Summary
Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.
Abstract
El proceso basado en la ultracentrifugación se considera el método común para el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares (sEV). Sin embargo, el rendimiento de este método de aislamiento es relativamente menor, y estos métodos son ineficientes para separar los subtipos de sEV. Este estudio demuestra un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEVs), separadas con éxito por ultrafiltración del medio condicionado de hUC-MSCs. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores exosomales (CD9, CD81, TSG101) y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizaron con análisis de seguimiento de nanopartículas, ensayo de proteína BCA, western blot y microscopio electrónico de transmisión, respectivamente. El tamaño de los hUC-MSC-sEVs aislados fue de 30-200 nm, con una concentración de partículas de 7,75 × 10 10 partículas/ml y una concentración de proteínas de80 μg/mL. Se observaron bandas positivas para los marcadores exosomales CD9, CD81 y TSG101. Este estudio mostró que los hUC-MSC-sEV se aislaron con éxito del medio condicionado hUC-MSC, y la caracterización mostró que el producto aislado cumplía con los criterios mencionados por Información mínima para estudios de vesículas extracelulares 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Según MISEV 2018, los sEV son partículas de bicapa lipídica no replicantes sin núcleo funcional presente, con un tamaño de 30-200 nm1. Los sEV derivados de MSC contienen importantes moléculas de señalización que desempeñan un papel importante en la regeneración de tejidos, como microARN, citoquinas o proteínas. Se han convertido cada vez más en un "punto caliente" de investigación en medicina regenerativa y terapia libre de células. Muchos estudios han demostrado que los sEV derivados de MSC son tan efectivos como las MSC en el tratamiento de diferentes afecciones, como la inmunomodulación 2,3,4,5, la mejora de la osteogénesis 6, la diabetes mellitus7,8 o la regeneración vascular 9,10. A medida que avanzan los ensayos de fase temprana, se han destacado tres cuestiones clave principales en relación con la traducción clínica de las MSC-EV: el rendimiento de las EV, la pureza de las EV (libres de desechos celulares y otros contaminantes biológicos como proteínas y citoquinas) y la integridad de la membrana bicapa de fosfolípidos de las EV después del aislamiento.
Se han desarrollado varios métodos para aislar sEVs, explotando la densidad, forma, tamaño y proteína de superficie de los sEVs11. Los dos métodos más comunes en los aislamientos de sEV son las técnicas basadas en la ultracentrifugación y las basadas en la ultrafiltración.
Los métodos basados en la ultracentrifugación se consideran métodos estándar de oro en el aislamiento de sEV. Dos tipos de técnicas de ultracentrifugación que se emplean generalmente son la ultracentrifugación diferencial y la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Sin embargo, los métodos de ultracentrifugación a menudo resultan en un bajo rendimiento y requieren equipos costosos para la ultracentrífuga de alta velocidad (100,000-200,000 × g)11. Además, las técnicas de ultracentrifugación por sí solas son ineficientes para separar los subtipos de EV (sEV y EV grandes), lo que resulta en una capa de sedimento impuro11. Por último, la ultracentrifugación por gradiente de densidad también podría llevar mucho tiempo y requerir medidas de precaución adicionales, como la adición de tampón de sacarosa, para inhibir el daño del gradiente durante los pasos de aceleración y desaceleración12. Por lo tanto, la ultracentrifugación generalmente conduce a un rendimiento relativamente bajo y no es capaz de discriminar entre diferentes poblaciones de EV13, lo que limita su aplicación para la preparación de EV a gran escala11.
El segundo método de aislamiento EV es a través de ultrafiltración, que se basa en la filtración de tamaño. La ultrafiltración es relativamente rentable y rentable en comparación con la ultracentrifugación, ya que no implica equipos costosos ni largos tiempos de procesamiento14. Por lo tanto, la ultrafiltración parece ser una técnica de aislamiento más efectiva que los dos métodos de ultracentrifugación antes mencionados. Los productos aislados pueden ser más específicos en función del tamaño de los poros y el mayor rendimiento15. Sin embargo, la fuerza adicional incurrida durante el proceso de filtración puede resultar en la deformación o erupción de los EV16.
El documento actual propuso un protocolo de sobremesa rentable y rentable para aislar los sEV derivados de MSC para análisis posteriores y fines terapéuticos. El método descrito en este documento combinó un método de filtración simple con centrifugación de sobremesa para aislar EV de alto rendimiento y buena calidad de hUC-MSC para análisis aguas abajo, incluido el análisis de tamaño de partícula, ensayo de biomarcadores e imágenes microscópicas electrónicas.
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Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Células madre mesenquimales del cordón umbilical humano y cultivo
- Cultivar las hUC-MSCs a una densidad de siembra de 5 × 103/cm2 en DMEM, suplementado con 8% de lisado de plaquetas humanas y 1% de pen-estreptococo. Incubar las células a 37 °C enCO2 al 5%. Reemplace el medio de cultivo celular cada 3 días para asegurar un crecimiento celular adecuado.
- Expandir las celdas al paso 5 en matraces T175 para el aislamiento de sEV.
NOTA: Se necesitan muchos matraces para cosechar un alto rendimiento de sEV (el rendimiento aumenta con el número de células).
2. Aislamiento de vesículas extracelulares pequeñas de hUC - MSCs
- Reemplace el medio de cultivo con DMEM fresco libre de rojo fenol suplementado con Pen-Strep [medio acondicionado (CM)] al 1% cuando el cultivo alcance una confluencia del 70% -80% en el paso 5.
PRECAUCIÓN: Utilice sólo medios basales; evitar FBS y suplemento de lisado de plaquetas humanas para evitar la contaminación por sEV externos. - Después de 24 h, centrifugar el CM a 200 × g durante 5 min a 4 °C para eliminar los restos celulares. Recoja y filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar partículas mayores de 220 nm.
- Llene la unidad de filtro centrífugo con 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) filtrada a través de un filtro de 0,2 μm. Centrifugar la unidad de filtro centrífugo a 3.500 × g durante 5 min a 4 °C.
- Llene el CM filtrado en la unidad de filtro centrífugo (el volumen máximo de cada unidad es de 70 ml). Centrifugar el CM a 3.500 × g a 4 °C.
NOTA: La duración de la centrifugación debe controlarse de vez en cuando hasta que la solución haya alcanzado la superficie del filtro. - Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Centrifugar inversamente el recipiente filtrante de muestra con un vaso de recogida de concentrado a 1.000 x g a 4 °C durante 2 min.
- Transfiera el CM concentrado de nuevo a la unidad de filtro centrífugo. Añadir 30 ml de PBS filtrado en la unidad de filtro centrífugo y centrifugar la unidad a 3.500 × g a 4 °C.
- Deseche la solución en el vaso de solución de filtrado. Instale una taza de recolección de concentrado en la unidad de filtro y una centrífuga inversa a 1.000 × g durante 2 min a 4 °C para obtener los sEV purificados.
- Filtrar los sEV a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm.
- Transfiera las muestras a nuevos tubos y almacénelas a -80 °C para su posterior análisis.
3. Caracterización de hUC-MSC-sEVs
- Análisis de seguimiento de nanopartículas
- Diluir los hUC-MSC-sEV aislados en PBS filtrado a 20-100 partículas/fotograma.
- Introducir 1 ml de la muestra diluida en la cámara NTA utilizando jeringas desechables de 1 ml.
- Establezca los ajustes de medición en consecuencia: ajuste el nivel de la cámara al nivel 14, determine el umbral de detección para incluir tantas partículas como sea posible con la restricción de que se cuenten 10-100 cruces rojas y el recuento de cruces azules se limite a cinco.
- Para cada medición, grabe cinco videos de 1 minuto y analícelos utilizando el software NanoSight con un umbral de detección de cinco.
- Tome medidas por triplicado para cada muestra.
- Análisis Western blotting
- Lise los hUC-MSC-sEV con tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación helada (RIPA), incubar durante 30 min a 4 °C y centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C. Recoge el sobrenadante.
- Cuantifique la proteína utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinchonínico (BCA). Ensamble el conjunto de electroforesis en gel en consecuencia y realice la electroforesis en gel a 90 V hasta que la proteína llegue al final del gel de apilamiento. Cambie el voltaje a 200 V para separar las proteínas hasta el final del gel de resolución.
- Realizar transferencia semiseca para transferir las proteínas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) a 15 V durante 1 h.
- Bloquear la membrana de PVDF con albúmina sérica bovina (BSA)/solución salina tamponada con Tris-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) al 3% durante 1 h en un agitador a temperatura ambiente. Incubar la membrana de PVDF con anticuerpos primarios de la siguiente manera: anticuerpo monoclonal anti-CD 9 de ratón (1:500), anticuerpo monoclonal anti-CD 81 de ratón (1:500), anticuerpo monoclonal anti-TSG 101 de ratón anti-GRP 94 de ratón (1:500) a 4 °C durante la noche con agitación constante.
- Al día siguiente, lavar la membrana de PVDF 5 x 5 min con TBS-T e incubar con un anticuerpo secundario: proteína de unión a IgG kappa de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) durante 1 h con agitación a temperatura ambiente.
- Una vez más, lave la membrana de PVDF con TBS-T cinco veces y visualice la membrana en un generador de imágenes de carga acoplada (CCD) utilizando un reactivo de detección de quimioluminiscencia. Analizar el nivel de expresión de las proteínas utilizando el software ImageJ. Primero, abra el archivo de imagen en ImageJ (Archivo | Abierto...). Mejorar la calidad de la imagen ajustando el brillo y el contraste (Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste). Ajuste la imagen hasta que las manchas sean claramente visibles, haga clic en el botón Aplicar y luego guarde las imágenes en formato TIFF (Archivo | Guardar como | TIFF...).
- Microscopio electrónico de transmisión
- Diluir una parte de la muestra hUC-MSC-sEVs con cuatro partes de PBS filtrado hasta un volumen total de 10 μL e incubar en una rejilla de cobre recubierta de carbono durante 15 min.
- Retire el exceso de muestra con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante 3 minutos.
- Incubar 10 μL de solución de ácido fosfotúngstico (PTA) al 1% para teñir la muestra durante 3 min.
- Retire el exceso de solución de PTA al 1% con una toallita de laboratorio y deje que se seque al aire durante 3 minutos.
- Utilice la muestra para obtener imágenes de microscopio electrónico de transmisión.
NOTA: Consulte la Figura 1 para ver los pasos resumidos del experimento esquemático.
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Representative Results
La Figura 2 muestra que los hUC-MSC-sEV tienen un modo de tamaño de partícula a 53 nm, mientras que otros picos significativos de tamaño de partícula fueron 96 y 115 nm. La concentración de hUC-MSC-sEVs medida por NTA fue de 7,75 × 1010 partículas/mL. La concentración proteica de hUC-MSC-sEVs medida con el ensayo BCA fue de aproximadamente 80 μg/ml.
En el análisis western blotting, los hUC-MSC-sEV demostraron bandas positivas para los marcadores exosomales CD9, CD81 y TSG101, pero fueron negativos para GRP94 (Figura 3). GRP94 es un marcador de retículo endoplásmico comúnmente utilizado como marcador negativo para sEVs. Los hUC-MSC-sEV aislados se visualizaron bajo TEM para determinar su tamaño y morfología. hUC-MSCs-sEVs tamaño ~100 nm y mostró una estructura de membrana bicapa en forma de copa (Figura 4).
Figura 1: Esquema de trabajo del aislamiento, limpieza y caracterización de sEVs. El medio acondicionado se recolectó del cultivo MSC y se filtró a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar partículas grandes. El medio filtrado se transfirió a una unidad de filtro centrífugo para concentrar los sEV y se centrifugaba inversamente para recoger los sEV concentrados. Los sEV concentrados se resuspendieron con PBS filtrado en frío, y los pasos se repitieron con una unidad de filtro centrífuga para los pasos de lavado. Por último, los sEV se esterilizaron mediante filtración de 0,22 μm antes de caracterizarse mediante análisis de seguimiento de nanopartículas, análisis de transferencia occidental y microscopía electrónica de transmisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de seguimiento de nanopartículas de hUC-MSC-sEVs aislados. Los hUC-MSC-sEV fueron diluidos 100-1,000x con PBS clarificado y medidos usando Nanosight NS300 equipado con una cámara CMOS, una lente de objetivo 20x, un módulo láser azul (488 nm) y software NTA. La figura es una representación de NTA por triplicado. Abreviaturas: hUC-MSC-sEVs = pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano; NTA = análisis de seguimiento de nanopartículas; CMOS = semiconductor complementario de óxido metálico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Expresión de biomarcadores de hUC-MSC-sEVs . (A) Análisis Western blot del marcador positivo exosomal CD9. (B) Análisis Western blot del marcador positivo exosomal CD81. (C) Análisis Western blot del marcador positivo exosomal TSG101. (D) Análisis de Western blot del marcador negativo GRP94. Los cuatro marcadores se compararon con el lisado celular como control. De izquierda a derecha, Escalera, Lisado celular, hUC-MSC-sEVs (A,B); Escalera, hUC-MSC-sEVs, lisado celular, hUC-MSC-sEVs, lisado celular (C); Escalera, lisado celular, hUC-MSC-sEVs (D). Los pares de lisado celular son de dos réplicas, y estas imágenes son imágenes representativas de experimentos realizados por triplicado. Abreviatura: hUC-MSC-sEVs = pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Morfología de hUC-MSC-sEVs individuales bajo microscopía electrónica de transmisión. Los hUC-MSC-sEV se incubaron en una rejilla de cobre recubierta de carbono y se tiñeron con ácido fosfotúngstico al 1% antes de ser vistos bajo el microscopio electrónico de transmisión. Los hUC-MSC-sEVs, con un tamaño de alrededor de 100 nm, mostraron una estructura de membrana bicapa en forma de copa. Barra de escala = 100 nm. La imagen es representativa de tres capturas independientes. Abreviatura: hUC-MSC-sEVs = pequeñas vesículas extracelulares MSC derivadas del cordón umbilical humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los EV son uno de los subconjuntos importantes del secretoma en las MSC que desempeñan un papel crucial durante los procesos normales y patológicos. Sin embargo, los sEV, con un rango de tamaño entre 30 y 200 nm, han aumentado como una herramienta potencial para la terapia libre de células en la última década. Se desarrollaron varias técnicas para aislar los sEV de las MSC. Sin embargo, la ultracentrifugación diferencial, la ultrafiltración, la precipitación basada en polímeros, la captura de inmunoafinidad y la precipitación basada en microfluídica poseen diferentes ventajas y desventajas17. Ninguna de estas técnicas de aislamiento puede lograr una alta tasa de recuperación y especificidad. Por lo tanto, los investigadores deben seleccionar los métodos apropiados de acuerdo con sus preferencias en función de una alta tasa de recuperación o alta especificidad.
Antes del aislamiento de los sEV de las MSC, las MSC se evaluaron para detectar marcadores de superficie positivos (CD90, CD105, CD73) y marcadores negativos (CD34, CD11b, CD19, CD45 y HLA-DR) mediante citometría de flujo como se describió anteriormente18. La ventaja técnica de este estudio de los vehículos eléctricos podría proporcionar una solución a la situación actual. Solo requiere una configuración básica de sobremesa en el laboratorio para evitar el uso de equipos de alta gama para aislar los sEV. Los MSC fueron hambrientos con medios de cultivo en el protocolo descrito sin agregar ningún suero. Esto es crucial para prevenir cualquier contaminación de EV originada por la suplementación con suero. Sin embargo, teniendo en cuenta que los suplementos séricos son inevitables en algunos casos, los suplementos séricos sin exosomas se pueden considerar en la formulación de medios de cultivo completos. Además, los medios libres de rojo de fenol podrían utilizarse como sustituto de los medios de cultivo estándar, ya que este indicador de pH común podría causar problemas con las mediciones colorimétricas15. El protocolo se puede mejorar utilizando un filtro de bomba de 0,22 μm en lugar de un filtro de jeringa convencional durante la eliminación de partículas mayores de 220 nm. Se deben tomar precauciones para mejorar el rendimiento de los sEV. En la última centrifugación de CM a través de una unidad de filtro centrífugo, se debe evitar la centrifugación prolongada para garantizar que haya suficiente volumen de solución para eluyir los sEV del filtro. Pasar por alto esto puede reducir el rendimiento de los sEV recogidos durante la etapa de centrifugación inversa.
Este protocolo se limita a la escala de laboratorio y, como tal, puede no ser adecuado para el aislamiento a gran escala en la industria. Esto se debe al alto costo del uso único de una unidad de filtro centrífugo, que no es factible para el aislamiento a gran escala, que generalmente implica un volumen de hasta miles de litros de CM. En resumen, proporcionamos un protocolo de filtración simple a escala de sobremesa para aislar sEV derivados de MSC. Este protocolo también es adecuado para purificar sEV aislados para un análisis posterior posterior. Aunque este protocolo está diseñado específicamente para sEV derivados de MSC, una parte del protocolo descrito se puede usar para aislar sEV de diferentes fuentes, como fluidos corporales, líneas celulares u otras fuentes de tipo líquido.
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Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
La publicación de este video fue apoyada por My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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