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Biology

मधुमक्खी ऊतक में हिस्टोलॉजी मूल बातें और कोशिका मृत्यु का पता लगाना

Published: July 7, 2022 doi: 10.3791/64141
Automatic Translation
1
1Agricultural Institute of Slovenia

Summary

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधियां मधुमक्खी अनुसंधान में वयस्क मधुमक्खियों के मिडगट और हाइपोफैरेनजील ग्रंथियों में एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस के स्तर का पता लगाने और आकलन करने के लिए उपयोगी हैं।

Abstract

छत्ते के अंदर (नर्स श्रमिक और अन्य छत्ते मधुमक्खियां) और छत्ते के बाहर मधुमक्खियां (एपिस मेलिफेरा एल) जलवायु और मौसम परिवर्तन, विभिन्न कीटनाशकों, रोगजनकों और कुपोषण के संपर्क में आती हैं, मुख्य रूप से मुंह के माध्यम से प्रवेश करती हैं और मुख्य रूप से वयस्क मधुमक्खियों के पाचन तंत्र को प्रभावित करती हैं। मधुमक्खियों पर इस तरह के बाहरी और आंतरिक तनावों के प्रभावों को समझने और रोकने के लिए, एक उपयोगी शोध विधि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधि है। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए वयस्क मधुमक्खियों के मिडगट (वेंट्रिकुलस) और हाइपोफैरेनजील ग्रंथियों (एचपीजी) को तैयार करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। कोशिका क्षति के स्तर का आकलन करने और ऊतक पुनर्जनन की प्राकृतिक प्रक्रिया के रूप में प्रोग्राम्ड सेल डेथ (एपोप्टोसिस) से नेक्रोसिस को अलग करने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन किया गया है। ऑक्सालिक एसिड और कीटनाशकों (कीटनाशक और एक्रिसाइड) के साथ वयस्क मधुमक्खी उपचार के परिणाम और वेंट्रिकुलस और एचपीजी में कोशिका मृत्यु का निर्धारण प्रस्तुत किया गया है। कार्यप्रणाली के पक्ष और विपक्ष पर भी चर्चा की गई है।

Introduction

मधुमक्खियां (एपिस मेलिफेरा एल) अन्य जंगली परागणकों के बीच, कृषि पौधों के सबसे महत्वपूर्ण परागणक हैं। हजारों वर्षों में, बदलते पर्यावरण ने मधुमक्खियों को कई रोगजनकों और परजीवियों के लिए अपनी आकृति विज्ञान, शरीर विज्ञान, व्यवहार और सहिष्णुता को अनुकूलित करने के लिए प्रभावित किया है। इसलिए, मधुमक्खियोंने दुनिया भर में प्रजातियों और उप-प्रजातियों की एक अत्यधिक विविध श्रृंखला विकसित की है। ये परिणाम पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं, कि मधुमक्खी के पाचन तंत्र की संरचना में आनुवंशिक भिन्नता है, लेकिन यह भी सुझाव देते हैं कि मिडगट के परिवर्तन पर्यावरणीयकारकों 2,3 के कारण हैं।

मधुमक्खी के पाचन तंत्र के तीन मुख्य भाग होते हैं: फोरगट, मिडगट (वेंट्रिकुलस), और हिंडगट4। वेंट्रिकुलस पराग और अमृत / शहद के पाचन के लिए एक आवश्यक अंग है; हिंडगट में, आसमाटिक नियंत्रण पानी और आयनों के अवशोषण के माध्यम से होताहै। मधुमक्खी श्रमिकों की हाइपोफैरेनजील ग्रंथियां (एचपीजी) सिर में स्थित होती हैं और ब्रूड, रानी और कॉलोनी के सदस्यों को खिलाने के लिए शाही जेली घटकों को संश्लेषित और स्रावित करती हैं। उनका आकार उम्र और कार्यों के साथ बदलता है और उचित पोषण (गुणवत्ता पराग) पर निर्भर करता है। 6 से 18 दिनों की आयु के नर्स कार्यकर्ता ब्रूड पालन करते हैं, और एचपीजी का आकार 5,6 बढ़ जाता है। फोरगर मधुमक्खियों में, एचपीजी पतित हो जाते हैं और केवल उन एंजाइमों का स्राव करते हैं जो जटिल शर्करा को सरल लोगों (α-ग्लूकोसिडेस, ल्यूसीन एरिलामिडेस, इनवर्टेस) में परिवर्तित करने के लिए महत्वपूर्णहोते हैं।

मधुमक्खियों को कई जैविक और अजैविक तनावों के संपर्क में लाया जाता है8, और पाचन तंत्र कई नकारात्मक उत्तेजक से प्रभावित हो सकता है। पहला अवरोध जो रोगजनकों से जीव की रक्षा करता है, वह मिडगट में पेरिट्रोफिक झिल्ली है, जिसमें रोगजनकों से बचाने के लिए आंतों का श्लेष्महोता है। एचपीजी का विकास और कार्य आहार, आयु और कॉलोनी की स्थिति9 पर निर्भर करता है, और कीटनाशकों, एक्रिसाइड्स 10 और रोगजनकों 11,12,13 से प्रभावित होता है। वरोआ नियंत्रण उपचार के कारण छत्ते में एकेरिसाइड अवशेष और पर्यावरण से कीटनाशक फोरगर मधुमक्खियों और नर्स मधुमक्खियों को प्रभावित करते हैं14,15. मधुमक्खी उपनिवेशों के लिए सबसे बड़ा खतरा घुन वरोआ विनाशक है, दोनों कॉलोनी के नुकसानमें योगदान देने वाले वायरस के वेक्टर के रूप में और मेजबान के वसा शरीर (मधुमक्खियों में एक महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण अंग) के उपभोक्ता के रूप में, जो परिणामस्वरूप व्यक्ति के शरीर और कॉलोनी कार्यों को प्रभावित करताहै।

हालांकि, गहन खेत आवास मधुमक्खियों के लिए अल्पकालिक खाद्य आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं। इसलिए, कृषि-पर्यावरणीय योजनाओं को कृषि परिदृश्य में शहद केफूलों की उपलब्धता में वृद्धि करनी चाहिए। सेल या ऊतक स्तरों पर इन कारकों के विभिन्न उप-प्रजातियों 6,19,20,21 या उप-घातक प्रभावों का आकलन करने के लिए, हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधियां व्यावहारिक और पर्याप्त रूप से सटीक हैं जिनका उपयोग मधुमक्खियों में हिस्टोलॉजी अनुसंधान में किया जा सकता है।

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Protocol

1. मधुमक्खी अनुसंधान के लिए बुनियादी ऊतक विज्ञान

  1. मधुमक्खी ऊतक का विच्छेदन
    नोट: कार्यकर्ता मधुमक्खियों के विच्छेदन के लिए, एलईडी प्रकाश स्रोत के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। सबसे उपयोगी आवर्धन ~ 20x है।
    1. हेरफेर और विच्छेदन
      1. सावधानी से एक श्रमिक मधुमक्खी को बल के साथ लें और इसे बर्फ पर रखें (या -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में) 2 मिनट के लिए इसेस्थिर करने के लिए। पेट्री डिश पर मधुमक्खी को वक्ष के सबसे ऊपरी हिस्से के माध्यम से दो बार, बाएं से दाएं और दाएं से बाएं पिन करें।
      2. शरीर को ढंकने के लिए कीट नमकीन डालें। पेट्री डिश को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें, ध्यान केंद्रित करें और समायोजित करें।
      3. उपकरण तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. मिडगट का विच्छेदन
      1. मधुमक्खी के शरीर के दाईं ओर के केंद्र में टेरगिट ए 5 (चित्रा 1) के नीचे कैंची का एक बिंदु डालकर पेट से शुरू करें। टेरगिट ए 2 में काट लें।
      2. आंतरिक अंगों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए कैंची के आंतरिक ब्लेड को शरीर के किनारे के समानांतर रखें। कैंची को बाईं ओर घुमाएं और एक काट लें; दाईं ओर मुड़ें और एक और कटौती करें। धीरे से पेट के बाएं हिस्से को खोलें और इसे पिन करें। दूसरी तरफ दोहराएं।
      3. एक हाथ से बल का उपयोग करके, धीरे से मधुमक्खी के पेट को ऊपर की ओर खींचें, और दूसरे हाथ में कैंची के साथ, अन्नप्रणाली के अंत में काट लें। पेट और मिडगट को पेट से दूर खींचें और मलाशय को काट लें। कीट खारा घोल के साथ एक पिपेट का उपयोग करें और किसी भी मल या ऊतक के कुछ हिस्सों को हटा दें।
    3. एचपीजी का विच्छेदन
      1. चरण 1.1.1 में वर्णित के रूप में बर्फ पर एक श्रमिक मधुमक्खी को स्थिर करें। सिर को काट लें और एंटीना के साथ छोटी प्लेट पर रखें। सिर को दो पिन के साथ सुरक्षित करें: एक बाईं यौगिक आंख के माध्यम से और दूसरा दाईं यौगिक आंख के माध्यम से।
      2. पिन के आंतरिक भाग पर पहली यौगिक आंख में एक कट बनाएं, लैब्रम को जारी रखें, और फिर दूसरी यौगिक आंख (चित्रा 2) के पार दूसरी तरफ एक और कटौती करें।
      3. एंटीना काट लें। मास्क को उठाएं और जहां अभी भी संलग्न हैं वहां काट लें। बल लें और मस्तिष्क और यौगिक आंखों के हिस्से के साथ ग्रंथियों को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  2. निर्धारण, निर्जलीकरण, और पैराफिन एम्बेडिंग
    नोट: सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें।
    1. ऊतक को पेनिसिलिन बोतलों में रखें, 10% फॉर्मेलिन के साथ 3/4 भरा हुआ। 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में रखें।
    2. 24 घंटे के बाद, अल्कोहल की एक श्रृंखला में ऊतक को निर्जलित करें: 70%, 80%, 90%, 100%, प्रत्येक 1 घंटे के लिए 100% 2-प्रोपेनोल, 12 घंटे के लिए 100% 2-प्रोपेनोल, और अंत में 1 घंटे के लिए 100% 2-प्रोपेनोल।
    3. ऊतक को हिस्टोकैसेट में रखें; उन्हें 24 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 2-प्रोपेनोल और पैराफिन (1: 1) के साथ कांच के कक्षों में चिह्नित करें और रखें।
    4. हिस्टोकैसेट को पैराफिन (आई) के साथ दूसरे कक्ष में 24 घंटे के लिए ले जाएं। ताजा पैराफिन के साथ प्रक्रिया को दो बार दोहराएं (II. और III.), दोनों 24 घंटे के लिए।
    5. अंत में, माउंटिंग स्टेशन तैयार करें और ऊतक को मोम में एम्बेड करना शुरू करें।
      1. प्रत्येक हिस्टोकैसेट खोलें और कवर हटा दें। मोल्ड को मोम से भरें और सावधानी से मोल्ड के बीच में गर्म बल के साथ ऊतक डालें।
      2. हिस्टोकैसेट को मोल्ड पर रखें और इसे मोम के साथ थोड़ा कवर करें। मोल्ड को तुरंत कुछ सेकंड के लिए माउंटिंग स्टेशन की ठंडी सतह पर रखें, फिर इसे कुछ मिनटों के लिए ठंडी प्लेट पर रखें जब तक कि मोम कठोर न हो जाए और मोल्ड और हिस्टोकैसेट से अलग न हो जाए।
    6. तैयार नमूने को धूल और गर्मी से दूर एक बॉक्स में स्टोर करें।
    7. एक माइक्रोटोम पर 4 μm पतले खंड काटें: सबसे पहले, दो खंड एक दूसरे से जुड़े हुए हैं और फिर एक अलग से। खंडों को बल के साथ स्थानांतरित करें और उन्हें आसुत जल (42 डिग्री सेल्सियस) पर तैरने दें, फिर उन्हें ऑब्जेक्टिव ग्लास के बाईं ओर दो खंडों को एक साथ रखकर और दाईं ओर तीसरे को रखकर साफ स्लाइड पर इकट्ठा करें, जो स्पष्ट रूप से अलग रहें। हीटिंग डिवाइस पर रात भर चिह्नित स्लाइड छोड़ दें और अंत में उन्हें हिस्टोलॉजी नमूनों के लिए समर्पित बॉक्स में स्टोर करें।
  3. डीवैक्सिंग और पुनर्जलीकरण
    नोट: सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें।
    1. नौ कोप्लिन जार तैयार करें और अनुभागों को 5 मिनट के लिए क्लियरिंग एजेंटों (I., II., III.) की एक श्रृंखला में डालें।
    2. 2-प्रोपेनोल, इथेनॉल 96% (I., II.), अल्कोहल 90% और 80% और आसुत जल में 3 मिनट के लिए डाल दिया जाता है।
  4. हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन के साथ रंगाई
    नोट: सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें।
    1. छह कोप्लिन जार तैयार करें।
    2. हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला करने के लिए, 5 मिनट के लिए हेमेटॉक्सिलिन में अवक्षेपित, पुनर्जलीकृत खंडों को रखें, फिर उन्हें 2 मिनट के लिए बहते नल के पानी के नीचे सावधानीपूर्वक रखें। फिर उन्हें 1 मिनट के लिए आसुत जल में और 4 मिनट के लिए ईओसिन में रखें (ईओसिन के लिए, कोप्लिन जार आवश्यक नहीं है)।
    3. स्लाइड्स को इथेनॉल में 96% 1 मिनट के लिए रखें, फिर 2 मिनट के लिए 2-प्रोपेनोल, और अंत में 2 मिनट के लिए क्लियरिंग एजेंट में रखें।
    4. माउंटिंग मीडियम और एक कवर ग्लास जोड़ें और उन्हें सूखने दें। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।

Figure 1
चित्र 1: मधुमक्खी के शरीर का पृष्ठीय दृश्य। A1-A7 टेरगिट्स। मधुमक्खी विच्छेदन पर विस्तृत निर्देश कैरेक एट अल.24 में पाए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एचपीजी का पृष्ठीय दृश्य, मस्तिष्क से जुड़ी यौगिक आंखों के कुछ हिस्से (दिखाई नहीं देते हैं)। 5 से 6 दिनों की आयु के एक युवा कार्यकर्ता मधुमक्खी में मोटा और मलाईदार सफेद एचपीजी होता है। एसिनी मस्तिष्क पर स्थित होते हैं और मस्तिष्क के पीछे पहुंचने वाली शाखाओं के साथ सिर क्षेत्र को भरते हैं। चारा खोजने वाली मधुमक्खियों में, ये ग्रंथियां बहुत सिकुड़ जाती हैं और केवल पतले धागे जैसे अवशेष छोड़ती हैं। इस कारण से, ऊतक को खोने से बचने के लिए आगे की प्रक्रियाओं में आसान बनाने के लिए मस्तिष्क के साथ ग्रंथियों को निकालना बेहतर होता है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. ऊतक वर्गों में कोशिका मृत्यु का पता लगाना

  1. एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (परख ए)
    नोट: निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कोप्लिन जार तैयार करें।
    2. डीवैक्सिंग और पुनर्जलीकरण के बाद (चरण 1.3 देखें), स्लाइड्स को 0.85% NaCl समाधान में डुबोएं, और फिर फॉस्फेट-बफर्ड खारा (PBS) (5 मिनट) में।
    3. स्लाइड्स को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड 2 x 15 मिनट में रखें।
    4. कंटेनर में स्लाइड्स को सपाट रखें और प्रोटीन के (20 μg / mL) समाधान के 100 μL जोड़ें, फिर उन्हें 10-30 मिनट के लिए छोड़ दें।
    5. स्लाइड्स को पीबीएस (5 मिनट) में रखें।
    6. पीबीएस (5 मिनट) में स्लाइड्स को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में रखें।
    7. पीबीएस (2 x 5 मिनट) में स्लाइड्स को डुबोएं।
    8. कंटेनर में स्लाइड्स को सपाट रखें, 100 μL संतुलन बफर जोड़ें, और उन्हें 5-10 मिनट के लिए छोड़ दें।
    9. टीडीटी प्रतिक्रिया मिश्रण का 100 μL जोड़ें। कंटेनर के अंदर, स्लाइड के चारों ओर पेपर तौलिए रखें, तौलिए को पानी से नम करें, और फिर प्लास्टिक रैप के साथ कवर करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
    10. स्लाइड्स को वापस धुंधला रैक में रखें और 15 मिनट के लिए 2x नमकीन-सोडियम साइट्रेट (एसएससी) में डुबोएं।
    11. पीबीएस में स्लाइड 3 x 5 मिनट, फिर 0.3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में 3-5 मिनट के लिए डुबोएं, और फिर पीबीएस में फिर से, 3 x 5 मिनट।
    12. फिर से, स्लाइड्स को कंटेनर में सपाट रखें, स्ट्रेप्टाविडिन एचआरपी (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) के 100 μL जोड़ें, और 30 मिनट (प्लास्टिक रैप के साथ कवर) के लिए छोड़ दें।
    13. पीबीएस में स्लाइड्स को 3 x 5 मिनट डुबोएं।
    14. कंटेनर में स्लाइड्स को सपाट रखें और 3,3'-डायमिनोबेंजिडाइन (डीएबी) समाधान का 100 μL जोड़ें। हल्के भूरे रंग की पृष्ठभूमि की तलाश करें।
    15. स्लाइड्स को रैक पर वापस करें और उन्हें पानी में कई बार धोएं (डबल-डिस्टिल्ड)।
    16. बढ़ते माध्यम में ग्लास कवरलिप्स के नीचे स्लाइड्स को माउंट करें और सूखने के लिए सपाट छोड़ दें।
    17. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
  2. एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (परख बी)
    नोट: निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कोप्लिन जार तैयार करें।
    2. प्रोटीन के (पीबीएस में पतला 20 μg / mL) तैयार करें।
    3. अनुभागों (चरण 1.3) को डीवैक्सिंग और पुनर्जलीकृत करने के बाद, स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए पीबीएस में रखें।
    4. कंटेनर में स्लाइड्स को सपाट रखें और प्रोटीन के (20 μg / mL, 60 μL प्रति 5 सेमी² नमूना) जोड़ें।
    5. आसुत जल में स्लाइड्स को 2 x 2 मिनट धो लें।
    6. कमरे के तापमान पर अंतर्जात पेरोक्सीडेज (3% हाइड्रोजन पेरोक्सीडेज में) में बुझाएं।
    7. पीबीएस या पानी के साथ स्लाइड्स को 2 x 5 मिनट धोएं।
    8. कंटेनर में स्लाइड्स को सपाट रखें और कमरे के तापमान पर 10 सेकंड के लिए संतुलन बफर (75 μL/5 सेमी2) लागू करें।
    9. ऊतक के चारों ओर सावधानीपूर्वक पोंछें।
    10. प्रत्येक खंड में टीडीटी एंजाइम (टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लिओटिडिल ट्रांसफेरेज़) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफाइड कक्ष में इनक्यूबेट करें। ट्रे के अंदर, स्लाइड के चारों ओर पेपर तौलिए रखें, तौलिए को पानी से नम करें, और उन्हें प्लास्टिक रैप के साथ कवर करें।
    11. इनक्यूबेशन के बाद, नमूनों को रैक में डालें और उन्हें स्टॉप / वॉश बफर (10 मिनट) में छोड़ दें।
    12. एंटी-डिगॉक्सिजेनिन को कमरे के तापमान पर गर्म करें।
    13. पीबीएस (3 x 1 मिनट) में स्लाइड्स धोएं।
    14. ऊतक के चारों ओर सावधानी से पोंछें।
    15. अनुभागों में एंटी-डिगॉक्सिजेनिन-पेरोक्सीडेज संयुग्म (65 μL/5 सेमी²) की दो बूंदें जोड़ें और एक ह्यूमिडिफायर कंटेनर में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    16. पीबीएस 4 x 2 मिनट में धोने के बाद, कामकाजी ताकत पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट तैयार करें, और धीरे से अनुभाग के चारों ओर अतिरिक्त तरल और एस्पिरेट को टैप करें।
    17. पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट (75 μL/5 सेमी²) के साथ अनुभागों को कवर करें और 5 मिनट के लिए दाग दें। माइक्रोस्कोप के नीचे एक स्लाइड रखें और इष्टतम धुंधला समय निर्धारित करें।
    18. आसुत जल (3 x 1 मिनट) में एक धुंधला रैक में स्लाइड्स धोएं।
    19. 5 मिनट के लिए आसुत जल में स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें।
    20. 2 मिनट के लिए हेमेटॉक्सिलिन का उपयोग करके काउंटरस्टेन।
    21. स्लाइड को 3 मिनट के लिए बहते नल के पानी के नीचे रखें।
    22. आसुत जल में स्लाइड को धो लें।
    23. बढ़ते माध्यम में ग्लास कवरलिप्स के नीचे स्लाइड्स को माउंट करें और सूखने के लिए सपाट छोड़ दें।
    24. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
  3. एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (परख सी)
    नोट: निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कोप्लिन जार तैयार करें।
    2. ऊतक वर्गों को डीवैक्स और पुनर्जलीकृत करें (चरण 1.3 देखें)।
    3. प्रोटीन के के साथ ऊतक को इनक्यूबेट करें (37 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट)।
    4. स्लाइड्स को रैक पर वापस रखें और पीबीएस में 2x कुल्ला करें।
    5. 'ट्यूनल प्रतिक्रिया मिश्रण' के 50 μL के साथ कवर करें। कंटेनर के अंदर गीले पेपर तौलिए रखें, उन्हें प्लास्टिक रैप के साथ कवर करें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए छोड़ दें।
    6. पीबीएस के साथ 3x कुल्ला करें।
    7. कंटेनर में स्लाइड रखें और ऊतक के नमूने के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं।
    8. नमूने में कनवर्टर-एपी का 50 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफायर कंटेनर में इनक्यूबेट करें।
    9. पीबीएस में 3 गुना कुल्ला करें।
    10. सब्सट्रेट घोल के 50-100 μL जोड़ें और अंधेरे में 10 मिनट के लिए छोड़ दें।
      नोट: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत धुंधलापन का निरीक्षण करें।
    11. पीबीएस के साथ स्लाइड 3x को धो लें।
    12. 2 मिनट के लिए हेमेटॉक्सिलिन में अनुभागों को स्थानांतरित करके काउंटरस्टेन और फिर 5 मिनट के लिए बहते नल के पानी में सावधानीपूर्वक कुल्ला करें।
    13. एक जलीय माउंटिंग माध्यम में ग्लास कवरलिप्स के नीचे स्लाइड्स को माउंट करें और उन्हें सूखने के लिए सपाट छोड़ दें।
    14. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत मिडगट या एचपीजी के प्रत्येक नमूने में 70 से 100 कोशिकाओं की गिनती करके प्रभावित (सकारात्मक) कोशिकाओं का आकलन करें।

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Representative Results

मिडगट में कोशिका मृत्यु का पता लगाना
जुब्लजाना में स्लोवेनिया के कृषि संस्थान में प्रयोगात्मक मधुमक्खी से नए उभरे कार्यकर्ता मधुमक्खियों (एपिस मेलिफेरा कार्निका) को व्यक्तिगत रूप से 3% ऑक्सालिक एसिड (ओए) 23 के साथ इलाज किया गया था। ओए का उपयोग अक्सर वरोआ विनाशक नियंत्रण के लिए मधुमक्खी पालन में किया जाता है। उपचार के बाद, कार्यकर्ता मधुमक्खियों (प्रत्येक समूह से तीन) को बर्फ पर स्थिर किया गया था। मिडगट को विच्छेदित किया गया और इसे 10% फॉर्मलिन में तय किया गया। ऊतक को तब अल्कोहल समाधान की एक श्रृंखला में निर्जलित किया गया था और अंत में पैराफिन मोम में एम्बेडेड किया गया था। माइक्रोटोम के साथ 7 μm पतले वर्गों में काटे जाने के बाद, ऊतक के नमूने विश्लेषण के लिए तैयार किए गए थे। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, प्रभावित कोशिकाओं के प्रतिशत (तीन मिडगट नमूनों में से प्रत्येक से 70-100 कोशिकाएं) की गणना की गई थी। परख बी के साथ परिणामों ने संकेत दिया कि ओए के साथ उपचार ने मिडगट में कोशिकाओं को काफी प्रभावित किया (चित्रा 3)। परख ए ने इलाज और नियंत्रण मधुमक्खियों के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया; कोशिका मृत्यु की दर 10% से कम थी। नियंत्रण मधुमक्खियों में, केवल चीनी सिरप खिलाया गया, मिडगट की आकृति विज्ञान अप्रभावित और अच्छी तरह से संरक्षित था।

Figure 3
चित्र 3: मिडगट (ए) हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला; (बी) मिडगट का इम्यूनोस्टेनिंग (परख सी)। तीव्र लाल धुंधलापन मिडगट कोशिकाओं के नाभिक में स्थानीयकृत होता है। स्केल पट्टियाँ = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एचपीजी में कोशिका मृत्यु का पता लगाना
अगले परीक्षण में, प्रयोग आयोजित किया गया था, जिसमें तीन रोग मुक्त कॉलोनियों (एपिस मेलिफेरा एल) का चयन किया गया था। कवर ब्रूड के साथ कंघी को एक इनक्यूबेटर (34.5 डिग्री सेल्सियस) में रखा गया था, और नए उभरे श्रमिक मधुमक्खियों को उनकी उम्र को परिभाषित करने के लिए वक्ष पर एक स्थान के साथ चिह्नित किया गया था। अलग-अलग वृद्ध मधुमक्खियों को प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराया गया था। मधुमक्खियों को चिह्नित किया गया और उनकी कॉलोनी में वापस कर दिया गया। परीक्षण की शुरुआत से 30 दिनों के बाद मधुमक्खियों का नमूना लिया गया था। अंत में, उन्हें 7.5 सेमी x 4 सेमी x 4 सेमी होर्डिंग पिंजरे में डाल दिया गया, जिसमें एक तरफ तार की जाली थी और 28 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रखा गया था।

श्रमिकों को कीटनाशक (इमिडाक्लोप्रिड) या एक्रिसाइड (कौमाफोस) के साथ इलाज किया गया था, दोनों उप-घातक खुराक में समाधान, या नियंत्रण समूह10 के रूप में चीनी सिरप। विभिन्न समूहों की मधुमक्खियों को स्थिर किया गया और एचपीजी को विच्छेदित किया गया। एक नमूने में एक ही समूह के तीन से पांच श्रमिक शामिल थे ताकि जितना संभव हो उतने सेल प्राप्त कर सकें। प्रभावित कोशिकाओं का मूल्यांकन इम्यूनोहिस्टोलॉजी विधियों का उपयोग करके किया गया था। एचपीजी के एपोप्टोटिक नाभिक में लाल (परख सी) और भूरे (परख बी) प्रतिक्रिया उत्पादों का पता लगाया गया था। इमिडाक्लोप्रिड या कौमाफोस उपचार के बाद सकारात्मक लाल नाभिक अधिकांश ग्रंथियों की कोशिकाओं में निर्धारित किए गए थे (चित्रा 4), और केवल छिटपुट सेल नाभिक ने एक ही उपचारित समूहों से भूरे रंग की प्रतिक्रिया उत्पाद दिखाया। नियंत्रण समूह में कोई क्षतिग्रस्त एचपीजी कोशिकाएं नहीं थीं।

Figure 4
चित्र 4: हाइपोफैरेनजील ग्रंथियां( ए) हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला होना; (बी) इम्यूनोस्टेनिंग (परख सी)। लाल धुंधलापन कोशिकाओं के नाभिक में स्थानीयकृत होता है। (सी) इम्यूनोस्टेनिंग (परख बी)। ब्राउन प्रतिक्रिया उत्पाद सकारात्मक कोशिका नाभिक को इंगित करता है। स्केल पट्टियाँ = 50 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

जीवित जीवों में, कोशिका मृत्यु को एपोप्टोसिस या नेक्रोसिस25 के रूप में परिभाषित किया गया है और ऑटोफैगी26 के साथ हो सकता है। एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं के बीच अंतर यह है कि एपोप्टोसिस प्रोग्राम्ड सेल डेथ का एक रूप है और सामान्य कोशिकाओं में दिखाई देता है, जबकि नेक्रोसिस घातक स्थितियों (जैसे, दुर्घटना, बीमारी) 27,28 के कारण होता है। ट्यूनल तकनीक के आधार पर परख किट का उपयोग करके एपोप्टोसिस का पता लगाया जा सकता है (एपोप्टोसिस के दौरान उत्पन्न डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक में 3'-हाइड्रॉक्सिल टर्मिनी को लेबल करके डीएनए विखंडन का पता लगाना)। विभिन्न किट सेल विलोपन का पता लगाने में संवेदनशीलता के कई स्तर प्रदान करते हैं।

परख (परख सी) में से एक अत्यधिक संवेदनशील है और एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस29 दोनों का पता लगाता है; अन्य परख (बी) एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलतादिखाता है। परख सी का सिद्धांत एपोप्टोसिस के शुरुआती चरणों में डीएनए ब्रेक का पता लगाना है। एपोप्टोटिक कोशिकाओं को ठीक करने और स्थिर करने के बाद, ऊतक को ट्यूनल प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। इस बीच, टीडीटी की भूमिका डीएनए में मुक्त 3'-ओएच समूहों में फ्लोरेसिन-डीयूटीपी के अतिरिक्त को उत्प्रेरित करना है। ऊतक को धोने के बाद, एंटी-फ्लोरेसिन एंटीबॉडी डीएनए के क्षतिग्रस्त हिस्सों में लेबल को चिह्नित करता है। एंटीबॉडी का सिद्धांत एंजाइम क्षारीय फॉस्फेट से जुड़ना है जो एक रिपोर्टर के रूप में काम करता है। अंत में, एपी को इस विशिष्ट प्रतिक्रिया31 के परिणामस्वरूप देखा जा सकता है।

हेमेटॉक्सिलिन और अंगों का ईओसिन धुंधला होना प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रूपात्मक विश्लेषण के लिए एक सीधा और उपयोगी तरीका है। कोशिकाओं के किसी भी रूपात्मक परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए पहले इस चरण को शामिल करने की सिफारिश की जाती है। मधुमक्खी ऊतक के पतले वर्गों में एपोप्टोसिस के शुरुआती चरणों का पता लगाने के लिए, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए कम से कम दो किट उपलब्ध हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। दोनों एपोप्टोटिक सेल नाभिक को गहरे भूरे रंग में बदलते हैं और प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जाती है। परख ए (ट्यूनल तकनीक) का उपयोग करते हुए, स्ट्रेप्टाविडिन एचआरपी (हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज) बायोटिनाइलेटेड न्यूक्लियोटाइड्स को संयुग्मित करता है, और डीएबी (डायमिनोबेंजिडीन, एक स्थिर क्रोमोजेन) की प्रतिक्रिया के बाद एपोप्टोटिक नाभिक भूरे रंग का हो जाता है। परख बी डीएनए दरार और संघनित क्रोमैटिन का पता लगाने के माध्यम से सेल क्षति को अलग करता है, जो प्रारंभिक एपोप्टोसिस का संकेत है।

एक स्वस्थ जीव में, सेल नवीकरण का स्तर आमतौर परछोटे प्रतिशत 32,33 में मूल्यांकन किया जा सकता है। ओए उपचार के बाद मिडगट में कोशिका मृत्यु में वृद्धि हुई, जो इंगित करता है कि ओए के उपयोग का प्रयोगशाला प्रयोगों में कार्यकर्ता मधुमक्खियों के मिडगट्स पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है। इमिडाक्लोप्रिड और कौमाफॉस के साथ इलाज किए गए मधुमक्खियों के समूह ने खाद्य ग्रंथियों10 में एक बढ़ी हुई कोशिका मृत्यु (लाल नाभिक) का खुलासा किया, जो कोशिका क्षति या नेक्रोसिस का संकेत देता है; प्रोग्राम्ड सेल डेथ निम्न स्तर (भूरे रंग के नाभिक) 10 पर पाया गया था। हालांकि, नेक्रोटिक और एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु उच्च स्तर पर पाई गई, खासकर इमिडाक्लोप्रिड उपचार के बाद। अनुपचारित मधुमक्खियों के समूह में, एचपीजी में क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का स्तर 10% से अधिक नहीं था, जो सामान्य ऊतक कारोबार32 के अनुसार है।

कोशिका मृत्यु, क्षति या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु दोनों के कारण, दोनों परखों (बी और सी) द्वारा पता लगाया गया था और इसके परिणामस्वरूप अलग-अलग संवेदनशीलता थी; पहला नेक्रोटिक और प्रोग्राम्ड सेल डेथ11 दोनों का पता लगाता है। जैसा कि स्वस्थ श्रमिकों (नियंत्रण समूह) में पुष्टि की गई है, दोनों परखों ने केवल10 छिटपुट सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाया। मधुमक्खी ऊतक के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस डिटेक्शन परख मधुमक्खियों पर विभिन्न पदार्थों के उप-घातक प्रभावों का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तरीका साबित हुए।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम:
माइक्रोटोम से काटे जाने के बाद, ऊतक वर्गों को रात भर गर्म प्लेट (चपटे टेबल, सामग्री की तालिका देखें) पर उद्देश्य ग्लास पर रखा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में भविष्य के चरणों के लिए नमूनों को अच्छी तरह से सुखाया जाना आवश्यक है। जब ऊतक कांच से अच्छी तरह से जुड़ा नहीं होता है, तो यह कोशिका मृत्यु का पता लगाने की प्रक्रिया में सतह से अलग हो सकता है। वांछित ऊतक की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। इसके बाद, कई कोशिकाओं (विशेष रूप से ग्रंथियों के ऊतक) के साथ सही खंड की जांच करने के लिए एच एंड ई के साथ पहली स्लाइड को रंगना उपयोगी है और मिडगट सेक्शन उपयुक्त नहीं होने की स्थिति में नए तैयार करना है। एचपीजी को ढूंढना काफी चुनौतीपूर्ण हो सकता है, इसलिए बहुत सारे वर्गों में कटौती न करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए; अन्यथा, ग्रंथियां खो जाएंगी।

डीएनए विखंडन का पता लगाने के लिए सकारात्मक नियंत्रण जोड़ना उपयोगी लेकिन वैकल्पिक है। प्रयोगात्मक स्लाइडों में उच्च पृष्ठभूमि धुंधला होने से बचने के लिए स्लाइडों का अलग से इलाज करना महत्वपूर्ण है। परख बी में, सकारात्मक नियंत्रण कुछ किटों में शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें); दूसरों को अलग से खरीदा जाना चाहिए।

विधि की लंबाई और परिशुद्धता में एक सीमा है। एक जलीय माउंटिंग माध्यम में ऊतक का संरक्षण केवल अल्पकालिक (3 महीने से कम) है। यदि लंबे समय तक संरक्षण वांछित है (रंग के संभावित परिवर्तनों के कारण अनुशंसित नहीं है), तो अन्य माध्यम हैं, लेकिन परिणाम उतने विश्वसनीय नहीं हैं।

इन दो तरीकों (एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस डिटेक्शन) का एक साथ उपयोग करना मधुमक्खी ऊतक पर कीटनाशकों के विभिन्न प्रभावों की तुलना करने के लिए बहुत उपयोगी है, खासकर उप-घातक प्रभावों के लिए। वैकल्पिक विधि चारा खोजने की गतिविधि का अवलोकन और कीटनाशकों से प्रभावित श्रमिक मधुमक्खियों की संज्ञानात्मक धारणा पर इसका प्रभाव होगा। इस तरह की विधि वयस्क मधुमक्खियों की गतिविधियों पर उप-घातक प्रभावों का पता लगाने में तेज होगी, लेकिन आंतरिक क्षति की सीमा के बारे में किसी भी प्रश्न का उत्तर नहीं देगी जो प्रारंभिक चरण में व्यवहार को बदल सकती है, जैसा कि युवा (नर्स) मधुमक्खियों में होता है।

मधुमक्खी ऊतक की सरल आकृति विज्ञान का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण सेल क्षति, एपोप्टोसिस या विकृतियों में विभिन्न शोध दृष्टिकोणों तक पहुंचने के लिए एक ठोस आधार है। परजीवी और कीटों के कारण पर्यावरण या कॉलोनी उपचार में कीटनाशक के उपयोग के कारण हानिकारक हो सकते हैं और मधुमक्खी के जीवनकाल और कॉलोनी के अस्तित्व को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। मिडगट और एचपीजी मधुमक्खियों में आवश्यक अंग हैं और मधुमक्खियों की उम्र से संबंधित गतिविधियों को प्रभावित करने वाले किसी भी प्रकार के नकारात्मक बाहरी कारकों का जल्दी से जवाब देने की क्षमता और उद्देश्य रखते हैं। एचपीजी आकार और स्राव क्षमताओं में कमी करते हैं, और मिडगट में उपकला कोशिकाएं कोशिका मृत्यु में वृद्धि से प्रतिक्रिया करती हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विधियां, जैसे कि सीटू अध्ययन, मधुमक्खी ऊतक में एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए उपयोगी उपकरण हैं। वे मधुमक्खियों और अन्य लाभकारी कीड़ों पर संभावित प्रतिकूल प्रभावों के अध्ययन में लागू होने की क्षमता भी दिखाते हैं।

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Disclosures

लेखक के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

मैं स्लोवेनियाई रिसर्च एजेंसी, अनुदान संख्या पी 4-133 के समर्थन को कृतज्ञता पूर्वक स्वीकार करता हूं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol
ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) Sigma-Aldrich S7100 Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA
jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE
j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx
H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA
vD_BwE; Positive controls included in S7101
Covers
DeadEnd Colorimetric TUNEL system Promega G7360 Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
Dissecting microscope  (for bee dissection) Zeiss
Distilled water
Embedding cassette
EnVision System alkaline phosphatase kit Dako
Eosin Y Solution Sigma-Aldrich alcoholic
Ethanol 95% (or less pure), 90%, 80%
Faramount mounting medium, aqueous Dako mounting medium
Flattening table Leica HI1220
Forceps  (for bee dissection) Fine science tools 11294-00 Standard #4
Formalin 10% Formaldehyde
Hematoxylin Sigma-Aldrich
HistoChoice Clearing Agent Sigma-Aldrich clearing agent
Hydrogen peroxidase 3%
Incubator BioRad
Insect pins  (for bee dissection) Entosphinx 44594 Insect pins stainless steel – white, size 2
ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) Roche 11684809910 Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b
ul.pdf
KH2PO4
Lab clock
Light microscope Leica
Microscope slides Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust
Microtome Leica
Modular tissue embedding station Leica
Na2HPO4
NaCl
Paraformaldehyde 4%
Paraplast Leica
Pasteur pipettes 1.5 mL; 3 mL
PBS
Petri dish  (for bee dissection) Filled with condensation silicon  (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator)
Proteinase K Merck 21627
Ringers' solution  (for bee dissection) 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water
Scissors  (for bee dissection) Fine science tools 1406-09, 14061-09 Straight and curved, 9 cm
Universal liquid plus activator  (for bee dissection) Kulzer
Watchmaker’s forceps (for bee dissection) Fine science tools 91100-12
Water bath Leica
Watercolor brush 2x
Xantoprene L blue  (for bee dissection) Kulzer

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References

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जीव विज्ञान अंक 185 हिस्टोलॉजी एपिस मेलिफेरा कार्निका कोशिका मृत्यु एपोप्टोसिस नेक्रोसिस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री हाइपोफैरेनजील ग्रंथियां वेंट्रिकुलस
मधुमक्खी ऊतक में हिस्टोलॉजी मूल बातें और कोशिका मृत्यु का पता लगाना
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Smodiš Škerl, M. I. Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue. J. Vis. Exp. (185), e64141, doi:10.3791/64141 (2022).

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