Summary
本协议描述了用于从培养的人MSC中分离和表征代表性EV（外泌体和微囊泡）的差异离心。本文还解释了这些电动汽车的进一步应用。
Abstract
细胞外囊泡（EVs）是大多数细胞类型释放的异质膜纳米颗粒，它们越来越被认为是机体稳态的生理调节因子和病理的重要指标;与此同时，它们在建立可及和可控制的疾病疗法方面的巨大潜力正在显现。间充质干细胞（MSCs）可以在培养物中释放大量EV，这已显示出有望启动有效的组织再生并促进具有良好可扩展性和可重复性的广泛治疗应用。对收集和应用 MSC-EV 的简单有效的协议的需求不断增长。在这里，提供了一个基于差速离心的详细方案，以从培养的人MSC，外泌体和微囊泡中分离和表征代表性的EV，以用于进一步的应用。该方法在标记、局部移植和全身注射等一系列下游方法中具有适应性。该程序的实施将解决在转化研究中对简单可靠的MSC-EV收集和应用的需求。
Introduction
干细胞是未分化的多能细胞，具有自我更新能力和翻译潜力1。间充质干细胞（MSCs）在实验室中易于分离、培养、扩增和纯化，这在多次传代后仍然是干细胞的特征。近年来，越来越多的证据支持了MSCs在治疗用途中以旁分泌模式起作用的观点2，3。特别是细胞外囊泡（EVs）的分泌在介导MSCs的生物学功能中起着至关重要的作用。作为从大多数细胞类型释放的异质膜纳米颗粒，EV由称为外泌体（Exos），微囊泡（MV）甚至更大的凋亡体的亚类别组成4，5。其中，Exos是研究最广泛的EV，尺寸为40-150nm，具有内体起源，在生理条件下活跃分泌。MVs是通过直接从直径为100-1，000nm的细胞质膜表面脱落而形成的，其特征在于磷脂酰丝氨酸的高表达和供体细胞表面标志物的表达6。EV含有RNA，蛋白质和其他生物活性分子，它们具有与亲本细胞相似的功能，并在细胞通讯，免疫反应和组织损伤修复中发挥重要作用7。MSC-EVs作为再生医学中强大的无细胞治疗工具已被广泛研究8。
MSC衍生电动汽车的分离和纯化是研究和应用领域的常见问题。目前，差分和密度梯度超速离心9、超滤工艺10、免疫磁分离11、分子排阻色谱12和微流控芯片13是电动汽车分离纯化中广泛使用的方法。由于每种方法的优点和缺点，收集的电动汽车的数量、纯度和活性不能同时满足14，15。在本研究中，详细显示了从培养的MSC中分离和表征EV的差异离心方案，该方案支持了有效的治疗用途16，17，18，19，20。该方法对荧光标记、局部移植和全身注射等一系列下游方法的适应性已被进一步举例说明。实施该程序将解决在转化研究中简单可靠地收集和应用MSC-EV的需求。
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Protocol
所有动物程序均由第四军医大学动物护理和使用委员会批准，并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行。使用8周龄的C57Bl / 6小鼠（对雌性或雄性都没有偏好）。用于本研究的冷冻保存的人脐带衍生MSCs（UCMSCs）是从商业来源获得的（见 材料表）。人体细胞的使用得到了第四军医大学伦理委员会的批准。
1. 人间充质干细胞（hMSCs）培养
- 准备实验工作所需的附件和溶液，包括移液器，移液器吸头，10厘米培养皿，恒温设备（水浴），橡胶手套，75%酒精，培养基（在37°C下孵育），致死牛血清（FBS）和100x青霉素 - 链霉素（P / S）溶液（见 材料表）。
- 通过补充 20% FBS 和 1% P/S 来制备市售的 α-最低必需培养基 （α-MEM）。
注意：稀释超纯过滤水净化系统制成的超纯过滤水中用于分离和分析EV的所有溶液（见 材料表）。 - 通过在37°C水浴中融化，从液氮中回收冷冻保存的人脐带衍生MSC（UCMSCs）。
- 快速轻轻地将熔化的细胞悬液转移到装有 5 mL 培养基的 15 mL 管中（步骤 1.2）。在4°C，500× g 下离心5分钟。
- 用无菌移液管除去上清液并保留细胞沉淀。将 2 mL 培养基加入离心管中，轻轻重悬细胞。
- 将细胞接种在 10 cm 培养皿中，并加入 8 mL 培养基至总共 10 mL。
- 在细胞培养箱中在37°C的5%CO2 中培养MSC。
2. 用于分离外显子和中压的差速离心
- 当MSCs生长到>90%汇合时，用补充有20%EV耗尽FBS和1%P / S的α-MEM替换培养基，每皿8 mL。
注意：将FBS在4°C下离心，1，50，000 x g 过夜，以去除EV和其他杂质。 - 培养48小时后，将培养基（步骤2.1）收集到50mL离心管中。
- 将MSC培养基在4°C，800× g 下离心10分钟。
- 通过将上清液转移到清洁的 1.5 mL 锥形管中来去除细胞碎片和细胞碎片。
注意：必须使用 1.5 mL 锥形管来提高 EV 产量。 - 将上清液在4°C，16，000× g 下离心30分钟。沉淀为MVs.来自每个细胞培养皿的MVs用50μLPBS重悬。
- 将步骤2.5中通过移液管离心获得的上清液转移到干净的超速离心管中。在4°C下以1，50，000× g 离心2小时。
- 弃去上清液并收集残留物，即Exos。将七个细胞培养皿中的Exos重悬于50μL的PBS中。
注意：第六代UCMSC用于EV隔离。为了获得足够的MV和Exos用于实验用途，通常需要7-8个培养皿的培养细胞。EV样品可立即用于以下表征步骤或治疗应用，最好不要储存。
注意：避免反复冷冻和解冻电动汽车，最好在短期内将电动汽车储存在4°C，而不是-80°C。
3. 检测MSCs中EV的颗粒数和尺寸分布
注意：对于尺寸分布评估，纳米颗粒跟踪分析（NTA）由市售的纳米颗粒跟踪分析仪执行（参见 材料表）。
- 在 1，499 μL PBS 中稀释 1 μL EV（来自步骤 2.5 和步骤 2.7），并在 15 mL 管中充分混合。
- 按照制造商的说明操作跟踪分析仪。首先，启动兼容软件（参见 材料表）。
- 用蒸馏水填充样品池，然后让仪器开始检查样品池。
- 用准备好的标准溶液校准仪器。确保软件检测界面上显示的颗粒数在50-400之间（最好在200左右）。单击“ 确定”。
注意：通过在 1 mL 蒸馏水中重新配制 1 μL 校准溶液（参见 材料表）以生成初级溶液来制备标准溶液，然后取 100 μL 初级溶液并加入 25 mL 蒸馏水以制备标准溶液 （1：250，000）。将此工作试剂在4°C下储存一周。 - 用 5 mL 蒸馏水冲洗样品池。
- 样品分析前，用 1 mL 蒸馏水冲洗通道。确保软件检测界面显示的颗粒数小于10。
- 注入步骤3.1中制备的1mL EV样品。根据仪器的操作说明进行囊泡测试。
注意：在仔细的手动控制下，用 1 mL 注射器以 0.5 mL/s 的恒定速度进样样品和蒸馏水。
4. 透射电子显微镜（TEM）表征EV形貌
- 将步骤 2.7 中的 1 μL EV 稀释到 199 μL PBS 中并充分混合。将 20 μL EV 悬浮液滴加入到甲型/碳涂层的方形网中（参见 材料表），静置 3 分钟。
- 用小滤纸去除多余的液体，静置15秒，使表面稍微干燥。
- 用 1.5% 磷钨酸液滴对 EV 样品进行负染色 40 秒。
- 去除多余的磷钨酸，静置15秒以使表面稍微干燥。
- 将含有formvar/碳涂层方形网的样品放入覆盖有滤纸的干净盘中。用透射电子显微镜观察和捕获图像。
注意：在此过程中，以Exos为例。
5. MSC衍生电动汽车的标签
- EV 提取后（步骤 2.5），在 1.5 mL 锥形管中用 250 μL PBS 重悬。
- 使用另一个1.5 mL锥形管制备PKH26染料的工作溶液;使用 1 μL PKH26 标记试剂，用 250 μL 稀释剂 C（用于本研究的市售 EV 标记试剂盒的组分，参见 材料表）。
注意：使用前立即准备工作溶液。
注意：未经预稀释的过量PKH26染料或标签有损坏电动汽车的风险。 - 将重新悬浮的 EV 与工作溶液混合。让它在室温下静置 5 分钟，然后加入 500 μL EV 耗尽的 FBS 以停止反应。
- 对于MV，在4°C，16，000× g 下离心30分钟，并通过移液管弃去上清液。加入 1 mL PBS 冲洗残留物。
- 在4°C，16，000× g 下离心30分钟，弃去上清液以除去未结合的染料。
- 用 200 μL PBS 重悬残留物。将 20 μL 悬浮液滴在载玻片上，并在荧光显微镜下观察。
注意：在此过程中，以MV为例。
6. 间充质干细胞的局部移植和全身注射
注意：对于以下程序，请在注射前将EV放在冰上。
- 按照以下步骤进行局部移植。
- 用4%（体积/体积）异氟醚麻醉小鼠。在手术过程中将麻醉保持在1%-3%异氟醚。
- 手术前，给予5mg / kg卡洛芬（IP）镇痛，以尽量减少术后疼痛。
- 在伤口切除之前，剃掉背毛并通过交替使用 3 轮 10% 聚维酮碘和 75% 乙醇对背表面进行消毒。
- 使用活检打孔器（见 材料表），在背侧皮肤上形成直径为1cm的全层伤口。
- 将来自两个培养皿的 MSC 衍生 EV 重悬于 100 μL PBS 中，并在伤口床的皮下层中注射，在每个伤口周围有四个部位。
注意：每只小鼠平均注射100μgEV（来自两个10cm细胞培养皿的EV）。需要十个10厘米的MSC培养皿才能产生足够的EV，以在小鼠模型中建立n = 5的实验。 - 治疗后，用无菌纱布包裹小鼠并将它们放在隔热垫上（见 材料表）直到它们醒来。
- 确保小鼠在恢复足够的意识之前不会无人看管。在小鼠完全康复之前，不要将小鼠送回其他动物的陪伴下。
- 根据需要在术后第 2 天和第 3 天给予额外剂量的镇痛药。
- 进行全身注射。
- 将 MSC 衍生的 EV 重悬于 200 μL PBS 中，然后以 10：1 的体积比与肝素溶液混合。
- 将小鼠放入尾静脉成像系统（见 材料表）。按下开关提起拉杆。
- 静脉注射前使用酒精垫对尾静脉进行消毒。然后，通过尾静脉系统地向小鼠注射步骤6.2.1中制备的悬浮液。该程序由尾静脉插画师帮助。
注意：与肝素混合后立即注射EV悬浮液。每只小鼠平均注射100μgEV（来自两个10cm细胞培养皿的EV）。需要十个10厘米的MSC培养皿才能产生足够的EV，以在小鼠模型中建立n = 5的实验。
注意：小鼠尾静脉注射通常限制在200μl的体积。注射应该缓慢进行，如果您看到颠簸或阻力，则停止注射，这表明针头已脱离静脉。如果小鼠表现出卷曲和颤抖等不良临床症状，这可能是对大容量注射、快速注射或毒性/过敏反应的休克反应。
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Representative Results
来自培养的人UCMSC的MV和Exos按照实验工作流程分离（图1）。NTA结果表明，来自人类MSC的Exos尺寸范围为40 nm至335 nm，峰尺寸约为100 nm，MV的尺寸范围为50 nm至445 nm，峰尺寸为150 nm（图2）。MSC衍生的Exos的形态学特征表现出典型的杯形（图3）。EV通过PKH26有效地标记，通过标记颗粒的总视图和荧光显微镜观察（图4）。MSC衍生的EV的局部和全身注射在皮肤伤口周围或通过尾静脉进行（图5）。因此，Exos和MV被成功分离并应用于后续实验。
图1：从培养的人MSC中分离MV和Exos。 收集培养基并进行差速离心。 请点击此处查看此图的大图。
图2：来自MSC的Exos和MV的NTA分析。 描绘了具有代表性图像的粒度分布。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：通过 TEM 对来自 MSC 的 Exos 的形态学表征。 显示杯形的Exos。比例尺：200 nm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：PKH26 标记 MSC 衍生的 MV。 在荧光显微镜下粗略观察和观察PKH26标记的MV颗粒。比例尺：200 μm。 请点击这里查看此图的大图。
图 5：MSC 衍生 EV 的管理。 （A）皮肤伤口周围的局部移植和（B）通过尾静脉 全身 注射。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
电动汽车正在各种生物活动中发挥重要作用，包括抗原呈递、遗传物质转运、细胞微环境修饰等。此外，它们的广泛应用为诊断和治疗疾病带来了新的方法和机会21.电动汽车治疗应用的实现基于成功的分离和表征。然而，由于缺乏标准化的分离纯化方法和低提取效率，电动汽车的研究受到了阻碍。本文主要介绍了一种易于操作的EVs从培养的人间充质干细胞中提取和表征方案及其进一步应用，可标记并用于局部注射 促进 组织修复和静脉注射治疗全身性疾病。通过使用UCMSCs的新生儿来源，细胞的标准培养和无晚期传代，可以保持用于EV分离的MSCs的可重复性。尽管本手稿中分别使用术语Exos和MVs来指代从差速离心速度收集的EV，但未来的研究中需要更多的测定来区分其起源，正如细胞外囊泡研究的最小信息（MISEV2018）22 指南所建议的那样，例如通过活细胞成像观察生产过程和免疫电子显微镜检测特定标志物。总体而言，该方法简单，因此易于扩展和重现，这将对该领域有用。
在本研究中，来自MSCs的生理EV通过差速离心和超速离心逐渐分离为MV和Exos。本文强调了用补充20%EV耗尽的FBS替代α-MEM以收集培养基的重要性。此步骤可确保提取的 EV 仅来自 MSC，排除 EV 可能来自其他干扰物质的可能性。在全身注射之前，将10%肝素溶液混合到EV溶液中也很重要。近年来，一些研究表明，EVs具有促凝血作用，因此在全身注射期间添加肝素是必要的，以避免注射后形成血栓，否则导致小鼠急性致死23。在此协议实现过程中可能存在一些需要解决的问题。举一个突出的例子，如果EV的提取量不够，研究人员应该将其追溯到细胞上清液收集步骤。在上清液收集过程中，必须均匀吹动细胞以完全收集保留在MSC细胞外基质中的释放EV。当小鼠在注射EV后不久死亡时，就会发生另一个潜在的故障。如上所述，除了注射前添加肝素外，还必须调整注射EV的浓度（平均每只小鼠100μgEV）。为了验证注射的成功，可以对荧光标记的EV的生物分布或植入的特定组织部位（肝脏，脾脏等）的冷冻切片进行 体内 成像，此前报道了24。此外，建议在分离后尽快使用电动汽车，冷冻储存会导致颗粒损失、纯度降低和融合现象，从而导致人为颗粒25。此外，通常采用的PKH26标签将增加EV尺寸26，可以使用其他标记方法进行比较。
现有的EV分离方案主要报告如下：差分和密度梯度超速离心9，超滤工艺10，免疫磁分离11，分子排阻色谱12，微流控芯片13和基于聚合物的沉淀技术27。与超速离心相比，超滤工艺是一种方便的提取方法，有利于EVs在大体积样品9，10中的富集，而缺点是存在膜污染，容易造成样品损失。免疫磁分离适用于分离不同亚型的EV，所得EV纯度高。这种方法的缺点是成本高，产量低11。分子排阻色谱分离的EV纯度高，收率高。缺点是需要特殊设备，不能同时用于多个样品12。微流控芯片对材料和工艺要求高，成本高，难以处理大样品13。通过基于聚合物的沉淀技术分离的电动汽车含有非电动汽车污染物，将影响电动汽车活动14。其中，差速离心和超速离心仍然是电动汽车分离纯化应用最广泛的方法，被视为MSC-EV萃取的金标准。通过结合不同的离心时间和速度，逐步实现MSC培养基中EV的分离和富集，这是一种优化的方法。值得注意的是，在本手稿中分离的Exos和MV具有相似的尺寸分布，尽管MV往往更大，这可能是由于倾向于诱导纳米颗粒聚集的差异离心。尽管改进的方法在 EV 的尺寸维护方面可能表现更好，但差速离心在 EV 分离的高效率方面是有利的28.尽管对于电动汽车和GMP生产的大规模生产，该方法受到一次分离运行中可处理的培养基数量的限制，但该技术系统易于建立，并已通过大型动物的转化项目应用29，30。无论如何，上述分离方法各有优缺点，研究人员可以根据EV的不同来源和研究目的选择合适的方法。
近年来，电动汽车在临床应用中显示出巨大的潜力，例如疾病诊断31，治疗以及作为药物输送的载体32，33。基于其优势特性，各国广泛研究了EV作为治疗剂。在这方面，人们一直致力于研究电动汽车在疾病治疗中的作用以及电动汽车在疾病发病机制中的作用。目前从培养的间充质干细胞中分离、表征和治疗应用的 EV 方案已得到很好的应用。例如，MSC-Exos在皮肤伤口中的局部递送通过炎症调节促进愈合，尾静脉注射MSC衍生的EVs可以改善2型糖尿病的肝胰岛素抵抗和脂肪变性24。此外，涉及提高MSC-EVs产量和纯度的治疗应用即将出现，以提供可行的转化策略。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（32000974，81930025和82170988）和中国博士后科学基金（2019M663986和BX20190380）的资助。感谢国家基础医学实验教学示范中心（AMFU）和空军医科大学军事医学创新中心分析测试中心实验室的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
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