Summary
Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.
Abstract
Poiché le funzioni cerebrali sono sotto l'influenza continua dei segnali derivati dai tessuti periferici, è fondamentale chiarire come le cellule gliali nel cervello percepiscono varie condizioni biologiche nella periferia e trasmettono i segnali ai neuroni. Le microglia, cellule immunitarie nel cervello, sono coinvolte nello sviluppo sinaptico e nella plasticità. Pertanto, il contributo della microglia alla costruzione del circuito neurale in risposta allo stato interno del corpo dovrebbe essere testato criticamente mediante imaging intravitale della relazione tra dinamica microgliale e attività neuronale.
Qui, descriviamo una tecnica per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli. Il virus adeno-associato che codifica R-CaMP, un indicatore di calcio codificato dal gene della proteina di fluorescenza rossa, è stato iniettato nello strato 2/3 della corteccia visiva primaria in topi transgenici CX3CR1-EGFP che esprimono EGFP nelle microglia. Dopo l'iniezione virale, una finestra cranica è stata installata sulla superficie del cervello della regione iniettata. L'imaging a due fotoni in vivo in topi svegli 4 settimane dopo l'intervento chirurgico ha dimostrato che l'attività neurale e la dinamica microgliale potevano essere registrate simultaneamente alla risoluzione temporale inferiore al secondo. Questa tecnica può scoprire la coordinazione tra dinamica microgliale e attività neuronale, con la prima che risponde agli stati immunologici periferici e la seconda che codifica gli stati interni del cervello.
Introduction
Vi è una crescente evidenza che lo stato interno del corpo influenza costantemente le funzioni cerebrali negli animali 1,2,3,4,5. Di conseguenza, per ottenere una comprensione più profonda delle funzioni cerebrali, è fondamentale chiarire come le cellule gliali nel cervello monitorano le condizioni biologiche nella periferia e trasmettono le informazioni ai neuroni.
Le microglia, cellule immunitarie nel cervello, sono coinvolte nello sviluppo sinaptico e nella plasticità, che scolpiscono le caratteristiche dei circuiti neurali nel cervello 6,7,8,9. Ad esempio, il lavoro pionieristico di Wake et al. ha dimostrato che i processi microgliali entrano in contatto con le sinapsi in modo dipendente dall'attività neuronale nella neocorteccia del topo e che l'ischemia artificiale induce la perdita di sinapsi dopo un contatto prolungato con la microglia10. Tremblay et al. hanno scoperto che l'alterazione dell'esperienza visiva cambia la modalità di interazione microgliale con le sinapsi. Durante il periodo critico in cui il turnover della colonna vertebrale dendritica nella corteccia visiva primaria (V1) è aumentato dalla deprivazione binoculare, l'adattamento al buio riduce la motilità dei processi microgliali e aumenta sia la loro frequenza di contatto con le schisi sinaptiche che il numero di inclusioni cellulari nella microglia11. Questi risultati suggeriscono che i processi microgliali rilevano l'attività neurale e il loro ambiente circostante per rimodellare i circuiti neurali. Inoltre, uno studio recente ha riportato che la sorveglianza microgliale differisce tra condizioni di veglia e anestetizzate, suggerendo l'importanza di esperimenti che utilizzano topi svegli per studiare la comunicazione neurone-microglia in condizioni fisiologiche12.
L'imaging del calcio a due fotoni in vivo è un potente strumento per la registrazione della dinamica del calcio, che riflette l'attivazione neuronale in corso, in centinaia di neuroni contemporaneamente in un animale vivente13,14,15. L'imaging del calcio nei neuroni richiede generalmente una risoluzione temporale di più di pochi Hz per tracciare le risposte neuronali rapide16,17. Al contrario, studi precedenti che monitorano la dinamica microgliale hanno campionato strutture microgliali a una risoluzione temporale relativamente bassa inferiore a 0,1 Hz18,19,20. Uno studio recente ha applicato l'imaging simultaneo a due fotoni per comprendere la comunicazione neurone-microglia21. Tuttavia, non è ancora chiaro come i processi microgliali dinamici rispondano all'attività neurale circostante con una risoluzione temporale di più di pochi Hz nei topi svegli. Per risolvere questo problema, descriviamo un metodo simultaneo di imaging a due fotoni in vivo dell'attività neurale e della dinamica microgliale con una risoluzione temporale superiore a 1 Hz nei topi svegli. Questo metodo ci consente di ottenere immagini stabili nei topi svegli a un frame rate più elevato (massimo, 30 Hz con la dimensione del fotogramma dei pixel di 512 x 512 pixel) e fornisce un modo più favorevole per studiare il comportamento di sorveglianza delle microglia o la loro interazione con l'attività neuronale nei topi svegli.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico animale e dal Comitato per la sicurezza degli esperimenti genetici ricombinanti della Graduate School of Medicine e della Facoltà di Medicina dell'Università di Tokyo ed eseguiti secondo le loro linee guida.
1. Preparazione
- Sterilizzare tutti gli strumenti e gli apparati necessari per l'intervento chirurgico utilizzando autoclave o etanolo al 70%.
- Preparazione della pipetta di vetro.
- Fissare saldamente un capillare calibrato da 75 μL al supporto dell'estrattore di micropipette. Impostare l'estrattore sul programma con i parametri consigliati come P (pressione) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180.
- Dopo aver terminato il programma (di solito da 4,5 a 5 s), il capillare viene diviso in due pipette di vetro con code affusolate. Quindi, rompere la parte distale delle code con una pinzetta per mantenere il diametro della punta entro 30-50 μm. Per questo, rompere le code distali di 1 cm alla fine della parte smussata.
- Per la craniotomia, preparare una finestra cranica incollando un disco di vetro esterno più grande, di 4 mm di diametro, 0,15 ± 0,02 mm di spessore, su un disco di vetro interno più piccolo, 2 mm di diametro, 0,525 ± 0,075 mm di spessore, utilizzando un reagente di fotopolimerizzazione UV (Figura 2A).
2. Iniezione di AAV
- Preparazione dell'apparecchio di iniezione
- Posizionare una pipetta di vetro collegata a una siringa Hamilton da 26 G attraverso un tubo su un portapipette di uno strumento stereotassico, quindi inclinare il portapipette di 60° anteriormente rispetto all'asse verticale (figura 1A,B).
- Riempire la pipetta di vetro, la siringa e il tubo di collegamento con paraffina liquida. Posizionare la siringa su un microiniettore.
- Procedura chirurgica
NOTA: Il seguente intervento chirurgico è stato eseguito in una cabina sterilizzata. Uno stereomicroscopio è stato utilizzato per l'intervento chirurgico, se necessario.- Anestetizzare un topo CX3CR1-EGFP maschio (informazioni dettagliate nella Tabella dei Materiali) a 7-8 settimane (peso corporeo 22-26 g) con isoflurano al 3% in una camera a tenuta di gas. Dopo 3 minuti, estrarre il topo dalla camera quando perde il movimento volontario tranne la respirazione, quindi passare all'anestesia continua con un tubo nasale con isoflurano al 2%.
NOTA: L'isoflurano è noto per attivare la microglia. Tuttavia, poiché l'imaging viene eseguito 4 settimane dopo l'intervento chirurgico, non vi è alcun effetto dell'isoflurano sui topi durante l'imaging. Sebbene l'anestesia con isoflurano venga utilizzata per alcuni minuti quando i topi vengono inseriti nello strumento stereotassico prima dell'imaging (passo 4.2.1), abbiamo scoperto che l'effetto di questa breve anestesia è trascurabile. - Durante l'intervento chirurgico, tenere il topo caldo con una piastra riscaldante a 37 °C per prevenire l'ipotermia. Applicare unguento oculare su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale e somministrare un'iniezione di meloxicam, per via sottocutanea (5 mg / kg). Collegare il mouse a una barra auricolare ausiliaria, quindi fissare il mouse sullo strumento stereotassico con il lato dorsale verso l'alto.
- Regolare la concentrazione di isoflurano a una percentuale appropriata (1% -2%) durante l'intervento chirurgico mentre si monitora il respiro e la frequenza cardiaca. Rimuovere i capelli con una crema depilatoria e disinfettare la testa più volte con un movimento circolare sia con uno scrub a base di iodio o clorexidina che con alcool. Quindi, iniettare 0,1 ml di lidocaina all'1% per via sottocutanea e applicare teli sterili per proteggere il sito chirurgico.
- Incidere il cuoio capelluto aperto lungo la linea mediana con le forbici ed effettuare l'incisione lunga circa 2 cm, per garantire una buona esposizione del cranio sopra la corteccia visiva primaria destra. Dopo l'incisione del cuoio capelluto, irrigare la testa con soluzione salina durante l'intera procedura per evitare che il cranio e il cervello esposti si secchino.
- Rimuovere il periostio sul cranio esposto usando una pinza. Forare il cranio sulle coordinate stereotassiche: 3 mm lateralmente alla linea mediana, 0,5 mm anteriormente alla linea lambda, per creare un piccolo foro con circa 0,5 mm di diametro. Risciacquare via i residui di sangue e tessuto dalla punta del trapano, se necessario.
- Riempire la pipetta di vetro con 1 μL di rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 utilizzando la seguente procedura con un titolo di 8,3 x 1012 genomi vettoriali/mL22.
- Far avanzare la siringa per espellere 1 μL di paraffina liquida dalla pipetta di vetro. Posizionare un pezzo di pellicola trasparente, circa 2 cm x 2 cm, sul cranio esposto del topo ed espellere una goccia di 1 μL di soluzione AAV sulla pellicola usando un pipettatore.
- Posizionare la punta della pipetta di vetro nella goccia di soluzione AAV sulla pellicola e tirare delicatamente la siringa per aspirare la soluzione AAV. Dopo l'espulsione, ruotare il rubinetto a forma di T per rilasciare la pressione all'interno del tubo e della pipetta di vetro.
- Inserire la pipetta di vetro ad una profondità di 500 μm dalla superficie del cervello attraverso il foro creato al punto 2.2.5, quindi iniettare 0,5 μL di soluzione AAV utilizzando il microiniettore (Figura 1C). Utilizzare la portata volumetrica di iniezione di 2,0 μL/h; un'iniezione di 0,5 μL richiede 15 minuti e successivamente attendere 5 minuti.
- Dopo l'iniezione, ritirare delicatamente la pipetta di vetro e sciacquare la superficie del cervello con soluzione salina.
- Anestetizzare un topo CX3CR1-EGFP maschio (informazioni dettagliate nella Tabella dei Materiali) a 7-8 settimane (peso corporeo 22-26 g) con isoflurano al 3% in una camera a tenuta di gas. Dopo 3 minuti, estrarre il topo dalla camera quando perde il movimento volontario tranne la respirazione, quindi passare all'anestesia continua con un tubo nasale con isoflurano al 2%.
3. Impianto della finestra cranica
NOTA: L'impianto della finestra cranica segue l'iniezione di AAV lo stesso giorno.
- Segna un cerchio di 2,5 mm di diametro sul cranio, centrato di 3 mm lateralmente dalla lambda. Creare una scanalatura circolare lungo il segno sul cranio perforando. Pulire i detriti in quanto potrebbero influire negativamente sulla visibilità del cranio e applicare soluzione salina durante il processo di perforazione per evitare il riscaldamento.
- Per verificare se la profondità di perforazione nella scanalatura circolare è sufficiente per rimuovere il frammento centrale del cranio, premere delicatamente il cranio centrale con una pinza. Se si muove verticalmente con poca resistenza, la profondità di perforazione è sufficiente.
- Quando il solco raggiunge una profondità sufficiente, inserire la punta della pinza nella parte inferiore del frammento centrale del cranio e sollevarla delicatamente e rimuoverla per esporre la superficie del cervello (Figura 1D).
- Usando un ago da 27 G, pungere e strappare la dura sul bordo della superficie cerebrale esposta. Inserire la punta della pinza attraverso il foro praticato sul bordo della dura. Tenere la dura e staccarla per esporre la superficie del cervello.
NOTA: Se si verifica sanguinamento, sciacquare la superficie del cervello con soluzione salina fino a quando l'emorragia si ferma. - Utilizzando una pinza, disperdere le fibre emostatiche una ad una in soluzione salina in un piatto da 3,5 mm, quindi posizionare le fibre emostatiche lungo i margini del foro in cui è presente la dura transettata.
- Posizionare una finestra cranica preparata al punto 1.3 sulla superficie cerebrale esposta, quindi farla aderire al cranio con colla istantanea mentre si preme delicatamente la finestra in modo che la finestra sia a stretto contatto con il cranio.
- Successivamente, applicare la colla istantanea su tutto il cranio esposto, quindi attaccare con cura una piastra frontale sul cranio in modo che la finestra si trovi al centro del foro quadrato della piastra di testa (Figura 2C). Assicurarsi che la superficie della piastra di testa sia parallela alla superficie della finestra di vetro.
- Dopo che la colla si è sufficientemente indurita, applicare cemento dentale sul cranio esposto per rinforzare l'attacco tra la testa e la piastra di testa (Figura 2).
NOTA: Se gli esperimenti includono la presentazione di stimoli visivi ai topi, la luce diffusa nell'area di imaging deve essere evitata. Si consiglia di annerire il cemento mescolandolo con il carbone attivo per la riduzione della riflessione della luce. - Ritirare il topo dall'anestesia dopo che il cemento si è indurito sufficientemente (circa 20 minuti). Quindi, metti il mouse in una nuova gabbia per recuperare da solo.
- Dopo aver confermato la sua coscienza e il movimento volontario, indicando il pieno recupero, rimetti il topo nella gabbia di casa. Durante il recupero, somministrare una seconda, o più se necessario, dose di meloxicam (una volta ogni 24 ore per 1-3 giorni) se si verificano evidenti comportamenti che indicano dolore.
4. Imaging a due fotoni in vivo della microglia e della dinamica neuronale del calcio
- Assuefazione dei topi all'apparato del microscopio
- Tre settimane dopo l'intervento, indurre l'anestesia nel topo con isoflurano al 3% e posizionare il topo sotto la lente obiettiva 25x di un microscopio a due fotoni utilizzando uno strumento stereotassico su misura (Figura 3C). Per la configurazione qui, il mouse è impostato sulla parte superiore di un tapis roulant e può correre liberamente.
- Circa 10 minuti dopo, rimuovere il mouse dalla fase del microscopio e riportarlo nella gabbia di casa. Ripetere l'abitudine almeno 3 volte a giorni alterni prima dell'acquisizione di immagini a due fotoni.
- Acquisizione di immagini a due fotoni
NOTA: Si consiglia di eseguire l'acquisizione dell'immagine più di 4 settimane dopo l'intervento, poiché l'attivazione microgliale ritorna gradualmente al livello basale.- Come al punto 4.1, indurre l'anestesia nel topo con isoflurano al 3% e posizionare il topo sotto la lente dell'obiettivo del microscopio a due fotoni utilizzando uno strumento stereotassico personalizzato.
- Installare il dispositivo di ombreggiatura personalizzato e un monitor LCD per la stimolazione visiva come descritto di seguito (Figura 3D).
- Posizionare l'obiettivo per mettere a fuoco la superficie del cervello, quindi impostare questa posizione dell'obiettivo come posizione Z originale. Mantenere costanti le coordinate x-y ed elevare l'obiettivo; Rimuovere il mouse e lo strumento stereotassico dall'obiettivo e dal tapis roulant.
- Fissare un dispositivo di ombreggiatura sulla parte superiore della piastra di testa utilizzando silicone, che viene annerito mescolando con polvere di carbone, e assicurarsi che lo spazio tra la piastra di testa e il dispositivo di ombreggiatura sia ben sigillato.
- Riempire il dispositivo di ombreggiatura con acqua distillata, quindi fissare nuovamente il mouse e il telaio stereotassico sotto l'obiettivo e sul tapis roulant. Ripristinare con attenzione il piano focale sulla superficie del cervello, controllando la profondità della lente dell'obiettivo.
NOTA: per evitare il rischio di danneggiare l'obiettivo, impostare prima le coordinate xyz, quindi applicare il dispositivo di ombreggiatura dell'obiettivo. È anche ragionevole installare prima il coperchio e quindi regolare le coordinate, ma per questa opzione è necessaria una gestione prudente. - Coprire l'obiettivo con un foglio di alluminio nero per evitare la contaminazione della luce dal monitor LCD utilizzato per la stimolazione visiva attraverso la lente dell'obiettivo (Figura 3D). Impostare un monitor LCD da 10 pollici a 12,5 cm davanti agli occhi del mouse per presentare stimoli visivi (Figura 3D).
- Configurare i filtri di raccolta delle emissioni di fluorescenza su fluorescenza EGFP (filtro di emissione 525/50 nm) e fluorescenza R-CaMP (filtro di emissione 593/46 nm) e la lunghezza d'onda di eccitazione a 1.000 nm. Acquisisci immagini con una risoluzione spaziale di 0,25 μm/pixel utilizzando un obiettivo 25x 1,1 NA e PMT GaAsP.
- Trova la regione di imaging in cui i neuroni R-CaMP (+) e la microglia EGFP (+) possono essere visualizzati simultaneamente nello strato 2/3. Per questa configurazione, i dati ottenuti nella Figura 4 e nel Video 1 si trovavano a una profondità di 100 μm dalla superficie piale, utilizzando un'anteprima dell'immagine dal vivo. Mantenere la potenza del laser di eccitazione il più bassa possibile per evitare foto-sbiancamento e danni causati dall'aumento della temperatura locale nella regione di imaging.
- Acquisire immagini al frame rate di 30 Hz. Contemporaneamente all'acquisizione dell'immagine, presentare uno stimolo visivo drifting-grating al 100% di contrasto, 1,5 Hz, 0,04 cicli per grado in 12 direzioni a 6 orientamenti da 0° a 150° in passi di 30° al mouse17.
- Dopo l'acquisizione dell'immagine, rimuovere il mouse dallo stadio del microscopio, staccare il dispositivo di ombreggiatura e lo strumento stereotassico dal mouse e riportare il mouse nella sua gabbia di casa.
- Registrazione dei dati
- Converti e salva i dati di immagine acquisiti (in questo caso il formato nd2) come una serie di file di immagine tiff per ogni canale di colore, utilizzando Fiji o il software fornito con il microscopio.
- Applicare Turboreg, un plugin delle Fiji, per eseguire la registrazione con mode = translation. Utilizzare l'immagine media come immagine di riferimento con i file di immagine tiff del canale EGFP.
- Esegui la seguente elaborazione per ogni frame utilizzando MATLAB.
NOTA: Sebbene MATLAB sia utilizzato nella seguente elaborazione, la descrizione si concentra principalmente sull'intenzione di ogni passaggio in modo che i dati possano essere analizzati da altri software di programmazione come Python.- Utilizzare la funzione imread per leggere due immagini tiff EGFP prima e dopo la registrazione dello stesso fotogramma, rispettivamente. Utilizzare la funzione imread per leggere l'immagine tiff R-CaMP dello stesso fotogramma.
- Utilizzare la funzione normcorr2 per calcolare la funzione di correlazione tra le variabili vettorizzate delle due immagini GFP lette al punto 4.3.3.1.
- Utilizzare la funzione max per rilevare l'indice lineare con la correlazione incrociata più elevata della funzione di correlazione, quindi utilizzare la funzione ind2sub per calcolare la posizione di movimento dell'immagine registrata dall'immagine originale.
- Utilizzare la funzione imwarp per tradurre l'immagine R-CaMP nella posizione calcolata al punto 4.3.3.3, quindi utilizzare la funzione imwrite per salvare l'immagine registrata di R-CaMP.
- Generazione di tracce di calcio
- Eseguire la seguente elaborazione utilizzando MATLAB. Utilizzare la funzione imread per leggere tutte le immagini tiff R-CaMP registrate generate al punto 4.3.3.4. Se le immagini registrate sono già state caricate come variabile nell'area di lavoro, omettere questo passaggio.
- Utilizzare la funzione media per generare un'immagine di proiezione temporale. Utilizzare la funzione imshow per mostrare l'immagine media come figura; utilizzare la funzione roipoly per generare una maschera binaria ROI della struttura target (spina dendritica in questi dati).
- Utilizzando la funzione media con le immagini ottenute moltiplicando la maschera binaria con le immagini di ciascun fotogramma come variabili di input, calcolare l'intensità media della fluorescenza all'interno del ROI per ciascun fotogramma.
- Come descritto in precedenza17, alla variabile ottenuta al punto 4.4.3, applicare il filtro di frequenza del burro al cutoff = 1,6 s, per tagliare il rumore ad alta frequenza, quindi applicare il filtro mediano scorrevole alla finestra temporale = 200 s, per tagliare il rumore a bassa frequenza.
Representative Results
Abbiamo eseguito l'iniezione di AAV e l'impianto della finestra cranica in V1 di un topo transgenico CX3XR1-EGFP di 8 settimane come descritto in questo protocollo. Quattro settimane dopo l'intervento, abbiamo eseguito simultaneamente l'imaging a due fotoni in vivo dell'attività neurale basata su R-CaMP e della dinamica microgliale nello strato 2/3 di V1 (Figura 4 e Video 1). Durante l'imaging, il mouse è stato posizionato su un tapis roulant e lasciato correre liberamente. Le immagini sono state acquisite al frame rate di 30 Hz con una risoluzione spaziale di 0,25 μm/pixel utilizzando un obiettivo 25x, 1,1 NA e PMT GaAsP. Sia EGFP che R-CaMP sono stati eccitati a una lunghezza d'onda di 1.000 nm e la fluorescenza EGFP (filtro di emissione 525/50 nm) e la fluorescenza R-CaMP (filtro di emissione 593/46 nm) sono state raccolte simultaneamente. Dopo la registrazione dei dati acquisiti per ridurre al minimo gli artefatti di movimento, ogni quattro fotogrammi sono stati mediati in un fotogramma per ridurre il rumore di fondo. Gli stimoli visivi del reticolo sono stati presentati al topo e sono state analizzate le risposte visive dei neuroni e delle singole spine dendritiche (Figura 4D). I processi microgliali hanno mostrato dinamiche veloci e hanno cambiato la loro morfologia entro 10 secondi (Figura 4E e Video 1). Come descritto nella sezione Discussione, quando l'iniezione di AAV non è riuscita, l'espressione di R-CaMP non poteva essere rilevata. Se l'intervento chirurgico non ha avuto successo, i segnali di EGFP e R-CaMP non potevano essere osservati.
Figura 1: Iniezione di AAV . (A) Una pipetta di vetro è stata collegata a una siringa Hamilton da 26 G utilizzando un tubo di silicio. (B) Il set-up per l'iniezione di AAV. (C) La soluzione AAV è stata iniettata attraverso la pipetta di vetro inclinata di 60° anteriormente rispetto all'asse verticale. (D) Schema della procedura del cranio aperto (descritto al punto 3.3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Finestra cranica e piastra cranica . (A) Schema dell'impianto della finestra cranica. (B) Sono state utilizzate piastre di testa su misura. Per l'imaging nell'emisfero destro, il braccio più corto deve essere utilizzato sul lato destro. (C) Vista dorsale di un topo con una finestra cranica e una piastra cranica impiantata. (D) Vista ad alto ingrandimento della finestra cranica mostrata nella Figura 2C. (E) Vista dorsale di un topo fissato con lo strumento stereotassico su misura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Il set-up per l'imaging in vivo a due fotoni. (A) Vista dorsale del dispositivo di ombreggiatura. (B) Vista laterale del dispositivo di ombreggiatura. (C) Vista di un mouse con il dispositivo di ombreggiatura sulla piastra di testa sotto la lente dell'obiettivo. Il mouse è posizionato sul tapis roulant. (D) Vista al microscopio a eccitazione a due fotoni. Un monitor che presenta stimoli visivi è posizionato sul lato destro della figura. L'obiettivo è coperto con il dispositivo di ombreggiatura e un foglio di alluminio nero per evitare la luce dal monitor all'obiettivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Dinamica microgliale e risposte visive in una spina dendritica. (A-C) Immagini mediate nel tempo di microglia EGFP (+) e neuroni R-CaMP (+) nello strato 2/3 di V1 in un topo transgenico CX3XR1-EGFP di 12 settimane. L'intensità del segnale in ciascun canale è stata normalizzata in modo indipendente. (D) Risposte visive in una colonna vertebrale dendritica. I diagrammi a strisce con frecce nere indicano la direzione degli stimoli della griglia presentati nei tempi indicati dalle colonne grigie. Nelle tracce di calcio, le linee grigie indicano le risposte individuali e una linea nera indica la loro media. Nell'inserto destro, una punta di freccia gialla indica la colonna vertebrale dendritica in cui è stata generata la regione di interesse (ROI) per acquisire le tracce di calcio. (E) Il processo microgliale (punta di freccia ciano) ha mostrato una rapida retrazione in 10 s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Imaging a due fotoni dell'attività neuronale e della dinamica microgliale. Dati di imaging della microglia EGFP (+) e dei neuroni R-CaMP (+) nello strato 2/3 di V1 in un topo transgenico CX3XR1-EGFP di 12 settimane. Sul lato sinistro del film, il magenta indica R-CaMP nei neuroni e il verde indica EGFP nella microglia. Il centro del filmato corrisponde al segnale EGFP e il lato destro corrisponde al segnale R-CaMP. L'intensità del segnale in ciascun canale è stata normalizzata in modo indipendente. Il frame rate del filmato è 40 volte più veloce del tasso effettivo. Barra di scala = 10 μm Clicca qui per scaricare questo video.
Discussion
Descriviamo il protocollo di iniezione di AAV e craniotomia per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli, nonché l'elaborazione dei dati. Questa tecnica può scoprire la coordinazione tra dinamiche microgliali e attività neuronale su scale temporali che vanno da meno di secondo a decine di secondi.
Il protocollo chirurgico prevede diversi passaggi tecnicamente impegnativi. L'iniezione di AAV è uno dei passaggi critici. L'iniezione non riuscita di AAV può causare una significativa riduzione dell'espressione di R-CaMP. Ci sono due ragioni principali: pipette di vetro intasate e danni ai tessuti. L'intasamento delle pipette di vetro riduce o blocca completamente l'espulsione della soluzione AAV. Questa situazione può essere evitata colorando la soluzione AAV con un colorante come il verde veloce e confermando visivamente il successo dell'iniezione. Il danno tissutale causato dall'iniezione di AAV impedisce l'espressione genica esogena vicino al centro del sito di iniezione. È probabile che il danno indotto dall'iniezione di AAV sia causato da un improvviso aumento dell'efflusso dalla punta della pipetta di vetro dopo l'accumulo della pressione all'interno della pipetta. Pertanto, il deflusso della soluzione AAV dalla pipetta di vetro deve essere costante durante l'iniezione. La selezione di pipette di vetro con un diametro leggermente più largo sulle punte risolverebbe questo problema. Nell'impianto della finestra cranica, la velocità della chirurgia è fondamentale. Se l'intervento chirurgico richiede troppo tempo, il tessuto cerebrale può essere gravemente danneggiato. Di conseguenza, è necessaria una pratica ripetuta per garantire la velocità e la fluidità della chirurgia. Inoltre, durante le 4 settimane dall'intervento chirurgico all'imaging, la qualità dell'imaging può essere ridotta dalla rigenerazione del tessuto tra la finestra cranica e il tessuto cerebrale con il metodo convenzionale17. Il metodo qui supera questo problema applicando occhiali spessi per il disco di vetro interno delle finestre craniche per inibire la rigenerazione dei tessuti e mantenere la finestra libera. Nel sistema qui descritto, questo effetto era evidente utilizzando un disco di vetro interno con uno spessore di 0,525 ± 0,075 μm.
Il metodo può essere applicato con successo a topi di età superiore alle 4 settimane, ma l'applicazione ai topi più giovani può essere problematica. Nei topi giovani, il cranio mostra una crescita rapida e prominente, che induce una discrepanza tra l'osso cranico e la finestra di vetro.
In alcuni studi all'avanguardia, l'imaging a due fotoni in vivo è stato utilizzato per studiare le interazioni microglia-neurone 12,21,23. Soprattutto nel lavoro pionieristico di Merlini et al., hanno eseguito simultanee immagini in vivo della dinamica microgliale e dell'attività neurale all'interno dei corpi cellulari21. In questo metodo, utilizzando occhiali interni più spessi per le finestre craniche, potremmo sopprimere gli artefatti di movimento nell'orientamento della profondità e ottenere la misurazione stabile dell'attività neuronale nelle microstrutture, come le spine dendritiche. Questo metodo aiuterebbe a studiare le interazioni del processo sinapsi-microglia nei topi svegli.
Recentemente, uno studio in vitro ha dimostrato che i processi microgliali sottili simili a filopodi hanno una motilità più rapida rispetto ai processi spessi, suggerendo l'importanza della loro motilità più rapida nella sorveglianza19. Il sistema qui può tracciare la motilità dei processi microgliali sottili con una risoluzione temporale da un sub-secondo a poche decine di secondi. Questa proprietà aiuta a chiarire il significato funzionale della loro motilità per la sorveglianza in vivo.
In futuro, la combinazione di questa tecnica di imaging con interventi, come l'optogenetica24 o la chemiogenetica25, applicata a circuiti neurali locali o connessioni neurali interregionali farebbe luce su nuove funzioni microgliali nello sviluppo sinaptico e nella plasticità che scolpiscono le caratteristiche dei circuiti neurali. Inoltre, un'ulteriore integrazione di imaging, intervento e compiti comportamentali contribuirebbe a rivelare il coordinamento di microglia e neuroni alla base di comportamenti specifici.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Masashi Kondo e il Dr. Masanori Matsuzaki per aver fornito vettori di virus. Questo lavoro è stato sostenuto da Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 a S.O.), l'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (JP19gm1310003 e JP17gm5010003 a S.O. e JP19dm0207082 a H.M.), l'UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), la Japan Science and Technology Agency Moonshot R&D (JPMJMS2024 a H.M.), Brain Science Foundation (a H. M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| 27G needle | Terumo | NN-2719S | |
| AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
| Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
| Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
| CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
| DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
| Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
| Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
| Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
| Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
| Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
| ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
| Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
| MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
| Microinjector | KD Scientific | KDS-100 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
| Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
| Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
| Shading device | Customized | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
| Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
| Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Treadmill | Customized | N/A | |
| UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
| Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |
References
- Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27 (2011).
- Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527 (2010).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
- Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
- Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839 (2017).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K.
- Roth, B. L.
