Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Positronutslippstomografi Avbildning av cellehandel: En metode for celleradiomerking

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/64117
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Presentert her er en protokoll til radiolabel celler med en positronemisjonstomografi (PET) radioisotop, 89 Zr (t1/2 78,4 h), ved hjelp av en klar til bruk radiomerking synton, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr] Zr-DBN). Radiomerking av celler med [89Zr]Zr-DBN tillater ikke-invasiv sporing og avbildning av administrerte radiomerkede celler i kroppen med PET i opptil 7 dager etter administrering.

Abstract

Stamcelle- og kimær antigenreseptor (CAR) T-celleterapier fremstår som lovende terapeutiske midler for organregenerering og som immunterapi for ulike kreftformer. Til tross for at det er gjort betydelige fremskritt på disse områdene, er det fortsatt mer å lære for bedre å forstå farmakokinetikken og farmakodynamikken til de administrerte terapeutiske cellene i det levende systemet. For ikke-invasiv, in vivo sporing av celler med positronemisjonstomografi (PET), er det utviklet en ny [89 Zr] Zr-p-isotiocyanatobenzyl-desferrioksamin ([89 Zr]Zr-DBN)-mediert celleradiomerkingsmetode ved bruk av 89Zr (t1/2 78,4 timer). Den foreliggende protokollen beskriver en [89Zr]Zr-DBN-mediert, klar til bruk, radiomerkingssynthon for direkte radiomerking av forskjellige celler, inkludert mesenkymale stamceller, avstamningsveiledede kardiopoietiske stamceller, leverregenererende hepatocytter, hvite blodlegemer, melanomceller og dendrittiske celler. Den utviklede metoden muliggjør ikke-invasiv PET-avbildning av celletrafikk i opptil 7 dager etter administrering uten å påvirke naturen eller funksjonen til de radiomerkede cellene. I tillegg beskriver denne protokollen en trinnvis metode for radiosyntese av [89 Zr] Zr-DBN, biokompatibel formulering av [89 Zr] Zr-DBN, fremstilling av celler for radiomerking, og til slutt radiomerking av celler med [89Zr] Zr-DBN, inkludert alle de intrikate detaljene som trengs for vellykket radiomerking av celler.

Introduction

Stamcelle- og kimær antigenreseptor (CAR) T-celleterapier blir stadig mer populære og er under aktiv etterforskning for behandling av ulike sykdommer, som myokardsvikt1,2, retinal degenerasjon 2, makuladegenerasjon 2, diabetes 2, hjerteinfarkt3,4,5 og kreft 6,7,8,9,10. Blant de to plausible tilnærmingene til stamcellebehandlinger, kan stamceller enten bli direkte innpodet på sykdomsstedet for å forårsake en terapeutisk respons, eller forårsake endringer i mikromiljøet på sykdomsstedet uten å feste seg til sykdomsstedet for å initiere en indirekte terapeutisk respons. En indirekte terapeutisk respons kan forårsake endringer i mikromiljøet på sykdomsstedet ved å frigjøre faktorer som vil reparere eller behandle sykdommen5. Disse tilnærmingene til stamcellebehandlinger kan evalueres ved ikke-invasiv avbildning av radiomerkede stamceller. Ikke-invasiv avbildning kan korrelere opptaket av de radiomerkede cellene på sykdomsstedet med en terapeutisk respons for å dechiffrere den direkte versus indirekte terapeutiske responsen.

I tillegg utvikles immuncellebaserte terapier for å behandle ulike kreftformer ved bruk av CAR T-celle 6,7,8,9,10 og dendrittisk celleimmunterapi 11,12. Mekanistisk, i CAR T-celle immunterapi 6,7,8,9,10, er T-celler konstruert for å uttrykke en epitop som binder seg til et spesifikt antigen på svulster som må behandles. Disse konstruerte CAR T-cellene, ved administrering, binder seg til det spesifikke antigenet som er tilstede på tumorcellene gjennom en epitop-antigen-interaksjon. Etter binding gjennomgår de bundne CAR T-cellene aktivering og prolifererer og frigjør cytokiner, som signaliserer vertens immunsystem for å angripe svulsten som uttrykker det spesifikke antigenet. I kontrast, når det gjelder dendritiske celleterapier11,12, er dendrittiske celler konstruert for å presentere et spesifikt kreftantigen på overflaten. Disse konstruerte dendrittiske cellene, når de administreres, hjem til lymfeknuter og binder seg til T-cellene i lymfeknuter. T-cellene, ved binding til de spesifikke kreftantigenene på de administrerte dendrittiske cellene, gjennomgår aktivering / proliferasjon og initierer en immunrespons av verten mot svulsten som uttrykker det spesifikke antigenet. Derfor er vurderingen av trafikk av administrerte CAR T-celler til et tumorsted 9,10 og homing av dendrittiske celler til lymfeknuter11,12 mulig ved å avbilde radiomerkede CAR T-celler og dendrittiske celler for å bestemme effekten av immunterapi. Videre kan ikke-invasiv cellehandel bidra til å bedre forstå det terapeutiske potensialet, klargjøre den direkte versus indirekte terapeutiske responsen, og forutsi og overvåke den terapeutiske responsen til både stamcelle- og immuncellebaserte terapier.

Ulike bildebehandlingsmodaliteter for cellehandel har blitt utforsket 3,4,9,10,12, inkludert optisk bildebehandling, magnetisk resonansavbildning (MRI), enkelt-foton emisjonscomputertomografi (SPECT) og positronemisjonstomografi (PET). Hver av disse teknikkene har sine egne fordeler og ulemper. Blant disse er PET den mest lovende modaliteten på grunn av sin kvantitative natur og høye følsomhet, som er avgjørende for pålitelig kvantifisering av celler i bildebasert cellehandel 3,4,9,10.

Den positronemitterende radioisotopen 89Zr, med en halveringstid på 78,4 timer, er egnet for cellemerking. Det tillater PET-avbildning av cellehandel i over 1 uke og produseres lett av allment tilgjengelige, medisinske syklotroner med lav energi 13,14,15,16,17. I tillegg er en passende funksjonalisert, p-isotiocyanatobenzyl-desferrioxamin (DFO-Bn-NCS) chelator kommersielt tilgjengelig for syntesen av en 89 Zr-merket, klar til bruk, cellemerking synthon, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, også kjent som [89Zr] Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. Prinsippet for [89 Zr]Zr-DBN-mediert cellemerking er basert på en reaksjon mellom primære aminer av cellemembranproteiner og isotiocyanatdelen (NCS) av [89Zr]Zr-DBN for å produsere en stabil kovalent tioureabinding.

[89Zr] Zr-DBN-basert cellemerking og avbildning har blitt publisert for å spore en rekke forskjellige celler, inkludert stamceller 18,23,25, dendrittiske celler18, kardiopoietiske stamceller19, decidual stromale celler 20, benmargsavledede makrofager 20, mononukleære celler i perifert blod 20, Jukat / CAR T-celler 21, hepatocytter22,24 og hvite blodlegemer 25. Følgende protokoll gir trinnvise metoder for fremstilling og celleradiomerking med [89Zr]Zr-DBN og beskriver endringer som kan være nødvendige i radiomerkingsprotokollen for en bestemt celletype. For større klarhet er metoden for cellemerking presentert her delt inn i fire seksjoner. Den første delen omhandler utarbeidelsen av [89 Zr]Zr-DBN ved å chelatere 89Zr med DFO-Bn-NCS. Den andre delen beskriver fremstillingen av en biokompatibel formulering av [89Zr]Zr-DBN som lett kan brukes til celleradiomerking. Den tredje delen dekker trinnene som er nødvendige for forkondisjonering av celler for radiomerking. Forkondisjoneringen av celler innebærer å vaske cellene med proteinfritt fosfatbufret saltvann (PBS) og HEPES bufret Hanks balansert saltløsning (H-HBSS) for å fjerne eksterne proteiner, som kan forstyrre eller konkurrere med reaksjonen av [89Zr] Zr-DBN med primære aminer tilstede på celleoverflateproteiner under radiomerking. Den siste delen gir trinn involvert i selve radiomerkingen av cellene og kvalitetskontrollanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dendrittiske celler og melanomceller ble oppnådd kommersielt18. Hepatocytter ble isolert fra leveren hos griser etter laparoskopisk partiell hepatektomi22,24. Stamceller ble isolert fra benmargsaspirater18,19,26. De fettvevsavledede stamcellene ble hentet fra Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. Humane hvite blodlegemer ble isolert fra det innsamlede blodet mottatt fra Divisjon for transfusjonsmedisin, Mayo Clinic Rochester25. Ulike celler som brukes til radiomerking ble oppnådd og brukt i samsvar med retningslinjer anbefalt av Institutional Animal Care and Use Committee, Mayo Clinic Stem Cell Research Oversight Subcommittee, Division of Transfusion Medicine Research Committee, Institutional Biosafety Committee og av Radiation Safety Committee.

1. Fremstilling av [89 Zr]Zr-p-isotiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89Zr]Zr-DBN)

Timing: ~ 160-220 min
MERK: For fremstilling av [89 Zr]Zr-DBN, isoler 89 Zr i form av [89 Zr]Zr-hydrogenfosfat ([89 Zr]Zr(HPO 4)2) eller [89 Zr]Zr-klorid ([89Zr]ZrCl4), som nevnt i trinn 1.1.

  1. Isoler 89 Zr fra foreldre 89Y ved hjelp av en etablert hydroksymatharpiksbasert rensemetode13,17. Kort sagt, lag først en kolonne med ~ 100 mg hydroksymatharpiks, aktiver deretter hydroksamatharpiksen ved å vaske kolonnen med 8,0 ml ren vannfri acetonitril, etterfulgt av en spyling med 5,0-6,0 ml luft. Deretter vasker du kolonnen med 15 ml avionisert vann, etterfulgt av en annen spyling med 5,0-6,0 ml luft, og passerer deretter 2,0 ml 0,50 N HCl (spormetallbasisklasse) etterfulgt av en ekstra spyling med 5,0-6,0 ml luft. Deretter legger du løsningen som inneholder både 89 Zr og 89 Y til hydroksymatharpiksen sakte, og vasker den ubundne 89Y fra hydroksymatharpiksen med 20 ml 2,0 N HCl, etterfulgt av 10 ml avionisert vann og en spyling med 5,0-6,0 ml luft.
    MERK: Etter spyling med luft kan elueringen på 89Zr utføres som vist nedenfor.
    1. For å eluere 89 Zr i form av [89 Zr]Zr(HPO 4)2, tilsett først 0,50 ml 1,2 MK2HPO 4/KH 2 PO 4-buffer (pH 3,5) til kolonnen fra trinn 1.1 og la den sitte på kolonnen i 30 minutter for å fremme frigjøringen av 89 Zr som en [89Zr]Zr(HPO 4)2fra harpiksen. Deretter eluerer du 89Zr fra kolonnen med ytterligere 1,50 ml 1,2 M K 2 HPO 4/ KH2PO4 buffer (pH 3,5). Etter eluering av [89 Zr]Zr(HPO 4)2, følg trinn 1.2, 1.2.1 og 1.2.2 for fremstilling av [89 Zr]Zr-DBN ved bruk av [89Zr]Zr(HPO4)2, som vist i figur 1.
    2. For å oppnå 89 Zr som [89 Zr]ZrCl4, først eluere 89 Zr som [89Zr]Zr-oksalat.
      1. For å eluere 89 Zr i form av [89 Zr]Zr-oksalat, tilsett 0,50 ml 1,0 M oksalsyre til kolonnen fra trinn 1,1 og la den sitte på kolonnen i 1 min for å fremme frigjøringen av 89 Zr som et [89Zr]-oksalat fra harpiksen. Deretter eluerer du 89Zr fra kolonnen med ytterligere 2,50 ml 1,0 M oksalsyre (totalt 3,0 ml)17.
      2. For å konvertere [89 Zr]Zr-oksalat til [89Zr]ZrCl4 ved hjelp av en anionbyttekolonne, som beskrevet av Larenkov et al.14, aktiver først kolonnen ved å vaske med 6,0 ml acetonitril, etterfulgt av en spyling med 5,0-6,0 ml luft. Vask deretter kolonnen med 10,0 ml saltvann, etterfulgt av en annen spyling på 5,0-6,0 ml luft. Til slutt, pass 10,0 ml avionisert vann, etterfulgt av en spyling med 5,0-6,0 ml luft.
      3. Legg 3,0 ml oppløsningen inneholdende [89Zr]Zr-oksalat langsomt på den aktiverte anionbyttekolonnen, etterfulgt av en skylling på 5,0-6,0 ml luft. Vask deretter den 89Zr-belastede kolonnen med 50,0 ml avionisert vann for å fjerne ubundet oksalation, etterfulgt av en spyling med 5,0-6,0 ml luft.
      4. For å eluere 89 Zr i form av [89 Zr]ZrCl 4, tilsett 0,10 ml 1,0 N HCl til kolonnen, la den sitte på kolonnen i 1,0 min for å fremme frigjøringen av 89 Zr som [89 Zr]ZrCl4 fra harpiksen, og eluere 89Zr fra kolonnen med ytterligere 0,40 ml 1,0 N HCl (totalt 0,5 ml). Tørk den eluerte [89Zr]ZrCl4 i et V-formet hetteglass ved å plassere den i en varmeblokk ved 65 °C under en jevn strøm av nitrogengass i 10-30 minutter. Etter tørking rekonstitueres den tørkede [89 Zr]ZrCl 4 i vann og følg trinn 1.3 og 1.3.1 for tilberedning av [89 Zr]Zr-DBN ved bruk av [89Zr]ZrCl4, som vist i figur 1.
  2. Ta ~ 120 μL av [89Zr] Zr (HPO 4) 2, formulert i 1,2 M K 2 HPO 4 / KH 2 PO4 (pH 3,5) (10-25 MBq) fra trinn 1.1.1, og nøytraliser løsningen for å oppnå pH 7,5-8,0 med ~ 100 μL av 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5) og ~ 65 μL av 1,0 M K 2 CO3.
    1. For å oppnå riktig mengde DFO-Bn-NCS for trinn 1.2.2 eller 1.3.1 for forskjellige 89 Zr-formuleringer med en variert tilsynelatende spesifikk aktivitet på 89 Zr, utfør et sett med keleringsreaksjoner ved bruk av et fast volum av en nøytralisert formulering av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4 med en rekke DFO-Bn-NCS (7,5-15 μg). Når det gjelder [89Zr]Zr(HPO4)2, inkuber chelateringsreaksjonen ved 37 °C i en shaker ved ~550 rpm i 60 minutter. Mens, når det gjelder [89Zr]ZrCl4, inkuber chelateringsreaksjonen ved 25 °C i en shaker ved ~550 o / min i 30 minutter. Kast chelation reaksjon som viser bunnfall under eller på slutten av inkubasjon. På slutten av inkubasjonen, utfør radioaktiv tynnsjiktskromatografi (rad-TLC) med 100 mM dietylenetriaminpentaacetat (DTPA), pH 7,0, som en mobil fase for å estimere chelateringseffektiviteten av DFO-Bn-NCS for hver chelareaksjon, som diskutert nedenfor i trinn 1.5.
      MERK: Basert på chelation effektivitet, bruke minimum mengden av DFO-Bn-NCS i trinn 1.2.2 eller 1.3.1 som trengs for å oppnå en ≥97% chelation effektivitet uten å forårsake utfelling av DFO-Bn-NCS i nøytralisert formulering av [89 Zr] Zr (HPO 4) 2 eller [89Zr] ZrCl4. Her ble [89Zr]Zr-DBN syntetisert i ≥97% radiokjemisk renhet.
    2. Forbered fersk 5,0 mM DFO-Bn-NCS i vannfri DMSO (3,76 mg / ml) og tilsett 4,0 μL av 5,0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol eller 15 μg) til ~ 285 μL nøytralisert [89Zr] Zr (HPO4) 2 (10-25 MBq) fra trinn 1.2 og bland løsningen ved pipettering. Hold den endelige DMSO-konsentrasjonen i chelateringsblandingen under 2% av totalvolumet.
  3. Ta ~ 180 μL av [89 Zr] ZrCl 4 formulert i 0,1 N HCl (40-80 MBq) fra trinn 1.1.2.4 og nøytraliser den resulterende løsningen for å oppnå pH 7,5-8,0 med ~ 25 μL av 1,0 M Na2CO3.
    1. Forbered fersk 2,5 mM DFO-Bn-NCS i vannfritt dimetylsulfoksid (DMSO) (1,88 mg / ml) og tilsett 4,0 μL av 2,5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol eller 7,5 μg) til ~ 205 μL nøytralisert [89 Zr] ZrCl4 (40-80 MBq) fra trinn 1,3. Bland oppløsningen ved pipettering. Hold den endelige DMSO-konsentrasjonen i chelateringsblandingen under 2% av totalvolumet.
  4. Fortsett med kelering av 89 Zr ved 37 ° C i en shaker ved ~ 550 rpm i 60 min i tilfelle av [89 Zr] Zr (HPO 4) 2, eller ved 25 ° C i en shaker ved ~ 550 rpm i 30 min i tilfelle av [89Zr] ZrCl4.
  5. Bestem 89Zr chelation effektivitet med rad-TLC med 100 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC mobilt løsningsmiddel. Forvent at [89 Zr]Zr-DBN viser en R f på ~0,021-0,035, [89 Zr]ZrCl 4 for å vise en R f på ~1,0, og [89Zr]Zr(HPO4)2 for å vise en R f på ~1,0. Beregn chelation effektivitet (%) ved hjelp av ligning (1):
    Prosentandel av 89 Zr chelatert til DFO-NCS for å danne [89 Zr]Zr-DBN = [ (Radioaktivitet ved R f av [89 Zr]Zr - DBN) / (Summen av radioaktiviteter ved R f av [89 Zr]Zr - DBN og ved R   f av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    MERK: Den akseptable 89Zr chelation effektivitet for å fortsette med celle radiomerking, som bestemmes av rad-TLC, er ≥97%. Den foreslåtte ≥97% radiokjemisk renhet av [89Zr]Zr-DBN ble satt i henhold til standard krav til radiokjemisk renhet for andre radiofarmaka som brukes i felten. Se representativ rad-TLC i tilleggsfigur S1 og tilleggsfigur S2.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av [89Zr]Zr-DBN-preparat. For fremstilling av [89 Zr]Zr-DBN, nøytraliser forhåndsformulert [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4 til en pH på 7,5-8,0. Inkuber den nøytraliserte løsningen med DFO-Bn-NCS. Sjekk chelation effektivitet av 89Zr til DFO-Bn-NCS av rad-TLC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Biokompatibel formulering av [ 89Zr ]Zr-DBN for celleradiomerking (figur 2)

Timing: ~ 35 min
MERK: Gitt tiden det tar for fremstilling av celler i trinn 3, start trinn 3 ca. 20 minutter før begynnelsen av trinn 2 for en ~ 30 min inkubasjon. Dette gjør at celleradiomerking i trinn 4 kan starte innen ~5-10 minutter etter fullføring av trinn 2-3.2.2.

  1. For [89 Zr]Zr-DBN-formulering fremstilt fra [89 Zr]ZrCl 4, tilsett 50,0 μL av en cellekompatibel blanding bestående av ~27,0 μL av 1,2 MK2HPO 4/KH2PO 4 (pH 3,5) + ~23,0 μL av 1,0 M HEPES-KOH-buffer (pH 7,5) til 50,0 μL [89 Zr]Zr-DBN. Inkuber [89Zr]Zr-DBN-cellekompatibel blanding i ~30 min ved romtemperatur (25 °C).
    MERK: [89 Zr]Zr-DBN-formuleringen laget av [89Zr]Zr(HPO4)2 er biokompatibel for radiomerking av celler og krever ikke trinn 2.

Figure 2
Figur 2: Fremstilling av den biokompatible formuleringen av [89Zr]Zr-DBN for celleradiomerking. For fremstilling av en bruksklar biokompatibel formulering av radiolabeling-syntonen, tilsett et likt volum cellekompatibel blanding, bestående av 1,2 MK2HPO 4/KH2PO4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH til et likt volum på [89Zr]Zr-DBN. Inkuber ved 25 °C i ~30 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Fremstilling av celler for radiomerking

Timing: ~ 40-50 min

  1. Trypsinize ~ 12 × 106 adherente celler (stamceller, melanom kreftceller, kardiopoietiske stamceller, dendrittiske celler eller hepatocytter) og sentrifuge cellene i et 15,0 ml konisk sentrifugerør ved ~ 96 × g i 10 minutter ved 4 ° C.
    1. Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i ~500 μL PBS, og overfør cellesuspensjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuger cellene i en mikrosentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    2. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i ~500 μL H-HBSS. Sentrifuger cellene i en 1,5 ml mikrosentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C. Gjenta trinn 3.1.2 en gang til og gå videre til trinn 4.1.1.
      MERK: H-HBSS er Hanks balansert saltløsning med 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. Når det gjelder ikke-adherente celler, slik som humane hvite blodlegemer (ferskt isolerte humane hvite blodlegemer fra blodet), hopp over trypsiniseringen og sentrifuge cellesuspensjonen som inneholder ~12 × 106 celler i en 1,5 ml mikrosentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    1. Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i ~500 μL PBS, og sentrifuge cellene i en 1,5 ml mikrosentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    2. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i ~500 μL H-HBSS. Sentrifuger cellene i en 1,5 ml mikrosentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C. Gjenta trinn 3.2.2 en gang til og gå videre til trinn 4.1.1.

4. Radiomerking av celler

Timing: ~ 125-155 min

  1. Oppstart av radiomerking av celler (figur 3)
    1. Bruk cellesuspensjonen fra trinn 3.1.2 eller trinn 3.2.2 for å forberede en ~500 μL cellesuspensjon med omtrent ~6 × 106 celler i ~500 μL H-HBSS ved pH 7,5-8,0 i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    2. Til dette, legg til ~ 100 μL av den biokompatibelt formulerte [89Zr] Zr-DBN fra trinn 2.
  2. Celleinkubasjon for radiomerking (figur 4)
    1. Bland den biokompatibelt formulerte [89 Zr]Zr-DBN og cellesuspensjonen ved forsiktig å pipetere opp og ned med et mikropipettsett ved ~500 μL. Mål mengden radioaktivitet i inkubasjonsrøret ved hjelp av en radioaktivitetsdosekalibrator ved 489-innstillingen for 89Zr-isotop16.
    2. Inkuber cellene og [89Zr]Zr-DBN-blandingen i en shaker ved ~550 rpm ved 25-37 °C i 30-45 minutter for cellemerking.
      MERK: Temperaturen på inkubasjonen vil variere avhengig av celletypene som brukes til radiomerking, som vist i tabell 1.
    3. Etter inkubasjon i trinn 4.2.2, utfør rad-TLC på celleradiomerkingsreaksjonen ved bruk av nyfremstilt rad-TLC-løsningsmiddel (20 mM natriumsitrat [pH 4,9-5,1]:metanol [1:1, V:V]). Etter rad-TLC-kjøringen, se etter [89 Zr]Zr-DBN og [89 Zr]ZrCl4 rundt R f = ~0,73-0,81 og R f = ~0,01-0,02 for de radiomerkede cellene. Beregn prosentandelen radioaktivitet ved Rf = ~0,01-0,02 ved hjelp av ligning (2).
      Prosentandel av radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioaktivitet ved R f= ~0,01 - 0,02) / (Summen av radioaktiviteter ved R f = ~0,01 - 0,02 og R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      MERK: For å forstå toppene visualisert ved R f = ~ 0,01-0,02 og R f = ~ 0,73-0,81, se rad-TLC for radiomerkingsreaksjon av hvite blodlegemer i tilleggsfigur S3.
    4. I et separat 1,5 ml mikrosentrifugerør, bland ~100 μL av det biokompatibelt formulerte [89Zr]Zr-DBN med ~500 μL H-HBSS ved pH 7,5-8,0 for bruk som en ikke-cellekontroll for bakgrunnskorreksjon i trinn 4.2.5. Etter inkubering ved tilsvarende temperatur og tid som brukt i trinn 4.2.2, utfør rad-TLC. Etter rad-TLC-kjøringen, se etter [89 Zr]Zr-DBN og [89 Zr]ZrCl4 rundt Rf = ~0,73-0,81. Beregn prosentandelen av radioaktivitet ved Rf = ~0,01-0,02 ved hjelp av ligning (3).
      Radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02 = [(Radioaktivitet ved R f= ~0,01 - 0,02) / (Summen av radioaktiviteter ved R f= ~0,01 - 0,02 og R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      MERK: For å forstå toppene visualisert ved Rf = ~ 0,01-0,02 og ~ 0,73-0,81, se rad-TLC for ikke-cellekontrollreaksjon i tilleggsfigur S4.
    5. Beregn effektiv celleradiomerking (%) ved å trekke radioaktivitetsprosenten ved R f = ~0,01-0,02 (fra rad-TLC fra trinn 4.2.4) fra radioaktivitetsprosenten ved Rf = ~0,01-0,02 (fra rad-TLC fra trinn 4.2.3).
  3. Slukking av radioaktiv merking og cellevask (figur 5)
    1. Etter å ha bekreftet fullføring av radiomerking med rad-TLC i trinn 4.2.5, utfør slukking av radiomerkingsreaksjonen ved tilsetning av ~600 μL kjølt, celletilpasset komplett medium, eller ved tilsetning av H-HBSS, som vist i tabell 1.
    2. Sentrifuger cellene i en mikrosentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
    3. Resuspender de pelleterte cellene forsiktig i ~ 500 μL kjølt medium (Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) + 10% føtal bovint serum + 5% penicillin / streptomycin eller Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10% føtal bovint serum + 5% penicillin / streptomycin eller H-HBSS for en bestemt celletype, som vist i tabell 1. Utfør resuspendering av cellepelleten ved å pipettere forsiktig opp og ned med en mikropipette satt til ~500 μL.
    4. Sentrifuger cellene i en mikrosentrifuge ved ~96 × g i 10 minutter ved 4 °C.
    5. Gjenta trinn 4.3.2-4.3.4 to ganger for å vaske bort den ubundne radioaktiviteten.
    6. Overfør pelleten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør med DMEM + 10% føtal bovint serum + 5% penicillin/streptomycin når det gjelder stamceller eller H-HBSS og mål radioaktiviteten i cellepelleten ved hjelp av en dosekalibrator ved 489-innstillingen for 89Zr-isotop16.
    7. Beregn endelig radiomerkingseffektivitet etter alle vaskene ved hjelp av ligning (4).
      Radiomerkingseffektivitet = [(Forfallskorrigert radioaktivitet i cellepellet i trinn 4.3.6) / (Forfallskorrigert radioaktivitet i cellepellet og H-HBSS i trinn 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. For å sikre kvaliteten på de radiomerkede cellene, må du først visuelt inspisere den endelige suspensjonen av radiomerkede celler for tilstedeværelse av klumper. Hvis det ikke er noen klumper, fortsett med denne endelige suspensjonen til neste trinn. Hvis det er klumper, men de kan resuspenderes ved pipettering eller ved forsiktig risting, gjør du det og fortsett til neste trinn, da dette passerer den visuelle inspeksjonen. Men hvis klumpene ikke resuspenderes enten ved pipettering eller forsiktig risting, kast suspensjonen og start på nytt.
    9. Hvis den visuelle inspeksjonen er bestått, utfør en trypanblå ekskluderingslevedyktighetstest ved bruk av 0,4% trypanblå oppløsning fremstilt i PBS innen 1 time etter radiomerking og vasketrinnene (4.3.3-4.3.7) for å vurdere cellelevedyktigheten til de radiomerkede cellene.
      1. For å utføre testen, tilsett 10,0 μL 0,4 % trypanblå oppløsning til 10,0 μL cellesuspensjon av både radiomerkede og umerkede celler og bland dem ved å pipetere trypan blåcellesuspensjonen opp og ned med mikropipette satt til 10,0 μL.
      2. Legg inn et hemacytometer med ~ 10,0 μL av trypan-blåcelle-suspensjonsblandingen, tell umiddelbart antall blåfargede celler og totalt antall celler i hemacytometeret under et mikroskop ved lav forstørrelse eller ved hjelp av en automatisert celleteller. Beregn prosentandelen av levedyktige celler ved hjelp av ligning (5).
        Prosentandel av levedyktige celler = 100 - [(Antall blåfargede celler) / (Antall celler totalt)] × 100 (5)
    10. Bruk de radiomerkede cellene hvis det ikke er noen endring i prosentandelen av levedyktige celler i den radiomerkede cellesuspensjonen sammenlignet med den umerkede motparten. Kast de radiomerkede cellene hvis prosentandelen av levedyktige celler er mindre enn umerket motpart.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk fremstilling av initiering av radiomerking av celler. Initier radiomerking av celler ved tilsetning av den biokompatibelt formulerte [89Zr]Zr-DBN til cellesuspensjonen fremstilt i HEPES bufret Hanks balansert saltløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk fremstilling av celleinkubasjon for radiomerking. Bland den biokompatibelt formulerte [89Zr]Zr-DBN grundig med cellesuspensjonen og inkuber cellesuspensjonen i en temperaturkontrollert varmeblokk på en shaker i 30-60 minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skjematisk fremstilling av slukking av radiomerking og cellevask. Slukk radiomerkingen av celler ved tilsetning av kjølt cellemedium eller H-HBSS, etterfulgt av sentrifugering ved 4 °C. For cellevask, kast supernatanten og resuspender cellepelleten i ~500 μL kjølt cellemedium eller H-HBSS. Gjenta syklusen med å kaste supernatanten og resuspendere cellepelleten i friskt medium for å fjerne ubundet radiomerkingssynton. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative resultatene som presenteres i dette manuskriptet er utarbeidet fra tidligere [89Zr]Zr-DBN syntese- og celleradiomerkingsstudier 18,19,22,23,24,25. Kort fortalt kan 89Zr med hell komplekseres med DFO-Bn-NCS i ~30-60 min ved 25-37 °C ved bruk av 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS (tabell 2). Effektiviteten av radiomerking av celler varierer fra 20-50 % som et ukorrigert utbytte observert i den radiomerkede cellepelleten etter vask (tabell 1). 18,19,22,23,24,25(tabell 1).

Totalt ble følgende konsentrasjoner av radioaktivitet oppnådd: 0,1 MBq/10 6 celler for hepatocytter 22,24, 0,50 ± 0,10 MBq/10 6 for melanomceller (mMCs)18, 0,47 ± 0,10 MBq/10 6 for humane mesenkymale stamceller (hMSCs)18, 0,39 ± 0,20 MBq/10 6 for dendrittiske celler (mDCs)18, 0,27± 0,30 MBq/10 6 for hvite blodceller 25, og 0,70 ± 0,20 MBq/106 for kardiopoetiske stamceller19 (tabell 1). Derimot ble det ikke observert cellemerking ved bruk av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl 425. Som vist tidligere ble radioetiketter funnet å være stabile i mMC, hMSC og mDC, med bare ubetydelig prosentandel av effluks observert over 7 dager etter merking (figur 6)18. For kardiopoietiske stamceller ble det ikke observert effluks over 2 dager etter merking19.

Tabell 1: Celleradiomerkingseffektivitet i forskjellige celletyper med [89Zr]Zr-DBN. Stamceller, melanomceller, kardiopoietiske stamceller, hepatocytter, dendrittiske celler og hvite blodlegemer ble radiomerket med [89Zr]Zr-DBN med variabel celleradiomerkingseffektivitet. *Effektiviteten av radiomerking av celler (%) ble estimert som beskrevet i trinn 4.3.7. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: 89Zr chelation effektivitet av DFO-Bn-NCS. Chelateringseffektiviteten til DFO-Bn-NCS for 89 Zr ved bruk av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 og [89Zr]ZrCl4 er forskjellige, målt med rad-TLC. *Verdier er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Med 50 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC-løsningsmiddel, viser [89 Zr]Zr(HPO4)2 en R f på ~0,9 18 og [89Zr]Zr-DBN viser en R f på ~0,018. Med 100 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC-løsningsmiddel, viser [89Zr]ZrCl4 en Rf på ~1,0. [89Zr] Zr(HPO4)2 viser en R f på ~1,0, og [89Zr]Zr-DBN viser en R f på ~0,021-0,035. Kelerende effektivitet (%) = prosentandel av 89 Zr chelatert til DFO-Bn-NCS for å danne [89 Zr]Zr-DBN = (radioaktivitet ved R f av [89 Zr]Zr-DBN/(summen av radioaktivitetene ved R f av [89 Zr]Zr-DBN og ved R f av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4) × 100. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Effekten av radiomerking på levedyktigheten til de radiomerkede cellene ble vurdert i mMCs 18, grishepatocytter 22,24, hMSCs 18, humane kardiopoietiske stamceller19 og immunceller, som musens dendrittiske celler (mDCs)18 og hvite blodlegemer 25, ved bruk av trypan blue exclusion viability test. Det ble observert at radiomerking ikke hadde noen negativ innvirkning på cellens levedyktighet; <5% av de døde cellene ble funnet opptil 7 dager etter merking for både [89Zr]Zr-DBN-merkede og umerkede mMCs og hMSCs18. Radiomerking påvirket heller ikke levedyktigheten til grisens hepatocytter22,24 når de ble testet innen 1 time etter radiomerking eller 2 dager etter radiomerking for de dyrkede radiomerkede humane kardiopoietiske stamceller19.

Radiomerking av humane hvite blodlegemer påvirket heller ikke cellens levedyktighet negativt, da ~ 90-95% av levedyktige celler ble observert i både umerkede og merkede cellepopulasjoner innen 1 time etter radiomerking25. Radiomerking av kardiopoietiske stamceller påvirket ikke morfologien, levedyktigheten eller spredningskapasiteten til humane kardiopoietiske stamceller19. Funksjonelle studier ble utført med kardiopoietiske stamceller i hjerteinfarktmodell19. I de funksjonelle studiene forble det karakteristiske uttrykket av mesodermale og prokardiogene transkripsjonsfaktorer som definerte kardiopoietisk fenotype uendret i radiomerkede kardiopoietiske stamceller19. De radiomerkede kardiopoietiske stamcellene kunne forbedre venstre ventrikkels ejeksjonsfraksjon i et kronisk infarkt musehjerte i infarkthjertemodell 19.

Figure 6
Figur 6: Stabilitet av forskjellige celler radiomerket med 89Zr over 7 dager. Retensjonen av 89Zr radioaktivitet av radiomerkede celler ble funnet å være stabil i alle cellene som ble studert, med en ubetydelig utstrømning observert over 7 dager etter merking. Verdier vises som gjennomsnitt ± standardavvik, n = 3. Dette tallet er fra Bansal et al.18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Representativ rad-TLC på 89 Zr kelering med DFO-Bn-NCS ved bruk av [89Zr]Zr(HPO4)2 i 100 mM DTPA (pH 7.0) løsning. Rad-TLC ble kjørt i 100 mM DTPA (pH 7.0) som mobilfasen; [89Zr] Zr-DBN ; viser en R f på ~0,021-0,035 og [89Zr]Zr(HPO4)2 viser en R f på ~1,0. Kelerende effektivitet (%) = prosentandel av 89 Zr chelatert til DFO-Bn-NCS for å danne [89 Zr]Zr-DBN = [radioaktivitet ved R f av [89 Zr]Zr-DBN/(summen av radioaktivitetene ved R f av [89 Zr]Zr-DBN og ved R f av [89Zr]Zr(HPO4)2)] × 100. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S2: Representativ rad-TLC på 89 Zr kelering med DFO-Bn-NCS ved bruk av [89Zr]ZrCl4 i 100 mM DTPA (pH 7.0) løsning. Rad-TLC ble kjørt i 100 mM DTPA (pH 7.0) som mobilfasen; [89Zr] Zr-DBN viser en R f på ~0,021-0,035 og [89Zr]ZrCl4 viser en R f på ~1,0. Kelerende effektivitet (%) = prosentandel av 89 Zr chelatert til DFO-Bn-NCS for å danne [89 Zr]Zr-DBN = [radioaktivitet ved R f av [89 Zr]Zr-DBN/(summen av radioaktivitetene ved R f av [89 Zr]Zr-DBN og ved R f av [89Zr]ZrCl4)] × 100. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S3: Representativ rad-TLC for celleradiomerkingsreaksjon fra trinn 4.2.3 i en 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1): metanol (1: 1, V: V) løsning. Rad-TLC ble kjørt i 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1): metanol (1: 1, V: V) som mobilfase; de radiomerkede cellene viser en R f på ~0,01-0,02 og [89 Zr]Zr-DBN og [89 Zr]ZrCl4 viser en R f på ~0,73-0,81. Prosentandelen radioaktivitet ved en R f på ~0,01-0,02 beregnes med formel: [(radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02)/(summen av radioaktivitetene ved R f = ~0,01-0,02 og R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S4: Representativ rad-TLC for ikke-cellekontrollreaksjon fra trinn 4.2.4 i en 20 mM natriumcitrat pH 4.9-5.1: metanol (1: 1, V: V) løsning. Med 20 mM natriumsitrat (pH 4,9-5,1): metanol (1:1, V:V) som rad-TLC-løsningsmiddel ble rad-TLC kjørt i 20 mM natriumsitrat (pH 4,9-5,1):metanol (1:1, V:V) som mobilfase; [89Zr] Zr-DBN og [89Zr]ZrCl4 viser en Rf på ~0,73-0,81. Prosentandelen radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02 beregnes med formel: [(radioaktivitet ved R f = ~0,01-0,02)/(summen av radioaktiviteten ved R f = ~0,01-0,02 og R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Følgende er kritiske trinn i protokollen som trenger optimalisering for effektiv cellemerking. I protokolltrinn 1.2 og 1.3, avhengig av volumet på [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4 anvendt, må et passende volum (mikroliter) base brukes; 1,0 M K 2 CO 3løsning må brukes til nøytralisering av [89 Zr] Zr (HPO 4) 2 og 1,0 M Na2CO 3 løsning for nøytralisering av [89Zr] ZrCl4 for å oppnå et pH-område på 7,5-8,0. I trinn 2.1 må den cellekompatible blandingen bestående av K 2 HPO 4 / KH2PO4 og HEPES tilsettes i [89 Zr] Zr-DBN-formuleringen, når den fremstilles fra [89Zr] ZrCl4, for å øke celleradiomerkingseffektiviteten. Det bemerkes at desferrioksamin-Bn-NCS radiomerket med [89 Zr]ZrCl 4 ikke klarte å radiomerke stamceller med mindre fosfat- og HEPES-buffere ble tilsatt i cellemerkingsblandingen, noe som indikerer at en passende formulering er nødvendig for å bruke [89Zr]ZrCl4 som startformulering.

For optimalisering av cellemerkingseffektiviteten for hver celletype (protokolltrinn 4.2), må inkubasjonstiden økes til opptil ~60 min, og inkubasjonstemperaturen økes fra 25 °C til 37 °C eller pH i merkeløsningen økes til ~8,0. Valget av inkubasjonstid, temperatur og pH er i henhold til kompatibiliteten til celletypen. For eksempel ble radiomerking av hepatocytter utført ved 27 °C i 45 minutter ved pH ~7,522,24, men radiomerking av stamceller ble utført ved 37 °C i 30 minutter ved pH ~7,5 18.

I protokolltrinn 4.3, for å forhindre tap av celler under vask, må supernatanten pipetteres forsiktig ut med en pipettevoluminnstilling lavere enn supernatantvolumet som må pipetteres ut. For eksempel, hvis supernatantvolumet er ~ 600 μL, må supernatanten pipetteres ut i trinn på ~ 200-500 μL. Dette bidrar til å unngå å forstyrre cellepelleten. Hvis cellepelleten blir forstyrret mens den pipetterer ut supernatant, bør pipettering ut av supernatanten stoppes og sentrifugeres igjen for å få en veldefinert cellepellet. Noen celler, som monocytter i suspensjonen av hvite blodlegemer, er tilbøyelige til å binde seg til rørets vegger. Dette påvirker gjenvinningen av alle radiomerkede hvite blodlegemer fra tuben etter vask.

Etter radiomerking av celler er en visuell inspeksjonstest, en trypanblå eksklusjonstest og en stabilitets-/effluksanalyse akseptabel som kvalitetskontrollkriterier. Hvis cellelevedyktigheten konsekvent avtar ved hvert radiomerkingsforsøk for en bestemt celletype, bør cellene som blir radiomerket, kontrolleres for å sikre at de er kompatible med cellemediet og bufferen som brukes under celleradiomerking. Ulike kompatible buffere og cellemedium er oppsummert i tabell 1. Det foretrekkes å bruke kjente forlikelige cellekulturbetingelser for stabilitets-/effluksstudier. For eksempel kan stabilitets-/effluksstudier utføres med stamceller, dendrittiske celler, makrofager, kreftceller, decidual stromale celler og mononukleære celler i perifert blod i cellekulturforhold som vist av Bansal et al.18og Friberger et al.20.

De potensielle problemene med lav chelation effektivitet eller inkonsekvent chelation effektivitet, og / eller lav celle radiolabeling utbytte eller tap i celle levedyktighet kan løses ved å endre trinn 1.5, 4.3.7, og 4.3.10, basert på årsakene oppsummert i tabell 3.

Tabell 3: Feilsøking relatert til [89Zr]Zr-DBN-syntese og celleradiomerking. Mulige årsaker og løsninger for en lav / inkonsekvent chelation effektivitet, lav celle radiolabeling utbytte, eller tap i celle levedyktighet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

PET-avbildning av cellehandel gir høy følsomhet, egnet romlig oppløsning og lav bakgrunn25 som fordeler i forhold til andre modaliteter 3,4,9,10. [89Zr]Zr-DBN-mediert merking av celleoverflateproteiner med en stabil kovalent binding gir stabilitet av radiolabel-taggen 18,19,20,21,22,23,24,25. Som et resultat øker [89Zr]Zr-DBN-basert cellemerking påliteligheten og tilliten til radiosignalet (positronemisjon og gammas produsert etter tilintetgjørelse) oppnådd fra de radiomerkede cellene. I mellomtiden er andre metoder, som [89Zr]Zr-oksinbasert radiomerking, kjent for å møte utstrømning av merkingsradiotaggen over tid på grunn av den ikke-kovalente karakteren av radiomerkingen, og produserer lavere og off-labeled radiosignaler27,28.

En begrensning av denne cellemerkingsteknikken er at radioaktivitetssignalene i PET-bildene er anskaffet etter in vivo-administrering av levende radiomerkede celler, men gir ingen anelse om signalet stammer fra levende radiomerkede celler eller fra rusk av radiomerkede celler som kunne ha dødd i kroppen etter administrering.

PET-avbildning for cellehandel har et enormt potensial, da det kan støtte utviklingen av nye cellebaserte terapier29,30. Leger og forskere som arbeider i cellebaserte terapier for å behandle kreft 6,7,8,9,10, hjerteinfarkt 3,4,5, myokardsvikt 1,2, retinal 2 og makuladegenerasjon, og diabetes 2 vil finne dette 89Zr-basert cellemerkingsprotokoll instrumentell, for bedre å forstå responsene til deres cellebaserte terapier som stamcelleterapier. I tillegg har 89Zr-merkede stamceller31, hvite blodlegemer32, dendrittiske celler 33,34 og CAR T-celler35 stort potensial for å komme inn i det kliniske riket innen de neste 3-5 årene. Videre kan farmasøytiske selskaper bruke denne teknikken til å utvikle og validere sine cellebaserte terapeutiske midler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingen økonomisk konkurrerende interesse, men er oppfinnerne av denne teknologien (Patent # US20210330823A1).

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 og DOE DE-SC0008947 tilskudd, International Atomic Energy Agency, Wien, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, og Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Alle figurene ble laget ved hjelp av BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A996-4
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 12571063
Anion exchange column Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany 731876 Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc., Glendale, AZ, USA 352096 Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-11904
DFO-Bn-NCS Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA B-705 p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 276855
Dose calibrator Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA 5130-3234 CRC -55tR Dose Calibrator 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS) The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 14025092 For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A508P212
Melanoma cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-6475
Methanol Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 34860
Microcentrifuge tube Eppendorf, Hamburg, Germany 30108442 Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA 415-ML-010
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 10010023 For washing cells
Saline Covidien LLC, Mansfield, MA, USA 1020 0.9% Sterile Saline Solution
Shaker  Eppendorf, Hamburg, Germany T1317 Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet  Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA SGI0001 iTLC-SG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
  2. Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
  3. Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
  4. Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
  5. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  6. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
  7. Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
  8. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
  9. Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
  10. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  11. Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
  12. Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
  13. Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  14. Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
  15. Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
  16. Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
  17. Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
  18. Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
  19. Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
  20. Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
  21. Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
  22. Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
  23. Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
  24. Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
  25. Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
  26. Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
  27. Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
  28. Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
  29. Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
  30. Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
  31. Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
  32. Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
  33. Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
  34. de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  35. Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).

Tags

Kreftforskning utgave 200
Positronutslippstomografi Avbildning av cellehandel: En metode for celleradiomerking
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey,… More

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey, M. K. Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling. J. Vis. Exp. (200), e64117, doi:10.3791/64117 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter