Summary
Detta protokoll beskriver ett generaliserat och lättimplementerat schema för insamling av lutade enpartikeldata i kryo-EM-experiment. Ett sådant förfarande är särskilt användbart för att erhålla en högkvalitativ EM-karta för prover som lider av preferensorienteringsbias på grund av vidhäftning till luft-vattengränssnittet.
Abstract
Enpartikelanalys (SPA) med kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) är nu en vanlig teknik för högupplöst strukturbiologi. Strukturbestämning av SPA bygger på att erhålla flera distinkta vyer av ett makromolekylärt objekt förglasat i ett tunt islager. Idealt sett skulle en samling likformigt fördelade slumpmässiga projektionsorienteringar uppgå till alla möjliga vyer av objektet, vilket ger upphov till rekonstruktioner som kännetecknas av isotrop riktningsupplösning. Men i verkligheten lider många prover av företrädesvis orienterade partiklar som fäster vid luft-vattengränssnittet. Detta leder till ojämna vinkelorienteringsfördelningar i datasetet och inhomogen Fourier-rumssampling i rekonstruktionen, vilket översätts till kartor som kännetecknas av anisotrop upplösning. Att luta provstadiet ger en generaliserbar lösning för att övervinna upplösningsanisotropi genom att förbättra enhetligheten i orienteringsfördelningarna och därmed isotropin för Fourierrumsprovtagning. Detta protokoll beskriver en automatiserad datainsamlingsstrategi i lutningssteg med hjälp av Leginon, en programvara för automatiserad bildinsamling. Proceduren är enkel att implementera, kräver ingen extra utrustning eller programvara och är kompatibel med de flesta standardtransmissionselektronmikroskop (TEM) som används för avbildning av biologiska makromolekyler.
Introduction
Tillkomsten av direkta elektrondetektorer under det senaste decenniet 1,2,3 har stimulerat en exponentiell ökning av antalet högupplösta strukturer av makromolekyler och makromolekylära sammansättningar lösta med hjälp av kryo-EM 4,5,6 med en partikel. Nästan alla renade makromolekylära arter förväntas vara mottagliga för strukturbestämning med kryo-EM, förutom de minsta proteinerna ~ 10 kDa i storlek eller under7. Mängden utgångsmaterial som behövs för preparering av nät och strukturbestämning är minst en storleksordning mindre än andra tekniker för strukturbestämning, såsom kärnmagnetisk resonansspektroskopi och röntgenkristallografi 4,5,6.
En huvudutmaning för strukturbestämning med kryo-EM innebär dock lämplig nätberedning för avbildning. En omfattande studie som utvärderade olika prover med olika förglasningsstrategier och galler föreslog att de flesta metoder för förglasning av prover på kryo-EM-galler leder till preferensvidhäftning av makromolekyler till luft-vattengränssnittet8. Sådan vidhäftning kan potentiellt orsaka fyra suboptimala resultat: (1) det makromolekylära provet denaturerar fullständigt, i vilket fall ingen framgångsrik datainsamling och bearbetning är möjlig; (2) provet denatureras delvis, i vilket fall det kan vara möjligt att erhålla strukturella insikter från regioner av makromolekylen som inte är skadade; (3) provet behåller den ursprungliga strukturen, men endast en uppsättning partikelorienteringar i förhållande till elektronstrålens riktning representeras i bilderna; (4) provet behåller sin ursprungliga struktur, och vissa men inte alla möjliga partikelorienteringar i förhållande till elektronstrålens riktning representeras i bilderna. För fall (3) och (4) hjälper lutad datainsamling till att minimera riktningsupplösningsanisotropi som påverkar den rekonstruerade kryo-EM-kartan och ger en generaliserbar lösning för en mängd olika prover9. Tekniskt sett kan lutning också gynna fall (2), eftersom denatureringen förmodligen sker vid luft-vattengränssnittet och på samma sätt begränsar antalet distinkta orienteringar som representeras i data. Omfattningen av orienteringsbias i datauppsättningen kan potentiellt ändras genom att experimentera med lösningstillsatser, men brist på bred tillämplighet hindrar dessa trial-and-error-metoder. Att luta provsteget i en enda optimerad lutningsvinkel är tillräckligt för att förbättra orienteringsfördelningen genom att ändra geometrin för avbildningsexperimentet9 (figur 1). På grund av den geometriska konfigurationen av det företrädesvis orienterade provet med avseende på elektronstrålen, för varje kluster av preferensorienteringar, genererar lutning av gallret en kon av belysningsvinklar med avseende på klustercentroiden. Därför sprider detta ut vyerna och förbättrar följaktligen Fourier-rymdprovtagning och isotropin för riktningsupplösning.
Det finns i praktiken vissa nackdelar med att luta scenen. Om du lutar provsteget införs en fokusgradient över synfältet, vilket kan påverka noggrannheten i uppskattningarna av kontrastöverföringsfunktionen (CTF). Insamling av lutande data kan också leda till ökad strålinducerad partikelrörelse orsakad av ökade laddningseffekter vid avbildning av lutande prover. Rutnätslutning leder också till en ökning av den uppenbara istjockleken, vilket i sin tur leder till bullrigare mikrografier och kan i slutändan påverka upplösningen av rekonstruktioner 5,9,10. Det kan vara möjligt att övervinna dessa problem genom att tillämpa avancerade beräkningsdatabehandlingsscheman som beskrivs kortfattat i protokoll- och diskussionsavsnitten. Slutligen kan lutning leda till ökad partikelöverlappning, vilket hindrar den efterföljande bildbehandlingsrörledningen. Även om detta kan mildras till viss del genom att optimera partikelkoncentrationen på nätet, är det ändå ett viktigt övervägande. Här beskrivs ett protokoll som är enkelt att implementera för lutande datainsamling med hjälp av Leginon mjukvarusvit (en automatiserad bildinsamlingsprogramvara), tillgänglig öppen åtkomst och kompatibel med ett brett spektrum av mikroskop11,12,13,14. Metoden kräver minst version 3.0 eller senare, med version 3.3 och framåt som innehåller dedikerade förbättringar för att möjliggöra lutande datainsamling. Ingen ytterligare programvara eller utrustning behövs för detta protokoll. Omfattande instruktioner om beräkningsinfrastruktur och installationsguider finns på annan plats15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av prov
- Använd rutnät som innehåller guldfolie och guldgallerstöd16 (se materialtabell) eftersom lutande datainsamling kan accentuera strålinducerad rörelse17.
OBS: För den aktuella studien förglasades prover på galler med manuell dopp- och blottningsteknik18 i ett fuktat (mer än 80%) kylrum (~ 4 ° C). - Undvik att använda galler som innehåller kopparstöd och kolfolie eller ett kontinuerligt lager av amorft kol om det inte är absolut nödvändigt, eftersom dessa galler kan leda till större strålinducerad rörelse16 när provsteget lutas.
OBS: Alternativa stödskikt, såsom grafen / grafenoxid, verkar minska strålinducerad rörelse jämfört med amorft kol19,20. - Förskärma galler och identifiera regioner som kännetecknas av acceptabel istjocklek och partikelfördelning. Galler som innehåller för tätt packade partiklar leder till partikelöverlappning under lutande datainsamling, vilket kan påverka databehandlingsstegen nedströms.
OBS: Dessa steg är subjektiva eftersom identifiering av bra isområden utförs genom visuell inspektion av oskarpa bilder för regioner där partikelkontrasten är tydlig. Detta kanske inte är möjligt för alla prover eftersom vissa prover inte kommer att distribueras effektivt i områden med tunn is, vilket leder till utmaningar under datainsamlingen (beskrivs i avsnittet Diskussion). - Vitrifiera gallret som innehåller ditt proteinprov. Här, för demonstrationsändamål, använder vi DNA Protection during Starvation (DPS) protein (se Table of Materials) i ett intervall från 0,1-0,5 mg / ml med guldfolie och guldstödnät.
OBS: Proteinet renades som beskrivits tidigare, förutom att ingen TEV-proteasklyvning utfördes21. Proteinkoncentrationsområdet för ett prov av intresse måste optimeras individuellt, eftersom det är svårt att mäta ett idealiskt intervall som är universellt tillämpligt och nästan säkert kommer att variera mellan olika prover.
2. Ställa in lutande datainsamling
- Rikta in mikroskopet för att säkerställa parallell belysning av provet och minimera komaavvikelser22.
OBS: Mikroskopet måste vara väl anpassat för standard SPA-datainsamling utan steglutning. Inga speciella justeringar behövs för lutande datainsamling, men en bra justering säkerställer att inriktning och avbildning går smidigt. Ett allmänt schema som jämför insamling av lutande och olutade data finns i figur 2. - Spela in en rutnätsatlas utan scenlutning för att identifiera rutor som är lämpliga för datainsamling eller inspektera rutor manuellt vid förstoringen som används i Square Acquisition Node. Leta efter rutor där folien är intakt, inte ser uttorkad ut och har idealisk istjocklek.
OBS: Square Acquisition Node är den lågförstoringsnod som används för flerskalig avbildning i Leginon.- För typisk otippad automatiserad datainsamling, registrera en rutnätatlas, som ger en översikt över den övergripande rutnätkvaliteten och en första indikation på lämpliga områden för datainsamling.
- Välj sedan lämpliga rutor genom atlasen och skicka dem till kön. Sedan, antingen genom manuellt val av hål eller genom den automatiska EM-hålsökaren, köa och skicka in hålmålen.
- Slutligen, använd den automatiska EM-hålsökaren för att skicka in exponeringsmål för hög förstoring.
OBS: För lutande datainsamling kan kvadrater behöva köas manuellt för konsekventa resultat, särskilt om den optimala lutningsvinkeln inte har bestämts i förväg och sannolikt kommer att justeras under datainsamlingen. Rutnätsatlasen kunde också registreras med hjälp av en fördefinierad steglutning om lutningsvinkeln som användes för datainsamling tidigare hade fastställts.
- Flytta provstadiet till en ruta av intresse.
- Bestäm den eucentriska höjden för scenpositionen med hjälp av α-wobbler vid ± 15° steglutning. Justera Z-höjden för att få scenen till eucentrisk höjd med hjälp av knappsatspanelen för mikroskopet. Se till att bildförskjutningen är minimal under α-wobble-rutinen.
OBS: Om den eucentriska höjden inte identifieras korrekt kommer en stor bildförskjutning att observeras när scenen lutas vid kvadratförstoringen. Detta kan också hända om det finns lokala deformationer på gallret, till exempel om rutnätet är trasigt eller kraftigt böjt i närheten av det avbildade området. Även om det är bäst att undvika sådana regioner för datainsamling är det absolut nödvändigt att noggrant uppskatta eucentrisk höjd om dessa representerar en av de få lovande regionerna för datainsamling. Figur 3 visar hur inriktning utan korrekt identifiering av eucentrisk höjd kan orsaka stora bildförskjutningar i kvadratförstoringen. - Hitta en mer exakt Z-höjd, använd noden Fokuserare och tryck på Simulera.
- Uppskatta vanligtvis Z-höjden i noden Fokuserare vid förstoringen som används i Square Acquisition Node.
OBS: Fokuseringsnodens fokussekvens kan också inkludera en fin Z-fokusuppskattning vid hålförvärvsnoden (ett verktyg i Leginon-programvaran) förstoring under datainsamling. - Justera inställningarna för noden Fokuserare och aktivera/inaktivera alternativet finjusteringsfokus Z under den första köen av rutor.
OBS: Det är viktigt att säkerställa att eucentrisk höjd identifieras korrekt när automatiserad datainsamling börjar, vilket kan kräva återaktivering av fint Z-fokus (steg 2.10).
- Uppskatta vanligtvis Z-höjden i noden Fokuserare vid förstoringen som används i Square Acquisition Node.
- Luta provsteget till önskad lutningsvinkel för datainsamling vid den verkliga eucentriska höjden och centrera om scenen om det behövs. 0 °, 30 ° och 60 ° lutningsvinklar användes för denna studie. Tryck på Simulera i noden Square Acquisition för att börja köa mål för hålförvärvsnodexponeringar .
Anmärkning: Som anges i steg 2.2.1 kan rutnätsatlasen registreras med en fördefinierad steglutning, vilket skulle undanröja behovet av att luta scenen igen vid detta steg. Detta fungerar bra och påskyndar processen om lutningsvinkeln som används för datainsamling är fördefinierad. Det nuvarande protokollet är skrivet med nya prover i åtanke, där användaren kanske vill testa olika lutningsvinklar för datainsamling. - Välj ett Z-fokusmål och områden med hål som är lämpliga för höga förstoringsexponeringar.
- Tryck på Skicka mål för att köa för avbildning. Tryck inte på Skicka mål i kö förrän du har köat klart för alla rutor.
- För provstadiet tillbaka till sitt otippade tillstånd. Gå till nästa ruta och upprepa steg 2.3-2.8 tills ett tillräckligt antal hålexponeringar har köats.
- Gå till noden Hole Targeting och tryck på Submit Queued Targets när alla rutor har ställts i kö.
Om fint Z-fokus inaktiverades tidigare för att spara tid (steg 2.5) måste det återaktiveras innan kön skickas. - Inspektera manuellt mål som valts av noden Exponeringsförvärv med hög förstoring för att testa om den automatiska EM-hålsökaren exakt kan identifiera lämpliga regioner för bildinsamling när provsteget lutas.
- Under den här proceduren väljer du "Tillåt användarverifiering av valda mål" i nodinställningarna för exponeringsförvärv . När användaren är nöjd med inriktningsnoggrannheten avmarkerar du det här alternativet för automatisk datainsamling.
OBS: Mål i noden Exponeringsförvärv med hög förstoring avbildas vanligtvis med hjälp av en strål-lutningsstrategi för bildförskjutning, som fungerar lika bra för både lutad och otiltad datainsamling23,24,25,26. För korrekt CTF-uppskattning i nedströms databehandlingssteg måste kalibreringen av lins-koma-aberration utföras för datainsamlingsstrategin strål-lutning bildförskjutning.
- Under den här proceduren väljer du "Tillåt användarverifiering av valda mål" i nodinställningarna för exponeringsförvärv . När användaren är nöjd med inriktningsnoggrannheten avmarkerar du det här alternativet för automatisk datainsamling.
3. Behandling av uppgifter
- Initiera on-the-fly databehandling 10,27,28,29 med rörelsekorrigering av inspelade filmer, CTF-uppskattning, partikelval och generering av initiala rekonstruktioner under datainsamling.
OBS: För den aktuella studien har cryoSPARC Live10 (se materialförteckning) använts för förbehandling. Databehandling i farten ger en inledande kryo-EM-rekonstruktion och en approximation för vinkelfördelningen, som kan informera användaren om omfattningen av upplösningsanisotropi. Dessa kan i sin tur användas för att vägleda användaren om huruvida lutningsvinkeln som används för datainsamling är tillräckligt hög. - Visualisera den rekonstruerade kartan och plotta Euler-vinkelfördelningen för att mäta omfattningen av föredragna partikelorienteringar.
OBS: Eulers vinkelfördelningar kan omvandlas direkt till Fourierrymdsamplingsfördelningar för att bestämma den potentiella omfattningen av upplösningsanisotropi. Ett grafiskt användargränssnitt (GUI) har utvecklats för att hjälpa användaren att utvärdera kvaliteten på en Euler-vinkelfördelning och bestämma en optimal lutningsvinkel30,31. Verktyget kan hämtas från Github-förvaret, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui. - Om det behövs justerar du scenlutningsvinkeln vid vilken data samlas in för att övervinna effekterna av preferensorientering. Vinkeln kan ökas om preferensorienteringen förblir ett problem, vilket framgår av kartan och Euler-fördelningen i 3.2. Alternativt kan användaren vilja dela upp datainsamlingen i grupper och spela in med flera olika lutningsvinklar, såsom 20 °, 30 ° och 40 °.
OBS: Även om de flesta TEM måste ha förmågan att luta scenen till 70 °, varierar vanliga provsteglutningar (som vi har använt) från 20 ° -40 °.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DPS vid 0,3 mg/ml användes för att demonstrera avbildning vid 0°, 30° och 60° lutningar. Data från olika lutningsvinklar samlades in på samma rutnät i olika rutnätsregioner. CTF-upplösningen passar för högre vinkellutningar tenderar att vara sämre, vilket var fallet vid jämförelse av de tre dataseten i denna studie. Figur 4 visar jämförande representativa bilder och 2D-klassificeringsmedelvärden. Även om proteinkoncentrationen är oförändrad över de olika lutningsvinklarna, gör en högre lutningsvinkel att det avbildade området verkar mer trångt när det gäller partikelkoncentration. Detta kan vara problematiskt för databehandling eftersom partikelöverlappning kan komplicera 3D-rekonstruktioner och vinkelförfiningar. Iterativ 2D-klassificering producerade rutinmässigt en ren stapel partiklar med 0 ° och 30 ° lutade dataset, medan 60 ° datasetet krävde noggrann rengöring av partikelstaplarna för att säkerställa att klassmedelvärden visar minimal överlappning för intilliggande partiklar. Klassgenomsnittet från figur 4C i den röda rutan representerar ett exempel på partikelöverlappning. Även om omcentrering under klassificering kan resultera i att signalen från närliggande partiklar blir genomsnittlig, kan betydande partikelöverlappning äventyra noggrannheten hos partikelinriktningsparametrar, vilket ger rekonstruktioner som kännetecknas av lägre upplösning. Den bästa lösningen för att undvika partikelöverlappning är att förskärma galler med optimal istjocklek och partikelfördelning. En omfattande kvantitativ översikt över mätvärdena för att utvärdera förbättringar från lutande datainsamling beskrivs på annan plats32.
Figur 1: Översikt över fördelar och utmaningar med lutande datainsamling. Den övre panelen visar en närbild av ett rutnäthål. Gallerstänger är i guld, glasaktig isblå och makromolekylära partiklar röda. Pilar anger elektronstrålens riktning. Bottenpanelen representerar en samling hål med samma färgschema som i toppanelen. Den svarta stjärnan representerar det fina fokusmålet före exponeringsbildtagning vid hög förstoring. Lutningsvinkeln anges som "α". Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Arbetsflödesdiagram som jämför otiltad och lutad datainsamlingsstrategi. Stegvis jämförelse av olutad och lutad datainsamling visar det ytterligare steget att manuellt uppskatta den eucentriska höjden och centrera om för varje lutad kvadrat (2 och 3 för lutad datainsamling). Resten av arbetsflödet liknar de två strategierna. Dessa inkluderar att välja en lämplig kvadrat för avbildning (1 för lutad och olutad datainsamling), initiera ett köschema genom att välja en kvadrat för avbildning (kallad simulera; 2 och 4 för olutad respektive lutad datainsamling), vilket ger ett eucentriskt höjdfokusmål och köhålsförstoringsmål (3 och 5 för olutad och lutad datainsamling, respektive). och slutligen skicka in kön med utvalda exponeringsmål för hög förstoring (4 och 6 för olutad respektive lutad datainsamling). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av rutnätet vid kvadratförstoring med olika lutningsvinklar. Bilder som samlats in nära och långt från eucentrisk Z-höjd visas på de övre respektive nedre panelerna. Strålens optiska axel indikeras av mitten av de röda koncentriska ringarna. Den gröna pilen indikerar rutan av intresse. Det finns en trasig rutnätsfunktion intill torget av intresse som referens. Den objektiva bländaren tas bort för enkel visning. Skalstapel = 20 μM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa hålexponeringar och 2D-klassmedelvärden som samlats in vid olika lutningsvinklar. Panelerna A, B och C avser avbildning som utförs med provsteget otippat vid 0° eller lutat till 30° och 60°. 2D-klassmedelvärden som påverkas av trångboddhet visas i den röda rutan i (C). Skalstång = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föredragen partikelorientering orsakad av provets vidhäftning till luft-vattengränssnittet är en av de sista stora flaskhalsarna för rutinmässig högupplöst strukturbestämning med kryo-EM SPA 4,5,6. Datainsamlingsschemat som presenteras här ger en lättimplementerad strategi för att förbättra orienteringsfördelningen av partiklar inom ett dataset. Vi noterar att protokollet inte kräver någon extra utrustning eller programvara och inte påverkar datainsamlingshastigheten. Följande överväganden är viktiga vid datainsamling för lutande prover.
För det första måste den avbildade kvadraten vara i eucentrisk höjd för optimal inriktning. Eucentrisk höjd justeras genom att spela in lutningsparbilder i små steglutningsvinklar (vanligtvis 0,5 ° -2 °) och identifiera fokus baserat på ett fördefinierat förhållande mellan bildförskjutning och oskärpa. Om målfyrkanten kräver en stor justering av den eucentriska höjden resulterar detta i en betydande bildförskjutning av den fyrkantiga bilden, så att när scenen lutas igen kan synfältet blockeras av den objektiva bländaren.
För det andra blir det normalt cirkulära hålet alltmer avlångt med högre lutningar vid medelförstoring (hålförvärvsnod förstoring). I avsaknad av noggranna bildförskjutningskalibreringar är det möjligt att en del av folien kan avbildas tillsammans med partiklar inbäddade i glasaktig is för en given exponeringsförstoring. Därför måste kalibreringarna av bildförskjutning helst vara korrekta. Ett alternativ är att öka förstoringen så att den avbildade arean i förhållande till hålstorleken minskar. Vid högre förstoring skulle fel i strållutningsinducerad bildförskjutning ha en mindre effekt på användarens förmåga att navigera till ett område med glasis. Detta kommer emellertid på bekostnad av att minska antalet partiklar i de resulterande mikrograferna, proportionellt mot en ökning av förstoringen.
För det tredje har autofokus större chans att misslyckas för lutande datainsamling på grund av ökad strålinducerad rörelse och ökad provtjocklek. Således kan uppnåendet av exakt fokus ibland ge vissa utmaningar för lutad datainsamling, särskilt om fokusmålet är guldfolien i mitten av fyra hål, vilket är standardpraxis för olutad datainsamling. Vid frekventa fel på fokusuppskattningar är ett alternativ att ställa in kanten på ett hål som fokusmål. Detta måste ge en tillräcklig signal för exakt faskorrelation mellan strållutningsinducerade bildpar och efterföljande fokusjustering. Enligt vår erfarenhet resulterar fokus på kanten av ett hål sällan i autofokusfel.
Och slutligen, när bilder med hög förstoring väljs långt från rutnätets mittpunkt, kan skillnaden i fokus mellan riktade bilder på motsatta sidor av lutningsaxeln vara betydande. Storleken på denna skillnad är beroende av lutningsvinkeln och avståndet från fokuspunkten. Till exempel, vid en lutningsvinkel på 30 °, kommer två mål som är 6 μm från varandra på rutnätets yta och valda exakt vinkelrätt mot lutningsaxeln att ha en 3 μm skillnad i oskärpa mellan dem (förhållandet är: delta defocus = sin (lutningsvinkel) * (avstånd från lutningsaxeln)). Mål som väljs längs lutningsaxeln kommer att ha samma oskärpa, medan andra kommer att hamna någonstans däremellan. Om lutningsaxeln definieras i Leginon under kalibreringen kompenserar programvaran automatiskt för förändringen i oskärpa. Användare måste dock vara medvetna om att möjligheten att ha större fokusgradienter under högförstoringsbilder ändå finns. Stora fokusövertoningar bör minimalt påverka den slutliga rekonstruktionen33, men det kan vara nödvändigt att använda större lådstorlekar under databearbetningen för att förhindra aliaseffekter. Under dessa omständigheter kan det vara motiverat att använda ett smalare defokusområde under datainsamling, och randomisering av defokus kommer naturligt från att luta scenen. Justering av partikeldeskärpa under databehandling kan förbättra upplösningen av slutliga rekonstruktioner. Men eftersom noggrann modellering av CTF-passningar kan vara utmanande för höga steglutningsvinklar, måste man vara noga med att övervaka datakvaliteten och CTF-passningen under exponeringskurering. I allmänhet resulterar suboptimal istjocklek i sämre noggrannhet vid modellering av CTF-uppskattningar. Därför måste man vara försiktig med att avbilda i områden där isen är tunn, förutsatt att partikelfördelningen är tillräckligt bra i dessa områden.
En förbättrad och mer enhetlig orienteringsfördelning leder till en motsvarande förbättring av riktningsupplösningen för de rekonstruerade kryo-EM-kartorna. Dessutom förbättrar en mer enhetlig orienteringsfördelning urvalskompensationsfaktorn, som direkt hänför sig till global upplösning30,31. Således bör kollektiv förbättring av orienteringsfördelningen förbättra noggrannheten i atommodellering och förfining 9,30,31. Detta skulle i princip utgöra starka skäl för rutinmässigt genomförande av lutande datainsamling. Det finns dock flera försiktighetsåtgärder som användaren måste vara medveten om. För det första kan den ökade fokusgradienten och istjockleken påverka den totala globala upplösningen, förmodligen på grund av en kombination av ökat bakgrundsbrus och ökad strålinducerad rörelse, i kombination med andra indirekta problem som uppstår som ett resultat17. Denna effekt förväntas bli mer uttalad i fall där isen i sig är tjockare. Men eftersom de flesta prover lider av en viss mängd föredragen orientering, vilket i sin tur kan leda till ojämn provtagning, kan lutad datainsamling vara generellt fördelaktig så länge de skadliga effekterna minimeras eller mildras. För det andra kan det vara nödvändigt att luta scenen så högt som 60 ° för vissa prover som kännetecknas av svår preferensorientering. Anekdotiska opublicerade bevis från vårt arbete och kollegors rapporter tyder på att även ~ 40 ° lutningar är otillräckliga för att övervinna upplösningsanisotropi för vissa exemplar. Ansträngningar för att identifiera en optimal lutningsvinkel för en uppsättning fördelningar pågår, baserat på idéerna i Baldwin et al.31. Slutligen bör man notera att i princip skulle en rekonstruktion från ett prov som kännetecknas av en perfekt patologisk enda föredragen orientering fortfarande ha en 30 ° saknad kon även när data samlas in i en 60 ° lutningsvinkel. I simulerade experiment är det osannolikt att en 30 ° saknad kon påverkar experimentella tolkningar mycket. En lutning på 60° är förmodligen tillräcklig även för de mest patologiskt företrädesvis orienterade exemplaren. Men i de fall där steget kan behöva lutas med så mycket som 60 ° måste koncentrationen av partiklar i synfältet optimeras noggrant, eftersom partikelöverlappning kommer att komplicera databehandlingen. Det är inte möjligt att luta till mer än 60° (eller 70° på utvalda mikroskopsteg) på standard-TEM, på grund av begränsningar i provstegets utformning. I sådana fall kan ytterligare optimering med tillsatser och provbiokemi krävas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Bill Anderson, Charles Bowman och Jean-Christophe Ducom (TSRI) för hjälp med mikroskopi, Leginon installationer och dataöverföringsinfrastruktur. Vi tackar också Gordon Louie (Salk Institute) och Yong Zi Tan (National University of Singapore) för den kritiska läsningen av manuskriptet. Vi tackar Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) för att ha försett oss med plasmiden för uttryck av DPS. Detta arbete stöddes av bidrag från US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 och R01AI136680 till DL), National Science Foundation (NSF MCB-2048095 till DL), Hearst Foundations (till DL) och Arthur och Julie Woodrow Chair (till J. P. N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
- Russo, C. J., Henderson, R.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
- Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
- Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
- Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
- Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
- Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
- Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
- Glaeser, R. M., et al.
