Summary
이 프로토콜은 간단한 실험실 규모의 벤치탑 설정으로 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, sEV 마커 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화됩니다.
Abstract
초원심분리 기반 공정은 작은 세포외 소포(sEV) 분리를 위한 일반적인 방법으로 간주됩니다. 그러나 이 분리 방법의 수율은 상대적으로 낮고 이러한 방법은 sEV 아형을 분리하는 데 비효율적입니다. 이 연구는 hUC-MSC의 조건화된 배지에서 한외여과에 의해 성공적으로 분리된 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, 엑소좀 마커(CD9, CD81, TSG101) 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화되었습니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기는 30-200nm였으며 입자 농도는 7.75 ×10 10 particles/mL이고 단백질 농도는 80μg/mL였습니다. 엑소좀 마커 CD9, CD81 및 TSG101에 대한 양성 밴드가 관찰되었습니다. 이 연구는 hUC-MSC-sEV가 hUC-MSC 조건 배지에서 성공적으로 분리되었음을 보여주었고, 특성화는 분리된 생성물이 세포외 소포 연구를 위한 최소 정보 2018(MISEV 2018)에서 언급한 기준을 충족함을 보여주었습니다.
Introduction
MISEV 2018에 따르면 sEV는 기능적 핵이 존재하지 않는 비복제 지질 이중층 입자로 크기가 30-200nm1입니다. MSC 유래 sEV에는 microRNA, 사이토카인 또는 단백질과 같이 조직 재생에 중요한 역할을 하는 중요한 신호 분자가 포함되어 있습니다. 그들은 점점 더 재생 의학 및 무세포 요법의 연구 "핫스팟"이 되었습니다. 많은 연구에 따르면 중간엽 줄기세포에서 추출한 sEV는 면역조절 2,3,4,5, 골형성 강화 6, 당뇨병7,8 또는 혈관 재생 9,10과 같은 다양한 질환을 치료하는 데 중간엽 줄기세포만큼 효과적이다. 초기 단계 시험이 진행됨에 따라 MSCs-EV의 임상 번역과 관련된 세 가지 주요 주요 문제, 즉 EV의 수율, EV의 순도(세포 파편 및 단백질 및 사이토카인과 같은 기타 생물학적 오염 물질이 없음), 분리 후 EV의 인지질 이중층 막의 무결성이 강조되었습니다.
sEV를 분리하기 위한 다양한 방법이 개발되었으며, sEV의 밀도, 모양, 크기 및 표면 단백질을 이용한다(11). sEV 분리에서 가장 일반적인 두 가지 방법은 초원심분리 기반 및 한외여과 기반 기술입니다.
초원심분리 기반 방법은 sEV 분리에서 표준이 되는 방법으로 간주됩니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 유형의 초원심분리 기술은 차동 초원심분리와 밀도 구배 초원심분리입니다. 그러나 초원심분리 방법은 종종 수율이 낮고 고속 초원심분리기(100,000-200,000 × g)를 위한 고가의 장비가 필요합니다11. 또한, 초원심분리 기술만으로는 EV 아형(sEV 및 대형 EV)을 분리하는 데 비효율적이며, 그 결과 불순한 퇴적물층(11)이 생성된다. 마지막으로, 밀도 구배 초원심분리는 또한 시간이 많이 소요될 수 있으며 가속 및 감속 단계12 동안 구배 손상을 억제하기 위해 자당 완충액 추가와 같은 추가 예방 단계가 필요할 수 있습니다. 따라서, 초원심분리는 일반적으로 상대적으로 낮은 수율을 초래하고,EVs13의 상이한 집단을 구별할 수 없으며, 이는 대규모 EV 준비(11)에 대한 적용을 제한한다.
EV 격리의 두 번째 방법은 크기 여과를 기반으로 하는 한외여과를 통한 것입니다. 한외여과는 고가의 장비나 긴 처리 시간을 필요로 하지 않기 때문에 초원심분리에 비해 상대적으로 시간 및 비용 효율적이다14. 따라서, 한외여과는 앞서 언급한 두 가지 초원심분리 방법보다 더 효과적인 분리 기술인 것으로 보인다. 분리된 생성물은 기공 크기와 더 높은 수율에 기초하여 보다 구체적일 수 있다15. 그러나, 여과 과정 동안 발생하는 추가적인 힘은 EV(16)의 변형 또는 분출을 초래할 수 있다.
현재 논문은 다운스트림 분석 및 치료 목적을 위해 MSC 유래 sEV를 분리하기 위한 비용 및 시간 효율적인 벤치탑 프로토콜을 제안했습니다. 이 논문에 설명된 방법은 입자 크기 분석, 바이오마커 분석 및 전자 현미경 이미징을 포함한 다운스트림 분석을 위해 hUC-MSC에서 고수율 및 고품질 EV를 분리하기 위해 벤치탑 원심분리와 간단한 여과 방법을 결합했습니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 인간 탯줄 중간엽 줄기세포 및 배양
- hUC-MSC를 DMEM에서 5 ×10 3/cm2 의 파종 밀도로 배양하고, 8% 인간 혈소판 용해물 및 1% Pen-Strep으로 보충하였다. 세포를 5%CO2에서 37°C에서 인큐베이션한다. 적절한 세포 성장을 보장하기 위해 3일마다 세포 배양 배지를 교체하십시오.
- sEV 분리를 위해 T175 플라스크의 계대 5까지 세포를 확장합니다.
참고: 높은 수율의 sEV를 수확하려면 많은 플라스크가 필요합니다(수율은 세포 수에 따라 증가함).
2. hUC - MSCs에서 작은 세포외 소포 분리
- 배양이 계대 5에서 70%-80% 밀도에 도달하면 배양 배지를 1% Pen-Strep[조건부 배지(CM)]이 보충된 신선한 페놀-적색 유리 DMEM으로 교체합니다.
주의 : 기본 매체만 사용하십시오. 외부 sEV에 의한 오염을 피하기 위해 FBS 및 인간 혈소판 용해물 보충제를 피하십시오. - 24시간 후, CM을 200 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 0.22μm 필터를 통해 상청액을 수집하고 여과하여 220nm보다 큰 입자를 제거합니다.
- 0.2μm 필터로 여과된 30mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 원심 필터 장치를 채웁니다. 원심 필터 장치를 3,500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
- 여과된 CM을 원심 필터 장치에 채웁니다(각 장치의 최대 부피는 70mL). CM을 4°C에서 3,500 × g 으로 원심분리한다.
알림: 용액이 필터 표면에 도달할 때까지 원심분리 기간을 수시로 모니터링해야 합니다. - 여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 4°C에서 1,000 x g의 농축액 수집 컵으로 샘플 필터 컵을 2분 동안 역원심분리합니다.
- 농축된 CM을 원심 필터 장치로 다시 옮깁니다. 여과된 PBS 30mL를 원심분리 필터 유닛에 넣고 4°C에서 3,500×g으로 원심분리한다.
- 여과액 용액 컵에 용액을 버립니다. 필터부에 농축액 채취컵을 설치하고 1,000× g 에서 4°C에서 2분간 역원심분리하여 정제된 sEVs를 얻었다.
- 0.22μm 주사기 필터를 통해 sEV를 필터링합니다.
- 샘플을 새 튜브로 옮기고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.
3. hUC-MSC-sEV의 특성화
- 나노 입자 추적 분석
- 여과된 PBS에서 분리된 hUC-MSC-sEV를 20-100 입자/프레임으로 희석합니다.
- 희석된 샘플 1mL를 1mL 일회용 주사기를 사용하여 NTA 챔버에 넣습니다.
- 그에 따라 측정 설정을 지정합니다: 카메라 레벨을 레벨 14로 조정하고, 10-100개의 적십자 카운트를 제한하여 가능한 한 많은 입자를 포함하도록 감지 임계값을 결정하고, 블루 크로스 카운트는 5개로 제한합니다.
- 각 측정에 대해 5개의 1분 분량의 비디오를 녹화하고 감지 임계값이 5인 NanoSight 소프트웨어를 사용하여 분석합니다.
- 각 샘플에 대해 세 번 측정합니다.
- 웨스턴 블로팅 분석
- hUC-MSC-sEV를 얼음-차가운 방사성 면역침전 분석법(RIPA) 용해 완충액으로 용해하고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션하고, 4°C에서 5분 동안 200× g 에서 원심분리한다. 상청액을 수집합니다.
- Bicinchoninic Acid(BCA) Protein Assay Kit를 사용하여 단백질을 정량합니다. 그에 따라 설정된 겔 전기영동을 조립하고 단백질이 스태킹 겔의 끝에 도달할 때까지 90V에서 겔 전기영동을 수행합니다. 전압을 200V로 변경하여 분해 겔이 끝날 때까지 단백질을 분리합니다.
- 반건조 전사를 수행하여 단백질을 겔에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 1시간 동안 15V로 옮깁니다.
- 실온의 셰이커에서 3% 소 혈청 알부민(BSA)/트리스 완충 식염수-0.1% v/v 트윈 20(TBS-T)으로 PVDF 막을 1시간 동안 차단합니다. PVDF 막을 다음과 같이 1차 항체와 함께 인큐베이션한다: 마우스 항-CD 9 단일클론 항체 (1:500), 마우스 항-CD 81 단일클론 항체 (1:500), 마우스 항-GRP 94 단일클론 마우스 항-TSG 101 단일클론 항체 (1:500)를 4°C에서 하룻밤 동안 일정한 진탕.
- 다음날, PVDF 멤브레인을 TBS-T로 5 x 5분 세척하고 2차 항체인 양 고추 냉이 과산화효소 접합 마우스 IgG 카파 결합 단백질(m-IgGκ BP-HRP)(1:5,000)과 함께 실온에서 교반하면서 1시간 동안 추가로 배양합니다.
- 다시, TBS-T로 PVDF 멤브레인을 5회 세척하고, 화학발광 검출 시약을 사용하여 CCD(charge-coupled) 이미저에서 멤브레인을 시각화한다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질의 발현 수준을 분석합니다. 먼저 ImageJ에서 이미지 파일(파일 | 열기...). 밝기와 대비를 조정하여 이미지 품질 향상(Image | 조정 | 밝기/대비). 얼룩이 선명하게 보일 때까지 이미지를 조정하고 적용 버튼을 클릭한 다음 이미지를 TIFF 형식(파일 | 다른 이름으로 저장 | TIFF...)입니다.
- 투과 전자 현미경
- hUC-MSC-sEVs 샘플의 한 부분을 여과된 PBS의 4개 부분으로 총 부피 10μL로 희석하고 탄소 코팅된 구리 그리드에서 15분 동안 배양합니다.
- 실험실 물티슈를 사용하여 과도한 샘플을 제거하고 3분 동안 자연 건조시킵니다.
- 1% 포스포텅스텐산(PTA) 용액 10μL를 배양하여 샘플을 3분 동안 염색합니다.
- 실험실 물티슈를 사용하여 과도한 1% PTA 용액을 제거하고 3분 동안 자연 건조시킵니다.
- 투과 전자 현미경 이미징을 위해 샘플을 사용하십시오.
알림: 요약된 개략도 실험 단계는 그림 1 을 참조하십시오.
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Representative Results
그림 2 는 hUC-MSC-sEV가 53nm에서 입자 크기 모드를 갖는 반면 입자 크기의 다른 중요한 피크는 96nm 및 115nm임을 보여줍니다. NTA에 의해 측정된 hUC-MSC-sEVs의 농도는 7.75 ×10 10 particles/mL였다. BCA 분석으로 측정한 hUC-MSC-sEV의 단백질 농도는 약 80μg/mL였습니다.
웨스턴 블랏팅 분석에서 hUC-MSC-sEV는 엑소좀 마커 CD9, CD81 및 TSG101에 대해 양성 밴드를 나타내었지만 GRP94에 대해서는 음성이었습니다(그림 3). GRP94는 sEV의 음성 마커로 일반적으로 사용되는 소포체 마커입니다. 분리된 hUC-MSC-sEV를 TEM 하에서 시각화하여 크기와 형태를 결정했습니다. hUC-MSCs-sEVs 크기는 ~100nm이며 컵 모양의 이중층 막 구조를 보여주었습니다(그림 4).
그림 1: sEV의 분리, 청소 및 특성화에 대한 작업 개략도. 컨디셔닝 배지를 MSC 배양물로부터 수집하고, 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 거대 입자를 제거하였다. 여과된 배지를 원심 필터 유닛으로 옮겨 sEV를 농축하고 역원심분리하여 농축된 sEV를 수집했습니다. 이어서, 농축된 sEV를 저온 여과된 PBS로 재현탁시키고, 세척 단계를 위해 원심 필터 유닛으로 단계를 반복하였다. 마지막으로, sEV는 나노 입자 추적 분석, 웨스턴 블로팅 분석 및 투과 전자 현미경을 사용하여 특성화되기 전에 0.22μm 여과로 멸균되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 분리된 hUC-MSC-sEV의 나노입자 추적 분석. hUC-MSC-sEV를 정제된 PBS로 100-1,000배 희석하고 CMOS 카메라, 20배 대물 렌즈, 청색 레이저 모듈(488nm) 및 NTA 소프트웨어가 장착된 Nanosight NS300을 사용하여 측정했습니다. 이 그림은 NTA를 세 번 표현한 것입니다. 약어: hUC-MSC-sEVs = 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포체; NTA = 나노입자 추적 분석; CMOS = 상보성 금속 산화물 반도체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: hUC-MSC-sEVs의 바이오마커 발현. (A) CD9 엑소좀 양성 마커의 웨스턴 블롯 분석. (B) CD81 엑소좀 양성 마커의 웨스턴 블롯 분석. (C) TSG101 엑소좀 양성 마커의 웨스턴 블롯 분석. (D) GRP94 음성 마커의 웨스턴 블롯 분석. 4개의 마커 모두를 대조군으로서 세포 용해물과 비교하였다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 래더, 세포 용해물, hUC-MSC-sEVs (A,B); 사다리, hUC-MSC-sEVs, 세포 용해물, hUC-MSC-sEVs, 세포 용해물 (C); 래더, 세포 용해물, hUC-MSC-sEVs (D). 세포 용해물 쌍은 두 번의 반복에서 나온 것이며, 이 이미지는 세 번 수행된 실험의 대표 이미지입니다. 약어: hUC-MSC-sEVs = 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 투과 전자 현미경에서 단일 hUC-MSC-sEV의 형태. hUC-MSC-sEV를 탄소 코팅된 구리 그리드에서 배양하고 투과 전자 현미경으로 보기 전에 1% 포스포텅스텐산으로 염색했습니다. 약 100nm 크기의 hUC-MSC-sEV는 컵 모양의 이중층 막 구조를 보였다. 스케일 바 = 100nm. 이미지는 세 개의 독립적인 캡처를 나타냅니다. 약어: hUC-MSC-sEVs = 인간 탯줄 유래 MSC 작은 세포외 소포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
EV는 MSC에서 시크릿톰의 중요한 하위 집합 중 하나이며 정상 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 30nm에서 200nm 사이의 크기 범위를 가진 sEV는 지난 10년 동안 무세포 치료를 위한 잠재적인 도구로 부상했습니다. MSC에서 sEV를 분리하기 위해 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나, 차등 초원심분리, 한외여과, 고분자 기반 침전, 면역친화성 포획 및 미세유체 기반 침전은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있다17. 이러한 분리 기술 중 어느 것도 높은 회수율과 특이성을 달성할 수 없습니다. 따라서 연구자들은 높은 회수율 또는 높은 특이성을 기반으로 선호도에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다.
중간엽 줄기세포 sEV를 분리하기 전에, 중간엽 줄기세포를 앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석에 의해 양성 표면 마커 (CD90, CD105, CD73) 및 음성 마커 (CD34, CD11b, CD19, CD45 및 HLA-DR)에 대해 평가하였다18. sEV에 대한 이 연구의 기술적 이점은 현재 상황에 대한 해결책을 제공할 수 있습니다. sEV를 분리하기 위해 고급 장비를 사용하지 않도록 실험실에 기본 벤치탑만 설치하면 됩니다. 중간엽 줄기세포는 혈청을 첨가하지 않고 기술된 프로토콜에서 배양 배지로 굶주렸다. 이는 혈청 보충으로 인한 EV의 오염을 방지하는 데 중요합니다. 그러나 경우에 따라 혈청 보충제가 불가피하다는 점을 고려하면 완전한 배양 배지를 공식화할 때 엑소좀이 고갈된 혈청 보충제를 고려할 수 있습니다. 또한, 페놀 적색이 함유되지 않은 배지는 표준 배양 배지의 대체품으로 사용될 수 있는데, 이는 이 일반적인 pH 지시약이 비색 측정에 문제를 일으킬 수 있기때문이다 15. 이 프로토콜은 220nm보다 큰 입자를 제거하는 동안 기존 주사기 필터 대신 0.22μm 펌프 필터를 사용하여 개선할 수 있습니다. sEV의 수율을 향상시키기 위해 예방 조치를 취해야 합니다. 원심 필터 장치를 통한 CM의 마지막 원심분리에서는 필터에서 sEV를 용리하기에 충분한 양의 용액이 있는지 확인하기 위해 장기간의 원심분리를 피해야 합니다. 이를 간과하면 역 원심분리 단계에서 수집된 sEV의 수율이 감소할 수 있습니다.
이 프로토콜은 실험실 규모로 제한되므로 업계의 대규모 격리에는 적합하지 않을 수 있습니다. 이는 원심 필터 장치를 한 번 사용하는 데 드는 비용이 높기 때문에 일반적으로 최대 수천 리터의 CM을 포함하는 대규모 격리에는 적합하지 않습니다. 요약하면, MSC에서 파생된 sEV를 분리하기 위한 간단한 벤치탑 규모의 여과 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 추가 다운스트림 분석을 위해 분리된 sEV를 정제하는 데에도 적합합니다. 이 프로토콜은 MSC에서 파생된 sEV를 위해 특별히 설계되었지만 설명된 프로토콜의 일부를 사용하여 체액, 세포주 또는 기타 액체 유형 소스와 같은 다양한 소스에서 sEV를 분리할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 비디오의 출판은 My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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