Summary
本プロトコルは、培養ヒト間葉系幹細胞から代表的なEV(エキソソームおよびマイクロベシクル)を単離および特性評価するための差動遠心分離について説明しています。これらのEVのさらなる用途についても、本稿で解説しています。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、ほとんどの細胞型によって放出される不均一な膜ナノ粒子であり、生物の恒常性の生理学的調節因子および病状の重要な指標としてますます認識されています。その間、アクセス可能で制御可能な疾患治療薬を確立するための彼らの計り知れない可能性が浮上しています。間葉系幹細胞(MSC)は、培養中に大量のEVを放出することができ、効果的な組織再生を促進し、優れたスケーラビリティと再現性を備えた広範な治療アプリケーションを促進することが期待されています。MSC-EVを収集して適用するためのシンプルで効果的なプロトコルに対する需要が高まっています。ここでは、さらなる応用のために培養ヒトMSC、エクソソーム、およびマイクロベシクルから代表的なEVを単離および特性評価するための、差動遠心分離に基づく詳細なプロトコルを提供します。この方法の適応性は、標識、局所移植、全身注射などの一連の下流アプローチに対して示されています。この手順の実施により、シンプルで信頼性の高いMSC-EVの収集とトランスレーショナルリサーチへの応用の必要性に対処します。
Introduction
幹細胞は、自己複製能と翻訳能を持つ未分化多能性細胞です1。間葉系幹細胞(MSC)は、実験室で簡単に分離、培養、増殖、精製でき、複数回継代しても幹細胞の特徴が残ります。近年、MSCが治療目的でパラクリンモードで作用するという見解を支持する証拠が増えています2,3。特に細胞外小胞(EV)の分泌は、間葉系幹細胞の生物学的機能を媒介する上で重要な役割を果たしています。ほとんどの細胞型から放出される不均一な膜性ナノ粒子として、EVはエキソソーム(Exo)、マイクロベシクル(MV)、およびさらに大きなアポトーシス体と呼ばれるサブカテゴリで構成されています4,5。その中で、Exosは40〜150nmのサイズを有する最も広く研究されているEVであり、これはエンドソーム起源であり、生理学的条件下で活発に分泌される。MVは、直径100〜1,000nmの細胞原形質膜の表面から直接脱落することによって形成され、これはホスファチジルセリンの高発現およびドナー細胞の表面マーカーの発現を特徴とする6。EVにはRNA、タンパク質、その他の生理活性分子が含まれており、これらは親細胞と同様の機能を持ち、細胞コミュニケーション、免疫応答、組織損傷修復に重要な役割を果たします7。MSC-EVは、再生医療における強力な無細胞治療ツールとして広く研究されています8。
MSC由来のEVの単離と精製は、研究と応用の分野で共通の問題です。現在、示差および密度勾配超遠心分離9、限外ろ過プロセス10、免疫磁気分離11、分子排除クロマトグラフ12、およびマイクロ流体チップ13は、EVの単離および精製に広く採用されている方法である。それぞれのアプローチの長所と短所により、収集されたEVの量、純度、および活性を同時に満たすことはできません14,15。本研究では、培養MSCからのEVの分離と特性評価の差動遠心分離プロトコルが詳細に示され、効率的な治療的使用をサポートしてきました16、17、18、19、20。蛍光標識、局所移植、全身注射などの一連の下流アプローチに対するこの方法の適応性がさらに例示されています。この手順を実施することで、トランスレーショナルリサーチにおけるMSC-EVの簡単で信頼性の高い収集と適用の必要性に対処できます。
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Protocol
すべての動物の手順は、第4軍事医科大学の動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用のための国立衛生研究所ガイドに従って実施されました。8週齢のC57Bl/6マウス(雌または雄のいずれの選好もしない)を使用した。本研究に使用された凍結保存されたヒト臍帯由来MSC(UCMSC)は、商業的な供給源から入手した( 資料表を参照)。ヒト細胞の使用は、第4軍事医科大学の倫理委員会によって承認されました。
1. ヒト間葉系幹細胞(hMSC)の培養
- ピペット、ピペットチップ、10 cmペトリ皿、恒温装置(ウォーターバス)、ゴム手袋、75%アルコール、培地(37°Cでインキュベート)、致命的なウシ血清(FBS)、および100xペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)溶液( 材料の表を参照)など、実験作業に必要なアクセサリと溶液を準備します。
- 市販のアルファ最小必須培地(α-MEM)に20%FBSと1%P/Sを添加して調製します。
注:EVの分離と分析に使用されるすべての溶液を、超純ろ過水精製システムによって製造された超純ろ過水で希釈します(材料の表を参照)。 - 凍結保存されたヒト臍帯由来MSC(UCMSC)を37°Cの水浴で溶かして液体窒素から回収します。
- 融解した細胞懸濁液を、5 mLの培養液を入れた15 mLチューブに迅速かつ穏やかに移します(ステップ1.2)。4°Cで500 x g で5分間遠心分離します。
- 滅菌ピペットで上清を除去し、細胞沈殿物を保持します。2 mLの培養液を遠沈管に加え、細胞を静かに再懸濁します。
- 細胞を10 cmのシャーレに播種し、8 mLの培養液を加えて合計10 mLにします。
- MSCsをセルインキュベーター内の5%CO2 中で37°Cで培養する。
2. エクソおよびMVの単離のための差動遠心分離
- 間葉系幹細胞が>90%コンフルエントまで成長したら、培養液を、各ディッシュ8 mLに対して20%EV枯渇FBSと1%P/Sを添加したα-MEMに交換します。
注:FBSを4°C、1,50,000 x g で一晩遠心分離して、EVやその他の不純物を除去します。 - 48時間の培養後、培養液を50 mL遠沈管に回収します(ステップ2.1)。
- MSC培養液を4°C、800 x g で10分間遠心分離します。
- 上清をきれいな1.5 mLコニカルチューブに移して、細胞断片と細胞破片を取り除きます。
注意: EVの歩留まりを向上させるには、1.5mLのコニカルチューブを使用する必要があります。 - 上清を4°C、16,000 x g で30分間遠心分離します。ペレットはMVsであり、細胞の各ディッシュからのMVを50μLのPBSで再懸濁した。
- ステップ2.5で遠心分離して得られた上清をピペットで移し、超遠沈管を洗浄する。1,50,000 x g で4°Cで2時間遠心分離します。
- 上清を捨て、Exosである残留物を収集します。7皿の細胞からExoを50 μLのPBSに再懸濁します。
注:6番目の継代UCMSCは、EVの絶縁に使用されます。実験用に十分なMVとExosを入手するには、通常、7〜8皿の培養細胞が必要です。EVサンプルは、次の特性評価ステップまたは治療用途にすぐに使用されますが、保存しない方がよいでしょう。
注意:EVの凍結と解凍を繰り返すことは避け、EVは-80°Cではなく、短期間で4°Cで保管するのが最善です。
3. 間質幹細胞からのEVの粒子数とサイズ分布の検出
注:サイズ分布の評価では、ナノ粒子追跡分析(NTA)は市販のナノ粒子追跡分析装置によって実行されます( 材料表を参照)。
- 1 μLのEVを1,499 μLのPBSで希釈し(ステップ2.5およびステップ2.7から)、15 mLチューブで十分に混合します。
- トラッキングアナライザーは、製造元の指示に従って操作してください。まず、互換性のあるソフトウェアを起動します(材料表を参照)。
- サンプルセルに蒸留水を満たし、機器がセルチェックを開始できるようにします。
- 準備した標準溶液で機器を校正します。ソフトウェア検出インターフェイスに表示される粒子数が50〜400(できれば約200)であることを確認してください。 OK をクリックします。
注:1 μLの校正溶液( 材料の表を参照)を1 mLの蒸留水に再構成して一次溶液を生成し、次に100 μLの一次溶液を取り、25 mLの蒸留水を加えて標準溶液を調製して標準溶液を調製します(1:250,000)。この作業試薬を4°Cで1週間保存します。 - サンプルセルを5 mLの蒸留水ですすいでください。
- サンプル分析の前に、1 mLの蒸留水でチャネルを洗い流してください。ソフトウェア検出インターフェイスに表示されるパーティクル数が 10 未満であることを確認します。
- ステップ3.1で調製したEVサンプル1mLを注入します。機器の取扱説明書に従って小胞試験を実施してください。
注意: サンプルと蒸留水は、注意深い手動制御の下で、1 mLシリンジで0.5 mL / sの一定速度で注入されます。
4. 透過型電子顕微鏡(TEM)によるEV形態の解析
- ステップ2.7のEV1μLを199μLのPBSで希釈し、十分に混合します。20 μLのEVサスペンションドロップをホルムバー/カーボンコーティングされた正方形メッシュ( 材料の表を参照)に追加し、3分間そのままにします。
- 小さなろ紙で余分な液体を取り除き、15秒間そのままにして表面をわずかに乾かします。
- EVサンプルを1.5%リンタングステン酸液滴で40秒間ネガティブ染色します。
- 余分なリンタングステン酸を取り除き、15秒間放置して表面をわずかに乾燥させます。
- ホルムバー/カーボンコーティングされた正方形のメッシュを含むサンプルを、ろ紙で覆われたきれいな皿に入れます。透過型電子顕微鏡で画像を観察・撮影します。
注:このプロセスでは、Exosを例として取り上げます。
5. 間葉系幹細胞由来のEVの表示
- EV抽出後(ステップ2.5)、250 μLのPBSを1.5 mLのコニカルチューブに再懸濁します。
- PKH26色素の作業溶液を調製するために、別の1.5mLコニカルチューブを使用してください。250 μLの希釈液Cで希釈した1 μLのPKH26標識試薬を使用します(本研究に使用した市販のEV標識キットのコンポーネント、 材料の表を参照)。
注意: 使用直前に作業溶液を準備してください。
注意: 事前に希釈せずに過剰なPKH26染料またはラベルを付けると、EVが損傷する危険があります。 - 再吊り下げられたEVを実用的な溶液と混ぜます。室温で5分間静置した後、EV枯渇したFBSを500 μL加えて反応を停止させます。
- MVの場合は、4°C、16,000 x g で30分間遠心分離し、上清をピペットで廃棄します。1 mLのPBSを加えて残留物を洗い流します。
- 4°Cで遠心分離し、16,000 x g で30分間、上清を捨てて、未結合の色素を除去した。
- 残留物を200 μLのPBSで再懸濁します。20 μLの懸濁液をスライド上に滴下し、蛍光顕微鏡で観察します。
注: このプロセスでは、MV を例として取り上げます。
6. MSC-EVの局所移植と全身注射
注意: 次の手順では、噴射する前にEVを氷の上に置きます。
- 以下の手順に従って局所移植を行います。
- マウスを4%(vol / vol)イソフルランで麻酔します。.処置中は麻酔を1%〜3%イソフルランに維持する。
- 手術前に、手術後の痛みを最小限に抑えるために、鎮痛のために5 mg / kgのカルプロフェン(IP)を投与します。
- 創傷切除の前に、背毛を剃り、10%ポビドンヨードと75%エタノールを3回交互に塗布して背面を滅菌します。
- 生検パンチ( 材料の表を参照)を使用して、背側の皮膚に直径1 cmの全層創傷を作成します。
- 2つのディッシュから得られたMSC由来のEVを100 μLのPBSに再懸濁し、創傷床の皮下層、4つの部位を持つ各創傷の周囲に注射を投与します。
注:マウスあたり平均100μgのEV(2つの10cmディッシュの細胞からのEV)が注射されます。マウスモデルでn = 5の実験を設定するのに十分なEVを生成するには、MSCの10 cmディッシュが10個必要です。 - 治療後、マウスを滅菌ガーゼで包み、目覚めるまで断熱パッド( 材料表を参照)の上に置きます。
- 十分な意識を取り戻すまで、マウスが放置されていないことを確認してください。マウスが完全に回復するまで、マウスを他の動物の会社に戻さないでください。
- 必要に応じて、手術後2日目と3日目に追加の鎮痛剤を投与します。.
- 全身注射を行います。
- MSC由来のEVを200 μLのPBSに再懸濁し、ヘパリン溶液と10:1の容量比で混合します。
- マウスを尾静脈イメージングシステムに置きます( 材料の表を参照)。スイッチを押してレバーを持ち上げます。
- IV注射の前にアルコールパッドを使用して尾静脈を消毒します。次いで、ステップ6.2.1で調製した懸濁液を尾静脈を通してマウスに体系的に注射する。手順は尾静脈イラストレーターによって助けられます。
注:ヘパリンと混合した直後にEV懸濁液を注入してください。マウスあたり平均100μgのEV(2つの10cmディッシュの細胞からのEV)を注射します。マウスモデルでn = 5の実験を設定するのに十分なEVを生成するには、MSCの10 cmディッシュが10個必要です。
注意:マウスの尾静脈注射は通常200μlの容量に制限されています。注射はゆっくりと進み、針が静脈から出ていることを示唆する隆起や抵抗が見られる場合は停止する必要があります。マウスがカールや震えなどの有害な臨床徴候を示した場合、これは大量注射、高速注射、または毒性/アナフィラキシーに対するショック反応である可能性があります。
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Representative Results
培養ヒトUCMSCからのMVおよびExoは、実験ワークフローに従って単離されます(図1)。NTAの結果は、ヒト間葉系幹細胞由来のExosのサイズが40 nmから335 nmの範囲でピークサイズが約100 nmであり、MVのサイズが50 nmから445 nmの範囲でピークサイズが150 nmであることを示しています(図2)。MSC由来のExosの形態学的特性は、典型的なカップ形状を示します(図3)。EVはPKH26によって効率的に標識され、PKH26は標識ペレットとしての全体像と蛍光顕微鏡の両方によって観察されます(図4)。MSC由来のEVの局所注射および全身注射は、皮膚創傷周辺または尾静脈を通して行われます(図5)。したがって、ExosとMVは正常に分離され、その後の実験に適用されます。
図1:培養ヒト間葉系幹細胞からのMVおよびエクソの分離。 培地を回収し、示差遠心分離を行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MSCからのエクソとMVのNTA分析。 代表的な画像による粒度分布が描かれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TEMによるMSCからのエクソの形態特性。 カップ型のエグゾが展示されています。スケールバー:200 nm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PKH26によるMSC由来MVの標識。 PKH26標識MVペレットを肉眼的に観察し、蛍光顕微鏡で観察する。スケールバー:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:MSC由来のEVの投与。 (A)皮膚創傷周辺の局所移植および(B)尾静脈 を介した 全身注射。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
EVは、抗原提示、遺伝物質輸送、細胞微小環境改変など、多様な生物学的活動において重要な役割を果たすようになっています。さらに、それらの幅広いアプリケーションは、病気の診断と治療のための新しいアプローチと機会をもたらします21。EVの治療用途の実装は、分離と特性評価の成功に基づいています。しかし、標準化された単離精製方法がなく、抽出効率が低いため、EVの研究は妨げられてきました。本稿では、主に培養ヒト間葉系幹細胞からのEVの容易に実現可能な抽出および特性評価プロトコルと、局所注射による組織修復の促進および静脈注射 による 全身性疾患の治療に標識および使用できるさらなるアプリケーションを紹介します。EV単離のためのMSCの再現性は、UCMSCの新生児起源、細胞の標準的な培養、および継代の遅れがないことによって維持されます。本稿では、それぞれExosとMVという用語を遠心分離速度差から採取したEVを指すために使用していますが、細胞外小胞研究のための最小情報(MISEV2018)22 ガイドラインで推奨されているように、製造プロセスを観察するための生細胞イメージングや特異的マーカーを検出するための免疫電子顕微鏡など、それらの起源を区別するために、今後の研究ではさらに多くのアッセイが必要になります。全体として、この方法は単純であり、したがって容易にスケーラブルで再現性があり、現場に役立つであろう。
本研究では、MSCからの生理的EVを、差動遠心分離と超遠心分離によってMVとExosに徐々に分離します。ここでは、培地を回収するために20%EV枯渇FBSを添加したα-MEMを代替することの意義が強調されている。このステップにより、抽出されたEVがMSCのみに由来することが保証され、EVが他の干渉物質に由来する可能性は排除されます。全身注射の前に、10%ヘパリン溶液をEV溶液に混合することも重要です。近年、いくつかの研究により、EVには凝固促進効果があることが示されているため、全身注射中にヘパリンを添加することは、注射後の血栓の形成を回避するために必要であり、そうでなければマウスの急性致死につながります23。このプロトコルの実装中に、トラブルシューティングが必要な問題が発生する可能性があります。1つの顕著な例として、EVの抽出量が十分でない場合、研究者はそれを細胞上清収集ステップにまでさかのぼる必要があります。上清の収集中、細胞を均等に吹き飛ばして、MSCの細胞外マトリックスに保持されている放出されたEVを完全に収集する必要があります。別の潜在的な障害は、EVの注射直後にマウスが死亡したときに発生します。上記のように、注射前にヘパリンを添加することに加えて、注射されたEVの濃度(マウスあたり平均100μgのEV)を調整する必要があります。注射の成功を検証するために、以前に報告された、生着の特定の組織部位(肝臓、脾臓など)の蛍光標識EVまたは凍結切片の生体分布の インビボ イメージングを行うことができます24。また、EVは単離後できるだけ早く使用することが推奨されており、凍結保管は粒子の損失、純度の低下、および人工粒子25につながる融合現象を引き起こします。さらに、一般的に採用されているPKH26ラベルはEVサイズ26を増加させ、他のラベリング方法を比較に使用できます。
EVを単離するための既存のプロトコルは、主に次のように報告されています:差動および密度勾配超遠心分離9、限外ろ過プロセス10、免疫磁気分離11、分子排除クロマトグラフ12、マイクロ流体チップ13、およびポリマーベースの沈殿技術27。超遠心分離と比較して、限外ろ過プロセスは便利な抽出方法であり、大容量のサンプル9,10でEVを濃縮するのに役立ちますが、欠点は膜汚染があり、サンプルの損失を引き起こしやすいことです。免疫磁気分離は、EVの異なるサブタイプの分離に適しており、得られたEVは高純度である。この方法の欠点は、低収率で高コストであることです11。分子排除クロマトグラフで分離されたEVは、高純度で高収率です。欠点は、特別な装置が必要であり、同時に複数のサンプルに使用できないことです12。マイクロ流体チップは、材料および技術に対する要求が高く、コストが高く、大きなサンプルを処理することが困難である13。ポリマーベースの沈殿技術によって分離されたEVには、EVの活動に影響を与えるEV以外の汚染物質が含まれています14。その中で、示差遠心分離と超遠心分離は、EVの分離と精製に依然として最も広く使用されている方法であり、MSC-EV抽出のゴールドスタンダードと見なされています。MSC培地からのEVの分離と濃縮は、最適化された方法を表す異なる時間と速度の遠心分離の組み合わせを通じて段階的に達成されます。この原稿で単離されたExosとMVは、MVが大きくなる傾向があるが、ナノ粒子の凝集を誘発する傾向がある差動遠心分離によるものと考えられるが、同様のサイズ分布を有することは注目に値する。修正された方法はEVのサイズ維持においてより良好に性能を発揮するかもしれないが、差動遠心分離はEV分離のための高効率において有利である28。EVの大規模生産とGMP生産の場合、この方法は1回の分離実行で処理できる媒体の量によって制限されますが、技術システムはセットアップが簡単で、大型動物のトランスレーショナルプロジェクトによって適用されています29,30。とにかく、上記の分離方法には長所と短所があり、研究者はEVのさまざまな供給源と研究目的に応じて適切な方法を選択する場合があります。
近年、EVは、疾患診断31、治療、および薬物送達のキャリア32,33などの臨床応用において大きな可能性を示しています。その有利な特性に基づいて、さまざまな国が治療薬としてEVを広く研究してきました。この点で、疾患治療におけるEVと、疾患の病因におけるEVの役割の根底にあるメカニズムに関する研究が行われています。培養間葉系幹細胞からのEVの分離、特性評価、および治療適用の現在のプロトコルは十分に適用されています。例えば、皮膚創傷におけるMSC-Exosの局所送達は炎症調節による治癒を促進し、MSC由来のEVの尾静脈注射は2型糖尿病の肝インスリン抵抗性と脂肪症を改善する可能性があります24。さらに、MSC-EVの収量と純度の向上を伴う治療用途が間近に迫っており、実行可能なトランスレーショナル戦略を提供しています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(32000974、81930025、82170988)および中国ポスドク科学財団(2019M663986およびBX20190380)からの助成金によってサポートされました。基礎医学のための国立実験教育デモンストレーションセンター(AMFU)と空軍医科大学の軍事医療イノベーションセンターの分析および試験中央研究所の支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
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