Summary
Här beskriver vi ett protokoll som kombinerar adenoassocierad virusinjektion med kranialfönsterimplantation för samtidig avbildning av mikroglialdynamik och neuronaktivitet hos vakna möss.
Abstract
Eftersom hjärnans funktioner är under kontinuerlig påverkan av signaler som härrör från perifera vävnader är det viktigt att belysa hur gliaceller i hjärnan känner av olika biologiska förhållanden i periferin och överför signalerna till nervceller. Microglia, immunceller i hjärnan, är involverade i synaptisk utveckling och plasticitet. Därför bör mikroglias bidrag till neural kretskonstruktion som svar på kroppens inre tillstånd testas kritiskt genom intravital avbildning av förhållandet mellan mikroglialdynamik och neuronaktivitet.
Här beskrivs en teknik för samtidig avbildning av mikrogliadynamik och neuronaktivitet hos vakna möss. Adenoassocierat virus som kodar för R-CaMP, en genkodad kalciumindikator för rött fluorescensprotein, injicerades i lager 2/3 av den primära visuella cortexen i CX3CR1-EGFP-transgena möss som uttrycker EGFP i mikroglia. Efter viral injektion installerades ett kranialfönster på hjärnytan i det injicerade området. In vivo visade tvåfotonavbildning hos vakna möss 4 veckor efter operationen att neural aktivitet och mikroglialdynamik kunde registreras samtidigt vid den tidsmässiga upplösningen under en sekund. Denna teknik kan avslöja samordningen mellan mikroglialdynamik och neuronaktivitet, där den förra svarar på perifera immunologiska tillstånd och den senare kodar för de inre hjärntillstånden.
Introduction
Det finns växande bevis för att kroppens inre tillstånd ständigt påverkar hjärnfunktionerna hos djur 1,2,3,4,5. För att få en djupare förståelse för hjärnans funktioner är det därför viktigt att belysa hur gliaceller i hjärnan övervakar biologiska förhållanden i periferin och vidarebefordrar informationen till nervceller.
Microglia, immunceller i hjärnan, är involverade i synaptisk utveckling och plasticitet, som skulpterar egenskaper hos neurala kretsar i hjärnan 6,7,8,9. Till exempel visade det banbrytande arbetet av Wake et al. att mikrogliaprocesser kommer i kontakt med synapser på ett neuronalt aktivitetsberoende sätt i musneocortex och att artificiell ischemi inducerar synapsförlust efter långvarig kontakt med microglia10. Tremblay et al. fann att förändring av visuell erfarenhet förändrar modaliteten av mikroglial interaktion med synapser. Under den kritiska perioden då dendritisk ryggradsomsättning i den primära visuella cortexen (V1) ökar genom binokulär deprivation, minskar mörk anpassning rörligheten hos mikroglialprocesser och ökar både deras kontaktfrekvens med synaptiska klyftor och antalet cellulära inklusioner i microglia11. Dessa resultat tyder på att mikroglialprocesser känner av neural aktivitet och deras omgivande miljö för att omforma neurala kretsar. Dessutom rapporterade en nyligen genomförd studie att mikroglialövervakning skiljer sig mellan vakna och bedövade förhållanden, vilket tyder på vikten av experiment med vakna möss för att undersöka neuron-mikroglia-kommunikation under fysiologiska förhållanden12.
In vivo tvåfotonkalciumavbildning är ett kraftfullt verktyg för registrering av kalciumdynamik, vilket återspeglar pågående neuronal bränning, i hundratals neuroner samtidigt i ett levande djur13,14,15. Kalciumavbildning i neuroner kräver i allmänhet en tidsupplösning på mer än några Hz för att spåra snabba neuronala svar16,17. Däremot har tidigare studier som spårar mikroglialdynamik samplat mikrogliastrukturer med en relativt låg tidsupplösning på mindre än 0,1 Hz18,19,20. En nyligen genomförd studie tillämpade samtidig tvåfotonavbildning för att förstå neuron-mikroglia-kommunikation21. Det är dock fortfarande oklart hur dynamiska mikroglialprocesser svarar på den omgivande neurala aktiviteten vid en tidsupplösning på mer än några Hz hos vakna möss. För att ta itu med detta problem beskriver vi en samtidig in vivo tvåfotonavbildningsmetod för neural aktivitet och mikroglialdynamik med en tidsupplösning högre än 1 Hz hos vakna möss. Denna metod gör det möjligt för oss att uppnå stabil avbildning hos vakna möss med en högre bildhastighet (maximalt 30 Hz med pixelramstorleken 512 x 512 pixlar) och ger ett mer gynnsamt sätt att undersöka övervakningsbeteendet hos mikroglia eller deras interaktion med neuronaktivitet hos vakna möss.
Protocol
Alla experiment godkändes av djuretikkommittén och säkerhetskommittén för genetiska rekombinanta experiment vid Graduate School of Medicine och Faculty of Medicine, University of Tokyo, och utfördes enligt deras riktlinjer.
1. Förberedelse
- Sterilisera alla instrument och apparater som behövs för operationen med autoklav eller 70% etanol.
- Förberedelse av glaspipett.
- Fäst en 75 μL kalibrerad kapillär ordentligt på hållaren på mikropipettavdragaren. Ställ in avdragaren i programmet med de rekommenderade parametrarna som P (tryck) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180.
- Efter avslutad program (vanligtvis 4,5 till 5 s) är kapillären uppdelad i två glaspipetter med avsmalnande svansar. Bryt sedan den distala delen av svansarna med pincett för att hålla spetsdiametern inom 30-50 μm. För detta, bryt svansarna 1 cm distala till slutet av den avfasade delen.
- För kraniotomi, förbered ett kranialfönster genom att limma en större yttre glasskiva, 4 mm i diameter, 0,15 ± 0,02 mm i tjocklek, till en mindre inre glasskiva, 2 mm i diameter, 0,525 ± 0,075 mm i tjocklek, med hjälp av ett UV-ljushärdande reagens (figur 2A).
2. AAV-injektion
- Beredning av injektionsapparat
- Placera en glaspipett ansluten till en 26 G Hamilton-spruta genom ett rör på en pipetthållare på ett stereotaxiskt instrument och luta sedan pipetthållaren 60° framåt från den vertikala axeln (figur 1A,B).
- Fyll glaspipetten, sprutan och anslutningsröret med flytande paraffin. Placera sprutan på en mikroinjektor.
- Kirurgiskt ingrepp
OBS: Följande operation utfördes i ett steriliserat bås. Ett stereomikroskop användes för operationen vid behov.- Bedöva en manlig CX3CR1-EGFP-mus (detaljerad information i materialtabellen) vid 7 till 8 veckors ålder (kroppsvikt 22-26 g) med 3% isofluran i en gastät kammare. Efter 3 min, ta ut musen från kammaren när den förlorar frivillig rörelse utom andning, och byt sedan till kontinuerlig anestesi med en nässlang med 2% isofluran.
OBS: Isofluran är känt för att aktivera mikroglia. Men eftersom avbildning utförs 4 veckor efter operationen finns det ingen effekt av isofluran på mössen under avbildning. Även om isoflurananestesi används under några minuter när möss placeras i det stereotaktiska instrumentet före avbildning (steg 4.2.1), fann vi att effekten av denna korta anestesi är försumbar. - Håll musen varm med en värmedyna vid 37 °C under operationen för att förhindra hypotermi. Applicera ögonsalva på båda ögonen för att förhindra torrhet i hornhinnan och administrera en meloxikaminjektion, subkutant (5 mg/kg). Fäst musen på en extra öronstång och fixera sedan musen på det stereotaxiska instrumentet med ryggsidan uppåt.
- Justera isoflurankoncentrationen till en lämplig procentsats (1%-2%) under operationen medan du övervakar andningen och hjärtfrekvensen. Ta bort håret med hårborttagningskräm och desinficera huvudet flera gånger i en cirkulär rörelse med både en jodbaserad eller klorhexidinbaserad skrubb och alkohol. Injicera sedan 0,1 ml 1% lidokain subkutant och applicera sterila draperier för att säkra operationsområdet.
- Skär hårbotten öppen längs mittlinjen med sax och gör snittet ca 2 cm långt, för att säkerställa en god exponering av skallen ovanför den högra primära visuella cortexen. Efter snittet i hårbotten, bevattna huvudet med saltlösning under hela proceduren för att förhindra att den exponerade skallen och hjärnan torkar.
- Ta bort periosteumet på den exponerade skallen med pincett. Borra skallen på de stereotaxiska koordinaterna: 3 mm lateralt mot mittlinjen, 0,5 mm framför lambdalinjen, för att skapa ett litet hål med ca 0,5 mm diameter. Skölj vid behov bort blod och vävnadsrester från borrkronan.
- Fyll glaspipetten med 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 med följande procedur vid en titer på 8,3 x 1012 vektorgenom/ml22.
- För sprutan framåt så att 1 μl flytande paraffin matas ut från glaspipetten. Placera en bit transparent film, ca 2 cm x 2 cm, på musens exponerade skalle och driv ut en droppe med 1 μL AAV-lösning på filmen med hjälp av en pipetter.
- Placera glaspipettspetsen i droppen AAV-lösning på filmen och dra försiktigt sprutan för att aspirera AAV-lösningen. Efter utkastningen, vrid den T-formade stoppkranen för att frigöra trycket inuti röret och glaspipetten.
- För in glaspipetten på ett djup av 500 μm från hjärnytan genom hålet som skapades i steg 2.2.5 och injicera sedan 0,5 μL AAV-lösning med hjälp av mikroinjektorn (figur 1C). Använd insprutningsvolymflödet på 2,0 μl/h. en injektion på 0,5 μL tar 15 minuter och vänta sedan i 5 minuter.
- Efter injektionen, dra försiktigt ut glaspipetten och skölj hjärnytan med saltlösning.
- Bedöva en manlig CX3CR1-EGFP-mus (detaljerad information i materialtabellen) vid 7 till 8 veckors ålder (kroppsvikt 22-26 g) med 3% isofluran i en gastät kammare. Efter 3 min, ta ut musen från kammaren när den förlorar frivillig rörelse utom andning, och byt sedan till kontinuerlig anestesi med en nässlang med 2% isofluran.
3. Implantation av kranialfönster
OBS: Implantation av kranialfönster följer AAV-injektionen samma dag.
- Markera en cirkel med en diameter på 2,5 mm på skallen, centrerad 3 mm i sidled från lambdan. Skapa ett cirkulärt spår längs märket på skallen genom att borra. Rengör skräpet eftersom det kan påverka skallens synlighet negativt och applicera saltlösning under borrningsprocessen för att förhindra uppvärmning.
- För att kontrollera om borrdjupet i det cirkulära spåret är tillräckligt för att ta bort det centrala skallefragmentet, tryck försiktigt på den centrala skallen med pincett. Om den rör sig vertikalt med lite motstånd är borrdjupet tillräckligt.
- När spåret når tillräckligt djup, sätt in spetsen på pincetten i botten av det centrala skallefragmentet och lyft försiktigt och ta bort det för att exponera hjärnytan (figur 1D).
- Använd en 27 G nål, stick och riv dura vid kanten av den exponerade hjärnytan. Sätt in spetsen på pincetten genom hålet vid kanten av dura. Håll dura och skala av den för att exponera hjärnytan.
OBS: Om blödning uppstår, skölj hjärnytan med saltlösning tills blödningen slutar. - Använd pincett och sprid hemostatiska fibrer en efter en i saltlösning i en 3,5 mm skål och placera sedan de hemostatiska fibrerna längs kanterna på hålet där den transekterade dura är närvarande.
- Placera ett kranialfönster förberett i steg 1.3 på den exponerade hjärnytan och fäst den sedan på skallen med omedelbart lim medan du försiktigt trycker på fönstret så att fönstret är i nära kontakt med skallen.
- Applicera sedan omedelbart lim på hela den exponerade skallen och fäst sedan försiktigt en huvudplatta på skallen så att fönstret lokaliseras i mitten av huvudplattans fyrkantiga hål (figur 2C). Se till att huvudplattans yta är parallell med glasfönstrets yta.
- När limet har härdat tillräckligt, applicera tandcement på den exponerade skallen för att förstärka fästet mellan huvudet och huvudplattan (figur 2).
OBS: Om experimenten inkluderar presentation av visuella stimuli till möss, bör ströljus till bildområdet undvikas. Det är lämpligt att svarta cementet genom att blanda det med aktivt kol för att minska ljusreflektionen. - Dra ut musen från anestesin efter att cementet har härdat tillräckligt (ca 20 min). Sätt sedan musen i en ny bur för att återhämta sig ensam.
- Efter att ha bekräftat sitt medvetande och frivilliga rörelse, vilket indikerar full återhämtning, sätt musen tillbaka i hemburet. Under återhämtningen, administrera en andra, eller mer om nödvändigt, meloxikamdos (en gång var 24: e timme i 1-3 dagar) om uppenbara smärtindikerande beteenden uppstår.
4. In vivo tvåfotonavbildning av mikroglia och neuronal kalciumdynamik
- Habituation av möss till mikroskopapparaten
- Tre veckor efter operationen, inducera anestesi i musen med 3% isofluran och sätt musen under 25x objektivlinsen i ett tvåfotonmikroskop med hjälp av ett skräddarsytt stereotaxiskt instrument (figur 3C). För installationen här är musen inställd på toppen av ett löpband och får springa fritt.
- Cirka 10 minuter senare, ta bort musen från mikroskopsteget och sätt tillbaka den i hemburet. Upprepa tillvänjningen minst 3 gånger varannan dag före tvåfotonbildsförvärv.
- Förvärv av tvåfotonbilder
OBS: Vi rekommenderar att du utför bildförvärvet mer än 4 veckor efter operationen, eftersom mikroglialaktivering gradvis återgår till basalnivån.- Som i steg 4.1, inducera anestesi i musen med 3% isofluran och sätt musen under objektivlinsen i tvåfotonmikroskopet med hjälp av ett skräddarsytt stereotaxiskt instrument.
- Installera den skräddarsydda skuggningsenheten och en LCD-skärm för visuell stimulering enligt beskrivningen nedan (bild 3D).
- Placera objektivet så att det fokuserar på hjärnytan och ställ sedan in linspositionen som den ursprungliga Z-positionen. Håll xy-koordinaterna konstanta och höj objektivlinsen; Ta bort musen och det stereotaxiska instrumentet från objektivlinsen och löpbandet.
- Fäst en skugganordning på toppen av huvudplattan med silikon, som svärtas genom blandning med kolpulver, och se till att utrymmet mellan huvudplattan och skuggningsanordningen är väl tätat.
- Fyll skuggningsanordningen med destillerat vatten och fixa sedan musen och den stereotaxiska ramen igen under målet och på löpbandet. Återställ försiktigt fokalplanet vid hjärnytan och kontrollera objektivlinsens djup.
OBS: För att undvika risken att skada objektivlinsen, ställ in xyz-koordinaterna först och applicera sedan skuggningsanordningen på objektivlinsen. Det är också rimligt att installera locket först och sedan justera koordinaterna, men försiktig hantering är nödvändig för detta alternativ. - Täck objektivlinsen med svart aluminiumfolie för att undvika ljuskontaminering från LCD-skärmen som används för visuell stimulering genom objektivlinsen (bild 3D). Ställ in en 10-tums LCD-skärm på 12,5 cm framför musens ögon för att presentera visuella stimuli (bild 3D).
- Konfigurera filtren för insamling av fluorescensemission till EGFP-fluorescens (525/50 nm emissionsfilter) och R-CaMP-fluorescens (593/46 nm emissionsfilter) och excitationsvåglängden till 1 000 nm. Hämta bilder med en rumslig upplösning på 0,25 μm/pixel med ett 25x 1,1 NA-mål och GaAsP PMT.
- Hitta bildområdet där R-CaMP (+) neuroner och EGFP (+) mikroglia kan avbildas samtidigt i lager 2/3. För den här inställningen befann sig data som erhållits i figur 4 och video 1 på ett djup av 100 μm från pialytan med hjälp av en förhandsvisning av live-bilden. Håll excitationslaserns effekt så låg som möjligt för att undvika fotoblekning och skador orsakade av ökad lokal temperatur i bildområdet.
- Hämta bilder med bildhastigheten 30 Hz. Samtidigt med bildinsamlingen, presentera en drifting-gitter visuella stimuli vid 100% kontrast, 1,5 Hz, 0,04 cykler per grad i 12 riktningar vid 6 orienteringar från 0 ° till 150 ° i 30 ° steg till musen17.
- Efter bildförvärvet, ta bort musen från mikroskopsteget, ta bort skuggningsanordningen och det stereotaxiska instrumentet från musen och sätt tillbaka musen till sin hembur.
- Registrering av uppgifter
- Konvertera och spara förvärvade bilddata (nd2-format i det här fallet) som en serie tiff-bildfiler för varje färgkanal, med hjälp av Fiji eller programvaran som medföljer mikroskopet.
- Använd Turboreg, ett plugin från Fiji, för att utföra registrering med läge = översättning. Använd genomsnittlig bild som referensbild med tiff-bildfilerna i EGFP-kanalen.
- Utför följande bearbetning för varje bildruta med MATLAB.
OBS: Även om MATLAB används i följande bearbetning, fokuserar beskrivningen huvudsakligen på avsikten med varje steg så att data kan analyseras av annan programmeringsprogramvara som Python.- Använd imread-funktionen för att läsa två EGFP tiff-bilder före respektive efter registrering av samma bildruta. Använd imread-funktionen för att läsa R-CaMP tiff-bilden av samma ram.
- Använd funktionen normcorr2 för att beräkna korrelationsfunktionen mellan de vektoriserade variablerna i de två GFP-bilderna som lästes i steg 4.3.3.1.
- Använd funktionen max för att identifiera det linjära indexet med den högsta korskorrelationen för korrelationsfunktionen och använd sedan funktionen ind2sub för att beräkna rörelsepositionen för den registrerade bilden från dess ursprungliga bild.
- Använd funktionen imwarp för att översätta R-CaMP-bilden till den position som beräknades i steg 4.3.3.3 och använd sedan funktionen imwrite för att spara den registrerade bilden av R-CaMP.
- Generering av kalciumspår
- Utför följande bearbetning med MATLAB. Använd imread-funktionen för att läsa alla registrerade R-CaMP tiff-bilder som genererades i steg 4.3.3.4. Om de registrerade bilderna redan har lästs in som en variabel på arbetsytan utelämnar du det här steget.
- Använd medelfunktionen för att generera en tidsprojektionsbild. Använd imshow-funktionen för att visa den genomsnittliga bilden som en figur; använda roipoly-funktionen för att generera en binär ROI-mask av målstrukturen (dendritisk ryggrad i dessa data).
- Använd medelfunktionen med bilderna erhållna genom att multiplicera den binära masken med bilder av varje ram som ingångsvariabler, beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten inom ROI för varje ram.
- Som beskrivits tidigare17, på variabeln som erhållits i steg 4.4.3, applicera smörvärdfrekvensfiltret vid cutoff = 1,6 s, för skärning av högfrekvent brus, och applicera sedan det glidande medianfiltret vid tidsfönstret = 200 s, för skärning av lågfrekvent brus.
Representative Results
Vi utförde AAV-injektion och implantation av kranialfönster i V1 av en 8 veckor gammal CX3XR1-EGFP transgen mus enligt beskrivningen i detta protokoll. Fyra veckor efter operationen utförde vi samtidig in vivo tvåfotonavbildning av R-CaMP-baserad neural aktivitet och mikroglialdynamik i lager 2/3 av V1 (figur 4 och video 1). Under avbildningen placerades musen på ett löpband och fick springa fritt. Bilder togs med bildhastigheten 30 Hz med den rumsliga upplösningen 0,25 μm/pixel med ett 25x, 1,1 NA-mål och GaAsP PMT. Både EGFP och R-CaMP exciterades vid en våglängd på 1 000 nm, och EGFP-fluorescens (525/50 nm emissionsfilter) och R-CaMP-fluorescens (593/46 nm emissionsfilter) samlades in samtidigt. Efter registrering av förvärvade data för att minimera rörelseartefakter beräknades var fjärde bildruta i genomsnitt i en bildruta för att minska bakgrundsbruset. Grating visuella stimuli presenterades för musen, och de visuella svaren hos neuroner och individuella dendritiska spines analyserades (Figur 4D). Mikrogliaprocesser visade snabb dynamik och förändrade deras morfologi inom 10 s (figur 4E och video 1). Som beskrivs i avsnittet Diskussion kunde uttrycket av R-CaMP inte detekteras när AAV-injektionen misslyckades. Om operationen inte lyckades kunde signalerna från EGFP och R-CaMP inte observeras.
Figur 1: AAV-injektion . (A) En glaspipett anslöts till en 26 G Hamilton-spruta med hjälp av ett kiselrör. (B) Upplägget för AAV-injektion. (C) AAV-lösningen injicerades via glaspipetten lutad 60° framåt från den vertikala axeln. (D) Schematiskt diagram över proceduren för öppen skalle (beskrivs i steg 3.3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kranialfönster och huvudplatta . (A) Schematiskt diagram över implantation av kranialfönster. (B) Skräddarsydda huvudplattor användes. För avbildning på höger halvklot ska den kortare armen användas på höger sida. (C) Ryggvy av en mus med ett kranialfönster och en implanterad huvudplatta. d) Hög förstoringsvy av kranialfönstret som visas i figur 2C. (E) Ryggvy av en mus fixerad med det skräddarsydda stereotaktiska instrumentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Upplägget för tvåfotonavbildning in vivo. (A) Ryggvy av skuggningsanordningen. (B) Sidovy av skuggningsanordningen. (C) Vy av en mus med skugganordningen på huvudplattan under objektivlinsen. Musen placeras på löpbandet. (D) Visa under tvåfotonexcitationsmikroskopet. En bildskärm som presenterar visuella stimuli placeras på höger sida av figuren. Objektivlinsen är täckt med skugganordningen och svart aluminiumfolie för att undvika ljus från monitorn till objektivlinsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mikroglialdynamik och visuella reaktioner i en dendritisk ryggrad. (AC) Tidsgenomsnittliga bilder av EGFP (+) mikroglia och R-CaMP (+) neuroner i lager 2/3 av V1 i en 12 veckor gammal CX3XR1-EGFP transgen mus. Signalintensiteten i varje kanal normaliserades oberoende. (D) Visuella reaktioner i en dendritisk ryggrad. Randdiagram med svarta pilar anger riktningen för gitterstimuli som presenteras i den tidpunkt som indikeras av grå kolumner. I kalciumspår indikerar grå linjer individuella svar, och en svart linje indikerar deras genomsnitt. I den högra insatsen indikerar en gul pilspets den dendritiska ryggraden där intresseområdet (ROI) genererades för att förvärva kalciumspåren. (E) Mikroglialprocessen (cyanpilspets) visade snabb tillbakadragning på 10 s. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Video 1: Tvåfotonavbildning av neuronal aktivitet och mikroglialdynamik. Bilddata för EGFP(+)-mikroglia och R-CaMP(+)-neuroner i lager 2/3 av V1 i en 12 veckor gammal CX3XR1-EGFP-transgen mus. På vänster sida av filmen indikerar magenta R-CaMP i neuroner och grönt indikerar EGFP i mikroglia. Filmens mitt motsvarar EGFP-signalen och höger sida motsvarar R-CaMP-signalen. Signalintensiteten i varje kanal normaliserades oberoende. Filmens bildhastighet är 40 gånger snabbare än den faktiska hastigheten. Skalstapel = 10 μm Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Vi beskriver protokollet för AAV-injektion och kraniotomi för samtidig avbildning av mikroglialdynamik och neuronaktivitet hos vakna möss samt databehandling. Denna teknik kan avslöja samordningen mellan mikroglialdynamik och neuronal aktivitet på tidsskalor som sträcker sig från subsekund till tiotals sekunder.
Operationsprotokollet omfattar flera tekniskt krävande steg. AAV-injektion är ett av de kritiska stegen. Misslyckad AAV-injektion kan orsaka en signifikant minskning av uttrycket av R-CaMP. Det finns två huvudorsaker: igensatta glaspipetter och vävnadsskador. Igensättning av glaspipetter minskar eller blockerar helt utmatningen av AAV-lösningen. Denna situation kan undvikas genom att färga AAV-lösningen med ett färgämne som snabbgrönt och visuellt bekräfta injektionens framgång. Vävnadsskada orsakad av AAV-injektion förhindrar exogent genuttryck nära mitten av injektionsstället. Skadorna som orsakas av AAV-injektion orsakas sannolikt av en plötslig ökning av utflödet från glaspipettens spets efter ackumulering av trycket inuti pipetten. Därför bör utflödet av AAV-lösning från glaspipetten vara konstant under injektionen. Att välja glaspipetter med en något bredare diameter vid sina spetsar skulle lösa detta problem. Vid implantation av kranialfönster är operationens hastighet kritisk. Om operationen tar för lång tid kan hjärnvävnaden skadas allvarligt. Följaktligen är upprepad övning nödvändig för att säkerställa operationens hastighet och jämnhet. Dessutom kan kvaliteten på avbildningen under de 4 veckorna från operation till avbildning försämras genom vävnadsregenerering mellan kranialfönstret och hjärnvävnaden med konventionell metod17. Metoden här övervinner detta problem genom att applicera tjocka glasögon för den inre glasskivan i kranialfönstren för att hämma vävnadsregenerering och hålla fönstret klart. I det system som beskrivs här var denna effekt uppenbar genom att använda en inre glasskiva med en tjocklek av 0,525 ± 0,075 μm.
Metoden kan tillämpas framgångsrikt på möss äldre än 4 veckor, men appliceringen på yngre möss kan vara problematisk. Hos unga möss visar skallen snabb och framträdande tillväxt, vilket inducerar en obalans mellan kranialbenet och glasfönstret.
I vissa banbrytande studier användes in vivo tvåfotonavbildning för att studera mikroglia-neuroninteraktioner 12,21,23. Särskilt i det banbrytande arbetet av Merlini et al. utförde de samtidig in vivo-avbildning av mikroglialdynamik och neural aktivitet inom cellkropparna21. I denna metod, genom att använda tjockare inre glasögon för kranialfönster, kunde vi undertrycka rörelseartefakter i djuporienteringen och uppnå stabil mätning av neuronaktivitet i mikrostrukturer, såsom dendritiska ryggar. Denna metod skulle hjälpa till att undersöka synaps-mikrogliala processinteraktioner hos vakna möss.
Nyligen visade in vitro-studier att tunna filopodiliknande mikroglialprocesser har snabbare rörlighet än tjocka processer, vilket tyder på vikten av deras snabbare rörlighet vid övervakning19. Systemet här kan spåra rörligheten hos tunna mikroglialprocesser med en tidsupplösning från en subsekund till några tiotals sekunder. Denna egenskap hjälper till att belysa den funktionella betydelsen av deras rörlighet för övervakning in vivo.
I framtiden skulle kombinationen av denna bildteknik med interventioner, såsom optogenetik24 eller kemogenetik25, tillämpad på lokala neurala kretsar eller interregionala neurala anslutningar belysa nya mikroglialfunktioner i synaptisk utveckling och plasticitet som skulpterar egenskaper hos neurala kretsar. Ytterligare integration av bildbehandling, intervention och beteendeuppgifter skulle också bidra till att avslöja samordningen av mikroglia och neuroner som ligger till grund för specifika beteenden.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Masashi Kondo och Dr. Masanori Matsuzaki för att tillhandahålla virusvektorer. Detta arbete stöddes av Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 till S.O.), Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 och JP17gm5010003 till S.O. och JP19dm0207082 till HM), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), Japan Science and Technology Agency Moonshot R&D (JPMJMS2024 till HM), Brain Science Foundation (till H. M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
| 26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
| 27G needle | Terumo | NN-2719S | |
| AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
| Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
| Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
| CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
| DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
| Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
| Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
| Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
| Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
| Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
| Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
| Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
| ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
| Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
| MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
| Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
| Microinjector | KD Scientific | KDS-100 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
| Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
| Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
| Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
| Shading device | Customized | N/A | |
| Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
| Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
| Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
| Surgical silk | Ethicon | K881H | |
| Treadmill | Customized | N/A | |
| UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
| Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |
References
- Andoh, M., et al. Exercise reverses behavioral and synaptic abnormalities after maternal inflammation. Cell Reports. 27 (10), 2817-2825 (2019).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews. Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Clasadonte, J., Scemes, E., Wang, Z., Boison, D., Haydon, P. G. Connexin 43-mediates astroglial metabolic networks contribute to the regulation of the sleep-wake cycle. Neuron. 95 (6), 1365-1380 (2017).
- Taylor, A. M. W., et al. Microglia disrupt mesolimbic reward circuitry in chronic pain. Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
- Kondo, S., Kohsaka, S., Okabe, S. Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Molecular Brain. 4, 27 (2011).
- Wu, Y., Dissing-Olsen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic mediators of synapse development and plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Andoh, M., Koyama, R. Microglia regulate synaptic development and plasticity. Developmental Neurobiology. 81 (5), 568-590 (2020).
- Iida, T., Tanaka, S., Okabe, S. Spatial impact of microglial distribution on dynamics of dendritic spines. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1400-1417 (2019).
- Nakayama, H., et al. Microglia permit climbing fiber elimination by promoting GABAergic inhibition in the developing cerebellum. Nature Communications. 9 (1), 2830 (2018).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. Journal of Neuroscience. 29 (13), 3974-3980 (2009).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biology. 8 (11), 10000527 (2010).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Kim, T. H., Schnitzer, M. J. Fluorescence imaging of large-scale neural ensemble dynamics. Cell. 185 (1), 9-41 (2022).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Isshiki, M., Okabe, S. Evaluation of cranial window types for in vivo two-photon imaging of brain microstructures. Microscopy (Oxf). 63 (1), 53-63 (2014).
- Ohtsuki, G., et al. Similarity of visual selectivity among clonally related neurons in visual cortex. Neuron. 75 (1), 65-72 (2012).
- Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Bernier, L. P., et al. Nanoscale surveillance of the brain by microglia via cAMP-regulated filopodia. Cell Reports. 27 (10), 2895 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nature Neuroscience. 24 (1), 19-23 (2021).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLife. 6, 26839 (2017).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586 (7829), 417-423 (2020).
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Roth, B. L. DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
