Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Positronemissionstomografi Imaging af cellehandel: En metode til celleradiomærkning

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/64117
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Præsenteret her er en protokol til radiolabelceller med en positronemissionstomografi (PET) radioisotop, 89 Zr (t1/2 78,4 h), ved hjælp af en brugsklar radiomærkningssynthon, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89Zr] Zr-DBN). Radioaktive mærkningsceller med [89Zr] Zr-DBN tillader ikke-invasiv sporing og billeddannelse af administrerede radioaktivt mærkede celler i kroppen med PET i op til 7 dage efter administration.

Abstract

Stamcelle- og kimære antigenreceptor (CAR) T-celleterapier fremstår som lovende behandlinger til organregenerering og som immunterapi til forskellige kræftformer. På trods af at der er gjort betydelige fremskridt på disse områder, er der stadig mere at lære for bedre at forstå farmakokinetikken og farmakodynamikken af de administrerede terapeutiske celler i det levende system. Til ikke-invasiv in vivo-sporing af celler med positronemissionstomografi (PET) er der udviklet en ny [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89 Zr] Zr-DBN) -medieret celleradiomærkningsmetode ved hjælp af 89Zr (t1/2 78,4 timer). Denne protokol beskriver en [89Zr] Zr-DBN-medieret, klar til brug, radiomærkning synthon til direkte radiomærkning af forskellige celler, herunder mesenkymale stamceller, afstamningsstyrede kardiopoietiske stamceller, leverregenererende hepatocytter, hvide blodlegemer, melanomceller og dendritiske celler. Den udviklede metode muliggør ikke-invasiv PET-billeddannelse af cellehandel i op til 7 dage efter administration uden at påvirke arten eller funktionen af de radioaktivt mærkede celler. Derudover beskriver denne protokol en trinvis metode til radiosyntese af [89 Zr] Zr-DBN, biokompatibel formulering af [89 Zr] Zr-DBN, forberedelse af celler til radioaktiv mærkning og endelig radiomærkning af celler med [89Zr] Zr-DBN, herunder alle de indviklede detaljer, der er nødvendige for en vellykket radiomærkning af celler.

Introduction

Stamcelle- og kimær antigenreceptor (CAR) T-celleterapier vinder popularitet og er under aktiv undersøgelse til behandling af forskellige sygdomme, såsom myokardiesvigt1,2, retinal degeneration 2, makuladegeneration 2, diabetes 2, myokardieinfarkt3,4,5 og kræft 6,7,8,9,10. Blandt de to plausible tilgange til stamcelleterapier kan stamceller enten podes direkte på sygdomsstedet for at forårsage en terapeutisk reaktion eller forårsage ændringer i sygdomsstedets mikromiljø uden at klæbe til sygdomsstedet for at indlede en indirekte terapeutisk respons. En indirekte terapeutisk reaktion kan forårsage ændringer i mikromiljøet på sygdomsstedet ved at frigive faktorer, der ville reparere eller behandle sygdommen5. Disse tilgange til stamcelleterapier kunne evalueres ved ikke-invasiv billeddannelse af radioaktivt mærkede stamceller. Ikke-invasiv billeddannelse kunne korrelere optagelsen af de radioaktivt mærkede celler på sygdomsstedet med et terapeutisk respons for at dechiffrere det direkte versus indirekte terapeutiske respons.

Derudover udvikles immuncellebaserede terapier til behandling af forskellige kræftformer ved hjælp af CAR T-celle 6,7,8,9,10 og dendritisk celleimmunterapi 11,12. Mekanisk er T-celler i CAR T-celleimmunterapi 6,7,8,9,10 konstrueret til at udtrykke en epitop, der binder til et specifikt antigen på tumorer, der skal behandles. Disse konstruerede CAR T-celler binder ved administration til det specifikke antigen, der er til stede på tumorcellerne gennem en epitop-antigeninteraktion. Efter binding gennemgår de bundne CAR T-celler aktivering og prolifererer derefter og frigiver cytokiner, hvilket signalerer værtsens immunsystem til at angribe tumoren, der udtrykker det specifikke antigen. I modsætning hertil er dendritiske celler i tilfælde af dendritiske celleterapier11,12 konstrueret til at præsentere et specifikt kræftantigen på deres overflade. Disse konstruerede dendritiske celler, når de administreres, hjem til lymfeknuderne og binder til T-cellerne i lymfeknuderne. T-cellerne, efter binding til de specifikke kræftantigener på de administrerede dendritiske celler, gennemgår aktivering / proliferation og initierer et immunrespons fra værten mod tumoren, der udtrykker det specifikke antigen. Derfor er vurderingen af handel med administrerede CAR T-celler til et tumorsted9,10 og homing af dendritiske celler til lymfeknuderne11,12 mulig ved billeddannelse af radioaktivt mærkede CAR T-celler og dendritiske celler for at bestemme effekten af immunterapi. Desuden kan ikke-invasiv cellehandel bidrage til bedre at forstå det terapeutiske potentiale, afklare det direkte versus indirekte terapeutiske respons og forudsige og overvåge det terapeutiske respons af både stamcelle- og immuncellebaserede terapier.

Forskellige billeddannelsesmetoder til cellehandel er blevet undersøgt 3,4,9,10,12, herunder optisk billeddannelse, magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), computertomografi med en fotonemission (SPECT) og positronemissionstomografi (PET). Hver af disse teknikker har sine egne fordele og ulemper. Blandt disse er PET den mest lovende modalitet på grund af dens kvantitative karakter og høje følsomhed, som er afgørende for pålidelig kvantificering af celler i billeddannelsesbaseret cellehandel 3,4,9,10.

Den positronemitterende radioisotop 89Zr, med en halveringstid på 78, 4 timer, er egnet til cellemærkning. Det tillader PET-billeddannelse af cellehandel i over 1 uge og produceres let af bredt tilgængelige, lavenergi medicinske cyklotroner 13,14,15,16,17. Derudover er en passende funktionaliseret, p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin (DFO-Bn-NCS) chelator kommercielt tilgængelig til syntese af en 89 Zr-mærket, klar til brug, cellemærkningssynthon, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin, også kendt som [89Zr] Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. Princippet om [89 Zr] Zr-DBN-medieret cellemærkning er baseret på en reaktion mellem primære aminer af cellemembranproteiner og isothiocyanatdelen (NCS) af [89Zr] Zr-DBN for at producere en stabil kovalent thiourea-binding.

[89Zr] Zr-DBN-baseret cellemærkning og billeddannelse er blevet offentliggjort for at spore en række forskellige celler, herunder stamceller 18,23,25, dendritiske celler18, kardiopoietiske stamceller19, decidual stromale celler 20, knoglemarvsafledte makrofager 20, mononukleære celler i perifert blod 20, Jurkat / CAR T-celler 21, hepatocytter 22,24 og hvide blodlegemer 25. Følgende protokol indeholder trinvise metoder til forberedelse og celleradiomærkning med [89Zr] Zr-DBN og beskriver ændringer, der kan være nødvendige i radiomærkningsprotokollen for en bestemt celletype. For større klarhed er metoden til celleradiomærkning præsenteret her opdelt i fire sektioner. Det første afsnit omhandler forberedelsen af [89 Zr]Zr-DBN ved chelatering af 89Zr med DFO-Bn-NCS. Det andet afsnit beskriver fremstillingen af en biokompatibel formulering af [89Zr]Zr-DBN, der let kan anvendes til celleradiomærkning. Det tredje afsnit dækker de trin, der er nødvendige for forkonditionering af celler til radioaktiv mærkning. Forkonditioneringen af celler involverer vask af cellerne med proteinfri fosfatbufret saltvand (PBS) og HEPES-bufret Hanks afbalanceret saltopløsning (H-HBSS) for at fjerne eksterne proteiner, som kan forstyrre eller konkurrere med reaktionen af [89Zr] Zr-DBN med primære aminer til stede på celleoverfladeproteinerne under radiomærkning. Det sidste afsnit indeholder trin, der er involveret i den faktiske radioaktive mærkning af cellerne og kvalitetskontrolanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dendritiske celler og melanomceller blev opnået kommercielt18. Hepatocytter blev isoleret fra leveren hos svin efter laparoskopisk partiel hepatektomi22,24. Stamceller blev isoleret fra knoglemarvsaspirater18,19,26. De fedtvævsafledte stamceller blev opnået fra Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. Humane hvide blodlegemer blev isoleret fra det indsamlede blod modtaget fra Division of Transfusion Medicine, Mayo Clinic Rochester25. Forskellige celler, der anvendes til radioaktiv mærkning, blev opnået og anvendt i overensstemmelse med retningslinjer anbefalet af Institutional Animal Care and Use Committee, Mayo Clinic Stem Cell Research Oversight Subcommittee, Division of Transfusion Medicine Research Committee, Institutional Biosafety Committee og af Radiation Safety Committee.

1. Fremstilling af [ 89 Zr ]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([ 89Zr ]Zr-DBN)

Tidspunkt: ~ 160-220 min
BEMÆRK: Til fremstilling af [89 Zr]Zr-DBN isoleres 89 Zr i form af [89 Zr]Zr-hydrogenphosphat ([89 Zr]Zr(HPO 4)2) eller [89 Zr]Zr-chlorid ([89Zr]ZrCl4), som nævnt i trin 1.1.

  1. 89Zr isoleres fra forælder 89Y ved hjælp af en etableret hydroxamatharpiksbaseret rensningsmetode13,17. Kort sagt, forbered først en kolonne med ~ 100 mg hydroxamatharpiks, aktiver derefter hydroxamatharpiksen ved at vaske søjlen med 8,0 ml ren vandfri acetonitril efterfulgt af en skylning med 5,0-6,0 ml luft. Derefter vaskes kolonnen med 15 ml deioniseret vand efterfulgt af en anden skylning med 5,0-6,0 ml luft, og passerer derefter 2,0 ml 0,50 N HCI (spormetalbasiskvalitet) efterfulgt af en yderligere skylning med 5,0-6,0 ml luft. Derefter fyldes opløsningen indeholdende både 89 Zr og 89 Y langsomt til hydroxamatharpiksen, og den ubundne 89Y vaskes fra hydroxamatharpiksen med 20 ml 2,0 N HCl efterfulgt af 10 ml deioniseret vand og en skylning med 5,0-6,0 ml luft.
    BEMÆRK: Efter skylning med luft kan elueringen af 89Zr udføres som vist nedenfor.
    1. For eluering af 89 Zr i form af [89 Zr]Zr(HPO 4)2 tilsættes først 0,50 ml 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO 4-buffer (pH 3,5) til kolonnen fra trin 1.1 og lader den sidde på søjlen i 30 minutter for at fremme frigivelsen af 89 Zr som en [89Zr]Zr(HPO4)2 fra harpiksen. Derefter elueres de 89Zr fra søjlen med yderligere 1,50 ml 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO4 buffer (pH 3,5). Efter elueringen af [89 Zr]Zr(HPO 4)2 skal du følge trin 1.2, 1.2.1 og 1.2.2 til fremstilling af [89 Zr]Zr-DBN ved hjælp af [89Zr]Zr(HPO 4)2, som vist i figur 1.
    2. For at opnå 89 Zr som [89 Zr]ZrCl4, eluer først 89 Zr som [89Zr]Zr-oxalat.
      1. Til eluering af 89 Zr i form af [89 Zr]Zr-oxalat tilsættes 0,50 ml 1,0 M oxalsyre til kolonnen fra trin 1.1 og lader den sidde på kolonnen i 1 min for at fremme frigivelsen af 89 Zr som et [89Zr]-oxalat fra harpiksen. Derefter elueres de 89Zr fra kolonnen med yderligere 2,50 ml 1,0 M oxalsyre (i alt 3,0 ml)17.
      2. For at konvertere [89 Zr]Zr-oxalat til [89Zr]ZrCl4 ved hjælp af en anionbytterkolonne, som beskrevet af Larenkov et al.14, skal du først aktivere kolonnen ved at vaske med 6,0 ml acetonitril efterfulgt af en skylning med 5,0-6,0 ml luft. Vask derefter kolonnen med 10,0 ml saltvand efterfulgt af en anden skylning på 5,0-6,0 ml luft. Til sidst passerer 10,0 ml deioniseret vand efterfulgt af en skylning med 5,0-6,0 ml luft.
      3. Læg 3,0 ml opløsningen indeholdende [89Zr]Zr-oxalat langsomt på den aktiverede anionbytterkolonne efterfulgt af en skylning på 5,0-6,0 ml luft. Derefter vaskes den 89Zr-belastede søjle med 50,0 ml deioniseret vand for at fjerne ubundet oxalation, efterfulgt af en skylning med 5,0-6,0 ml luft.
      4. For at eluere 89 Zr i form af [89 Zr]ZrCl 4 tilsættes 0,10 ml 1,0 N HCl til kolonnen, lad den sidde på søjlen i 1,0 min for at fremme frigivelsen af 89 Zr som [89Zr]ZrCl4 fra harpiksen, og eluer 89Zr fra kolonnen med yderligere 0,40 ml 1,0 N HCl (i alt 0,5 ml). Den eluerede [89Zr]ZrCl4 tørres i et V-formet hætteglas ved at anbringe den i en varmeblok ved 65 °C under en konstant strøm af nitrogengas i 10-30 minutter. Efter tørring rekonstitueres den tørrede [89 Zr]ZrCl 4 i vand, og trin 1.3 og 1.3.1 følges til fremstilling af [89 Zr]Zr-DBN ved anvendelse af [89Zr]ZrCl4, som vist i figur 1.
  2. Tag ~120 μL [89Zr]Zr(HPO 4)2, formuleret i 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO 4 (pH 3,5) (10-25 MBq) fra trin 1.1.1, og neutralisere opløsningen for at opnå pH 7,5-8,0 med ~100 μL 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5) og ~65 μL af 1,0 M K 2 CO3.
    1. For at opnå en passende mængde DFO-Bn-NCS til trin 1.2.2 eller 1.3.1 for forskellige 89 Zr-formuleringer med en varieret tilsyneladende specifik aktivitet på 89 Zr udføres et sæt chelationsreaktioner ved anvendelse af et fast volumen af en neutraliseret formulering af [89 Zr]Zr(HPO4)2 eller [89Zr]ZrCl4 med et interval af DFO-Bn-NCS (7,5-15 μg). I tilfælde af [89Zr]Zr(HPO4)2 inkuberes chelationsreaktionen ved 37 °C i en ryster ved ~550 rpm i 60 minutter. Mens chelationsreaktionen for [89Zr]ZrCl4 inkuberes ved 25 °C i en ryster ved ~550 rpm i 30 min. Kassér chelateringsreaktionen, der viser bundfald under eller ved afslutningen af inkubationen. Ved inkubationens afslutning udføres radioaktiv tyndtlagskromatografi (rad-TLC) med 100 mM diethylentriaminpentaacetat (DTPA), pH 7,0, som en mobil fase for at estimere chelationseffektiviteten af DFO-Bn-NCS for hver chelationsreaktion, som diskuteret nedenfor i trin 1.5.
      BEMÆRK: Baseret på chelationseffektiviteten anvendes den minimumsmængde DFO-Bn-NCS i trin 1.2.2 eller 1.3.1, der er nødvendig for at opnå en chelationseffektivitet på ≥97 % uden at forårsage udfældning af DFO-Bn-NCS i den neutraliserede formulering af [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl 4. Heri blev [89Zr] Zr-DBN syntetiseret i ≥97% radiokemisk renhed.
    2. Forbered frisk 5,0 mM DFO-Bn-NCS i vandfri DMSO (3,76 mg / ml) og tilsæt 4,0 μL 5,0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol eller 15 μg) til ~ 285 μL neutraliseret [89Zr] Zr (HPO4) 2 (10-25 MBq) fra trin 1.2 og bland opløsningen ved pipettering. Hold den endelige DMSO-koncentration i chelatblandingen under 2% af det samlede volumen.
  3. Der tages ~180 μL [89 Zr]ZrCl4 formuleret i 0,1 N HCl (40-80 MBq) fra trin 1.1.2.4, og den resulterende opløsning neutraliseres for at opnå pH 7,5-8,0 med ~25 μL 1,0 MNa2CO3.
    1. Forbered frisk 2,5 mM DFO-Bn-NCS i vandfri dimethylsulfoxid (DMSO) (1,88 mg / ml) og tilsæt 4,0 μL 2,5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol eller 7,5 μg) til ~ 205 μL neutraliseret [89 Zr] ZrCl4 (40-80 MBq) fra trin 1.3. Bland opløsningen ved pipettering. Hold den endelige DMSO-koncentration i chelatblandingen under 2% af det samlede volumen.
  4. Der fortsættes med chelationen på 89 Zr ved 37 °C i en ryster ved ~550 o/min i 60 minutter for [89 Zr]Zr(HPO4)2 eller ved 25 °C i en ryster ved ~550 o/min i 30 minutter for [89Zr]ZrCl4.
  5. Bestem 89Zr chelationseffektiviteten ved rad-TLC med 100 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC mobilopløsningsmiddel. Forvent, at [89 Zr]Zr-DBN viser en R f på ~0,021-0,035, [89 Zr]ZrCl 4 viser en R f på ~1,0 og [89Zr]Zr(HPO4)2 viser en R f på ~1,0. Chelatationseffektiviteten (%) beregnes ved hjælp af ligning (1):
    Procentdel af 89 Zr chelateret til DFO-NCS til dannelse af [89 Zr]Zr-DBN = [ (Radioaktivitet ved R f af [89 Zr]Zr - DBN) / (Summen af radioaktiviteterne ved R f af [89 Zr]Zr - DBN og ved R   f af [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    BEMÆRK: Den acceptable 89Zr chelationseffektivitet for at fortsætte med celleradiomærkning, som bestemt af rad-TLC, er ≥97%. Den foreslåede ≥97% radiokemisk renhed på [89Zr] Zr-DBN blev fastsat i henhold til standardkravet til radiokemisk renhed for andre radioaktive lægemidler, der anvendes i marken. Se den repræsentative rad-TLC i supplerende figur S1 og supplerende figur S2.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over [89Zr]Zr-DBN-præparatet. Til fremstilling af [89 Zr]Zr-DBN neutraliseres præformulerede [89 Zr]Zr(HPO4)2 eller [89Zr]ZrCl4 til en pH-værdi på 7,5-8,0. Den neutraliserede opløsning inkuberes med DFO-Bn-NCS. Kontroller chelationseffektiviteten på 89Zr til DFO-Bn-NCS ved rad-TLC. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Biokompatibel formulering af [ 89Zr ]Zr-DBN til celle radioaktiv mærkning (figur 2)

Tidspunkt: ~35 min
BEMÆRK: I betragtning af den tid, det tager at forberede celler i trin 3, skal du starte trin 3 ca. 20 minutter før begyndelsen af trin 2 for en ~ 30 minutters inkubation. Dette gør det muligt for celleradiomærkning i trin 4 at starte inden for ~ 5-10 minutter efter afslutningen af trin 2-3.2.2.

  1. Til [89 Zr]Zr-DBN-formulering fremstillet af [89 Zr]ZrCl 4 tilsættes 50,0 μL af en cellekompatibel blanding bestående af ~27,0 μL 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO 4 (pH 3,5) + ~23,0 μL 1,0 M HEPES-KOH-buffer (pH 7,5) til 50,0 μL [89 Zr]Zr-DBN. Den [89Zr]Zr-DBN-cellekompatible blanding inkuberes i ~30 min ved stuetemperatur (25 °C).
    BEMÆRK: [89 Zr]Zr-DBN-formuleringen fremstillet af [89Zr]Zr(HPO4)2 er biokompatibel til radioaktiv mærkning af celler og kræver ikke trin 2.

Figure 2
Figur 2: Fremstilling af den biokompatible formulering af [89Zr]Zr-DBN til celleradioaktiv mærkning. Til fremstilling af en brugsklar biokompatibel formulering af den radioaktive mærkningssynthon tilsættes et lige så stort volumen cellekompatibel blanding, der omfatter 1,2 MK2HPO 4/KH2PO4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH til et lige stort volumen på [89Zr]Zr-DBN. Inkuberes ved 25 °C i ~30 min. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Forberedelse af celler til radioaktiv mærkning

Timing: ~40-50 min

  1. Trypsinize ~ 12 × 106 klæbende celler (stamceller, melanom kræftceller, kardiopoietiske stamceller, dendritiske celler eller hepatocytter) og centrifuger cellerne i et 15,0 ml konisk centrifugerør ved ~ 96 × g i 10 minutter ved 4 ° C.
    1. Supernatanten kasseres, cellepelletsen resuspenderes i ~500 μL PBS, og cellesuspensionen overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Cellerne centrifugeres i en mikrocentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    2. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i ~500 μliter H-HBSS. Centrifuger cellerne i en 1,5 ml mikrocentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C. Gentag trin 3.1.2 endnu en gang, og fortsæt til trin 4.1.1.
      BEMÆRK: H-HBSS er Hanks afbalanceret saltopløsning med 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. I tilfælde af ikke-klæbende celler, såsom humane hvide blodlegemer (frisk isolerede humane hvide blodlegemer fra blodet), spring trypsiniseringen over og centrifuger cellesuspensionen indeholdende ~ 12 × 106 celler i en 1,5 ml mikrocentrifuge ved ~ 96 × g i 10 minutter ved 4 ° C.
    1. Supernatanten kasseres, cellepellet resuspenderes i ~500 μl PBS, og cellerne centrifugeres i en 1,5 ml mikrocentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    2. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i ~500 μliter H-HBSS. Centrifuger cellerne i en 1,5 ml mikrocentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C. Gentag trin 3.2.2 endnu en gang, og fortsæt til trin 4.1.1.

4. Radioaktiv mærkning af celler

Tidspunkt: ~125-155 min

  1. Initiering af celleradioaktiv mærkning (figur 3)
    1. Brug cellesuspensionen fra trin 3.1.2 eller trin 3.2.2 til at fremstille en ~500 μL cellesuspension med ca. ~6 × 106 celler i ~500 μL H-HBSS ved pH 7,5-8,0 i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas.
    2. Til dette tilsættes ~ 100 μL af den biologisk kompatible formulerede [89Zr] Zr-DBN fra trin 2.
  2. Celleinkubation til radioaktiv mærkning (figur 4)
    1. Bland den biologisk kompatible [89 Zr]Zr-DBN og cellesuspensionen ved forsigtigt pipettering op og ned med en mikropipette indstillet til ~500 μL. Mængden af radioaktivitet i inkubationsrøret måles ved hjælp af en radioaktivitetsdosiskalibrator ved 489-indstillingen for 89Zr-isotop 16.
    2. Inkuber cellerne og [89Zr] Zr-DBN-blandingen i en ryster ved ~ 550 o / min ved 25-37 ° C i 30-45 minutter til cellemærkning.
      BEMÆRK: Inkubationens temperatur varierer afhængigt af de celletyper, der anvendes til radioaktiv mærkning, som vist i tabel 1.
    3. Efter inkubation i trin 4.2.2 udføres rad-TLC på celleradiomærkningsreaktionen ved hjælp af frisklavet rad-TLC-opløsningsmiddel (20 mM natriumcitrat [pH 4,9-5.1]:methanol [1:1, V:V]). Efter rad-TLC-kørslen skal du kigge efter [89 Zr]Zr-DBN og [89 Zr]ZrCl4 omkring R f = ~0,73-0,81 og R f = ~0,01-0,02 for de radioaktivt mærkede celler. Beregn procentdelen af radioaktivitet ved Rf = ~ 0, 01-0, 02 ved hjælp af ligning (2).
      Procentdel af radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02 = [ (radioaktivitet ved R f = ~0,01 - 0,02) / (summen af radioaktiviteterne ved R f = ~0,01 - 0,02 og R f = ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      BEMÆRK: For at forstå toppe visualiseret ved R f = ~ 0,01-0,02 og R f = ~ 0,73-0,81, se rad-TLC for hvide blodlegemer radiomærkning reaktion i supplerende figur S3.
    4. I et separat 1,5 ml mikrocentrifugeglas blandes ~100 μL af det biokompatibelt formulerede [89Zr]Zr-DBN med ~500 μL H-HBSS ved pH 7,5-8,0 til brug som ikke-cellekontrol til baggrundskorrektion i trin 4.2.5. Efter inkubation ved en lignende temperatur og tid som anvendt i trin 4.2.2 udføres rad-TLC. Efter rad-TLC-kørslen skal du kigge efter [89 Zr]Zr-DBN og [89 Zr]ZrCl4 omkring Rf = ~0,73-0,81. Beregn procentdelen af radioaktivitet ved Rf = ~ 0,01-0,02 ved hjælp af ligning (3).
      Radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioaktivitet ved R f= ~0,01 - 0,02) / (summen af radioaktiviteterne ved R f= ~0,01 - 0,02 og R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      BEMÆRK: For at forstå toppene visualiseret ved Rf = ~ 0,01-0,02 og ~ 0,73-0,81, se rad-TLC for no-cell control reaction i supplerende figur S4.
    5. Beregn den effektive celleradioaktive mærkning (%) ved at trække radioaktivitetsprocenten ved R f = ~ 0,01-0,02 (fra rad-TLC fra trin 4.2.4) fra radioaktivitetsprocenten ved R f = ~ 0,01-0,02 (fra rad-TLC fra trin 4.2.3).
  3. Slukning af radioaktiv mærkning og cellevask (figur 5)
    1. Efter bekræftelse af afslutningen af radioaktiv mærkning med rad-TLC i trin 4.2.5 udføres slukning af den radioaktive mærkningsreaktion ved tilsætning af ~ 600 μL kølet, cellepassende komplet medium eller ved tilsætning af H-HBSS som vist i tabel 1.
    2. Cellerne centrifugeres i en mikrocentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres.
    3. Resuspender forsigtigt de pelleterede celler i ~ 500 μL kølet medium (Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) + 10% føtalt bovint serum + 5% penicillin / streptomycin eller Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10% føtalt bovint serum + 5% penicillin / streptomycin eller H-HBSS for en bestemt celletype, som vist i tabel 1. Udfør resuspension af cellepelleten ved forsigtigt pipettering op og ned med en mikropipette indstillet til ~ 500 μL.
    4. Cellerne centrifugeres i en mikrocentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    5. Trin 4.3.2-4.3.4 gentages to gange for at vaske den ubundne radioaktivitet væk.
    6. Overfør pelleten til et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør med DMEM + 10% føtalt bovint serum + 5% penicillin/streptomycin i tilfælde af stamceller eller H-HBSS og mål radioaktiviteten i cellepelleten ved hjælp af en dosiskalibrator ved 489-indstillingen for 89Zr-isotop16.
    7. Beregn den endelige radioaktive mærkningseffektivitet efter alle vaske ved hjælp af ligning (4).
      Radiomærkningseffektivitet = [(Henfaldskorrigeret radioaktivitet i cellepellet ved trin 4.3.6) / (Henfaldskorrigeret radioaktivitet i cellepellet og H-HBSS ved trin 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. For at sikre kvaliteten af de radioaktivt mærkede celler skal du først visuelt inspicere den endelige suspension af radioaktivt mærkede celler for tilstedeværelsen af klumper. Hvis der ikke er klumper, skal du fortsætte med denne endelige suspension til næste trin. Hvis der er klumper, men de kan resuspenderes ved pipettering eller ved forsigtig omrystning, skal du gøre det og fortsætte til næste trin, da dette passerer den visuelle inspektion. Hvis klumperne imidlertid ikke opslæmmes igen enten ved pipettering eller forsigtig omrystning, kasseres suspensionen, og forfra påbegyndes.
    9. Hvis den visuelle inspektion er bestået, udføres en prøve pan blå udelukkelse levedygtighedstest med 0,4% trypanblå opløsning fremstillet i PBS inden for 1 time efter radioaktiv mærkning og vasketrinnene (4.3.3-4.3.7) til vurdering af cellelevedygtigheden af de radioaktivt mærkede celler.
      1. For at udføre testen tilsættes 10,0 μL 0,4% trypanblå opløsning til 10,0 μL cellesuspension af både radioaktivt mærkede og umærkede celler og blandes ved pipettering af trypanblåcellesuspensionen op og ned med mikropipette indstillet til 10,0 μL.
      2. Indlæs et hæmacytometer med ~ 10,0 μL af trypan-blåcellesuspensionsblandingen, tæl straks antallet af blåfarvede celler og det samlede antal celler i hæmacytometeret under et mikroskop ved lav forstørrelse eller ved hjælp af en automatiseret celletæller. Beregn procentdelen af levedygtige celler ved hjælp af ligning (5).
        Procentdel af levedygtige celler = 100 - [(Antal blåfarvede celler) / (Antal samlede celler)] × 100 (5)
    10. Brug de radioaktivt mærkede celler, hvis der ikke er nogen ændring i procentdelen af levedygtige celler i den radioaktivt mærkede cellesuspension sammenlignet med den umærkede modstykke. Kassér de radioaktivt mærkede celler, hvis procentdelen af levedygtige celler er mindre end umærket modstykke.

Figure 3
Figur 3: Skematisk oversigt over initiering af celleradiomærkning. Radioaktiv mærkning af celler påbegyndes ved tilsætning af den biologisk kompatible formulerede [89Zr]Zr-DBN til cellesuspensionen fremstillet i HEPES bufferet Hanks afbalanceret saltopløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Skematisk oversigt over celleinkubation til radioaktiv mærkning. Bland den biologisk kompatible [89Zr]Zr-DBN grundigt med cellesuspensionen, og inkuber cellesuspensionen i en temperaturstyret varmeblok på en ryster i 30-60 min. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Skematisk oversigt over slukning af radioaktiv mærkning og cellevask. Den radioaktive mærkning af celler slukkes ved tilsætning af kølet cellemedium eller H-HBSS efterfulgt af centrifugering ved 4 °C. Ved cellevask kasseres supernatanten, og cellepelletten resuspenderes i ~500 μl afkølet cellesubstrat eller H-HBSS. Cyklussen gentages med kassering af supernatanten og resuspendering af cellepelletten i frisk medium for at fjerne eventuel ubundet synthon til radioaktiv mærkning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative resultater præsenteret i dette manuskript blev samlet fra de tidligere [89Zr] Zr-DBN syntese og celle radiomærkning undersøgelser 18,19,22,23,24,25. Kort fortalt kan 89Zr med succes kompleksiseres med DFO-Bn-NCS på ~30-60 min ved 25-37 °C ved hjælp af 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS (tabel 2). Celleradiomærkningseffektiviteten varierer fra 20-50% som et ukorrigeret udbytte observeret i den radioaktivt mærkede cellepille efter vask (tabel 1). 18,19,22,23,24,25(tabel 1).

Samlet set blev følgende radioaktivitetskoncentrationer opnået: 0,1 MBq/10 6 celler for hepatocytter22,24, 0,50 ± 0,10 MBq/10 6 for melanomceller (mMC'er)18, 0,47 ± 0,10 MBq/10 6 for humane mesenkymale stamceller (hMSC'er)18, 0,39 ± 0,20 MBq/10 6 for dendritiske celler (mDC'er)18, 0,27± 0,30 MBq/10 6 for hvide blodlegemer 25, og 0,70 ± 0,20 MBq/106 for kardiopoietiske stamceller19 (tabel 1) . I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen cellemærkning ved anvendelse af [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl425. Som tidligere påvist viste radioaktive etiketter sig at være stabile i mMC'er, hMSC'er og mDC'er, med kun ubetydelig procentdel af efflux observeret over 7 dage efter mærkning (figur 6)18. For kardiopoietiske stamceller blev der ikke observeret efflux over 2 dage efter mærkning19.

Tabel 1: Celleradiomærkningseffektivitet i forskellige celletyper med [89Zr]Zr-DBN. Stamceller, melanomceller, kardiopoietiske stamceller, hepatocytter, dendritiske celler og hvide blodlegemer blev radioaktivt mærket med [89Zr] Zr-DBN med variabel celle radiomærkning effektivitet. *Effektiviteten af celleradiomærkning (%) blev estimeret som beskrevet i trin 4.3.7. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: 89Zr chelationseffektivitet af DFO-Bn-NCS. Chelateringseffektiviteten af DFO-Bn-NCS for 89 Zr ved anvendelse af [89 Zr]Zr(HPO4)2 og [89Zr]ZrCl4 er forskellige, målt ved rad-TLC. *Værdier præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Med 50 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC-opløsningsmiddel viser [89 Zr]Zr(HPO4)2 en R f på ~0,9 18 og [89Zr]Zr-DBN viser en R f på ~0,018. Med 100 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC-opløsningsmiddel viser [89Zr]ZrCl4 en Rf på ~1,0. [89Zr] Zr(HPO4)2 viser en R f på ~1,0, og [89Zr]Zr-DBN viser en R f på ~0,021-0,035. Chelatationseffektivitet (%) = procentdel af 89 Zr chelateret til DFO-Bn-NCS for at danne [89 Zr]Zr-DBN = (radioaktivitet ved R f på [89 Zr]Zr-DBN/(summen af radioaktiviteterne ved R f på [89 Zr]Zr-DBN og ved R f på [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4) × 100. Klik her for at downloade denne tabel.

Effekten af radioaktiv mærkning på levedygtigheden af de radioaktivt mærkede celler blev vurderet i mMC'er 18, svinehepatocytter 22,24, hMSC'er 18, humane kardiopoietiske stamceller19 og immunceller, såsom dendritiske celler hos mus (mDC'er)18 og hvide blodlegemer 25, ved anvendelse af trypanblå udelukkelseslevedygtighedstesten. Det blev observeret, at radioaktiv mærkning ikke havde nogen negativ indvirkning på cellernes levedygtighed; <5% af de døde celler blev fundet op til 7 dage efter mærkning for både [89Zr] Zr-DBN-mærkede og umærkede mMC'er og hMSC'er18. Radiomærkning påvirkede heller ikke levedygtigheden af svinehepatocytter22,24, når de blev testet inden for 1 time efter radioaktiv mærkning eller 2 dage efter radioaktiv mærkning for de dyrkede radioaktivt mærkede humane kardiopoietiske stamceller19.

Radiomærkning af humane hvide blodlegemer påvirkede heller ikke cellernes levedygtighed negativt, da ~ 90-95% af levedygtige celler blev observeret i både de umærkede og mærkede cellepopulationer inden for 1 time efter radiomærkning25. Radioaktiv mærkning af kardiopoietiske stamceller påvirkede ikke morfologien, levedygtigheden eller spredningskapaciteten af humane kardiopoietiske stamceller19. Funktionelle studier blev udført med kardiopoietiske stamceller i et myokardieinfarkt model19. I de funktionelle undersøgelser forblev den karakteristiske ekspression af mesodermale og prokardiogene transkriptionsfaktorer, der definerede den kardiopoietiske fænotype, uændret i radioaktivt mærkede kardiopoietiske stamceller19. De radioaktivt mærkede kardiopoietiske stamceller var i stand til at forbedre venstre ventrikels uddrivningsfraktion i et kronisk infarkt musehjerte i infarkthjertemodel19.

Figure 6
Figur 6: Stabilitet af forskellige celler radioaktivt mærket med 89Zr over 7 dage. Tilbageholdelsen af 89Zr radioaktivitet af radioaktivt mærkede celler viste sig at være stabil i alle de undersøgte celler, med en ubetydelig efflux observeret over 7 dage efter mærkning. Værdier vises som gennemsnit ± standardafvigelse, n = 3. Dette tal er fra Bansal et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Repræsentativ rad-TLC på 89 Zr chelation med DFO-Bn-NCS ved anvendelse af [89Zr]Zr(HPO4)2 i 100 mM DTPA (pH 7,0) opløsning. Rad-TLC blev kørt i 100 mM DTPA (pH 7,0) som den mobile fase; [89Zr] Zr-DBN ; viser en R f på ~0,021-0,035 og [89Zr]Zr(HPO4)2 viser en R f på ~1,0. Chelateringseffektivitet (%) = procentdel af 89 Zr chelateret til DFO-Bn-NCS til dannelse af [89 Zr]Zr-DBN = [radioaktivitet ved R f på [89 Zr]Zr-DBN/(summen af radioaktiviteterne ved R f [89 Zr]Zr-DBN og ved R f [89Zr]Zr(HPO4)2)] × 100. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Repræsentativ rad-TLC på 89 Zr chelation med DFO-Bn-NCS ved anvendelse af [89Zr]ZrCl4 i 100 mM DTPA (pH 7,0) opløsning. Rad-TLC blev kørt i 100 mM DTPA (pH 7,0) som den mobile fase; [89Zr] Zr-DBN viser en R f på ~0,021-0,035 og [89Zr]ZrCl4 viser en R f på ~1,0. Chelateringseffektivitet (%) = procentdel af 89 Zr chelateret til DFO-Bn-NCS til dannelse af [89 Zr]Zr-DBN = [radioaktivitet ved R f på [89 Zr]Zr-DBN/(summen af radioaktiviteterne ved R f [89 Zr]Zr-DBN og ved R f [89Zr]ZrCl4)] × 100. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Repræsentativ rad-TLC af celleradiomærkningsreaktion fra trin 4.2.3 i et 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5.1):methanol (1:1, V:V) opløsning. Rad-TLC blev kørt i 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1): methanol (1: 1, V: V) som den mobile fase; de radioaktivt mærkede celler viser en R f på ~ 0,01-0,02 og [89 Zr] Zr-DBN og [89 Zr] ZrCl4 viser en R f på ~ 0,73-0,81. Procentdelen af radioaktivitet ved en R f på ~0,01-0,02 beregnes ved formel: [(radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02)/(summen af radioaktiviteterne ved R f = ~0,01-0,02 og R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: Repræsentativ rad-TLC af nulcellekontrolreaktion fra trin 4.2.4 i en 20 mM natriumcitrat pH 4,9-5.1: methanol (1: 1, V: V) opløsning. Med 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1): methanol (1: 1, V: V) som rad-TLC-opløsningsmiddel blev rad-TLC kørt i 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1): methanol (1: 1, V: V) som den mobile fase; [89Zr] Zr-DBN og [89Zr]ZrCl4 viser en Rf på ~0,73-0,81. Procentdelen af radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02 beregnes ved formel: [(radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02)/(summen af radioaktiviteterne ved R f = ~0,01-0,02 og R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Følgende er kritiske trin i protokollen, der har brug for optimering til effektiv celleradiomærkning. I protokoltrin 1.2 og 1.3 skal der afhængigt af det anvendte volumen på [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4 anvendes et passende volumen (mikroliter) base; 1,0 MK2CO3 opløsning skal anvendes til neutralisering af [89 Zr]Zr(HPO 4)2 og 1,0 M Na 2 CO3 opløsning til neutralisering af [89Zr]ZrCl4 for at opnå et pH-interval på 7,5-8,0. I trin 2.1 skal den cellekompatible blanding bestående afK2HPO 4/KH2PO 4 og HEPES tilsættes i [89 Zr]Zr-DBN-formuleringen, når den fremstilles ud fra [89Zr]ZrCl 4, for at øge effektiviteten af celleradiomærkning. Det bemærkes, at desferrioxamin-Bn-NCS radioaktivt mærket med [89 Zr]ZrCl 4 undlod at mærke stamceller radioaktivt, medmindre fosfat- og HEPES-buffere blev tilsat i cellemærkningsblandingen, hvilket indikerer, at en passende formulering er nødvendig for at anvende [89Zr]ZrCl 4 som udgangsformulering.

For at optimere cellemærkningseffektiviteten for hver celletype (protokoltrin 4.2) skal inkubationstiden øges til op til ~ 60 minutter, og inkubationstemperaturen øges fra 25 ° C til 37 ° C, eller pH i mærkningsopløsningen øges til ~ 8,0. Valget af inkubationstid, temperatur og pH er i henhold til celletypens kompatibilitet. For eksempel blev radioaktiv mærkning af hepatocytter udført ved 27 ° C i 45 minutter ved pH ~ 7,522,24, men radiomærkning af stamceller blev udført ved 37 ° C i 30 minutter ved pH ~ 7,5 18.

For at forhindre tab af celler under vask i protokol trin 4.3 skal supernatanten pipetteres omhyggeligt med en pipettevolumenindstilling, der er lavere end det supernatantvolumen, der skal pipetteres ud. Hvis supernatantens rumfang f.eks. er ~600 μl, skal supernatanten pipetteres ud i trin på ~200-500 μl. Dette hjælper med at undgå at forstyrre cellepelleten. Hvis cellepillen forstyrres under pipettering af supernatanten, skal pipetteringen af supernatanten stoppes og centrifugeres igen for at få en veldefineret cellepellet. Nogle celler, såsom monocytter i suspensionen af hvide blodlegemer, er tilbøjelige til at binde til rørets vægge. Dette påvirker genopretningen af alle radioaktivt mærkede hvide blodlegemer fra røret efter vask.

Efter radioaktiv mærkning af celler accepteres en visuel inspektionstest, en trypanblå udelukkelseslevedygtighedstest og en stabilitets-/effluxanalyse som kvalitetskontrolkriterier. Hvis cellelevedygtigheden konsekvent falder ved hvert radiomærkningsforsøg for en bestemt celletype, skal de celler, der bliver radioaktivt mærket, kontrolleres for at sikre, at de er kompatible med cellemediet og bufferen, der anvendes under celleradiomærkning. Forskellige kompatible buffere og cellemedium er opsummeret i tabel 1. Det foretrækkes at anvende kendte kompatible cellekulturbetingelser til stabilitets-/effluxundersøgelser. For eksempel kan stabilitets-/effluxundersøgelser udføres med stamceller, dendritiske celler, makrofager, kræftceller, decidual stromale celler og mononukleære celler i perifert blod under cellekulturbetingelser som vist af Bansal et al.18og Friberger et al.20.

De potentielle problemer med lav chelationseffektivitet eller inkonsekvent chelationseffektivitet og/eller lavt radioaktivt mærkningsudbytte eller tab af cellelevedygtighed kan løses ved at ændre trin 1.5, 4.3.7 og 4.3.10 baseret på årsagerne opsummeret i tabel 3.

Tabel 3: Fejlfinding relateret til [89Zr]Zr-DBN-syntese og celleradiomærkning. Mulige årsager og løsninger til en lav / inkonsekvent chelationseffektivitet, lavt celle radiomærkning udbytte, eller tab i celle levedygtighed. Klik her for at downloade denne tabel.

PET-billeddannelse af cellehandel tilbyder høj følsomhed, passende rumlig opløsning og lav baggrund25 som fordele i forhold til andre modaliteter 3,4,9,10. Den [89Zr] Zr-DBN-medierede mærkning af celleoverfladeproteiner med en stabil kovalent binding giver stabilitet af radioetiketmærket 18,19,20,21,22,23,24,25. Som et resultat forbedrer [89Zr] Zr-DBN-baseret cellemærkning pålideligheden og tilliden til radiosignalet (positronemission og gammaer produceret efter udslettelse) opnået fra de radioaktivt mærkede celler. I mellemtiden vides andre metoder, såsom [89Zr] Zr-oxinbaseret radiomærkning, at støde på udstrømning af mærkning af radiotag over tid på grund af den ikke-kovalente karakter af deres radiomærkning, der producerer lavere og off-mærkede radiosignaler27,28.

En begrænsning af denne celle radiomærkning teknik er, at radioaktivitetssignalerne i PET-billederne erhverves efter in vivo administration af levende radioaktivt mærkede celler, men giver ingen anelse om, hvorvidt signalet stammer fra levende radioaktivt mærkede celler eller fra snavs af radioaktivt mærkede celler, der kunne være døde i kroppen efter administrationen.

PET-billeddannelse til cellehandel har et enormt potentiale, da det kan understøtte udviklingen af nye cellebaserede terapier29,30. Læger og forskere, der arbejder i cellebaserede terapier til behandling af kræft 6,7,8,9,10, myokardieinfarkt 3,4,5, myokardiesvigt 1,2, retinal 2 og makula 2 degeneration og diabetes 2 vil finde dette 89Zr-baseret cellemærkningsprotokol instrumental, for bedre at forstå svarene fra deres cellebaserede terapier såsom stamcelleterapier. Derudover har 89Zr-mærkede stamceller31, hvide blodlegemer32, dendritiske celler 33,34 og CAR T-celler35 stort potentiale til at komme ind i den kliniske verden inden for de næste 3-5 år. Desuden kan farmaceutiske virksomheder bruge denne teknik til at udvikle og validere deres cellebaserede terapeutiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingen økonomisk konkurrerende interesse, men er opfinderne af denne teknologi (patent # US20210330823A1).

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 og DOE DE-SC0008947 tilskud, Det Internationale Atomenergiagentur, Wien, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology og Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Alle figurer blev oprettet ved hjælp af BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A996-4
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 12571063
Anion exchange column Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany 731876 Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc., Glendale, AZ, USA 352096 Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-11904
DFO-Bn-NCS Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA B-705 p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 276855
Dose calibrator Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA 5130-3234 CRC -55tR Dose Calibrator 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS) The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 14025092 For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A508P212
Melanoma cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-6475
Methanol Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 34860
Microcentrifuge tube Eppendorf, Hamburg, Germany 30108442 Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA 415-ML-010
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 10010023 For washing cells
Saline Covidien LLC, Mansfield, MA, USA 1020 0.9% Sterile Saline Solution
Shaker  Eppendorf, Hamburg, Germany T1317 Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet  Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA SGI0001 iTLC-SG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
  2. Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
  3. Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
  4. Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
  5. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  6. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
  7. Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
  8. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
  9. Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
  10. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  11. Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
  12. Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
  13. Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  14. Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
  15. Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
  16. Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
  17. Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
  18. Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
  19. Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
  20. Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
  21. Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
  22. Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
  23. Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
  24. Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
  25. Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
  26. Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
  27. Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
  28. Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
  29. Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
  30. Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
  31. Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
  32. Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
  33. Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
  34. de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  35. Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).

Tags

Kræftforskning nr. 200
Positronemissionstomografi Imaging af cellehandel: En metode til celleradiomærkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey,… More

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey, M. K. Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling. J. Vis. Exp. (200), e64117, doi:10.3791/64117 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter