Nozioni di base sull'istologia e rilevamento della morte cellulare nel tessuto delle api
Summary
I metodi immunoistochimici sono utili nella ricerca sulle api per rilevare e valutare il livello di apoptosi e necrosi nell’intestino medio e nelle ghiandole ipofaringee delle api adulte.
Abstract
Le api mellifere (Apis mellifera L.) all’interno dell’alveare (lavoratrici nutrici e altre api dell’alveare) e all’esterno dell’alveare (raccoglitrici) sono esposte ai cambiamenti climatici e climatici, vari pesticidi, agenti patogeni e malnutrizione, entrando principalmente attraverso la bocca e colpendo principalmente i tratti digestivi delle api adulte. Per comprendere e prevenire gli effetti di tali fattori di stress esterni e interni sulle api, un utile metodo di ricerca è il metodo immunoistochimico. Viene descritto un protocollo di base per preparare l’intestino medio (ventricolo) e le ghiandole ipofaringee (HPG) delle api adulte per l’analisi istologica. Viene descritta una metodologia dettagliata per valutare il livello di danno cellulare e distinguere la necrosi dalla morte cellulare programmata (apoptosi) come processo naturale di rigenerazione dei tessuti. Vengono presentati i risultati del trattamento delle api adulte con acido ossalico e pesticidi (insetticida e acaricida) e la determinazione della morte cellulare nel ventricolo e negli HPG. Vengono inoltre discussi i pro e i contro della metodologia.
Introduction
Le api mellifere (Apis mellifera L.) sono, tra gli altri impollinatori selvatici, i più importanti impollinatori delle piante agricole. Nel corso di migliaia di anni, l’ambiente mutevole ha influenzato le api ad adattare la loro morfologia, fisiologia, comportamento e tolleranza a diversi agenti patogeni e parassiti. Pertanto, le api hanno sviluppato una gamma molto diversificata di specie e sottospecie in tutto il mondo1. Questi risultati sono coerenti con i risultati precedenti, che c’è una variazione genetica nella struttura del tratto digestivo dell’ape, ma suggeriscono anche che le alterazioni dell’intestino medio sono dovute a fattori ambientali 2,3.
Il tratto digestivo dell’ape ha tre parti principali: foregut, midgut (ventricolo) e hindgut4. Il ventricolo è un organo essenziale per la digestione del polline e del nettare/miele; Nell’intestino posteriore, il controllo osmotico avviene attraverso l’assorbimento di acqua e ioni2. Le ghiandole ipofaringee (HPG) delle operaie delle api si trovano nella testa e sintetizzano e secernono componenti della pappa reale per nutrire la covata, la regina e i membri della colonia. Le loro dimensioni cambiano con l’età e le attività e dipendono da una corretta alimentazione (polline di qualità). Gli operatori infermieri di età compresa tra 6 e 18 giorni eseguono l’allevamento della covata e la dimensione degli HPG aumenta di 5,6. Nelle api bottinatrici, gli HPG degenerano e secernono solo enzimi importanti per convertire gli zuccheri complessi in quelli semplici (α-glucosidasi, leucina arilamidasi, invertasi) nel miele7.
Le api sono esposte a diversi fattori di stress biotici e abiotici8 e il tratto digestivo può essere influenzato da diversi stimolanti negativi. La prima barriera che protegge l’organismo dagli agenti patogeni è la membrana peritrofica nel midgut, che consiste nella mucosa intestinale per proteggersi dagli agenti patogeni4. Lo sviluppo e la funzione degli HPG dipendono dalla dieta, dall’età e dalla condizione della colonia9 e sono influenzati da insetticidi, acaricidi 10 e agenti patogeni11,12,13. I residui di acaricidi nell’alveare dovuti al trattamento di controllo della varroa e ai pesticidi dall’ambiente colpiscono le api bottinatrici e le api nutrici14,15. La più grande minaccia per le colonie di api è l’acaro Varroa destructor, sia come vettore di virus che contribuiscono alla perdita di colonie16 sia come consumatore del corpo grasso dell’ospite (un importante organo vitale nelle api), che di conseguenza influenza il corpo dell’individuo e le funzioni della colonia17.
Tuttavia, gli habitat intensivi dei terreni agricoli possono fornire un approvvigionamento alimentare a breve termine per le api mellifere. Pertanto, i regimi agroambientali dovrebbero migliorare la disponibilità di fiori di miele nei paesaggi agricoli18. Per valutare la morfologia di diverse sottospecie 6,19,20,21 o gli effetti subletali di questi fattori a livello cellulare o tissutale, in particolare midgut e HPG, i metodi istologici e immunoistochimici sono pratici e sufficientemente accurati per essere utilizzati nella ricerca istologica nelle api mellifere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli organismi viventi, la morte cellulare è definita come apoptosi o necrosi25 e può essere accompagnata da autofagia26. La differenza tra cellule apoptotiche e necrotiche è che l’apoptosi è una forma di morte cellulare programmata e appare nelle cellule normali, mentre la necrosi si verifica a causa di condizioni letali (ad esempio, incidente, malattia)27,28. L’apoptosi può essere rilevata utilizzando kit di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosco con gratitudine il sostegno dell’Agenzia di ricerca slovena, sovvenzione n. P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
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