق .tif.
    ملاحظة: كان إعداد المجهر لالتقاط الصورة في هذه الدراسة هو تسريع الجهد أو جهد التوتر العالي 80 كيلو فولت وتكبير 20000x.

Representative Results

تصور منهجية QD-TEM الحالية وجود Sigmar1 وتوطينه على مقصورات القلب تحت الخلوية من خلال إجراء وضع علامات QD المستهدفة المضادة ل Sigmar1 على أقسام القلب فائقة النحافة للفأر البالغ. تم توضيح مضاد Sigmar1 الكثيف الإلكترون المسمى QD على أغشية الميتوكوندريا (الداخلية والخارجية) ، والليزوزومات ، والشبكة الإندوبلازمية / الشبكة الساركوبلازمية (ER / SR) واجهة الغشاء والميتوكوندريا (الشكل 2 أ ، ب) بواسطة صور QD-TEM. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف أقسام القلب أيضا باستخدام IgG للأرانب و QD كعنصر تحكم Isotype للجسم المضاد الأساسي للأرانب Sigmar1 (الشكل 2C ، D). لذلك ، سلط تصوير QD-TEM الضوء على توطين Sigmar1 الداخلي وتخصيبه في الغالب على الليزوزومات وأغشية الميتوكوندريا.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي يوضح الخطوات والإجراءات المتسلسلة المستخدمة لأداء QD-TEM. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: Sigmar1 المسمى بالمناعة QD في أنسجة قلب الفئران البالغة . (أ ، ب) صور TEM تمثيلية تظهر Sigmar1 المسمى QD على الميتوكوندريا (الغشاء الخارجي والداخلي) ، وأغشية الشبكة الإندوبلازمية المرتبطة بالميتوكوندريا (ER) / الشبكة الساركوبلازمية (SR) ، والليزوزومات. (ج، د) صورة TEM لأقسام القلب للتحكم في النمط المتماثل المسمى QDs والأرانب IgG. شريط المقياس: 200 نانومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: تكوين PBS والحلول الأخرى المستخدمة لتجفيف الأنسجة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

في الدراسة الحالية ، تم استخدام الوسم المناعي بوساطة QD لإظهار التوطين تحت الخلوي ل Sigmar1 بشكل مميز. باستخدام QD ، تم تصوير توطين Sigmar1 على غشاء الميتوكوندريا ، وخاصة غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، في أنسجة القلب. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على Sigmar1 أيضا على الشبكة الساركوبلازمية / الإندوبلازمية (S / ER) والليزوزومات على مستوى البنية التحتية ، كما هو موضح في الشكل 2A-D.

الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي خطوة النقش أو كشف المستضد باستخدام محلول ميتادوريات الصوديوم عالي التركيز للكشف عن المستضد بعد تثبيت الجلوتارالدهيد والتناضح. استخدم هذا البروتوكول علاجا واحدا بتركيز عال (5٪) من ميتافورات الصوديوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هناك حاجة إلى مزيد من العناية في هذه الخطوة لأن مدة أطول أو تركيز أعلى لحضانة ميتافلورات الصوديوم سيؤدي إلى تجميع الهياكل ، وفقدان تعريف الغشاء للعضيات ، ويسبب ثقوبا في القسم ، مما يجعل من الصعب تصور البروتين أو الهيكل. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام تركيز أقل من محلول ميتافورمات (3٪) في خطوتين لمدة 30 دقيقة بدلا من 5٪ ميتادوريت. أظهرت الدراسات أن هذا الخيار يظهر نتائج مماثلة كما هو الحال مع محلول 5٪ metaperiodate لحضانة من خطوة واحدة مدتها 30 دقيقة. ومع ذلك ، فإن حل metaperiodate بنسبة 3٪ لمدة 30 دقيقة من الحضانة لمرتين يوفر تحكما أفضل في العملية26،27،28. في البداية ، استخدم هذا البروتوكول حضانة الأقسام بمحلول metaperiodate بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. ومع ذلك ، نظرا لكثرة الثقوب التي تم إنشاؤها في قسم الأنسجة بواسطة هذا التركيز ، تم تقليل التركيز النهائي ومدة الحضانة لمحلول metaperiodate وتحسينها إلى 5٪ لمدة 30 دقيقة.

خطوة أخرى تتطلب تحسين وقت التثبيت مع الجلوتارالدهيد. يؤدي التثبيت دون المستوى الأمثل للأنسجة إلى عدم كفاية وضع علامات QD ، في حين أن التثبيت المفرط للأنسجة يؤدي إلى وضع علامات غير محددة أعلى. لذلك ، يجب النظر بعناية في تحديد ومعايرة المستوى الأمثل لتثبيت الأنسجة لوضع العلامات المناسبة والمحددة للبروتينات. في هذه الطريقة باستخدام أنسجة القلب ، تمت معايرة وقت التثبيت مع الجلوتارالدهيد باستخدام 24 ساعة و 48 ساعة كنقاط زمنية. استنادا إلى صور التلوين للأقسام الثابتة لكل من النقاط الزمنية ، وجد أن الأقسام الثابتة لمدة 24 ساعة أظهرت نتائج أفضل. حتى الآن ، تتوفر بلورات QD النانوية بأحجام متعددة ، بما في ذلك 525 و 565 و 585 و 605 و 655 و 705 نانومتر11,29. كل من هذه QD لها أطياف الانبعاث الخاصة بها وتنبعث منها مضان بأطوال موجية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض QDs المتاحة تجاريا بأحجام مختلفة أشكالا مختلفة. على سبيل المثال ، QD 525 و 565 و 585 كروية تقريبا بأحجام مختلفة ، في حين أن QD 605 و 655 و 705 مستطيلة الشكل غير منتظمة. من بين هذه البلورات النانوية المختلفة QD ، يمكن تمييز QD 525 و 565 و 655 بسهولة عن بعضها البعض11,29. هذه الاختلافات في أطياف الانبعاث والأشكال تجعل QD مرشحا رائعا لوضع العلامات المتعددة للبروتينات والتصور عن طريق التألق والمجهر الإلكتروني. في هذه الدراسة ، تم استخدام QD المتاح تجاريا ، QD 655 ، لتسمية بروتين Sigmar1 لتمييزه عن أي خلفية غير محددة في الأقسام الملطخة.

نظير آخر من QD لوضع العلامات على البروتين في الفحص المجهري عالي الدقة هو جسيم immunogold. تستخدم جزيئات الذهب المناعي تقليديا لتسمية البروتينات للفحص المجهري عالي الدقة. جزيئات الذهب هذه كثيفة الإلكترون ويمكن التعرف عليها بسهولة مقارنة بالبلورات النانوية QD. ومع ذلك ، يظهر QD كفاءة أفضل مع اختراق أفضل في الأنسجة ، واستقرار أعلى ومدة صلاحية ، واحتفاظ أفضل بمكونات البنية التحتية ، مما يجعلها مرشحا أفضل لوضع العلامات على البروتين 4,5. يتمتع QD أيضا بقدرة فريدة على اكتشافه بواسطة كل من المجهر الضوئي والإلكتروني ، مما يضيف إلى قيمته على ملصق immunogold10.

أحد قيود هذا الوسم المناعي بوساطة QD هو استخدام رابع أكسيد الأوزميوم أثناء المعالجة. يستخدم رابع أكسيد الأوزميوم لزيادة كثافة الإلكترون والتوصيل والتباين لهياكل الأغشية البيولوجية الأقل كثافة للإلكترون والأقل تباينا 5,30. ومع ذلك ، فإن استخدام رابع أكسيد الأوزميوم على الفور وبشكل لا رجعة فيه يدمر خاصية العينة لإنشاء مضان عند وضع علامة QD6. هذا يحد من استخدام QD في الفحص المجهري الفلوري. سيكون النهج البديل الذي يحذف استخدام رابع أكسيد الأوزميوم مفيدا في الاحتفاظ بخصائص الفلورسنت وبالتالي التطبيق المزدوج للوسم المناعي بوساطة QD. تحتوي بعض الطرز الأحدث من TEM على خيار إرفاق نظام تحليل الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) الذي يسمح بتحديد التركيب الأولي للمواد. ومن القيود الأخرى للدراسة عدم وجود رسم خرائط عنصري لعينة وتحليل الصور باستخدام EDX. لذلك ، يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على تحليل EDX لأطياف QD لتحليل تكوين العنصر.

اكتسب وضع العلامات QD للبروتينات الكثير من الاهتمام في الآونة الأخيرة. تقدم QD العديد من التطبيقات والمزايا في كل من البحوث البيولوجية والعلاجات الطبية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم لف QD برباط متعدد الأسنان يظهر ثباتا متزايدا يحافظ على العائد الكمومي. علاوة على ذلك ، فإن تغليف QD بهذه العوامل الحيوية المواتية يزيد أيضا من توافره البيولوجي في الأنسجة مما يجعله مرشحا جيدا للتطبيق المحتمل في الكشف عن الأورام وتصوير الخلايا الحية وتوصيل الأدوية وتصوير الأنسجة3،31،32.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة: R01HL145753 و R01HL145753-01S1 و R01HL145753-03S1 و R01HL152723 ؛ جائزة خط النهاية LSUHSC-S CCDS ، وجائزة أبحاث COVID-19 ، وجائزة أبحاث LARC ل MSB ؛ زمالة LSUHSC-S Malcolm Feist للقلب والأوعية الدموية وزمالة AHA لما بعد الدكتوراه إلى CSA (20POST35210789) ؛ وزمالة LSUHSC-S Malcolm Feist لما قبل الدكتوراه إلى RA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 Mesh copper grid Ted Pella G200HH
6-month-old male mice with FVB/N background Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Acetone 100% Fisher Chemicals A949
Antibody diluent Dako S3022
anti-Sigmar1 antibody Cell Signaling 61994S
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody Sigma Aldrich B7389
BSAc (10%) Electron Microscopy Sciences 25557
Calcium chloride Sigma Aldrich C7902
Cytoseal Xyl Thermo fisher 8312-4
DER 732C36AA10:C33 Electron Microscopy Sciences 13010
Dextrose Sigma Aldrich G7528
Diamond Knife Diatome Histo; Ultra 450
DMAE Electron Microscopy Sciences 13300
Electron microscope JEOL JEOL-1400 Flash
ERL 4221 Electron Microscopy Sciences 15004
Ethanol 100% Fisher Chemicals A405P
Glutaraldehyde 3% Electron Microscopy Sciences 16538-15
Glycine Alfa Aesar A13816
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA56
Micromolds Ted Pella 10505
Microtome Leica Microsystem EM UC7
Normal goat serum Invitrogen PCN5000
NSA Electron Microscopy Sciences 19050
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19150
Parafilm Genesse Scientific 16-101
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5655
Potassium Phosphate monobasic Sigma Aldrich 71640
Qdot 655 Streptavidin Conjugate Invitrogen Q10121MP
Sodium Acetate Fisher Scientific BP334
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
Sodium metaperiodate Sigma Aldrich 71859
Sodium Phosphate dibasic Sigma Aldrich P9541
Surgical blade (size 10) Aspen surgical 371110
TEM  image software AMT-V700 AMT TEM imaging systems
TEM imaging camera XR80 TEM series AMT TEM imaging systems
Toluidine Blue O solution (0.5%) Fisher Scientic S25612
Uranyl acetate Polysciences 21447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lidke, D. S., Lidke, K. A. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).
  2. de Duve, C. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20 (1971).
  3. Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).
  4. Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).
  5. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).
  6. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  7. Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  9. Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).
  11. Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  12. Lidke, D. S., et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).
  13. Pleskova, S. N., et al. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).
  14. Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).
  15. Hanaki, K. -i, et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).
  16. Lim, Y. T., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).
  17. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  18. Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).
  19. Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).
  20. Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575 (2021).
  21. Bohne, B., Harding, G. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).
  22. Roszkowski, M. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).
  23. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988 (2021).
  24. Jones, W. K., et al. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).
  25. Hunter, E. E. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).
  26. Morris, R. E., Ciraolo, G. M. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).
  27. Brorson, S. H. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).
  28. Lobo, M. V. T., et al. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).
  29. Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).
  30. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  31. Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).
  32. Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233 (2021).

Tags

علم الأحياء، العدد 187،
تصور التوطين تحت الخلوي لبروتين في القلب باستخدام وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية متبوعا بالمجهر الإلكتروني النافذ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aishwarya, R., Abdullah, C. S.,… More

Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Remex, N. S., Nitu, S., Hartman, B., King, J., Bhuiyan, M. S. Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64085, doi:10.3791/64085 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter