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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung des Zelltransports: Eine Methode der radioaktiven Markierung von Zellen

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/64117
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Hier wird ein Protokoll zur radioaktiven Markierung von Zellen mit einem Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Radioisotop, 89 Zr (t1/2 78,4 h), unter Verwendung eines gebrauchsfertigen radioaktiv markierenden Synthons, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89Zr]Zr-DBN), vorgestellt. Die radioaktive Markierung von Zellen mit [89Zr]Zr-DBN ermöglicht die nicht-invasive Verfolgung und Bildgebung von radioaktiv markierten Zellen im Körper mit PET für bis zu 7 Tage nach der Verabreichung.

Abstract

Stammzell- und chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien entwickeln sich zu vielversprechenden Therapeutika für die Organregeneration und als Immuntherapie für verschiedene Krebsarten. Trotz erheblicher Fortschritte in diesen Bereichen gibt es noch mehr zu lernen, um die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik der verabreichten therapeutischen Zellen im lebenden System besser zu verstehen. Für die nicht-invasive, in vivo Verfolgung von Zellen mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurde eine neuartige [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89 Zr]Zr-DBN)-vermittelte Zellradiomarkierungsmethode unter Verwendung von 89Zr (t1/2 78,4 h) entwickelt. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein [89Zr]Zr-DBN-vermitteltes, gebrauchsfertiges, radioaktiv markierendes Synthon für die direkte radioaktive Markierung einer Vielzahl von Zellen, einschließlich mesenchymaler Stammzellen, liniengesteuerter kardiopoetischer Stammzellen, leberregenerierender Hepatozyten, weißer Blutkörperchen, Melanomzellen und dendritischen Zellen. Die entwickelte Methodik ermöglicht eine nicht-invasive PET-Bildgebung des Zelltransports für bis zu 7 Tage nach der Verabreichung, ohne die Beschaffenheit oder Funktion der radioaktiv markierten Zellen zu beeinträchtigen. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine schrittweise Methode für die Radiosynthese von [89 Zr]Zr-DBN, die biokompatible Formulierung von [89 Zr]Zr-DBN, die Vorbereitung von Zellen für die radioaktive Markierung und schließlich die radioaktive Markierung von Zellen mit [89Zr]Zr-DBN, einschließlich aller komplizierten Details, die für die erfolgreiche radioaktive Markierung von Zellen erforderlich sind.

Introduction

Stammzell- und chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien gewinnen an Popularität und werden aktiv für die Behandlung verschiedener Krankheiten wie Myokardversagen1,2, Netzhautdegeneration 2, Makuladegeneration 2, Diabetes 2, Myokardinfarkt 3,4,5 und Krebs 6,7,8,9 untersucht.10. Unter den beiden plausiblen Ansätzen von Stammzelltherapien können Stammzellen entweder direkt auf die Krankheitsstelle transplantiert werden, um eine therapeutische Reaktion hervorzurufen, oder Veränderungen in der Mikroumgebung der Krankheitsstelle verursachen, ohne an der Krankheitsstelle zu haften, um eine indirekte therapeutische Reaktion auszulösen. Ein indirektes therapeutisches Ansprechen könnte Veränderungen in der Mikroumgebung des Krankheitsortes verursachen, indem Faktoren freigesetzt werden, die die Krankheit reparieren oder behandeln würden5. Diese Ansätze von Stammzelltherapien konnten durch nicht-invasive Bildgebung von radioaktiv markierten Stammzellen evaluiert werden. Die nicht-invasive Bildgebung könnte die Aufnahme der radioaktiv markierten Zellen an der Krankheitsstelle mit einem therapeutischen Ansprechen korrelieren, um das direkte und indirekte therapeutische Ansprechen zu entschlüsseln.

Darüber hinaus werden immunzellbasierte Therapien entwickelt, um verschiedene Krebsarten mit CAR-T-Zellen 6,7,8,9,10 und dendritischen Zellimmuntherapien 11,12 zu behandeln. Mechanistisch werden T-Zellen in der CAR-T-Zell-Immuntherapie 6,7,8,9,10 so verändert, dass sie ein Epitop exprimieren, das an ein spezifisches Antigen auf Tumoren bindet, das behandelt werden muss. Diese gentechnisch veränderten CAR-T-Zellen binden nach der Verabreichung durch eine Epitop-Antigen-Interaktion an das spezifische Antigen, das auf den Tumorzellen vorhanden ist. Nach der Bindung werden die gebundenen CAR-T-Zellen aktiviert, vermehren sich dann und setzen Zytokine frei, die dem Immunsystem des Wirts signalisieren, den Tumor anzugreifen, der das spezifische Antigen exprimiert. Im Gegensatz dazu werden dendritische Zellen im Falle von dendritischen Zelltherapien11,12 so verändert, dass sie ein spezifisches Krebsantigen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Diese manipulierten dendritischen Zellen besiedeln bei der Verabreichung die Lymphknoten und binden an die T-Zellen in den Lymphknoten. Die T-Zellen durchlaufen nach der Bindung an die spezifischen Krebsantigene auf den verabreichten dendritischen Zellen eine Aktivierung/Proliferation und initiieren eine Immunantwort des Wirts gegen den Tumor, der dieses spezifische Antigen exprimiert. Daher ist die Beurteilung des Transports von verabreichten CAR-T-Zellen zu einer Tumorstelle9,10 und des Homings von dendritischen Zellen zu den Lymphknoten11,12 durch die Bildgebung von radioaktiv markierten CAR-T-Zellen und dendritischen Zellen möglich, um die Wirksamkeit der Immuntherapie zu bestimmen. Darüber hinaus kann der nicht-invasive Zelltransport dazu beitragen, das therapeutische Potenzial besser zu verstehen, das direkte und indirekte therapeutische Ansprechen zu klären und das therapeutische Ansprechen sowohl von Stammzell- als auch von Immunzell-basierten Therapien vorherzusagen und zu überwachen.

Es wurden verschiedene bildgebende Modalitäten für den Zelltransport untersucht 3,4,9,10,12, darunter optische Bildgebung, Magnetresonanztomographie (MRT), Einzelphotonenemissions-Computertomographie (SPECT) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Jede dieser Techniken hat ihre eigenen Vor- und Nachteile. Unter diesen ist PET aufgrund ihrer quantitativen Natur und hohen Sensitivität, die für die zuverlässige Quantifizierung von Zellen im bildgebenden Zelltransport unerlässlich sind, die vielversprechendste Modalität 3,4,9,10.

Das Positronen-emittierende Radioisotop 89Zr mit einer Halbwertszeit von 78,4 h eignet sich für die Zellmarkierung. Es ermöglicht die PET-Bildgebung des Zelltransports über 1 Woche lang und wird von weit verbreiteten, energiearmen medizinischen Zyklotronen 13,14,15,16,17 leicht hergestellt. Darüber hinaus ist ein entsprechend funktionalisierter, p-Isothiocyanatobenzyl-Desferrioxamin (DFO-Bn-NCS)-Chelator für die Synthese eines 89 Zr-markierten, gebrauchsfertigen, zellmarkierenden Synthons, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin, auch bekannt als [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24, kommerziell erhältlich,25. Das Prinzip der [89 Zr]Zr-DBN-vermittelten Zellmarkierung basiert auf einer Reaktion zwischen primären Aminen von Zellmembranproteinen und dem Isothiocyanat (NCS)-Teil von [89Zr]Zr-DBN, um eine stabile kovalente Thioharnstoffbindung zu erzeugen.

[89Zr] Zr-DBN-basierte Zellmarkierung und Bildgebung wurden veröffentlicht, um eine Vielzahl verschiedener Zellen zu verfolgen, darunter Stammzellen 18,23,25, dendritische Zellen18, kardiopoetische Stammzellen19, deziduale Stromazellen 20, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen 20, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes 20, Jurkat/CAR-T-Zellen 21, Hepatozyten 22,24 und weiße Blutkörperchen 25. Das folgende Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Methoden zur Präparation und Radiomarkierung von Zellen mit [89Zr]Zr-DBN und beschreibt Änderungen, die im Radiomarkierungsprotokoll für einen bestimmten Zelltyp erforderlich sein können. Zur besseren Übersichtlichkeit ist die hier vorgestellte Methode der radioaktiven Zellmarkierung in vier Abschnitte unterteilt. Der erste Abschnitt befasst sich mit der Herstellung von [89 Zr]Zr-DBN durch Chelatbildung von 89Zr mit DFO-Bn-NCS. Der zweite Abschnitt beschreibt die Herstellung einer biokompatiblen Formulierung von [89Zr]Zr-DBN, die leicht für die radioaktive Markierung von Zellen verwendet werden kann. Der dritte Abschnitt behandelt die Schritte, die für die Vorkonditionierung von Zellen für die radioaktive Markierung erforderlich sind. Die Vorkonditionierung der Zellen beinhaltet das Waschen der Zellen mit proteinfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und HEPES-gepufferter Hanks-Salzlösung (H-HBSS), um externe Proteine zu entfernen, die die Reaktion von [89Zr]Zr-DBN mit primären Aminen, die während der radioaktiven Markierung auf den Proteinen der Zelloberfläche vorhanden sind, stören oder mit ihr konkurrieren könnten. Der letzte Abschnitt beschreibt die Schritte der eigentlichen radioaktiven Markierung der Zellen und der Analyse der Qualitätskontrolle.

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Protocol

Dendritische Zellen und Melanomzellen wurden kommerziell gewonnen18. Hepatozyten wurden nach laparoskopischer partieller Hepatektomie aus der Leber von Schweinen isoliert22,24. Die Stammzellen wurden aus Knochenmarkaspiraten isoliert18,19,26. Die aus dem Fettgewebe gewonnenen Stammzellen wurden aus dem Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23, gewonnen. Menschliche weiße Blutkörperchen wurden aus dem entnommenen Blut isoliert, das von der Abteilung für Transfusionsmedizin der Mayo Clinic Rochester25 erhalten wurde. Verschiedene Zellen, die für die radioaktive Markierung verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien gewonnen und verwendet, die vom Institutional Animal Care and Use Committee, dem Mayo Clinic Stem Cell Research Oversight Subcommittee, dem Division of Transfusion Medicine Research Committee, dem Institutional Biosafety Committee und dem Radiation Safety Committee empfohlen wurden.

1. Herstellung von [ 89 Zr ]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([ 89Zr ]Zr-DBN)

Zeit: ~160-220 min
ANMERKUNG: Zur Herstellung von [89 Zr]Zr-DBN 89 Zr in Form von [89 Zr]Zr-Hydrogenphosphat ([89 Zr]Zr(HPO4)2) oder [89 Zr]Zr-Chlorid ([89Zr]ZrCl4) isolieren, wie in Schritt 1.1 beschrieben.

  1. Isolierung von 89 Zr aus dem Mutterstoff 89Y unter Verwendung eines etablierten Reinigungsverfahrens auf Hydroxamatharzbasis13,17. Kurz gesagt, bereiten Sie zuerst eine Säule mit ~100 mg Hydroxamatharz vor, aktivieren Sie dann das Hydroxamatharz, indem Sie die Säule mit 8,0 ml reinem wasserfreiem Acetonitril waschen, gefolgt von einer Spülung mit 5,0-6,0 ml Luft. Dann wird die Säule mit 15 ml deionisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von einer weiteren Spülung mit 5,0 bis 6,0 ml Luft und dann 2,0 ml 0,50 N HCl (Spurenmetallbasis), gefolgt von einer zusätzlichen Spülung mit 5,0 bis 6,0 ml Luft. Als nächstes wird die Lösung, die sowohl 89 Zr als auch 89 Y enthält, langsam in das Hydroxamatharz geladen und die ungebundenen 89Y aus dem Hydroxamatharz mit 20 ml 2,0 N HCl gewaschen, gefolgt von 10 ml deionisiertem Wasser und einer Spülung mit 5,0 bis 6,0 ml Luft.
    HINWEIS: Nach dem Spülen mit Luft kann die Elution von 89Zr wie unten gezeigt durchgeführt werden.
    1. Um 89 Zr in Form von [89 Zr]Zr(HPO4)2 zu eluieren, werden zunächst 0,50 ml 1,2 MK2HPO4/KH2PO4-Puffer (pH3,5) in die Säule aus Schritt 1.1 gegeben und 30 Minuten auf der Säule sitzen gelassen, um die Freisetzung von 89 Zr als [89Zr]Zr(HPO 4)2 aus dem Harz zu fördern. Anschließend werden die 89Zr aus der Säule mit zusätzlichen 1,50 ml 1,2 M K2 HPO4/KH2PO4-Puffer (pH 3,5) eluiert. Nach der Elution von [89 Zr]Zr(HPO 4)2 sind die Schritte 1.2, 1.2.1 und 1.2.2 zur Herstellung von [89 Zr]Zr-DBN unter Verwendung von [89Zr]Zr(HPO 4)2 zu befolgen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
    2. Um 89 Zr als [89 Zr]ZrCl4 zu erhalten, werden zunächst 89 Zr als [89Zr]Zr-Oxalat eluiert.
      1. Zum Eluieren von 89 Zr in Form von [89 Zr]Zr-Oxalat werden 0,50 ml 1,0 M Oxalsäure in die Säule aus Schritt 1.1 gegeben und 1 Minute auf der Säule ruhen gelassen, um die Freisetzung von 89 Zr als [89Zr]-Oxalat aus dem Harz zu fördern. Anschließend werden die 89Zr aus der Säule mit zusätzlichen 2,50 ml 1,0 M Oxalsäure (insgesamt 3,0 ml)17 eluiert.
      2. Um [89Zr]Zr-Oxalat unter Verwendung einer Anionenaustauschsäule in [89Zr]ZrCl4 umzuwandeln, wie von Larenkov et al.14 beschrieben, wird die Säule zunächst durch Waschen mit 6,0 ml Acetonitril aktiviert, gefolgt von einer Spülung mit 5,0 bis 6,0 ml Luft. Waschen Sie dann die Säule mit 10,0 ml Kochsalzlösung, gefolgt von einer weiteren Spülung mit 5,0-6,0 ml Luft. Zum Schluss 10,0 ml deionisiertes Wasser ablassen, gefolgt von einer Spülung mit 5,0-6,0 ml Luft.
      3. Die 3,0-ml-Lösung, die [89Zr]Zr-Oxalat enthält, wird langsam auf die aktivierte Anionenaustauschsäule geladen, gefolgt von einer Spülung von 5,0-6,0 ml Luft. Waschen Sie dann die mit 89Zr beladene Säule mit 50,0 ml deionisiertem Wasser, um das ungebundene Oxalat-Ion zu entfernen, gefolgt von einer Spülung mit 5,0-6,0 ml Luft.
      4. Um 89 Zr in Form von [89 Zr]ZrCl4 zu eluieren, werden 0,10 ml 1,0 N HCl in die Säule gegeben, 1,0 Minuten auf der Säule sitzen gelassen, um die Freisetzung von 89 Zr als [89 Zr]ZrCl4 aus dem Harz zu fördern, und die 89Zr aus der Säule mit zusätzlichen 0,40 ml 1,0 N HCl (insgesamt 0,5 ml) eluiert. Trocknen Sie das eluierte [89Zr]ZrCl4 in einem V-förmigen Fläschchen, indem Sie es in einen Heizblock bei 65 °C unter einem stetigen Stickstoffgasstrom für 10-30 Minuten geben. Nach dem Trocknen wird das getrocknete [89 Zr]ZrCl4 in Wasser rekonstituiert und die Schritte 1.3 und 1.3.1 zur Herstellung von [89 Zr]Zr-DBN unter Verwendung von [89Zr]ZrCl4 befolgt, wie in Abbildung 1 dargestellt.
  2. Es werden ~120 μl [89Zr]Zr(HPO 4)2, formuliert in 1,2 MK2HPO 4/KH2PO 4 (pH 3,5) (10 bis 25 MBq) aus Schritt 1.1.1 entnommen und die Lösung neutralisiert, um einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 mit ~100 μl 1,0 M HEPES-KOH (PH 7,5) und ~65 μl 1,0 MK2CO3zu erreichen.
    1. Um die geeignete Menge an DFO-Bn-NCS für die Schritte 1.2.2 oder 1.3.1 für verschiedene 89 Zr-Formulierungen mit einer unterschiedlichen scheinbaren spezifischen Aktivität von 89 Zr zu erhalten, wird eine Reihe von Chelatreaktionen unter Verwendung eines festen Volumens einer neutralisierten Formulierung von [89 Zr]Zr(HPO4)2 oder [89Zr]ZrCl4 mit einem Bereich von DFO-Bn-NCS (7,5-15 μg) durchgeführt. Im Fall von [89Zr]Zr(HPO4)2 wird die Chelatreaktion bei 37 °C in einem Shaker bei ~550 U/min für 60 min inkubiert. Im Fall von [89Zr]ZrCl4 wird die Chelatreaktion bei 25 °C in einem Shaker bei ~550 U/min für 30 min inkubiert. Verwerfen Sie die Chelatreaktion, die während oder am Ende der Inkubation einen Niederschlag zeigt. Am Ende der Inkubation wird eine radioaktive Dünnschichtchromatographie (rad-DC) mit 100 mM Diethylentriaminpentaacetat (DTPA), pH 7,0, als mobile Phase durchgeführt, um die Chelatierungseffizienz von DFO-Bn-NCS für jede Chelatreaktion abzuschätzen, wie unten in Schritt 1.5 beschrieben.
      ANMERKUNG: Basierend auf der Chelatierungseffizienz ist die Mindestmenge an DFO-Bn-NCS in den Schritten 1.2.2 oder 1.3.1 zu verwenden, die erforderlich ist, um eine Chelatierungseffizienz von ≥97 % zu erreichen, ohne eine Ausfällung von DFO-Bn-NCS in der neutralisierten Formulierung von [89 Zr]Zr(HPO 4)2 oder [89Zr]ZrCl4 zu verursachen. Hierin wurde [89Zr]Zr-DBN in ≥97%iger radiochemischer Reinheit synthetisiert.
    2. Bereiten Sie frische 5,0 mM DFO-Bn-NCS in wasserfreiem DMSO (3,76 mg/ml) vor und fügen Sie 4,0 μl 5,0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol oder 15 μg) zu ~285 μl neutralisiertem [89Zr]Zr(HPO4)2 (10-25 MBq) aus Schritt 1.2 hinzu und mischen Sie die Lösung durch Pipettieren. Halten Sie die endgültige DMSO-Konzentration in der Chelatmischung unter 2 % des Gesamtvolumens.
  3. Man nehme ~180 μl [89 Zr]ZrCl4, formuliert in 0,1 N HCl (40–80MBq) aus Schritt 1.1.2.4 und neutralisiere die resultierende Lösung, um einen pH-Wert von 7,5–8,0 mit ~25 μl 1,0 MNa2CO3zu erreichen.
    1. Bereiten Sie frische 2,5 mM DFO-Bn-NCS in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) (1,88 mg/ml) vor und geben Sie 4,0 μl 2,5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol oder 7,5 μg) zu ~205 μl neutralisiertem [89 Zr]ZrCl4(40-80 MBq) aus Schritt 1.3. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren. Halten Sie die endgültige DMSO-Konzentration in der Chelatmischung unter 2 % des Gesamtvolumens.
  4. Fahren Sie mit der Chelatbildung von 89 Zr bei 37 °C in einem Shaker bei ~550 U/min für 60 min im Fall von [89 Zr]Zr(HPO 4)2 oder bei 25 °C in einem Shaker bei ~550 U/min für 30 min im Fall von [89Zr]ZrCl4 fort.
  5. Bestimmung der Chelatbildungseffizienz von 89Zr mittels rad-TLC mit 100 mM DTPA (pH 7,0) als mobiles Lösungsmittel rad-TLC. Erwarten Sie, dass [89 Zr]Zr-DBN ein R f von ~0,021-0,035 zeigt, [89 Zr]ZrCl 4 ein R f von ~1,0 und [89Zr]Zr(HPO4)2 ein R f von ~1,0. Berechnen Sie die Chelat-Effizienz (%) anhand von Gleichung (1):
    Prozentsatz von 89 Zr, die zu DFO-NCS chelatisiert werden, um [89 Zr]Zr-DBN = [ (Radioaktivität bei Rf  von [89 Zr]Zr - DBN) / (Summe der Radioaktivitäten bei R f von [89 Zr]Zr - DBN und bei R f von [89 Zr]Zr(HPO 4)2 oder [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    ANMERKUNG: Die akzeptable Chelatierungseffizienz von 89Zr, um mit der radioaktiven Markierung der Zellen fortzufahren, wie durch rad-TLC bestimmt, beträgt ≥97%. Die vorgeschlagene radiochemische Reinheit von ≥97 % von [89Zr]Zr-DBN wurde gemäß der radiochemischen Standardreinheitsanforderung für andere im Feld verwendete Radiopharmazeutika festgelegt. Siehe die repräsentative rad-TLC in der ergänzenden Abbildung S1 und der ergänzenden Abbildung S2.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der [89Zr]Zr-DBN-Präparation. Zur Herstellung von [89 Zr]Zr-DBN wird vorformuliertes [89 Zr]Zr(HPO4)2 oder [89Zr]ZrCl4auf einen pH-Wert von 7,5 bis 8,0 neutralisiert. Inkubieren Sie die neutralisierte Lösung mit DFO-Bn-NCS. Überprüfen Sie die Chelatierungseffizienz von 89Zr zu DFO-Bn-NCS durch rad-TLC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Biokompatible Formulierung von [ 89Zr ]Zr-DBN für die radioaktive Markierung von Zellen (Abbildung 2)

Zeit: ~35 min
HINWEIS: Angesichts der Zeit, die für die Vorbereitung der Zellen in Schritt 3 benötigt wird, beginnen Sie Schritt 3 etwa 20 Minuten vor Beginn von Schritt 2 für eine ~30-minütige Inkubation. Dadurch kann die radioaktive Markierung der Zellen in Schritt 4 innerhalb von ~5-10 Minuten nach Abschluss der Schritte 2-3.2.2 beginnen.

  1. Für die [89 Zr]Zr-DBN-Formulierung aus dem [89 Zr]ZrCl4 werden 50,0 μl eines zellkompatiblen Gemisches zugegeben, das ~27,0 μl 1,2 MK2HPO 4/KH2PO4 (pH 3,5) + ~23,0 μl 1,0 M HEPES-KOH-Puffer (pH 7,5) zu 50,0 μl [89 Zr]Zr-DBN enthält. Inkubieren Sie das [89Zr]Zr-DBN-Zell-kompatible Gemisch für ~30 Minuten bei Raumtemperatur (25 °C).
    HINWEIS: Die [89 Zr]Zr-DBN-Formulierung aus [89Zr]Zr(HPO4)2 ist biokompatibel für die radioaktive Markierung von Zellen und erfordert keinen Schritt 2.

Figure 2
Abbildung 2: Herstellung der biokompatiblen Formulierung des [89Zr]Zr-DBN für die radioaktive Markierung von Zellen. Zur Herstellung einer gebrauchsfertigen biokompatiblen Formulierung des radioaktiv markierenden Synthons wird ein gleiches Volumen einer zellkompatiblen Mischung, bestehend aus 1,2 MK2HPO 4/KH2PO4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH, zu einem gleichen Volumen von [89Zr]Zr-DBN zugegeben. Bei 25 °C ~30 min inkubieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Vorbereitung der Zellen für die radioaktive Markierung

Zeit: ~40-50 min

  1. Trypsinisieren Sie ~12 × 106 adhärente Zellen (Stammzellen, Melanomkrebszellen, kardiopoetische Stammzellen, dendritische Zellen oder Hepatozyten) und zentrifugieren Sie die Zellen in einem konischen 15,0-ml-Zentrifugenröhrchen bei ~96 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
    1. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in ~500 μl PBS und überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einer Mikrozentrifuge bei ~96 × g für 10 min bei 4 °C.
    2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in ~500 μl H-HBSS. Zentrifugieren Sie die Zellen in einer 1,5-ml-Mikrozentrifuge bei ~96 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Wiederholen Sie Schritt 3.1.2 noch einmal und fahren Sie mit Schritt 4.1.1 fort.
      HINWEIS: H-HBSS ist eine ausgewogene Hanks-Salzlösung mit 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. Bei nicht adhärenten Zellen, wie z. B. menschlichen weißen Blutkörperchen (frisch isolierte menschliche weiße Blutkörperchen aus dem Blut), überspringen Sie die Trypsinisierung und zentrifugieren Sie die Zellsuspension mit ~12 × 10 6 Zellen in einer 1,5 ml Mikrozentrifuge bei ~96 × g für10 min bei 4 °C.
    1. Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in ~500 μl PBS und zentrifugieren Sie die Zellen in einer 1,5-ml-Mikrozentrifuge bei ~96 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
    2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in ~500 μl H-HBSS. Zentrifugieren Sie die Zellen in einer 1,5-ml-Mikrozentrifuge bei ~96 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Wiederholen Sie Schritt 3.2.2 noch einmal und fahren Sie mit Schritt 4.1.1 fort.

4. Radioaktive Markierung von Zellen

Zeit: ~125-155 min

  1. Initiierung der radioaktiven Markierung von Zellen (Abbildung 3)
    1. Verwenden Sie die Zellsuspension aus Schritt 3.1.2 oder Schritt 3.2.2, um eine ~500 μl Zellsuspension mit ca. ~6 × 106 Zellen in ~500 μl H-HBSS bei pH 7,5-8,0 in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen herzustellen.
    2. Dazu fügen Sie ~100 μl des biokompatibel formulierten [89Zr]Zr-DBN aus Schritt 2 hinzu.
  2. Zellinkubation für die radioaktive Markierung (Abbildung 4)
    1. Mischen Sie das biokompatibel formulierte [89 Zr]Zr-DBN und die Zellsuspension, indem Sie vorsichtig mit einer Mikropipette auf ~500 μl auf und ab pipettieren. Messen Sie die Radioaktivitätsmenge im Inkubationsröhrchen mit einem Radioaktivitätskalibrator bei der Einstellung 489 für 89Zr-Isotop16.
    2. Inkubieren Sie die Zellen und das [89Zr]Zr-DBN-Gemisch in einem Schüttler bei ~550 U/min bei 25-37 °C für 30-45 Minuten für die Zellmarkierung.
      HINWEIS: Die Temperatur der Inkubation hängt von den Zelltypen ab, die für die radioaktive Markierung verwendet werden, wie in Tabelle 1 dargestellt.
    3. Nach der Inkubation in Schritt 4.2.2 wird die radioaktive Markierungsreaktion der Zelle mit einem frisch hergestellten rad-TLC-Lösungsmittel (20 mM Natriumcitrat [pH 4,9-5,1]:Methanol [1:1, V:V]) durchgeführt. Nach dem rad-TLC-Lauf ist nach [89 Zr]Zr-DBN und [89 Zr]ZrCl4 um R f = ~0,73-0,81 und R f = ~0,01-0,02 für die radioaktiv markierten Zellen zu suchen. Berechnen Sie den prozentualen Anteil der Radioaktivität bei Rf = ~0,01-0,02 unter Verwendung von Gleichung (2).
      Prozentsatz der Radioaktivität bei R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioaktivität bei R f= ~0,01 - 0,02) / (Summe der Radioaktivitäten bei R f = ~0,01 - 0,02 und R f = ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      ANMERKUNG: Um die Peaks zu verstehen, die bei R f = ~0,01-0,02 und R f = ~0,73-0,81 visualisiert werden, siehe die rad-TLC für die radioaktive Markierungsreaktion der weißen Blutkörperchen in Ergänzender Abbildung S3.
    4. Mischen Sie in einem separaten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ~100 μl des biokompatibel formulierten [89Zr]Zr-DBN mit ~500 μl H-HBSS bei einem pH-Wert von 7,5-8,0 zur Verwendung als No-Cell-Kontrolle für die Hintergrundkorrektur in Schritt 4.2.5. Nach der Inkubation bei einer ähnlichen Temperatur und Zeit wie in Schritt 4.2.2 ist die rad-TLC durchzuführen. Suchen Sie nach dem rad-TLC-Lauf nach [89 Zr]Zr-DBN und [89 Zr]ZrCl4 um Rf = ~0,73-0,81. Berechnen Sie den prozentualen Anteil der Radioaktivität bei Rf = ~0,01-0,02 unter Verwendung von Gleichung (3).
      Radioaktivität bei R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioaktivität bei R f= ~0,01 - 0,02) / (Summe der Radioaktivitäten bei R f= ~0,01 - 0,02 und R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      ANMERKUNG: Um die bei Rf = ~0,01-0,02 und ~0,73-0,81 visualisierten Peaks zu verstehen, siehe die rad-TLC der No-Cell-Kontrollreaktion in der ergänzenden Abbildung S4.
    5. Berechnen Sie die effektive Radiomarkierung der Zellen (%), indem Sie den Radioaktivitätsprozentsatz bei R f = ~0,01-0,02 (von rad-TLC aus Schritt 4.2.4) vom Radioaktivitätsprozentsatz bei R f = ~0,01-0,02 (von rad-TLC aus Schritt 4.2.3) subtrahieren.
  3. Quenching von radioaktiver Markierung und Zellwäsche (Abbildung 5)
    1. Nachdem Sie den Abschluss der radioaktiven Markierung durch rad-TLC in Schritt 4.2.5 bestätigt haben, ist die radioaktive Markierungsreaktion durch Zugabe von ~600 μl gekühltem, zellgeeignetem vollständigem Medium oder durch Zugabe von H-HBSS zu löschen, wie in Tabelle 1 gezeigt.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen in einer Mikrozentrifuge bei ~96 × g für 10 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
    3. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen vorsichtig in ~500 μl gekühltem Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM) + 10 % fötales Kälberserum + 5 % Penicillin/Streptomycin oder Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10 % fötales Kälberserum + 5 % Penicillin/Streptomycin oder H-HBSS für einen bestimmten Zelltyp, wie in Tabelle 1 dargestellt. Führen Sie die Resuspension des Zellpellets durch, indem Sie vorsichtig mit einer Mikropipette auf ~500 μl auf und ab pipettieren.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen in einer Mikrozentrifuge bei ~96 × g für 10 min bei 4 °C.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.2 bis 4.3.4 zweimal, um die ungebundene Radioaktivität abzuwaschen.
    6. Das Pellet wird in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit DMEM + 10 % fötalem Rinderserum + 5 % Penicillin/Streptomycin im Falle von Stammzellen oder H-HBSS überführt und die Radioaktivität im Zellpellet mit einem Dosiskalibrator bei der Einstellung 489 für 89Zr-Isotop16 gemessen.
    7. Berechnen Sie die endgültige radioaktive Markierungseffizienz nach allen Wäschen anhand von Gleichung (4).
      Radioaktivierungseffizienz = [(Zerfallskorrigierte Radioaktivität in Zellpellets in Schritt 4.3.6) / (Zerfallskorrigierte Radioaktivität in Zellpellets und H-HBSS in Schritt 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. Um die Qualität der radioaktiv markierten Zellen sicherzustellen, wird zunächst die endgültige Suspension der radioaktiv markierten Zellen visuell auf das Vorhandensein von Klumpen untersucht. Wenn keine Klumpen vorhanden sind, fahren Sie mit dieser letzten Aufhängung mit dem nächsten Schritt fort. Wenn Klumpen vorhanden sind, diese aber durch Pipettieren oder leichtes Schütteln wieder suspendiert werden können, tun Sie dies und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, da dieser die Sichtprüfung besteht. Wenn die Klumpen jedoch weder durch Pipettieren noch durch leichtes Schütteln resuspendiert werden, verwerfen Sie die Suspension und beginnen Sie von vorne.
    9. Wenn die Sichtprüfung bestanden wurde, ist innerhalb von 1 Stunde nach der radioaktiven Markierung und den Waschschritten (4.3.3-4.3.7) zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit der radioaktiv markierten Zellen ein Trypanblau-Ausschluss-Viabilitätstest mit 0,4%iger Trypanblau-Lösung durchzuführen, die in PBS hergestellt wurde.
      1. Um den Test durchzuführen, werden 10,0 μl 0,4%ige Trypanblaulösung in die 10,0 μl-Zellsuspension von radioaktiv markierten und nicht markierten Zellen gegeben und gemischt, indem die Trypan-Blaukörperchen-Suspension mit einer auf 10,0 μl eingestellten Mikropipette auf und ab pipettiert wird.
      2. Befüllen Sie ein Hämazytometer mit ~10,0 μl der Trypan-Blaukörperchen-Suspensionsmischung, zählen Sie sofort die Anzahl der blau gefärbten Zellen und die Gesamtzahl der Zellen im Hämazytometer unter einem Mikroskop bei geringer Vergrößerung oder mit einem automatischen Zellzähler. Berechnen Sie den Prozentsatz lebensfähiger Zellen mit Hilfe von Gleichung (5).
        Prozentsatz lebensfähiger Zellen = 100 - [(Anzahl der blau gefärbten Zellen) / (Anzahl der Zellen insgesamt)] × 100 (5)
    10. Verwenden Sie die radioaktiv markierten Zellen, wenn sich der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen in der radioaktiv markierten Zellsuspension im Vergleich zum unmarkierten Gegenstück nicht ändert. Verwerfen Sie die radioaktiv markierten Zellen, wenn der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen geringer ist als das unmarkierte Gegenstück.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Initiierung der radioaktiven Markierung von Zellen. Initiierung der radioaktiven Markierung von Zellen durch Zugabe des biokompatibel formulierten [89Zr]Zr-DBN zu der Zellsuspension, die in HEPES-gepufferter Hanks-balancierter Salzlösung hergestellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Zellinkubation für die radioaktive Markierung. Mischen Sie das biokompatibel formulierte [89Zr]Zr-DBN gründlich mit der Zellsuspension und inkubieren Sie die Zellsuspension in einem temperaturgeregelten Heizblock auf einem Schüttler für 30-60 min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Schematische Darstellung des Abschreckens von radioaktiver Markierung und Zellwäsche. Die radioaktive Markierung der Zellen wird durch Zugabe von gekühltem Zellmedium oder H-HBSS gelöscht, gefolgt von einer Zentrifugation bei 4 °C. Zum Waschen der Zellen wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in ~500 μl gekühltem Zellmedium oder H-HBSS resuspendiert. Wiederholen Sie den Zyklus des Verwerfens des Überstandes und der Resuspendierung des Zellpellets in frischem Medium, um das ungebundene radioaktiv markierte Synthon zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse, die in diesem Manuskript vorgestellt werden, wurden aus den vorangegangenen [89Zr]Zr-DBN-Synthese- und Zellradiomarkierungsstudienzusammengestellt 18,19,22,23,24,25. Kurz gesagt, 89Zr können erfolgreich mit DFO-Bn-NCS in ~30-60 min bei 25-37 °C unter Verwendung von 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS komplexiert werden (Tabelle 2). Die Effizienz der radioaktiven Markierung der Zellen variiert zwischen 20 und 50 % als unkorrigierte Ausbeute, die im radioaktiv markierten Zellpellet nach dem Waschen beobachtet wird (Tabelle 1). 18,19,22,23,24,25 (Tabelle 1).

Insgesamt wurden folgende Radioaktivitätskonzentrationen erreicht: 0,1 MBq/10 6 Zellen für Hepatozyten 22,24, 0,50 ± 0,10 MBq/10 6 für Melanomzellen (mMCs)18, 0,47 ± 0,10 MBq/10 6 für humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs)18, 0,39 ± 0,20 MBq/10 6 für dendritische Zellen (mDCs)18, 0,27± 0,30 MBq/10 6 für weiße Blutkörperchen 25, und 0,70 ± 0,20 MBq/106 für kardiopoetische Stammzellen19 (Tabelle 1) . Im Gegensatz dazu wurde keine Zellmarkierung mit [89 Zr]Zr(HPO 4)2 oder [89Zr]ZrCl 425 beobachtet. Wie bereits gezeigt, erwiesen sich radioaktive Markierungen in mMCs, hMSCs und mDCs als stabil, wobei nur ein vernachlässigbarer Prozentsatz des Ausflusses über 7 Tage nach der Markierung beobachtet wurde (Abbildung 6)18. Bei kardiopoetischen Stammzellen wurde über 2 Tage nach der Markierung kein Efflux beobachtet19.

Tabelle 1: Effizienz der radioaktiven Markierung von Zellen in verschiedenen Zelltypen mit [89Zr]Zr-DBN. Stammzellen, Melanomzellen, kardiopoetische Stammzellen, Hepatozyten, dendritische Zellen und weiße Blutkörperchen wurden mit [89Zr]Zr-DBN radioaktiv markiert. *Die radioaktive Markierungseffizienz der Zelle (%) wurde wie in Schritt 4.3.7 beschrieben geschätzt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: 89Zr Chelatierungseffizienz von DFO-Bn-NCS. Die Chelatbildungseffizienz von DFO-Bn-NCS für 89 Zr unter Verwendung von [89 Zr]Zr(HPO 4)2 und [89Zr]ZrCl4 ist unterschiedlich, gemessen mit rad-TLC. *Die Werte werden als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben. Mit 50 mM DTPA (pH 7,0) als rad-TLC-Lösungsmittel zeigt [89 Zr]Zr(HPO4)2 einen Rf von ~0,9 18 und [89Zr]Zr-DBN einen Rf von ~0,018. Mit 100 mM DTPA (pH 7,0) als rad-DC-Lösungsmittel zeigt [89Zr]ZrCl4 einen Rf von ~1,0. [89Zr] Zr(HPO4)2 zeigt einen Rf von ~1,0 und [89Zr]Zr-DBN zeigt einen Rf von ~0,021-0,035. Chelatierungseffizienz (%) = Prozentsatz von 89 Zr, die zu DFO-Bn-NCS chelatisiert werden, um [89 Zr]Zr-DBN zu bilden = (Radioaktivität bei Rf von [89 Zr]Zr-DBN/(Summe der Radioaktivitäten bei Rf von [89 Zr]Zr-DBN und bei Rf von [89 Zr]Zr(HPO4)2 oder [89Zr]ZrCl4) × 100. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Wirkung der radioaktiven Markierung auf die Lebensfähigkeit der radioaktiv markierten Zellen wurde in mMCs 18, Schweinehepatozyten 22,24, hMSCs 18, humanen kardiopoetischen Stammzellen19 und Immunzellen wie dendritischen Mauszellen (mDCs)18 und weißen Blutkörperchen 25 unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussviabilitätstests untersucht. Es wurde beobachtet, dass die radioaktive Markierung keinen negativen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen hatte; <5% der toten Zellen wurden bis zu 7 Tage nach der Markierung sowohl für [89Zr]Zr-DBN-markierte als auch für unmarkierte mMCs und hMSCs gefunden18. Die radioaktive Markierung hatte auch keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Schweinehepatozyten22,24, wenn sie innerhalb von 1 h nach der radioaktiven Markierung oder 2 Tage nach der radioaktiven Markierung auf die kultivierten radioaktiv markierten humanen kardiopoetischen Stammzellen getestet wurde19.

Die radioaktive Markierung menschlicher weißer Blutkörperchen wirkte sich auch nicht negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen aus, da ~90-95% der lebensfähigen Zellen sowohl in den unmarkierten als auch in den markierten Zellpopulationen innerhalb von 1 h nach der radioaktiven Markierung beobachtet wurden25. Die radioaktive Markierung kardiopoetischer Stammzellen hatte keinen Einfluss auf die Morphologie, Lebensfähigkeit oder Proliferationskapazität menschlicher kardiopoetischer Stammzellen19. Funktionelle Studien wurden mit kardiopoetischen Stammzellen in einem Myokardinfarktmodelldurchgeführt 19. In den funktionellen Studien blieb die charakteristische Expression von mesodermalen und pro-kardiogenen Transkriptionsfaktoren, die den kardiopoetischen Phänotyp definieren, in radioaktiv markierten kardiopoetischen Stammzellen unverändert19. Die radioaktiv markierten kardiopoetischen Stammzellen konnten die linksventrikuläre Ejektionsfraktion in einem chronisch infarktierten Mausherzen im Infarktherzmodell19 verbessern.

Figure 6
Abbildung 6: Stabilität verschiedener Zellen, die mit 89Zr radioaktiv markiert wurden, über 7 Tage. Die Retention von 89Zr-Radioaktivität durch radioaktiv markierte Zellen erwies sich in allen untersuchten Zellen als stabil, wobei über 7 Tage nach der Markierung ein vernachlässigbarer Ausfluss beobachtet wurde. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt, n = 3. Diese Abbildung stammt von Bansal et al.18. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Repräsentative rad-TLC der 89-Zr-Chelatbildung mit DFO-Bn-NCS unter Verwendung von [89Zr]Zr(HPO4)2 in 100 mM DTPA (pH 7,0)-Lösung. Rad-TLC wurde in 100 mM DTPA (pH 7,0) als mobile Phase durchgeführt; [89Zr] Zr-DBN ; zeigt einen Rf von ~0,021-0,035 und [89Zr]Zr(HPO4)2 einen Rf von ~1,0. Chelatierungseffizienz (%) = Prozentsatz von 89 Zr, die zu DFO-Bn-NCS chelatisiert werden, um [89 Zr]Zr-DBN zu bilden = [Radioaktivität bei Rf von [89 Zr]Zr-DBN/(Summe der Radioaktivitäten bei Rf von [89 Zr]Zr-DBN und bei Rfvon [89Zr]Zr(HPO4)2)] × 100. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Repräsentative rad-TLC der 89-Zr-Chelatbildung mit DFO-Bn-NCS unter Verwendung von [89Zr]ZrCl4in 100 mM DTPA (pH 7,0)-Lösung. Rad-TLC wurde in 100 mM DTPA (pH 7,0) als mobile Phase durchgeführt; [89Zr] Zr-DBN zeigt einen Rf von ~0,021-0,035 und [89Zr]ZrCl4zeigt einen Rf von ~1,0. Chelatierungseffizienz (%) = Prozentsatz von 89 Zr, die zu DFO-Bn-NCS chelatisiert werden, um [89 Zr]Zr-DBN zu bilden = [Radioaktivität bei Rf von [89 Zr]Zr-DBN/(Summe der Radioaktivitäten bei Rf von [89 Zr]Zr-DBN und bei Rf von [89Zr]ZrCl 4)] × 100. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Repräsentative rad-TLC der radioaktiven Zellmarkierungsreaktion aus Schritt 4.2.3 in einer 20 mM Natriumcitrat (pH 4,9-5,1):Methanol (1:1, V:V)-Lösung. Rad-TLC wurde in 20 mM Natriumcitrat (pH 4,9-5,1):Methanol (1:1, V:V) als mobile Phase durchgeführt; Die radioaktiv markierten Zellen zeigen einen Rf von ~0,01-0,02 und [89 Zr]Zr-DBN und [89 Zr]ZrCl4zeigen einen Rf von ~0,73-0,81. Der prozentuale Anteil der Radioaktivität bei einem Rf von ~0,01-0,02 wird nach der Formel berechnet: [(Radioaktivität bei Rf = ~0,01-0,02)/(Summe der Radioaktivitäten bei Rf = ~0,01-0,02 und Rf = ~0,73-0,81)] × 100. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Repräsentative rad-TLC der No-Cell-Kontrollreaktion aus Schritt 4.2.4 in einer 20 mM Natriumcitrat pH 4,9-5,1: Methanol (1:1, V:V)-Lösung. Mit 20 mM Natriumcitrat (pH 4,9-5,1): Methanol (1:1, V:V) als rad-TLC-Lösungsmittel wurde rad-TLC in 20 mM Natriumcitrat (pH 4,9-5,1):Methanol (1:1, V:V) als mobile Phase betrieben; [89Zr] Zr-DBN und [89 Zr]ZrCl4 zeigen einen Rf von ~0,73-0,81. Der prozentuale Anteil der Radioaktivität bei R f = ~0,01-0,02 wird nach folgender Formel berechnet: [(Radioaktivität bei R f = ~0,01-0,02)/(Summe der Radioaktivitäten bei R f = ~0,01-0,02 und R f = ~0,73-0,81)] × 100. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Im Folgenden sind wichtige Schritte im Protokoll aufgeführt, die für eine effektive Radiomarkierung von Zellen optimiert werden müssen. In den Protokollschritten 1.2 und 1.3 muss je nach verwendetem Volumen von [89 Zr]Zr(HPO4)2 oder [89Zr]ZrCl4 ein geeignetes Volumen (Mikroliter) Base verwendet werden; 1,0 MK2CO3-Lösung muss für die Neutralisation von [89 Zr]Zr(HPO4)2 und 1,0 M Na2CO3-Lösung für die Neutralisation von [89Zr]ZrCl4 verwendet werden, um einen pH-Bereich von 7,5 bis 8,0 zu erreichen. In Schritt 2.1 muss das zellkompatible Gemisch aus K2HPO4/KH2PO4undHEPES in die [89 Zr]Zr-DBN-Formulierung gegeben werden, wenn esaus [89Zr]ZrCl4 hergestellt wird, um die Effizienz der radioaktiven Markierung der Zelle zu erhöhen. Es wird darauf hingewiesen, dass Desferrioxamin-Bn-NCS, das mit [89 Zr]ZrCl4 radioaktiv markiert wurde, Stammzellen nicht radioaktiv markierte, es sei denn, Phosphat und HEPES-Puffer wurden in die Zellmarkierungsmischung gegeben, was darauf hindeutet, dass eine geeignete Formulierung erforderlich ist, um [89Zr]ZrCl4 als Ausgangsformulierung zu verwenden.

Zur Optimierung der Zellmarkierungseffizienz für jeden Zelltyp (Protokollschritt 4.2) muss die Inkubationszeit auf bis zu ~60 min erhöht und die Inkubationstemperatur von 25 °C auf 37 °C erhöht oder der pH-Wert der Markierungslösung auf ~8,0 erhöht werden. Die Wahl der Inkubationszeit, der Temperatur und des pH-Werts richtet sich nach der Kompatibilität des Zelltyps. Zum Beispiel wurde die radioaktive Markierung von Hepatozyten bei 27 °C für 45 min bei pH ~7,522,24 durchgeführt, aber die radioaktive Markierung von Stammzellen wurde bei 37 °C für 30 min bei pH ~7,5 18 durchgeführt.

Um den Verlust von Zellen während des Waschens zu verhindern, muss in Protokollschritt 4.3 der Überstand vorsichtig mit einem Pipettenvolumen pipettiert werden, das niedriger ist als das Überstandsvolumen, das herauspipettiert werden muss. Wenn das Überstandsvolumen beispielsweise ~600 μl beträgt, muss der Überstand in Schritten von ~200-500 μl pipettiert werden. Dies hilft, eine Störung des Zellpellets zu vermeiden. Wenn das Zellpellet beim Pipettieren des Überstandes gestört wird, sollte das Pipettieren aus dem Überstand gestoppt und erneut zentrifugiert werden, um ein gut definiertes Zellpellet zu erhalten. Einige Zellen, wie z. B. Monozyten in der Suspension der weißen Blutkörperchen, neigen dazu, sich an die Wände des Röhrchens zu binden. Dies wirkt sich auf die Rückgewinnung aller radioaktiv markierten weißen Blutkörperchen aus dem Röhrchen nach dem Waschen aus.

Nach der radioaktiven Markierung der Zellen sind ein visueller Inspektionstest, ein Trypanblau-Ausschluss-Viabilitätstest und eine Stabilitäts-/Effluxanalyse als Qualitätskontrollkriterien akzeptabel. Wenn die Zelllebensfähigkeit bei jedem radioaktiven Markierungsversuch für einen bestimmten Zelltyp konstant abnimmt, sollten die Zellen, die radioaktiv markiert werden, überprüft werden, um sicherzustellen, dass sie mit dem Zellmedium und dem Puffer kompatibel sind, die während der radioaktiven Markierung der Zellen verwendet werden. Verschiedene kompatible Puffer und Zellmedien sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Es wird bevorzugt, bekannte kompatible Zellkulturbedingungen für Stabilitäts-/Effluxstudien zu verwenden. Zum Beispiel können Stabilitäts-/Efflux-Studien mit Stammzellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, Krebszellen, dezidualen Stromazellen und mononukleären Zellen des peripheren Blutes unter Zellkulturbedingungen durchgeführt werden, wie Bansal et al.18und Friberger et al.20 gezeigt haben.

Die potentiellen Probleme einer niedrigen Chelat-Effizienz oder einer inkonsistenten Chelat-Effizienz und/oder einer geringen Ausbeute an radioaktiver Zellmarkierung oder eines Verlusts der Zelllebensfähigkeit können durch Modifikation der Schritte 1.5, 4.3.7 und 4.3.10 auf der Grundlage der in Tabelle 3 zusammengefassten Gründe gelöst werden.

Tabelle 3: Fehlerbehebung im Zusammenhang mit der [89Zr]Zr-DBN-Synthese und der radioaktiven Markierung von Zellen. Mögliche Gründe und Lösungen für eine niedrige/inkonsistente Chelat-Effizienz, eine geringe Ausbeute an radioaktiver Zellmarkierung oder einen Verlust der Zelllebensfähigkeit. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die PET-Bildgebung des Zelltransports bietet eine hohe Empfindlichkeit, eine geeignete räumliche Auflösung und einen geringen Hintergrund25 als Vorteile gegenüber anderen Modalitäten 3,4,9,10. Die [89Zr]Zr-DBN-vermittelte Markierung von Zelloberflächenproteinen mit einer stabilen kovalenten Bindung bietet Stabilität des radioaktiven Markierungstags 18,19,20,21,22,23,24,25. Infolgedessen erhöht die [89Zr]Zr-DBN-basierte Zellmarkierung die Zuverlässigkeit und das Vertrauen in das Radiosignal (Positronenemission und Gammas, die nach der Annihilation erzeugt werden), die von den radioaktiv markierten Zellen erhalten werden. In der Zwischenzeit ist bekannt, dass andere Verfahren, wie z. B. die [89Zr]Zr-Oxin-basierte Radiomarkierung, aufgrund der nicht-kovalenten Natur ihrer Radiomarkierung im Laufe der Zeit auf einen Ausfluss des Markierungsradiotags stoßen, wodurch niedrigere und nicht markierte Radiosignale erzeugtwerden 27,28.

Eine Einschränkung dieser radioaktiv markierten Zellmarkierungstechnik besteht darin, dass die Radioaktivitätssignale in den PET-Bildern nach der In-vivo-Verabreichung von lebenden, radioaktiv markierten Zellen erfasst werden, aber keinen Hinweis darauf geben, ob das Signal von lebenden radioaktiv markierten Zellen oder von den Trümmern radioaktiv markierter Zellen stammt, die nach der Verabreichung im Körper abgestorben sein könnten.

Die PET-Bildgebung für den Zelltransport hat ein enormes Potenzial, da sie die Entwicklung neuartiger zellbasierter Therapien unterstützen kann29,30. Ärzte und Wissenschaftler, die an zellbasierten Therapien zur Behandlung von Krebs 6,7,8,9,10, Myokardinfarkt 3,4,5, Myokardversagen1,2, Netzhaut- 2 und Makuladegeneration 2 sowie Diabetes2 arbeiten, werden dies finden 89Zr-basiertes Zellmarkierungsprotokoll ist unerlässlich, um die Reaktionen ihrer zellbasierten Therapien wie Stammzelltherapien besser zu verstehen. Darüber hinaus haben 89Zr-markierte Stammzellen31, weiße Blutkörperchen 32, dendritische Zellen33,34 und CAR-T-Zellen 35 ein großes Potenzial, innerhalb der nächsten 3-5 Jahre in den klinischen Bereich einzutreten. Darüber hinaus können Pharmaunternehmen diese Technik nutzen, um ihre zellbasierten Therapeutika zu entwickeln und zu validieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen konkurrierenden Interessen, sondern sind die Erfinder dieser Technologie (Patent # US20210330823A1).

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 und DOE DE-SC0008947 Grants, Internationale Atomenergie-Organisation, Wien, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Abteilung für Radiologie, und Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A996-4
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 12571063
Anion exchange column Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany 731876 Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc., Glendale, AZ, USA 352096 Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-11904
DFO-Bn-NCS Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA B-705 p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 276855
Dose calibrator Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA 5130-3234 CRC -55tR Dose Calibrator 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS) The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 14025092 For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A508P212
Melanoma cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-6475
Methanol Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 34860
Microcentrifuge tube Eppendorf, Hamburg, Germany 30108442 Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA 415-ML-010
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 10010023 For washing cells
Saline Covidien LLC, Mansfield, MA, USA 1020 0.9% Sterile Saline Solution
Shaker  Eppendorf, Hamburg, Germany T1317 Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet  Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA SGI0001 iTLC-SG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Krebsforschung Heft 200
Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung des Zelltransports: Eine Methode der radioaktiven Markierung von Zellen
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Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey, M. K. Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling. J. Vis. Exp. (200), e64117, doi:10.3791/64117 (2023).

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