Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Positronemissietomografie Beeldvorming van celhandel: een methode voor celradiolabeling

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/64117
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het radioactief labelen van cellen met een positronemissietomografie (PET) radio-isotoop, 89 Zr (t1/2 78,4 uur), met behulp van een kant-en-klaar radioactief labelend synthon, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling van cellen met [89Zr]Zr-DBN maakt niet-invasieve tracking en beeldvorming mogelijk van toegediende radioactief gelabelde cellen in het lichaam met PET tot 7 dagen na toediening.

Abstract

Stamcel- en chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapieën zijn in opkomst als veelbelovende therapieën voor orgaanregeneratie en als immunotherapie voor verschillende vormen van kanker. Ondanks dat er op deze gebieden aanzienlijke vooruitgang is geboekt, moet er nog meer worden geleerd om de farmacokinetiek en farmacodynamiek van de toegediende therapeutische cellen in het levende systeem beter te begrijpen. Voor niet-invasieve, in vivo tracking van cellen met positronemissietomografie (PET) is een nieuwe [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr]Zr-DBN)-gemedieerde celradiolabelingmethode ontwikkeld met behulp van 89Zr (t1/2 78,4 uur). Het huidige protocol beschrijft een [89Zr]Zr-DBN-gemedieerde, kant-en-klare, radiolabelende synthon voor directe radiolabeling van verschillende cellen, waaronder mesenchymale stamcellen, afstammingsgeleide cardiopoëtische stamcellen, leverregenererende hepatocyten, witte bloedcellen, melanoomcellen en dendritische cellen. De ontwikkelde methodologie maakt niet-invasieve PET-beeldvorming van celhandel mogelijk tot 7 dagen na toediening zonder de aard of de functie van de radioactief gelabelde cellen aan te tasten. Daarnaast beschrijft dit protocol een stapsgewijze methode voor de radiosynthese van [89 Zr]Zr-DBN, biocompatibele formulering van [89 Zr]Zr-DBN, voorbereiding van cellen voor radiolabeling en ten slotte de radiolabeling van cellen met [89Zr]Zr-DBN, inclusief alle ingewikkelde details die nodig zijn voor de succesvolle radiolabeling van cellen.

Introduction

Stamcel- en chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapieën winnen aan populariteit en worden actief onderzocht voor de behandeling van verschillende ziekten, zoals myocardiale insufficiëntie1,2, retinale degeneratie 2, maculadegeneratie 2, diabetes 2, myocardinfarct3,4,5 en kankers 6,7,8,9,10. Van de twee plausibele benaderingen van stamceltherapieën kunnen stamcellen ofwel rechtstreeks op de plaats van de ziekte worden geënt om een therapeutische respons te veroorzaken, ofwel veranderingen in de micro-omgeving van de ziekteplaats veroorzaken zonder zich aan de ziekteplaats te hechten om een indirecte therapeutische respons op gang te brengen. Een indirecte therapeutische respons kan veranderingen in de micro-omgeving van de plaats van de ziekte veroorzaken door factoren vrij te geven die de ziekte zouden herstellen of behandelen. Deze benaderingen van stamceltherapieën kunnen worden geëvalueerd door niet-invasieve beeldvorming van radioactief gelabelde stamcellen. Niet-invasieve beeldvorming zou de opname van de radioactief gelabelde cellen op de plaats van de ziekte kunnen correleren met een therapeutische respons om de directe versus indirecte therapeutische respons te ontcijferen.

Daarnaast worden op immuuncellen gebaseerde therapieën ontwikkeld om verschillende vormen van kanker te behandelen met behulp van CAR T-cel 6,7,8,9,10 en dendritische celimmunotherapie 11,12. Mechanistisch gezien worden T-cellen in CAR T-celimmunotherapie 6,7,8,9,10 gemanipuleerd om een epitoop tot expressie te brengen dat zich bindt aan een specifiek antigeen op tumoren die moeten worden behandeld. Deze gemanipuleerde CAR-T-cellen binden zich bij toediening aan het specifieke antigeen dat aanwezig is op de tumorcellen via een epitoop-antigeeninteractie. Na binding ondergaan de gebonden CAR-T-cellen activering en prolifereren ze vervolgens en geven ze cytokines af, die het immuunsysteem van de gastheer signaleren om de tumor aan te vallen die het specifieke antigeen tot expressie brengt. In het geval van dendritische celtherapieën11,12 daarentegen worden dendritische cellen gemanipuleerd om een specifiek kankerantigeen op hun oppervlak te presenteren. Deze gemanipuleerde dendritische cellen herbergen bij toediening de lymfeklieren en binden zich aan de T-cellen in de lymfeklieren. De T-cellen ondergaan, na binding aan de specifieke kankerantigenen op de toegediende dendritische cellen, activering/proliferatie en initiëren een immuunrespons van de gastheer tegen de tumor die dat specifieke antigeen tot expressie brengt. Daarom is de beoordeling van het transport van toegediende CAR-T-cellen naar een tumorplaats 9,10 en homing van dendritische cellen naar de lymfeklieren11,12 mogelijk door radioactief gelabelde CAR-T-cellen en dendritische cellen in beeld te brengen om de werkzaamheid van immunotherapie te bepalen. Bovendien kan niet-invasieve celhandel helpen om het therapeutisch potentieel beter te begrijpen, de directe versus indirecte therapeutische respons te verduidelijken en de therapeutische respons van zowel stamcel- als immuuncelgebaseerde therapieën te voorspellen en te monitoren.

Er zijn verschillende beeldvormingsmodaliteiten voor celhandel onderzocht 3,4,9,10,12, waaronder optische beeldvorming, magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), computertomografie met enkelvoudige fotonemissie (SPECT) en positronemissietomografie (PET). Elk van deze technieken heeft zijn eigen voor- en nadelen. Hiervan is PET de meest veelbelovende modaliteit vanwege het kwantitatieve karakter en de hoge gevoeligheid, die essentieel zijn voor de betrouwbare kwantificering van cellen in op beeldvorming gebaseerde celhandel 3,4,9,10.

De positron-emitterende radio-isotoop 89Zr, met een halfwaardetijd van 78,4 uur, is geschikt voor cellabeling. Het maakt PET-beeldvorming van celhandel gedurende meer dan 1 week mogelijk en wordt gemakkelijk geproduceerd door algemeen verkrijgbare, energiezuinige medische cyclotrons 13,14,15,16,17. Bovendien is een op de juiste manier gefunctionaliseerde, p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO-Bn-NCS) chelator in de handel verkrijgbaar voor de synthese van een 89 Zr-gelabelde, kant-en-klare cellabelsynthon, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, ook bekend als [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. Het principe van [89 Zr]Zr-DBN-gemedieerde cellabeling is gebaseerd op een reactie tussen primaire aminen van celmembraaneiwitten en het isothiocyanaat (NCS)-deel van [89Zr]Zr-DBN om een stabiele covalente thioureumbinding te produceren.

[89Zr] Zr-DBN-gebaseerde cellabeling en beeldvorming zijn gepubliceerd om een verscheidenheid aan verschillende cellen te volgen, waaronder stamcellen 18,23,25, dendritische cellen18, cardiopoëtische stamcellen19, deciduale stromale cellen 20, beenmerg-afgeleide macrofagen 20, perifere bloed mononucleaire cellen 20, Jurkat/CAR T-cellen21, hepatocyten 22,24 en witte bloedcellen 25. Het volgende protocol biedt stapsgewijze methoden voor bereiding en radioactieve labeling van cellen met [89Zr]Zr-DBN en beschrijft wijzigingen die nodig kunnen zijn in het radiolabelingsprotocol voor een specifiek celtype. Voor meer duidelijkheid is de hier gepresenteerde methode van celradiolabeling verdeeld in vier secties. Het eerste deel behandelt de bereiding van [89 Zr]Zr-DBN door 89Zr te cheleren met DFO-Bn-NCS. Het tweede deel beschrijft de bereiding van een biocompatibele formulering van [89Zr]Zr-DBN die gemakkelijk kan worden gebruikt voor radioactieve labeling van cellen. Het derde deel behandelt de stappen die nodig zijn voor de preconditionering van cellen voor radiolabeling. De preconditionering van cellen omvat het wassen van de cellen met eiwitvrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en HEPES-gebufferde Hanks gebalanceerde zoutoplossing (H-HBSS) om externe eiwitten te verwijderen, die de reactie van [89Zr]Zr-DBN met primaire aminen die aanwezig zijn op de eiwitten van het celoppervlak tijdens radiolabeling kunnen verstoren of concurreren. Het laatste deel bevat de stappen die betrokken zijn bij de daadwerkelijke radiolabeling van de cellen en de analyse van de kwaliteitscontrole.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dendritische cellen en melanoomcellen werden commercieel verkregen18. Hepatocyten werden geïsoleerd uit de lever van varkens na laparoscopische partiële hepatectomie22,24. Stamcellen werden geïsoleerd uit beenmergaspiraten18,19,26. De van vetweefsel afgeleide stamcellen werden verkregen van het Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. Menselijke witte bloedcellen werden geïsoleerd uit het verzamelde bloed dat werd ontvangen van de afdeling Transfusiegeneeskunde, Mayo Clinic Rochester25. Verschillende cellen die werden gebruikt voor radiolabeling werden verkregen en gebruikt in overeenstemming met de richtlijnen die worden aanbevolen door de Institutional Animal Care and Use Committee, Mayo Clinic Stem Cell Research Oversight Subcommittee, Division of Transfusion Medicine Research Committee, Institutional Biosafety Committee en door de Radiation Safety Committee.

1. Bereiding van [ 89 Zr ]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([ 89Zr ]Zr-DBN)

timing: ~160-220 min
OPMERKING: Isolaat voor de bereiding van [89 Zr]Zr-DBN 89 Zr in de vorm van [89 Zr]Zr-waterstoffosfaat ([89 Zr]Zr(HPO 4)2) of [89 Zr]Zr-chloride ([89Zr]ZrCl4), zoals vermeld in stap 1.1.

  1. Isoleer 89 Zr van ouder 89Y met behulp van een beproefde zuiveringsmethode op basis van hydroxamaathars13,17. Kortom, bereid eerst een kolom voor met ~100 mg hydroxamaathars, activeer vervolgens de hydroxamaathars door de kolom te wassen met 8,0 ml zuiver watervrij acetonitril, gevolgd door een spoeling met 5,0-6,0 ml lucht. Was vervolgens de kolom met 15 ml gedeïoniseerd water, gevolgd door nog een spoeling met 5.0-6.0 ml lucht en passeer vervolgens 2.0 ml 0.50 N HCl (basiskwaliteit van sporenmetalen) gevolgd door een extra spoeling met 5.0-6.0 ml lucht. Laad vervolgens de oplossing met zowel 89 Zr als 89 Y langzaam in de hydroxamaathars en was de ongebonden 89Y van de hydroxamaathars met 20 ml 2,0 N HCl, gevolgd door 10 ml gedeïoniseerd water en een spoeling met 5,0-6,0 ml lucht.
    NOTITIE: Na het spoelen met lucht kan de elutie van 89Zr worden uitgevoerd zoals hieronder weergegeven.
    1. Voor het elueren van 89 Zr in de vorm van [89 Zr]Zr(HPO 4)2, voeg eerst 0,50 ml 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO 4 buffer (pH 3,5) toe aan de kolom uit stap 1.1 en laat deze 30 minuten op de kolom staan om de afgifte van 89 Zr als een [89Zr]Zr(HPO 4)2 uit de hars te bevorderen. Elueer vervolgens de 89Zr uit de kolom met nog eens 1,50 ml 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO4 buffer (pH 3,5). Volg na de elutie van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 de stappen 1.2, 1.2.1 en 1.2.2 voor de bereiding van [89 Zr]Zr-DBN met behulp van [89Zr]Zr(HPO 4)2, zoals weergegeven in figuur 1.
    2. Voor het verkrijgen van 89 Zr als [89 Zr]ZrCl4, elueert u eerst 89 Zr als [89Zr]Zr-oxalaat.
      1. Voor het elueren van 89 Zr in de vorm van [89 Zr]Zr-oxalaat, voeg 0,50 ml 1,0 M oxaalzuur toe aan de kolom uit stap 1.1 en laat het 1 minuut op de kolom zitten om de afgifte van 89 Zr als een [89Zr]-oxalaat uit de hars te bevorderen. Elueer vervolgens de 89Zr uit de kolom met nog eens 2,50 ml 1,0 M oxaalzuur (totaal 3,0 ml)17.
      2. Om [89 Zr]Zr-oxalaat om te zetten in [89Zr]ZrCl4 met behulp van een anionenuitwisselingskolom, zoals beschreven door Larenkov et al.14, activeert u eerst de kolom door te wassen met 6,0 ml acetonitril, gevolgd door een spoeling met 5,0-6,0 ml lucht. Was vervolgens de kolom met 10.0 ml zoutoplossing, gevolgd door nog een spoeling van 5.0-6.0 ml lucht. Geef ten slotte 10,0 ml gedeïoniseerd water door, gevolgd door een spoeling met 5,0-6,0 ml lucht.
      3. Laad de 3,0 ml oplossing met [89Zr]Zr-oxalaat langzaam op de geactiveerde anionenuitwisselingskolom, gevolgd door een spoeling van 5,0-6,0 ml lucht. Was vervolgens de 89Zr-geladen kolom met 50.0 ml gedeïoniseerd water om ongebonden oxalaationen te verwijderen, gevolgd door een spoeling met 5.0-6.0 ml lucht.
      4. Voor het elueren van 89 Zr in de vorm van [89 Zr]ZrCl 4, voegt u 0,10 ml 1,0 N HCl toe aan de kolom, laat u deze 1,0 minuut op de kolom staan om de afgifte van 89 Zr als [89 Zr]ZrCl4 uit de hars te bevorderen, en elueert u de 89Zr uit de kolom met nog eens 0,40 ml 1,0 N HCl (totaal 0,5 ml). Droog de geëlueerde [89Zr]ZrCl4 in een V-vormige injectieflacon door deze gedurende 10-30 minuten in een verwarmingsblok bij 65 °C onder een constante stroom stikstofgas te plaatsen. Reconstitueer na het drogen de gedroogde [89 Zr]ZrCl 4 in water en volg de stappen 1.3 en 1.3.1 voor de bereiding van [89 Zr]Zr-DBN met behulp van [89Zr]ZrCl4, zoals weergegeven in figuur 1.
  2. Neem ~120 μL [89Zr]Zr(HPO 4)2, geformuleerd in 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO 4 (pH 3,5) (10-25 MBq) uit stap 1.1.1, en neutraliseer de oplossing tot pH 7,5-8,0 met ~100 μL van 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5) en ~65 μL van 1,0 M K 2 CO3.
    1. Om de juiste hoeveelheid DFO-Bn-NCS te verkrijgen voor stap 1.2.2 of 1.3.1 voor verschillende 89 Zr-formuleringen met een gevarieerde schijnbare specifieke activiteit van 89 Zr, voert u een reeks chelatiereacties uit met behulp van een vast volume van een geneutraliseerde formulering van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 of [89Zr]ZrCl4 met een bereik van DFO-Bn-NCS (7,5-15 μg). In het geval van [89Zr]Zr(HPO4)2 de chelatiereactie bij 37 °C in een shaker bij ~550 tpm gedurende 60 min. Terwijl, in het geval van [89Zr]ZrCl4, de chelatiereactie bij 25 °C in een shaker bij ~550 tpm gedurende 30 minuten wordt geïncubeerd. Gooi de chelatiereactie weg die neerslag vertoont tijdens of aan het einde van de incubatie. Voer aan het einde van de incubatie radioactieve dunnelaagchromatografie (rad-TLC) uit met 100 mM diethyleentriaminepentaacetaat (DTPA), pH 7.0, als een mobiele fase om de chelatie-efficiëntie van DFO-Bn-NCS voor elke chelatiereactie te schatten, zoals hieronder besproken in stap 1.5.
      OPMERKING: Gebruik op basis van de chelatie-efficiëntie de minimale hoeveelheid DFO-Bn-NCS in stappen 1.2.2 of 1.3.1 die nodig is om een chelatie-efficiëntie van ≥97% te bereiken zonder neerslag van DFO-Bn-NCS te veroorzaken in de geneutraliseerde formulering van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 of [89Zr]ZrCl 4. Hierin werd [89Zr]Zr-DBN gesynthetiseerd in ≥97% radiochemische zuiverheid.
    2. Bereid vers 5,0 mM DFO-Bn-NCS in watervrij DMSO (3,76 mg/ml) en voeg 4,0 μl 5,0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol of 15 μg) toe aan ~285 μL geneutraliseerde [89Zr]Zr(HPO4)2 (10-25 MBq) uit stap 1.2 en meng de oplossing door te pipetteren. Houd de uiteindelijke DMSO-concentratie in het chelatiemengsel onder 2% van het totale volume.
  3. Neem ~180 μL [89Zr]ZrCl 4 geformuleerd in 0,1 N HCl (40-80 MBq) uit stap 1.1.2.4 en neutraliseer de resulterende oplossing om pH 7,5-8,0 te bereiken met ~25 μL van 1,0 M Na2CO3.
    1. Bereid vers 2,5 mM DFO-Bn-NCS in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) (1,88 mg/ml) en voeg 4,0 μL 2,5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol of 7,5 μg) toe aan ~205 μL geneutraliseerde [89 Zr]ZrCl4 (40-80 MBq) uit stap 1.3. Meng de oplossing door te pipetteren. Houd de uiteindelijke DMSO-concentratie in het chelatiemengsel onder 2% van het totale volume.
  4. Ga verder met de chelatie van 89 Zr bij 37 °C in een shaker bij ~550 rpm gedurende 60 min in het geval van [89 Zr]Zr(HPO 4)2, of bij 25 °C in een shaker bij ~550 rpm gedurende 30 min in het geval van [89Zr]ZrCl 4.
  5. Bepaal de chelatie-efficiëntie van 89Zr met rad-TLC met 100 mM DTPA (pH 7,0) als het mobiele rad-TLC-oplosmiddel. Verwacht dat [89 Zr]Zr-DBN een R f van ~0,021-0,035 laat zien, [89 Zr]ZrCl 4 een R f van ~1,0 en [89Zr]Zr(HPO4)2 een R f van ~1,0. Bereken de chelatie-efficiëntie (%) met behulp van vergelijking (1):
    Percentage van 89 Zr gecheleerd tot DFO-NCS om [89 Zr]Zr-DBN te vormen = [ (Radioactiviteit bij R f van [89 Zr]Zr - DBN) / (Som van de radioactiviteiten bij R f van [89 Zr]Zr - DBN en bij R   f van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 of [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    OPMERKING: De aanvaardbare chelatie-efficiëntie van 89Zr om door te gaan met radiolabeling van cellen, zoals bepaald door rad-TLC, is ≥97%. De voorgestelde radiochemische zuiverheid van [89 Zr]Zr-DBN van ≥97% werd vastgesteld volgens de standaard radiochemische zuiverheidseis voor andere radiofarmaca die in het veld worden gebruikt. Zie de representatieve rad-TLC in aanvullende figuur S1 en aanvullende figuur S2.

Figure 1
Figuur 1: Schema van de [89Zr]Zr-DBN-voorbereiding. Neutraliseer voor de bereiding van [89 Zr]Zr-DBN voorgeformuleerde [89 Zr]Zr(HPO 4)2 of [89Zr]ZrCl4 tot een pH van 7,5-8,0. Incubeer de geneutraliseerde oplossing met DFO-Bn-NCS. Controleer de chelatie-efficiëntie van 89Zr volgens DFO-Bn-NCS met rad-TLC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Biocompatibele formulering van [ 89Zr ]Zr-DBN voor radioactieve labeling van cellen (Figuur 2)

timing: ~35 min
OPMERKING: Gezien de tijd die nodig is voor de voorbereiding van cellen in stap 3, start u stap 3 ongeveer 20 minuten voor het begin van stap 2 voor een incubatie van ~30 minuten. Hierdoor kan de radiolabeling van cellen in stap 4 binnen ~5-10 minuten na voltooiing van stap 2-3.2.2 worden gestart.

  1. Voor de formulering van [89 Zr]Zr-DBN gemaakt van de [89 Zr]ZrCl 4 voegt u 50,0 μl van een celcompatibel mengsel van ~27,0 μl 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO 4 (pH 3,5) + ~23,0 μl 1,0 M HEPES-KOH-buffer (pH 7,5) toe aan 50,0 μl [89 Zr]Zr-DBN. Incubeer het mengsel [89Zr]Zr-DBN-cel gedurende ~30 minuten bij kamertemperatuur (25 °C).
    OPMERKING: De [89 Zr]Zr-DBN-formulering gemaakt van [89Zr]Zr(HPO4)2 is biocompatibel voor de radioactieve labeling van cellen en vereist geen stap 2.

Figure 2
Figuur 2: Bereiding van de biocompatibele formulering van de [89Zr]Zr-DBN voor radioactieve labeling in cellen. Voor de bereiding van een kant-en-klare biocompatibele formulering van het radioactief labelende synthon, voeg een gelijk volume celcompatibel mengsel toe, bestaande uit 1,2 M K2 HPO 4/KH2PO4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH aan een gelijk volume [89Zr]Zr-DBN. Incubeer bij 25 °C gedurende ~30 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voorbereiding van cellen voor radioactieve labeling

timing: ~40-50 min

  1. Trypsiniseer ~12 × 106 aanhangende cellen (stamcellen, melanoomkankercellen, cardiopoëtische stamcellen, dendritische cellen of hepatocyten) en centrifugeer de cellen in een conische centrifugebuis van 15,0 ml bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    1. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de celpellet in ~500 μL PBS en breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer de cellen in een microcentrifuge bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    2. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in ~500 μL H-HBSS. Centrifugeer de cellen in een microcentrifuge van 1,5 ml bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal stap 3.1.2 nogmaals en ga verder met stap 4.1.1.
      OPMERKING: H-HBSS is een uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks met 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. In het geval van niet-klevende cellen, zoals menselijke witte bloedcellen (vers geïsoleerde menselijke witte bloedcellen uit het bloed), slaat u de trypsinisatie over en centrifugeert u de celsuspensie met ~12 × 106 cellen in een microcentrifuge van 1,5 ml bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    1. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de celpellet in ~500 μL PBS en centrifugeer de cellen in een microcentrifuge van 1,5 ml bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    2. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in ~500 μL H-HBSS. Centrifugeer de cellen in een microcentrifuge van 1,5 ml bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal stap 3.2.2 nogmaals en ga verder met stap 4.1.1.

4. Radioactieve labeling van cellen

timing: ~125-155 min

  1. Initiëren van radioactieve cellabeling (figuur 3)
    1. Gebruik de celsuspensie uit stap 3.1.2 of stap 3.2.2 om een ~500 μL celsuspensie te bereiden met ongeveer ~6 × 106 cellen in ~500 μL H-HBSS bij pH 7,5-8,0 in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml.
    2. Voeg hieraan ~100 μL van de biocompatibel geformuleerde [89Zr]Zr-DBN uit stap 2 toe.
  2. Celincubatie voor radioactieve labeling (figuur 4)
    1. Meng de biocompatibel geformuleerde [89 Zr]Zr-DBN en de celsuspensie door zachtjes op en neer te pipetteren met een micropipet van ~500 μL. Meet de hoeveelheid radioactiviteit in de incubatiebuis met behulp van een radioactiviteitsdosiskalibrator op de 489-instelling voor 89Zr-isotoop16.
    2. Incubeer de cellen en het [89Zr]Zr-DBN-mengsel in een shaker bij ~550 tpm bij 25-37 °C gedurende 30-45 minuten voor cellabeling.
      OPMERKING: De temperatuur van de incubatie is afhankelijk van de celtypen die worden gebruikt voor radioactieve labeling, zoals weergegeven in tabel 1.
    3. Voer na de incubatie in stap 4.2.2 rad-TLC uit op de radioactieve labelreactie van de cel met behulp van vers bereid rad-TLC-oplosmiddel (20 mM natriumcitraat [pH 4.9-5.1]:methanol [1:1, V:V]). Zoek na de rad-TLC-run naar [89 Zr]Zr-DBN en [89 Zr]ZrCl4 rond R f = ~0.73-0.81 en R f = ~0.01-0.02 voor de radioactief gelabelde cellen. Bereken het percentage radioactiviteit bij Rf = ~0,01-0,02 met behulp van vergelijking (2).
      Percentage radioactiviteit bij R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioactiviteit bij R f= ~0,01 - 0,02) / (Som van de radioactiviteit bij R f = ~0,01 - 0,02 en R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      OPMERKING: Om de pieken te begrijpen die worden gevisualiseerd bij R f = ~ 0,01-0,02 en R f = ~ 0,73-0,81, zie de rad-TLC voor radiolabelreactie op witte bloedcellen in aanvullende figuur S3.
    4. Meng in een aparte microcentrifugebuis van 1,5 ml ~100 μl van de biocompatibel geformuleerde [89Zr]Zr-DBN met ~500 μl H-HBSS bij pH 7,5-8,0 voor gebruik als no-cell control voor achtergrondcorrectie in stap 4.2.5. Voer na incubatie bij een vergelijkbare temperatuur en tijd als gebruikt in stap 4.2.2 rad-TLC uit. Zoek na de rad-TLC-run naar [89 Zr]Zr-DBN en [89 Zr]ZrCl4 rond Rf = ~0.73-0.81. Bereken het percentage radioactiviteit bij Rf = ~0,01-0,02 met behulp van vergelijking (3).
      Radioactiviteit bij R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioactiviteit bij R f= ~0,01 - 0,02) / (Som van de radioactiviteiten bij R f= ~0,01 - 0,02 en R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      OPMERKING: Om de pieken te begrijpen die worden gevisualiseerd bij Rf = ~0,01-0,02 en ~0,73-0,81, zie de rad-TLC van de niet-celcontrolereactie in aanvullende figuur S4.
    5. Bereken de effectieve radioactieve labeling van cellen (%) door het radioactiviteitspercentage bij R f = ~0,01-0,02 (van rad-TLC uit stap 4.2.4) af te trekken van het radioactiviteitspercentage bij R f = ~0,01-0,02 (van rad-TLC uit stap 4.2.3).
  3. Afschrikken van radioactieve etikettering en celwassen (figuur 5)
    1. Nadat u in stap 4.2.5 hebt bevestigd dat de radioactieve labeling met rad-TLC is voltooid, moet de radioactieve labelreactie worden geblust door toevoeging van ~600 μL gekoeld, voor de cel geschikt volledig medium, of door toevoeging van H-HBSS, zoals weergegeven in tabel 1.
    2. Centrifugeer de cellen in een microcentrifuge bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
    3. Resuspendeer de gepelleteerde cellen voorzichtig in ~500 μL gekoeld medium (Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum + 5% penicilline/streptomycine of Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10% foetaal runderserum + 5% penicilline/streptomycine of H-HBSS voor een bepaald celtype, zoals weergegeven in tabel 1. Voer resuspensie van de celpellet uit door voorzichtig op en neer te pipetteren met een micropipet die is ingesteld op ~500 μL.
    4. Centrifugeer de cellen in een microcentrifuge bij ~96 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    5. Herhaal de stappen 4.3.2-4.3.4 tweemaal om de ongebonden radioactiviteit weg te spoelen.
    6. Breng de pellet over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml met DMEM + 10% foetaal runderserum + 5% penicilline/streptomycine in het geval van stamcellen of H-HBSS en meet de radioactiviteit in de celpellet met behulp van een dosiskalibrator op de 489-instelling voor 89Zr-isotoop16.
    7. Bereken de uiteindelijke efficiëntie van radioactieve labeling na alle wasbeurten met behulp van vergelijking (4).
      Radiolabeling-efficiëntie = [(Verval gecorrigeerde radioactiviteit in celpellet in stap 4.3.6) / (Verval gecorrigeerde radioactiviteit in celpellet en H-HBSS in stap 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. Om de kwaliteit van de radioactief gelabelde cellen te garanderen, moet de uiteindelijke suspensie van radioactief gelabelde cellen eerst visueel worden geïnspecteerd op de aanwezigheid van klonten. Als er geen klonten zijn, gaat u met deze laatste opschorting verder met de volgende stap. Als er klonten zijn, maar deze kunnen worden geresuspendeerd door pipetteren of door zachtjes schudden, doe dit dan en ga verder met de volgende stap, aangezien dit de visuele inspectie doorstaat. Als de klonten echter niet opnieuw worden gesuspendeerd door pipetteren of zacht schudden, gooi dan de suspensie weg en begin opnieuw.
    9. Als de visuele inspectie met goed gevolg is uitgevoerd, voer dan binnen 1 uur na radioactieve labeling en de wasstappen (4.3.3-4.3.7) een test uit op de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van 0,4% trypanblauwe oplossing bereid in PBS om de levensvatbaarheid van de radioactief gelabelde cellen te beoordelen.
      1. Om de test uit te voeren, voegt u 10,0 μl 0,4% trypanblauwoplossing toe aan de 10,0 μl-celsuspensie van zowel radioactief gelabelde als niet-gelabelde cellen en mengt u deze door de trypan-blauwcelluspensie op en neer te pipetteren met een micropipet van 10,0 μl.
      2. Laad een hemacytometer met ~10,0 μL van het trypanmengsel van blauwcellige suspensie, tel onmiddellijk het aantal blauw gekleurde cellen en het totale aantal cellen in de hemacytometer onder een microscoop bij lage vergroting of met behulp van een geautomatiseerde celteller. Bereken het percentage levensvatbare cellen met behulp van vergelijking (5).
        Percentage levensvatbare cellen = 100 - [(Aantal blauw gekleurde cellen) / (Aantal totale cellen)] × 100 (5)
    10. Gebruik de radioactief gelabelde cellen als er geen verandering is in het percentage levensvatbare cellen in de radioactief gelabelde celsuspensie in vergelijking met de niet-gelabelde tegenhanger. Gooi de radioactief gelabelde cellen weg als het percentage levensvatbare cellen kleiner is dan dat van de niet-gelabelde tegenhanger.

Figure 3
Figuur 3: Schema van de start van de radioactieve labeling van cellen. Start radiolabeling van cellen door toevoeging van de biocompatibel geformuleerde [89Zr]Zr-DBN aan de celsuspensie bereid in HEPES-gebufferde Hanks gebalanceerde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Schema van de celincubatie voor radioactieve labeling. Meng de biocompatibel geformuleerde [89Zr]Zr-DBN grondig met de celsuspensie en incubeer de celsuspensie in een temperatuurgecontroleerd verwarmingsblok op een shaker gedurende 30-60 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Schema van het blussen van radioactieve labeling en celwassen. Blus de radioactieve labeling van cellen door toevoeging van gekoeld celmedium of H-HBSS, gevolgd door centrifugeren bij 4 °C. Voor het wassen van cellen, gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in ~500 μL gekoeld celmedium of H-HBSS. Herhaal de cyclus van het weggooien van het supernatans en het resuspenderen van de celpellet in vers medium om ongebonden radioactief labelend synthon te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representatieve resultaten die in dit manuscript worden gepresenteerd, zijn samengesteld uit de eerdere [89Zr]Zr-DBN-synthese- en celradiolabelingstudies 18,19,22,23,24,25. Kortom, 89Zr kan met succes worden gecomplexeerd met DFO-Bn-NCS in ~30-60 min bij 25-37 °C met behulp van 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS (tabel 2). De efficiëntie van de radioactieve labeling van cellen varieert van 20-50% als een niet-gecorrigeerde opbrengst die wordt waargenomen in de radioactief gelabelde celpellet na het wassen (tabel 1). 18,19,22,23,24,25(tabel 1).

Over het algemeen werden de volgende radioactiviteitsconcentraties bereikt: 0,1 MBq/10 6 cellen voor hepatocyten 22,24, 0,50 ± 0,10 MBq/10 6 voor melanoomcellen (mMC's)18, 0,47 ± 0,10 MBq/10 6 voor menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC's)18, 0,39 ± 0,20 MBq/10 6 voor dendritische cellen (mDC's)18, 0,27± 0,30 MBq/10 6 voor witte bloedcellen 25, en 0,70 ± 0,20 MBq/106 voor cardiopoëtische stamcellen19 (tabel 1) . Daarentegen werd geen cellabeling waargenomen met behulp van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 of [89Zr]ZrCl 425. Zoals eerder aangetoond, bleken radiolabels stabiel te zijn in mMC's, hMSC's en mDC's, met slechts een verwaarloosbaar percentage van de efflux waargenomen gedurende 7 dagen na labeling (Figuur 6)18. Voor cardiopoëtische stamcellen werd geen efflux waargenomen gedurende 2 dagen na labeling19.

Tabel 1: Efficiëntie van radioactieve labeling van cellen in verschillende celtypen met [89Zr]Zr-DBN. Stamcellen, melanoomcellen, cardiopoëtische stamcellen, hepatocyten, dendritische cellen en witte bloedcellen werden radioactief gelabeld met [89Zr]Zr-DBN met variabele celradiolabeling-efficiëntie. *De efficiëntie van de radioactieve labeling van cellen (%) werd geschat zoals beschreven in stap 4.3.7. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: 89Zr chelatie-efficiëntie van DFO-Bn-NCS. De chelatie-efficiëntie van DFO-Bn-NCS voor 89 Zr met behulp van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 en [89Zr]ZrCl4 is verschillend, zoals gemeten door rad-TLC. *Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Met 50 mM DTPA (pH 7,0) als rad-TLC-oplosmiddel vertoont [89 Zr]Zr(HPO4)2 een R f van ~0,9 18 en [89Zr]Zr-DBN een R f van ~0,018. Met 100 mM DTPA (pH 7.0) als rad-TLC-oplosmiddel vertoont [89Zr]ZrCl4 een Rf van ~1.0. [89Zr] Zr(HPO4)2 toont een R f van ~1.0, en [89Zr]Zr-DBN toont een R f van ~0.021-0.035. Chelatie-efficiëntie (%) = percentage van 89 Zr gecheleerd tot DFO-Bn-NCS om [89 Zr]Zr-DBN = (radioactiviteit bij R f van [89 Zr]Zr-DBN/(som van de radioactiviteit bij R f van [89 Zr]Zr-DBN en bij R f van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 of [89Zr]ZrCl4) × 100. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Het effect van radiolabeling op de levensvatbaarheid van de radioactief gelabelde cellen werd beoordeeld in mMC's 18, varkenshepatocyten 22,24, hMSC's 18, menselijke cardiopoëtische stamcellen19 en immuuncellen, zoals dendritische muizencellen (mDC's)18 en witte bloedcellen 25, met behulp van de trypanblauwe uitsluitingslevensvatbaarheidstest. Er werd waargenomen dat radioactieve labeling geen negatieve invloed had op de levensvatbaarheid van de cellen; <5% van de dode cellen werd tot 7 dagen na labeling gevonden voor zowel [89Zr]Zr-DBN-gelabelde als niet-gelabelde mMC's en hMSC's18. Radiolabeling had ook geen invloed op de levensvatbaarheid van varkenshepatocyten22,24 bij testen binnen 1 uur na radiolabeling of 2 dagen na radiolabeling voor de gekweekte radioactief gelabelde menselijke cardiopoëtische stamcellen19.

De radiolabeling van menselijke witte bloedcellen had ook geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van cellen, aangezien ~90-95% van de levensvatbare cellen werd waargenomen in zowel de niet-gelabelde als de gelabelde celpopulaties binnen 1 uur na radiolabeling25. De radioactieve labeling van cardiopoëtische stamcellen had geen invloed op de morfologie, levensvatbaarheid of proliferatiecapaciteit van menselijke cardiopoëtische stamcellen19. Functionele studies werden uitgevoerd met cardiopoëtische stamcellen in een myocardinfarctmodel19. In de functionele studies bleef de karakteristieke expressie van mesodermale en pro-cardiogene transcriptiefactoren die het cardiopoëtische fenotype definiëren onveranderd in radioactief gelabelde cardiopoëtische stamcellen19. De radioactief gelabelde cardiopoëtische stamcellen waren in staat om de linkerventrikel-ejectiefractie in een chronisch infarct muizenhart te verbeteren in het infarcthartmodel19.

Figure 6
Figuur 6: Stabiliteit van verschillende cellen radioactief gelabeld met 89Zr gedurende 7 dagen. De retentie van 89Zr-radioactiviteit door radioactief gelabelde cellen bleek stabiel te zijn in alle onderzochte cellen, met een verwaarloosbare efflux waargenomen gedurende 7 dagen na labeling. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, n = 3. Dit cijfer is afkomstig van Bansal et al.18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Representatief rad-TLC van 89 Zr-chelatie met DFO-Bn-NCS met behulp van [89Zr]Zr(HPO4)2 in 100 mM DTPA-oplossing (pH 7,0). Rad-TLC werd uitgevoerd in 100 mM DTPA (pH 7.0) als mobiele fase; [89Zr] Zr-DBN ; toont een R f van ~0.021-0.035 en [89Zr]Zr(HPO4)2 toont een R f van ~1.0. Chelatie-efficiëntie (%) = percentage van 89 Zr gecheleerd tot DFO-Bn-NCS om [89 Zr]Zr-DBN = [radioactiviteit bij R f van [89 Zr]Zr-DBN/(som van de radioactiviteiten bij R f van [89 Zr]Zr-DBN en bij R f van [89Zr]Zr(HPO4)2)] × 100 te vormen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Representatief rad-TLC van 89 Zr-chelatie met DFO-Bn-NCS met behulp van [89Zr]ZrCl4 in 100 mM DTPA-oplossing (pH 7,0). Rad-TLC werd uitgevoerd in 100 mM DTPA (pH 7.0) als mobiele fase; [89Zr] Zr-DBN toont een R f van ~0,021-0,035 en [89Zr]ZrCl4 toont een R f van ~1,0. Chelatie-efficiëntie (%) = percentage van 89 Zr gecheleerd tot DFO-Bn-NCS tot [89 Zr]Zr-DBN = [radioactiviteit bij R f van [89 Zr]Zr-DBN/(som van de radioactiviteiten bij R f van [89 Zr]Zr-DBN en bij R f van [89Zr]ZrCl4)] × 100. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Representatief rad-TLC van de radioactieve labelreactie van cellen uit stap 4.2.3 in een 20 mM natriumcitraatoplossing (pH 4,9-5,1):methanol (1:1, V:V). Rad-TLC werd uitgevoerd in 20 mM natriumcitraat (pH 4,9-5,1):methanol (1:1, V:V) als de mobiele fase; de radioactief gelabelde cellen vertonen een R f van ~0,01-0,02 en [89 Zr]Zr-DBN en [89 Zr]ZrCl4 vertonen een R f van ~0,73-0,81. Het percentage radioactiviteit bij een R f van ~0,01-0,02 wordt berekend met de formule: [(radioactiviteit bij R f = ~0,01-0,02)/(som van de radioactiviteit bij R f = ~0,01-0,02 en R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: Representatieve rad-TLC van de niet-celcontrolereactie uit stap 4.2.4 in een 20 mM natriumcitraat pH 4,9-5,1: methanol (1:1, V:V) oplossing. Met 20 mM natriumcitraat (pH 4,9-5,1): methanol (1:1, V:V) als rad-TLC-oplosmiddel, werd rad-TLC uitgevoerd in 20 mM natriumcitraat (pH 4,9-5,1):methanol (1:1, V:V) als mobiele fase; [89Zr] Zr-DBN en [89Zr]ZrCl4 vertonen een Rf van ~0.73-0.81. Het percentage radioactiviteit bij R f = ~0,01-0,02 wordt berekend met de formule: [(radioactiviteit bij R f = ~0,01-0,02)/(som van de radioactiviteit bij R f = ~0,01-0,02 en R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hieronder volgen kritieke stappen in het protocol die moeten worden geoptimaliseerd voor effectieve radiolabeling van cellen. In protocolstappen 1.2 en 1.3 moet, afhankelijk van het gebruikte volume van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 of [89Zr]ZrCl4, een geschikt volume (microliter) base worden gebruikt; 1,0 M K 2 CO 3 oplossing moet worden gebruikt voor de neutralisatie van [89 Zr]Zr(HPO 4)2 en 1,0 M Na 2 CO3 oplossing voor de neutralisatie van[89Zr]ZrCl 4 om een pH-bereik van 7,5-8,0 te bereiken. In stap 2.1 moet het celcompatibele mengsel bestaande uit K2 HPO 4/KH2PO 4 en HEPES worden toegevoegd aan de formulering [89 Zr]Zr-DBN, wanneer het wordt bereid uit [89Zr]ZrCl 4, om de efficiëntie van de radioactieve labeling van cellen te verhogen. Opgemerkt wordt dat desferrioxamine-Bn-NCS radioactief gelabeld met [89 Zr]ZrCl 4 er niet in slaagde stamcellen radioactief te labelen, tenzij fosfaat- en HEPES-buffers werden toegevoegd aan het cellabelmengsel, wat aangeeft dat een geschikte formulering nodig is om [89Zr]ZrCl4 als startformulering te gebruiken.

Voor optimalisatie van de efficiëntie van de celetikettering voor elk celtype (protocolstap 4.2) moet de incubatietijd worden verlengd tot maximaal ~60 min, en de incubatietemperatuur worden verhoogd van 25 °C naar 37 °C of de pH van de etiketteringsoplossing worden verhoogd tot ~8,0. De keuze van incubatietijd, temperatuur en pH zijn afhankelijk van de compatibiliteit van het celtype. Radiolabeling van hepatocyten werd bijvoorbeeld uitgevoerd bij 27 °C gedurende 45 minuten bij pH ~7,522,24, maar radiolabeling van stamcellen werd uitgevoerd bij 37 °C gedurende 30 minuten bij pH ~7,5 18.

In protocolstap 4.3 moet, om het verlies van cellen tijdens het wassen te voorkomen, het supernatans voorzichtig worden uitgepipetteerd met een pipetvolume-instelling die lager is dan het supernatantvolume dat moet worden uitgepipeteerd. Als het supernatansvolume bijvoorbeeld ~600 μL is, moet het supernatans in stappen van ~200-500 μL worden uitgepipetteerd. Dit helpt om verstoring van de celkorrel te voorkomen. Als de celpellet wordt verstoord tijdens het pipetteren van supernatant, moet het pipetteren uit het supernatans worden gestopt en opnieuw worden gecentrifugeerd om een goed gedefinieerde celpellet te krijgen. Sommige cellen, zoals monocyten in de suspensie van witte bloedcellen, zijn vatbaar voor binding aan de wanden van de buis. Dit heeft invloed op het herstel van alle radioactief gelabelde witte bloedcellen uit de buis na het wassen.

Na radioactieve labeling van cellen zijn een visuele inspectietest, een trypanblauwe uitsluitingslevensvatbaarheidstest en een stabiliteits-/effluxanalyse aanvaardbaar als kwaliteitscontrolecriteria. Als de levensvatbaarheid van cellen consequent afneemt bij elke poging tot radioactief labelen voor een bepaald celtype, moeten de cellen die radioactief worden gelabeld worden gecontroleerd om er zeker van te zijn dat ze compatibel zijn met het celmedium en de buffer die worden gebruikt tijdens het radioactief labelen van cellen. Verschillende compatibele buffers en celmedium zijn samengevat in tabel 1. Het verdient de voorkeur om bekende compatibele celkweekomstandigheden te gebruiken voor stabiliteits-/effluxstudies. Stabiliteits-/effluxstudies kunnen bijvoorbeeld worden uitgevoerd met stamcellen, dendritische cellen, macrofagen, kankercellen, deciduale stromale cellen en perifere mononucleaire bloedcellen in celkweekomstandigheden, zoals aangetoond door Bansal et al.18en Friberger et al.20.

De potentiële problemen van een lage chelatie-efficiëntie of inconsistente chelatie-efficiëntie, en/of een lage opbrengst van radioactieve cellabeling of verlies van cellevensvatbaarheid kunnen worden opgelost door de stappen 1.5, 4.3.7 en 4.3.10 te wijzigen op basis van de redenen samengevat in tabel 3.

Tabel 3: Probleemoplossing met betrekking tot [89Zr]Zr-DBN-synthese en radioactieve cellabeling. Mogelijke redenen en oplossingen voor een lage/inconsistente chelatie-efficiëntie, een lage opbrengst aan radioactieve labeling van cellen of verlies van levensvatbaarheid van cellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

De PET-beeldvorming van celhandel biedt een hoge gevoeligheid, geschikte ruimtelijke resolutie en een lage achtergrond25 als voordelen ten opzichte van andere modaliteiten 3,4,9,10. De [89Zr]Zr-DBN-gemedieerde labeling van celoppervlakeiwitten met een stabiele covalente binding biedt stabiliteit van de radiolabeltag 18,19,20,21,22,23,24,25. Als gevolg hiervan verbetert [89Zr]Zr-DBN-gebaseerde cellabeling de betrouwbaarheid en het vertrouwen in het radiosignaal (positronemissie en gamma's geproduceerd na annihilatie) verkregen van de radioactief gelabelde cellen. Ondertussen is bekend dat andere methoden, zoals [89Zr]Zr-oxine-gebaseerde radiolabeling, in de loop van de tijd uitvloeiing van de labelende radiotag tegenkomen vanwege de niet-covalente aard van hun radiolabeling, waardoor lagere en niet-gelabelde radiosignalen worden geproduceerd27,28.

Een beperking van deze techniek voor radioactieve cellabeling is dat de radioactiviteitssignalen in de PET-beelden worden verkregen na in vivo toediening van levende radioactief gelabelde cellen, maar geen aanwijzing geven of het signaal afkomstig is van levende radioactief gelabelde cellen of van het puin van radioactief gelabelde cellen die na de toediening in het lichaam hadden kunnen zijn afgestorven.

PET-beeldvorming voor celhandel heeft een enorm potentieel, omdat het de ontwikkeling van nieuwe celgebaseerde therapieën kan ondersteunen29,30. Artsen en wetenschappers die werkzaam zijn in celgebaseerde therapieën voor de behandeling van kanker 6,7,8,9,10, myocardinfarct 3,4,5, myocardiale insufficiëntie1,2, retinale 2 en maculaire 2 degeneratie en diabetes2 zullen dit vinden 89Zr-gebaseerd cellabelprotocol instrumenteel, om de reacties van hun celgebaseerde therapieën, zoals stamceltherapieën, beter te begrijpen. Bovendien hebben 89Zr-gelabelde stamcellen31, witte bloedcellen32, dendritische cellen 33,34 en CAR T-cellen 35 een groot potentieel om binnen de komende 3-5 jaar het klinische domein te betreden. Bovendien kunnen farmaceutische bedrijven deze techniek gebruiken om hun op cellen gebaseerde therapeutische middelen te ontwikkelen en te valideren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Auteurs hebben geen financieel concurrerend belang, maar zijn de uitvinders van deze technologie (Patent # US20210330823A1).

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 en DOE DE-SC0008947 subsidies, International Atomic Energy Agency, Wenen, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, en Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Alle figuren zijn gemaakt met behulp van BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A996-4
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 12571063
Anion exchange column Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany 731876 Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc., Glendale, AZ, USA 352096 Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-11904
DFO-Bn-NCS Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA B-705 p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 276855
Dose calibrator Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA 5130-3234 CRC -55tR Dose Calibrator 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS) The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 14025092 For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A508P212
Melanoma cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-6475
Methanol Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 34860
Microcentrifuge tube Eppendorf, Hamburg, Germany 30108442 Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA 415-ML-010
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 10010023 For washing cells
Saline Covidien LLC, Mansfield, MA, USA 1020 0.9% Sterile Saline Solution
Shaker  Eppendorf, Hamburg, Germany T1317 Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet  Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA SGI0001 iTLC-SG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
  2. Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
  3. Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
  4. Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
  5. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  6. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
  7. Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
  8. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
  9. Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
  10. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  11. Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
  12. Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
  13. Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  14. Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
  15. Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
  16. Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
  17. Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
  18. Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
  19. Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
  20. Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
  21. Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
  22. Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
  23. Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
  24. Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
  25. Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
  26. Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
  27. Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
  28. Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
  29. Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
  30. Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
  31. Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
  32. Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
  33. Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
  34. de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  35. Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).

Tags

Kankeronderzoek nummer 200
Positronemissietomografie Beeldvorming van celhandel: een methode voor celradiolabeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey,… More

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey, M. K. Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling. J. Vis. Exp. (200), e64117, doi:10.3791/64117 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter